NO164246B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av et terapeutisk aktivt antigent peptid. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av anti-

gene peptider mot infektiøse sykdommer og nærmere bestemt for behandling av sykdommer fremkalt av virus av familien Picornavirus slik som munn- og klovsyke.

Munn-og klovsyke er en meget smittsom sykdom av stor økonomisk betydning som rammer i første rekke dyr med spaltede klover. Dødeligheten som direkte tilskrives munn og klov-

syke, er generelt relativt liten, men hos unge dyr kan døde-ligheten være relativt høy. Av større økonomisk betydning er det at sykdommen er så' svekkende at infiserte dyr ikke kan ales opp og fores økonomisk. Den eneste erkjente effektive prosedyre for å fjerne infeksjonen så snart den er blitt oppdaget, er å slakte alle infiserte dyr, desinfisere alle lokaliteter som har vært fylt av dyrene, og oppløse likene i ulesket kalk. Da infeksjonen sprees uhyre hurtig, kan det økonomiske grunnlag for hele samfunn eller regioner ødelegges av et stort utbrudd av munn-og klovsyke.

Vaksiner er blitt produsert som immuniserer overfor munn-og klovsyke, primært ved inaktivering eller svekkelse av viruset. Slike vaksiner er blitt funnet å være effektive i en viss grad, men utbrudd av munn-og klovsyke er blitt knyttet til vaksiner hvori viruset var ufullstendig inaktivert eller utilstrekkelig svekket. Infeksjoner er også blitt sporet tilbake til virus forsvunnet fra utstyr tilknyttet forskning innen munn-og klovsyke eller produksjon av munn-

og klovsyke-vaksiner.

Munn-og klovsyke (FMD) fremkalles av et Picornavirus

av slekten aphthovirus. Det er flere virale serotyper av munn- og klovsykevirus (FMDV) hvor den mest vanlige er identifisert ved serotypebetegnelsene A, 0 og C, og mindre vanlig identifisert som SAT-1, SAT-2, SAT-3 og ASIA-1.

Blant disse serotyper er flere subtyper og subtypestammer også blitt identifisert.' De etterfølgende er blant de identi-fiserte subtyper og subtypestammer: FMDV A, subtype 10,

stamme 61 og subtype 12, stammer 119, USA og Pirbright;

FMDV 0, subtype 1, stamme Kaufbeuren; og FMDV C, subtype 3, stamme Indaial.

FMDV er blitt beskrevet i detalj, se f.eks.

H. L. Backrach, i Beltsville Symposium on Agricultural Research, J. A. Romberger, Ed., Allanheld, Montclair, N.J.

(1977), s. 3-32; Annual Reviews of Microbiology, J22, 201

(1968). Den molekylære biologi for disse vira er blitt beskrevet, R. R. Rueckert, i Molecular Biology of Picorna-viruses, R. Perex-Bercoff, Ed. Plenum, New York, (1979), s. 113. Viruset har en molekylstørrelse på ca. 7 x 10^ dalton og inneholder et pluss-strenget RNA genom på ca. 8.000 nucleo-tider. Picornavirusproteiner.er blitt syntetisert i infiserte celler som en forløper av et protein som deretter bearbeides av cellulære og virus-kodede proteaser til fire hoved.capsidproteiner (VP^, VP2» VP3 og VP4) og utallige ikke-capside proteiner.

Når hele VP3~proteinet ble anvendt for å inokulere svin,, fremkalte dette en nøytraliserende antistoffrespons og beskyttet både svin og kveg mot infeksjon; [J. Laporte, et al., CR. Acad. Sei., 276: 3399 (1973); H. L. Backrach et al., J. Immunol., 115: 1636 (1975),. Se også US patent-skrift 4 140 763]. Basert på denne informasjon var Dennis G. Kleid, et al., Science, 214: 1125-1129 (4... des. 1981) i stand til å produsere en klonet viral proteinvaksine for munn-

og klovsyke som ga antistoffrespons i kveg og svin.

Det bemerkes at litteraturen på dette område gjør bruk av de samme navn for å henvise til forskjellige capsidproteiner. Således henviser således de angitte forskere i USA typisk til det capsidprotein som her og i Europa angis som VP-^, som VP^-capsidet. Det er imidlertid enighet om at capsidproteinet her referert til som VP-j^, og av andre som VP^, er det immunologisk aktive capsidprotein.

Rekombinante DNA-molekyler og fremgangsmåter for fremstilling av peptider med spesifisitet1 for munn- og klovsyke-virale antigener er beskrevet i britisk patentsøknad GB 2 079 288A, av 20. jan. 1982. Se også Boothroyd et al., Nature, 290: 800-802 (1981); Kleid et:al., Science, 214: 1125-1129 (1981), og EPO-publikasjon nr. 0 068 693 2A svarende til søknad nr. 82303040.8 innlevert 11.6.1982.

K. Strohmaier et al., Proe. 5th Int. Congress Virology, Strasbourg, 1981, har spaltet VP-^-proteinet (der angitt som VPThr^ me<^ enzymer såvel som cyanbromid og fremkalt nøytral-iserende antistoffer under anvendelse av disse spaltede peptidfragmentene. Disse forfattere antydet at aminosyre-restsekvensene ved stilling 146 til 155 og 200 til 213 fra proteinamino-enden induserte produksjon av immunologisk viktige antistoffer. Disse forfattere antydet også at aminosyre-restsekvenser ved stilling 141 til 145 og 155 til 161 var blant de regioner av inaktive, ikke-fremkallende peptider. Denne VP^-sekvens svarer til VP^-sekvensen som tidligere er beskrevet i USA, se forklaring av Meloen, A. H., J. Gen. Virol., 45:761-763 (1979).

En avhandling av Strohmaier et al., J. Gen. Virol., 59:295-306 (1982) tar i detalj for seg arbeidet rapportert ved den ovenfor angitte kongress, og gir en sammenheng mellom de forskjellige capsidprotein-nomenklaturer anvendt av forskere innen dette område. Denne avhandling gjentar de oppdagelser som ble rapportert på kongressen, nemlig at to cyanbromid-spaltingsprodukter angitt CB^ og CB2 og et enzym-spaltingsprodukt angitt A2 av VP^ som svarer til aminosyre-reststillinger 55-180, 181-213 og 146-213 fra amino-enden, induserte nøytraliserende antistoff. Denne avhandling gjentok også at regioner med overlapping med andre spaltingsprodukter, innbefattende regioner 141-145 og 155-161, tilsynelatende ikke hadde noen effekt. Forfatterne anga på side 303 at de antok det "sannsynlig at bare to små regioner er essensielle for den immuniserende styrke av proteinet".

Poliomyelitis (herefter polio) og Hepatitis A-virus

er også medlemmer, dvs. slekter av Picornavirusfamilien. Vellykkede vaksiner overfor poliovirus type 1, 2 og 3 er blitt anvendt siden 1950, mens ingen vellykket vaksine mot Hepatitis A er kjent.

Et av de særpregede trekk ved Picornavira er at de inneholder 4 capsidproteiner. Capsidproteinet angitt som VP.^ av poliotype 1, er blitt funnet å inneholde en antigen determinantregion som er i stand til,å indusere produksjon av antistoff som nøytraliserer viruset, selv om de spesifikke aminosyre-determinantregioner av VP^-capsidet hittil ikke er blitt funnet. Et spesifikt capsid av Hepatitis A-virus er hittil ikke blitt identifisert som ansvarlig for indusering av produksjon av nøytraliserende antistoff.

I det siste er antigener blitt erholdt på flere måter, innbefattende avledning fra naturlige materialer, kobling av et hapten til en bærer og ved rekombinant DNA-teknologi.

Sela, et al., Proe. Nat. Acad. Sei., USA, 68:1450-1455

(juli, 1971); Science, 166:1365-1374 '(desember 1960), Adv. Immun., 5:29-129 (1966) har også beskrevet visse syntetiske

i

antigener.

Antigener avledet fra naturlige materialer er det utallige antall av kjente antigener som oppstår naturlig, slik som blodgruppeantigener, HLA-antigener, differensier-ingsantigener, virale og bakterielle 1 antigener og lignende. Betydelige anstrengelser har vært gjort i det siste århundre når det gjelder identifisering og studier av disse antigener .

Visse "syntetiske" antigener er blitt fremstilt ved kobling av små molekyler til bærere slik som f.eks. okseserumalbumin, for således å gi antigener som vil bevirke produksjon av antistoff overfor de€ koblede lille molekyl. Bærer-molekylet er nødvendig da det lille molekyl i seg selv ikke vil bli "gjenkjent" av immunsystemet til det dyr i hvilket det ble injisert. Denne teknikk er også'blitt anvendt i isolerte tilfeller for å fremstille antigener ved kobling av peptidfragmenter av kjente proteiner til bærere, som beskrevet i den ovenfor angitte artikkel av Sela:et al.

Selv om denne hapten-bærerteknikk har tjent forskningen bra når det gjelder undersøkelser av arten av immunresponsen, har den ikke vært av vesentlig nytte for fremstilling av antigener som vil spille en rolle ved diagnostisk eller terapeutisk bruk. Årsaken til denne mangel er flere.

For å velge og konstruere en anvendbar antigen determinant fra et patogen ved denne1 teknikk må man først bestemme hele proteinsekvensen i patogenet for å ha en mulig sjanse til å lykkes. På grunn av vanskeligheten ved dette arbeide er det meget sjeldent, om overhodet noen gang, blitt gjort.

Klassisk fremstilles vaksiner ved innføring av drepte eller svekkede organismer i verten sammen med egnede hjelpestoffer for å initiere den normale immunrespons overfor organismen mens man helst unngår patogene virkninger av organismen i verten. Problemstillingen lider av velkjente begrensninger ved at det er knapt mulig å unngå den patogene respons på grunn av vaksinens kompleksitet som innbefatter ikke bare den antigene determinant av interesse, men mange beslektede og ubeslektede skadelige materialer og hvor et hvilket som helst antall av slike i enkelte eller alle indi-vider kan fremkalle en uønsket reaksjon i verten.

Eksempelvis kan vaksiner fremstilt på klassisk måte, innbefatte konkurrerende antigener som er skadelige for den ønskede immune respons, antigener som innbefatter ubeslektede immunresponser, nucleinsyrer fra organismen eller kulturen, endotoksiner og bestanddeler av ukjent sammensetning og fra ukjent kilde. Disse vaksiner, utviklet fra komplekse materialer, har ifølge sakens natur en relativt høy sannsynlighet for å fremkalle konkurrerende responser selv fra antigenet av interesse. I tillegg må slike kjente vaksiner overfor FMDV holdes avkjølt før bruk, og avkjøling i fjerne områder hvor vaksinene anvendes, er ofte vanskelig å oppnå.

Rekombinant DNA-teknologi har åpnet nye veier til vaksineteknologi som har den fordel at fremstillingen starter med et monospesifikt gen, men mye av denne fordel tapes imidlertid i virkelig produksjon av antigen i Escherichia coli eller andre mikroorganismer. I denne prosedyre innføres genmaterialet i et plasmid som deretter innføres i E. coli . som produserer det ønskede protein, sammen med andre meta-bolisme produkter, alle i blanding med næringsmediet. Denne problemstilling kompliseres ved den usikkerhet om hvorvidt det ønskede protein vil bli uttrykt i det transformerte E. coli.

Selv om ennvidere det ønskede protein kan fremstilles, er det en viss usikkerhet med hensyn til hvorvidt det kan høstes eller ikke, eller hvorvidt det vil bli ødelagt under vekstprosessen for E. coli. Det er f.eks. vel kjent at fremmede eller forandrede proteiner nedbrytes av E. coli. Selv om proteinet er tilstede i tilstrekkelige mengder til å være av interesse, må det fremdeles separeres fra alle de andre produkter fra metabolismen av E. coli, innbefattende slike skadelige substanser som uønskede proteiner, endotoksiner, nucleinsyrer, gener og ukjente eller uforutsigelige substanser.

Selv om det var mulig eller ble mulig ved hjelp av avanserte men nødvendigvis meget kostbare teknikker å separere det ønskede protein fra allé andre produkter fra E. coli-metabolismen, vil vaksinen fremdeles omfatte et intakt protein som kan innbefatte uønskede antigene determinanter, av hvilke enkelte er kjent for å initiere meget alvorlige, motsatte responser. Det er kjent at visse proteiner som kan betraktes som vaksiner, innbefatter en antigen determinant som fremkaller slike alvorlige kryss-referanser eller bivirkninger at anvendelse av materialet som en vaksine forhindres.

Det er også mulig under anvendelse av hybridom-teknologi å fremstille antistoff til virale genprodukter. Hybridomteknologien gjør det mulig at man starter med en kompleks blanding av antigener og fremstiller monospesifikke antistoffer senere i prosessen. I motsetning til dette er foreliggende oppfinnelse den motsatte prosess idet den starter med den endelige antigene determinant i høy renhet slik at nødvendigheten av rensing av det ønskede antigeniske produkt unngåes.

Hybridom-antistoff er kjent for å ha lav affinitet

og lav bindingskonstant, og har derfor begrenset verdi.

I hybridom teknologien må man ennvidere bygge på produksjonen av antistoff med celler som er maligne, med alle de medfølgende problemer med hensyn til !separasjonsteknikker, renhet og sikkerhet.

Hybridomproduksjon bygger på vevkultur eller innføring i mus, med det selvsagte resultat at produksjonen er kostbar og at det også er variasjon fra sats til sats.

I tillegg er det vanskelig å lage et hybrid til molekyler som omfatter bare en liten prosent av den komplekse blanding man må starte med.

Tidligere undersøkelser av Arnon et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 68:1450 (1971), Atassi, Immunochemistry, 12:423 (1975) og Vyas et al., Science 178:1300 (1972) er blitt utlagt av disse forfattere for å indikere at korte lineære aminosyresekvenser generelt lite trolig induserer antistoffer som er reaktive med den naturlige proteinstruktur. Det ble antatt at for de fleste områder av de fleste molekyler ble antigene determinanter fra aminosyrerester vel adskilt i den lineære sekvens, men tilpasset peptidene anvendt for å indusere antistoff, antatt å være kritiske i de fleste tilfeller, selv for de antigener som innbefatter aminosyrer nær hverandre i en sekvens. Lerner, et al., Cell 23:109-110,

(1981); Nature 287:801-805 (1980), oppdaget at antistoff til lineære peptider reagerer med naturlige molekyler. Detaljerte biosynteser ble således unødvendige, uøkonomiske og foreldede.

Til tross for tilgjengeligheten av inaktiverte eller svekkede virusvaksiner overfor munn- og klovsyke har det foreligget et stort økonomisk og praktisk behov for, og en stor teoretisk interesse for utvikling av en vaksine overfor munn- og klovsyke som vil være fri for de risikoer som hittil har vedheftet fremstilling og håndtering av FMDV som fremkaller sykdommen. Tilgjengeligheten av klonede, virale proteiner kan være et meget betydelig skritt forover fra de gamle og meget sjansefylte problemstillinger.

Det klonede, virale proteinvaksine-området bærer også med seg et utall ulemper, begrensninger og risikoer. Varia-.sjoner i biosyntesesystemet kan i seg selv fremkalle variasjon i proteinenes uttrykksformer og således påvirke renhet, utbytter, styrke etc, av antigenene. I tillegg vil nærvær av andre proteiner og vanskelige og ineffektive separasjoner antyde sjansen for at vaksiner fremstilt via den klonede virale proteinprosedyre ikke vil være monospesifikke. Således er renhet, styrke og sikkerhet hovedproblemer med prod-uktene avledet fra denne teknologi.

Til tross for at den generelle prosedyre for fremstilling av syntetiske antigener, ut fra, enten en kjent peptidsekvens eller fra et genom har vært beskrevet, og til tross

i

for at syntesen av peptider med egnet lengde for anvendelse i antigene materialer nå er relativt godt kjent, er det fremdeles et meget stort område innen antigen-antistoff-teknologien som fortsatt er uløst. Selv om det foreligger enkelte retningslinjer og enkelte antagelser når det gjelder mulige antigene sekvenser er området fremdeles preget av spekulasjon og av "forsøk og feile"-metoder. Selv med erkjennelsen om at en lang sekvens kia<n> inneholde antigent aktive bestanddeler, er det fremdeles stor usikkerhet og spekulasjon med hensyn til hvorvidt alt eller bare en del av sekvensen er nødvendig for å fremkalle antigenisitet, og hvorvidt eller ikke en mindre del av sekvensen vil være av større eller mindre antigenisitet.

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt antigent peptid som har følgende aminosyrerestsekvens skrevet fra venstre mot høyre og i retning fra amino-enden til carboxy-enden: TyrAsn(Asp eller Thr)Gly(Phe)Glu(Thr)Cys(Ser eller Asn eller Thr)Arg(Lys eller Thr)TyrAsn(Ala eller Ser eller Thr)Arg

(Val eller Ala eller Asn eller Thr)Asn(Gly eller Ser)Ala (Asp eller Gly)Val(Ser eller Gin eller X)Pro(Gly eller Y) Asn(Z)Leu(Arg eller Val)Arg(Ser eller Ala)GlyAspLeu(Met eller Phe)Gin(Gly)Val(Thr eller Ser eller,His)Leu(Ile)AlaGln

(Ala eller Pro)Lys(Arg eller Ala)Val(His)Ala(Val)Arg(Thr eller Lys)Thr(Gin eller His)LeuPro og eventuelt Ala, og eventuelt inneholdende ytterligere to Cys-rester knyttet til hver sin ende av peptidene, hvori hver av aminosyre-

restene samt symbolene X, Y eller Z;i parentes indi-

viduelt kan erstatte den tilstøtende aminosyrerest umiddelbart

til venstre for parentesen, og hvor X og/eller Y og/eller Z i peptidaminosyre-restsekvensen uavhengig angir fraværet

av en aminosyrerest i stillingen av den tilstøtende aminosyrerest umiddelbart til venstre for parentesen, hvorved peptidets lengde forkortes med 1, 2 eller 3 aminosyrerester,

Det fremstilte antigene peptid inneholder en sekvens på ca. 20 aminosyrerester svarende til en aminosyre-rostsekvens fra stilling 130 til 160 fra amino-enden av FMDV VP^capsidproteinet, og nærmere bestemt fra stilling 141 til 160. Når dette peptid kjedes til en albuskjell-hemocyanin-bærer som et konjugat og innføres i en effektiv mengde som en vaksine i et vertsdyr, er det i stand til å fremkalle produksjon av antistoff i verten som immunoreagerer med munn- og klovvirus og beskytter verten mot infeksjon fremkalt av dette virus.

De syntetiske, antigene peptider fremstilt ifølge oppfinnelsen, kan anvendes sammen med fysiologisk akseptable fortynnings-midler slik som vann og/eller hjelpestoffer i en vaksine som er i stand til å beskytte dyr mot Picornavirus-fremkalte sykdommer slik som munn- og klovsyke.

Den mer særlig foretrukne munn- og klovsyke-relatérte peptidaminosyresekvens svarende til stillinger rundt 141 til rundt 160 fra amino-enden, starter ved amino-enden med Val(Ser eller Gin eller X)-resten ved stilling 141 i den ovenfor angitte sekvens.

Analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjenne-tegnet ved at en utgangsaminosyreharpiks fremstilles ved forestring av Boc-AA-OH til er. harpiks hvori AA betegner den relevante aminosyre, hvoretter det foretas en suksessiv kopling av Boc-AA-OH under anvendelse av sidekjedebeskyttende grupper, den beskyttede polypeptidharpiks behandles med flytende HF for å fjerne de beskyttende grupper og spalte polypeptidet fra harpiksen, hvoretter det spaltede, ubeskyttede polypeptid ekstraheres med fortynnet syre, hvoretter, om ønsket, det erholdte polypeptid koples til en proteinbærer, og, om ønsket, at det erholdte peptid oxyderes. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer mange fordeler, i særdeleshet når det gjelder anvendelse av peptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen i vaksiner mot Picornavirus-fremkalte sykdommer og i diagnose for bestemmelse av nærvær av disse sykdommer eller vira i dyr, innbefattet mennesket.

En iøynefallende fordel er at de syntetiske peptider kan tilveiebringe en del av en vaksine som beskytter dyrene mot disse sykdommer.

En særlig fordel er at vaksiner fremstilt under anvendelse av et syntetisk peptid, ikke behøver å nedkjøles før administrering for å oppnå effektiv vaksinering.

Ytterligere fordeler vil fremgå fra den etterfølgende detaljerte beskrivelse, eksempler og krav.

Kort beskrivelse av tegningene

I tegningene som utgjør en del ,av foreliggende beskrivelse, viser

fig. 1, 8 aminosyre-restsekvenser ved aminosyre-reststillinger 130-160 av VP^-capsidet fra munn- og klovsykevira, under anvendelse av den vanlige tre-bokstavskode for hver aminosyrerest. Sekvensene leses fra venstre mot høyre og i retning fra amino-enden mot carboxy-enden. Numrene 130, 140, 150 og 160 representerer aminosyre-reststillinger i forhold til amino-enden .av virus av Tubingen type 0, subtype 1, stamme Kaufbeuren, (Olk), med aminosyre-restsekvensene av de gjenværende vira VP^-capsider justert ved innbefattelse av én eller flere bindestreker slik at sammenhengen mellom disse sekvenser er mer tydelig. Forkortelsene for vira i tillegg til Olk er som følger: 01c = type 0, subtype 1, stamme Campos; A10 = type A, subtype 10, stamme 61; A12 = type A, subtype 12, stamme 119, A24 = type A, subtype 24; A2 7 = type A, subtype 27; A79 = type A, subtype 79; og C3 = type C, subtype 3, stamme Indaial.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

I. Generell diskusjon

Foreliggende oppfinnelse ligger i den oppdagelse at

en bestemt, relativt kort syntetisk peptidsekvens ganske uventet og overraskende er ekstremt aktiv antigen. Det syntetiske peptid inneholder en aminosyre-restsekvens på ca. 20 syrer i lengde. Peptidets aminosyre-restsekvens svarer minst til én aminosyrerest av et område på det antigene Picornavirus capsidprotein som er lokalisert i en distanse lik 60 til 75% av den totale aminosyre-restsekvenslengde av det antigene capsidprotein som målt fra amino-enden derav. Det syntetiske peptid inneholder en fra nøytral til positiv ionisk ladning, eksklusiv ioniske ladninger tilstedeværende på grunn av nærvær av amino- og/eller carboxyl-endegrupper.

I tillegg er syntetiske antigener innbefattende de senere beskrevne peptidsekvenser monospesifikke overfor spesifikke serotyper, subtyper og stammer av Picornavira slik som munn- og klovsykevirus, og er også polyspesifikke, om enn i mindre grad, overfor et flertall av serotypene, subtypene og stammene av disse vira.

Syntetiske peptider tilknyttet det Picornavirus som fremkaller munn- og klovsyke (FMD), vil bli diskutert som eksempler på syntetiske peptider som kan fremstilles. Spesifikke aminosyresekvenser svarende til aminosyre-reststillinger i FMDV VP-^-capsidet, angår bare dette virus.

I særdeleshet er det funnet at et syntetisk peptid inneholdende ca. 20 aminosyrer svarende til aminosyrerestsekvesen av stillinger rundt 130 til 160, og spesielt stillinger rundt 141 til 160 fra amino-enden av FMDV VP^-proteinet slik som det fra Tvibingen type 0, subtype 1, stamme Kaufbeuren, har meget høyere antigen effektivitet og aktivitet enn hva som er blitt antatt eller forutsatt fra tidligere undersøkelser. Et peptid fremstilt ifølge oppfinnelsen, alene, i rettkjedet eller cyclisk ringstruktur, som en polymer med peptidenheter kjedet med oxyderte cysteinrester av tilstøtende peptider, eller som et konjugat kjedet til en bærer, er en kraftig immunologisk reaktor (antigen) for munn- og klovsyke, hvilket vil bli diskutert i detalj i det etterfølgende.

Angivelsene "rundt stilling 130 til rundt stilling 160" og "rundt stilling 141 til rundt stilling 160" fra amino-enden og lignende fraser, er anvendt her. Disse aminosyre-reststillinger bestemmes i forhold itil referansen VP^-capsidprotein av type 0, subtype 1, stamme Kaufbeuren FMDV.

Det skal bemerkes at enkelte forskere innen området slik som Kleid et al. i EPO-publikasjonsnr. 0 068 693 A2,

i

har forskjøvet stillingene av aminosyrerester i 130-160-regionen av VP^-(VP^, tidligere diskutert) capsidproteinet med et aminosyre-stillingsnummer mot carboxy-enden i forhold til de stillingsnummere som her er angitt på grunn av nærvær av en ytterligere aminosyre (Val) etter Asp-53 i sekvensen av typen C, subtype 3, VP^-capsid, hvor de andre capsider ikke inneholder noen aminosyrerest. Følgelig fremkommer aminosyren ved en gitt stilling slik som 140 her som aminosyren ved stilling 141 i den ovenfor angitte EPO-søknad. Det er-således erkjent innen faget en forskjell på én eller flere aminosyrestillinger når forskjellige forskere angir sekvenser av det samme proteinmolekyl.

Capsidproteiner fra enkelte munn- og klovsykevira inneholder i tillegg ingen aminosyrerest ved én eller flere stillinger av 130-160-området i forhold til type VP^ av type 0, subtype 1, stamme Kaufbeuren som vist i fig. 1 og angitt ved bokstavene-"X", "Y" og "Z" i sekvensen av formel I. I lys av nærværet av slike strykninger eller utelatelser har enkelte forskere angitt aminosyrestillinger som bestemt ut fra proteinet eller et DNA-molekyl som koder dette protein, uten å gjøre rede for utelatelsene. Andre forskere illustrerer sammenhengen mellom VP-^-capsidene ved å indikere aminosyre-utelatelser med bindestreker, bokstaver eller andre indekser og nummererer de gjenværende aminosyre-reststillinger som om de utelatte rester var tilstede, hvilket er gjort her. Således foreligger det en ubetydelig variasjon innen faget når det gjelder å angi aminosyrestillinger.

Således er ordet "rundt" som anvendt i de ovenfor angitte uttrykk, ment å indikere at aminosyre-restsekvensen kan starte eller slutte ved en aminosyrerest opptil 3 rester på hver side av de angitte stillinger for å muliggjøre variasjonen av én til to stillingsnummere som angitt innen faget for en gitt aminosyrerest i en hvilken som helst bestemt peptidsekvens, og hvor man også tar i betraktning det faktum at visse aminosyrerester er utelatt i enkelte VP^-capsidproteiner.

Som tidligere angitt, er det flere typer, subtyper og stammer av FMDV. Av referansehensyn vil de her beskrevne peptidsekvenser bli diskutert under henvisning til VP^-proteinet fra en bestemt type, subtype og stamme; nemlig Tubingen type 0, subtype 1, stamme Kaufbeuren av FMDV, også angitt her som type 0, subtype 1, stamme Kaufbeuren og Olk. Ved anvendelse av aminosyresekvensen av ett bestemt FMDV-protein som referanse, beskrives således andre anvendbare peptidsekvenser som inneholder substituerte eller utelatte aminosyrerester ved bestemte lokaliseringer langs peptid-kjeden.

Peptidsekvenser fra VP^-capsidproteinet av 8 FMD-vira ved stillinger rundt 130 til rundt 160 er vist i fig. 1, under anvendelse av nummereringssystemet for referanseproteinet type Olk. Syntetiske, fortrinnsvis vannløselige, peptider som hver inneholder rundt 20 aminosyrer, med aminosyre-restsekvenser som svarer til eller hovedsakelig svarer til aminosyre-restsekvensene vist i fig. 1 og som oppfyller enhets-testbetingelsen som senere angitt, taes i betraktning.

Et foretrukket peptid med en aminosyre-restsekvens som svarer til aminosyre-reststillinger på rundt 130 til 160, lest fra venstre mot høyre og i retning fra amino-enden til carboxy-enden, er vist i formel I:

Formel I

hvori hver av aminosyrerestene X, Y eller Z i parentes kan uavhengig erstatte den tilstøtende;aminosyrerest umiddelbart til venstre for parentesen; dvs. aminosyreresten nærmere amino-enden;

X og/eller Y og/eller Z i peptidamino-syrerestsekvensen angir uavhengig fravær av en aminosyrerest i stillingen for den til-støtende aminosyrerest umiddelbart til venstre for parentesen (nærmere amino-enden) hvorved peptidlengden forkortes med 1, 2 eller 3 aminosyrerester, og

tallene i parentes over de ovenfor angitte bestemte aminosyrerester i sekvensen illustrerer stillinger av den bestemte aminosyrerest fra amino-enden av VP^-capsidproteinet av Tiibingen type 0, subtype 1, stamme1 Kaufbeuren FMDV. Disse tallangivelser er angitt av referansegrunner.

Den mere foretrukne sekvens svarende til stillinger rundt 141 til 160 av VP^-capsidproteinet, starter ved amino-enden med Val(Ser eller Gin eller X)-resten ved stilling 141

i formel I.

Poly-spesifisitet og kryssreaktivitet blant typer, subtyper og stammer av FMDV-slekten forbedres ved anvendelse av et antigent peptid hvis aminosyre-

restsekvens svarer til en aminosyre-restsekvens av i det minste mer enn én stamme, og fortrinnsvis mer enn én subtype

eller serotype av FMDV-slekten. Aminosyre-restsekvensen av et slikt peptid behøver ikke å tilsvare hovedsakelig aminosyre-restsekvensen av ethvert virus, men kan ikke desto mindre når det inokuleres som en vaksine i en dyrevert, fremkalle produksjon av antistoffer som immunoreagerer med

et flertall av virustyper, subtyper eller stammer og beskytter verten mot mer enn ett av disse vira.

Et poly-spesifikt peptid hvis aminosyre-restsekvens svarer til en aminosyre-restsekvens på minst mer enn én stamme av FMDU, kan ha den aminosyre-restsekvens som er vist i formel 1 hvori én eller flere i parentes angitte aminosyrerester, X, Y eller Z erstatter den tilstøtende aminosyrerest umiddelbart til venstre for parentesen, dvs. den til-støtende aminosyrerest mot amino-enden. Substitusjoner og utelatelser i området av aminosyre-reststillingene rundt 141 til 155 er foretrukne for å oppnå poly-spesifisitet i et peptid med en enkel aminosyre-restsekvens. Et slikt poly-spesifikt peptid kan fremstilles og anvendes på samme måte som et hvilket som helst annet peptid ifølge oppfinnelsen.

Uttrykket "tilsvarer hovedsakelig" i dets forskjellige grammatikalske former anvendes her og i kravene i forhold til peptidsekvensene relatert til Picornavira for å angi den beskrevne peptidsekvens pluss eller minus opptil 3 aminosyrerester ved enten den ene eller begge av amino- og carboxy-endene og inneholdende bare konservative substitusjoner i bestemte aminosyrerester langs peptidsekvonsen. Uttrykket "tilsvarer" i dets forskjellige grammatikalske former anvendes her og i kravene i forhold til peptidsekvenser relatert til Picornavira for å angi den beskrevne peptidsekvens pluss eller minus opptil 3 aminosyrerester ved enten den ene eller begge av amino- og carboxy-endene og inneholdende konservative såvel som radikale substitusjoner i bestemte aminosyrerester pg også inneholdende utelatelser eller tilføyelser av bestemte aminosyrerester langs peptidsekvensen.

Uttrykket "konservativ substitusjon" som anvendt ovenfor, er ment å angi at en aminosyrerest er blitt erstattet med en annen biologisk lik rest. jEksempler på konservative substitusjoner innbefatter substitusjon av en hydrofob rest slik som Ile, Val, Leu eller Met med en annen, eller substi-sjon av en polar rest med en annen slik som mellom Arg og Lys, mellom Glu og Asp eller mellom Gin og Asn, og lignende.

I enkelte tilfeller er erstatning av en ionisk rest med en motsatt ladet ionisk rest slik som Asp med Lys blitt angitt som konservativ innen faget ved at disse ioniske grupper bare er antatt å tilveiebringe oppløselighetsassistanse. Da de her diskuterte erstatninger generelt1 foretas på relativt korte syntetiske peptidantigener sammenlignet med et helt protein, vil en erstatning av en ionisk rest med en annen ionisk rest med motsatt ladning her bli betraktet som "radikal erstatning" slik som erstatninger mellom ikke-ioniske og ioniske rester, og massive rester slik som Phe, Tyr og Trp og mindre massive rester slik som Gly, Ile og Val.

Uttrykkene "ikke-ioniske" og "ioniske" rester anvendes her i deres vanlige betydning for å angi de aminosyrerester som normalt enten ikke bærer noen ladning eller normalt bærer en ladning ved fysiologiske pH-verdier. Eksempler på ikke-ioniske rester innbefatter Thr og Gin, mens eksempler på ioniske rester innbefatter Arg og Asp.

Den ovenfor angitte sekvens vist i formel I og den kortere, mer foretrukne syntetiske sekvens svarende til stillinger rundt 141 til 160 av FMDV VP^capsidet, innbefatter et stort antall av individuelle peptider, og hvor hvert av disse, med rundt 20 aminosyrerester i lengde, er et peptid fremstilt ifølge oppfinnelsen. Eksempelvis kan syntetiske peptider fremstilt med en amino-eride som starter ved stilling 141 av capsidet, starte med en Val-, Ser-eller Gln-amino-enderest.

Når i tillegg amino-ende-aminosyre-reststillingen er representert ved X som indikerer fravær av aminosyreresten umiddelbart til venstre for parentesen i formel I, kan peptidamino-enden starte med aminosyreréstene Pro, Gly eller Y av capsidstilling 142 hvori Y uavhengig betegner fravær av Pro og Gly slik at peptidamino-enden begynner med aminosyreresten svarende til stilling 143 i Olk istedenfor stillingene 141 eller 142. Ytterligere undersøkelser av formel I viser at resten i capsidstilling 143 kan være Asn eller Z og derved også være fraværende.

Således kan et peptid hvis sekvens svarer til capsid-stillinger rundt 141 til 160, begynne ved capsidstilling 141. Som tidligere angitt, kan peptidsekvenser som svarer til

en beskrevet sekvens, ha pluss eller minus opptil 3 amino-enderester ved hver ende. Det ovenfor beskrevne peptid hvis aminosyresekvens virkelig starter ved stilling 144 i forhold til Olk VP^-capsidproteinet, er blant de hvis sekvenser er "minus opptil 3 aminosyrerester ved den ene eller begge av amino- og carboxy-endene".

Peptider som er omfattet av oppfinnelsen, er innbefattet i regionen rundt 130 til 160 av type 0, subtype 1, stamme Kaufbeuren og type A, subtype 12, stamme 119 FMDV-proteiner (uttrykt under anvendelse av type 0-stillingsnummerering og angitt som hhv.Olk og A12) og de tilsvarende regioner av type C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 og ASIA-1. To eksempler på slike peptider er vist i det etterfølgende under anvendelse av Olk-virus-stillingsnummerering, og med en bindestrek for å angi en utelatt aminosyrerest.

Eksempel 1

Det er også blitt fastslått at aminosyre-restsekvensen av capsidregionen rundt 141 til rundt 160 er enestående og høyst uventet antigent aktiv og kraftig som diskutert i detalj i det etterfølgende.

Peptider med en sekvens på ca.< 20 aminosyrer, innen regionen rundt 130 til 160, og i særdeleshet i regionen rundt 141 til 160, til hvilke en Cys- eller annen aminosyre som en amino- eller carboxy-ende kan være tilsatt for å muliggjøre binding ved covalent binding ved et ytterligere syntesetrinn til en bærer, f.eks. et albuskjell-hemocyanin (KLH)

hvis en bærer skal anvendes, er én utførelsesform,

såvel som de ovenfor angitte peptider med variasjon i peptidlengde eller substitusjoner eller utelatelser når det gjelder individuelle aminosyrer som ikke ødelegger eller vesentlig forandrer den særpregede og kraftige antigenisitet som utvises av de FMDV mono-spesifikke og poly-spesifikke syntetiske antigene determinantpeptider fremstilt ifølge oppfinnelsen.

Disse sekvenser, adskilt fra andre antigent aktive eller antigent maskerende sekvenser, utgjør en utførelsesform i en annen form. Antigener omfattende mer enn én av de foregående antigent aktive sekvenser, adskilt fra antigent interferer-ende eller maskerende sekvenser, kjemisk forbundet eller blandet med hverandre, utgjør en annen form. Antigener omfattende en bærer til hvilken én eller flere av de foregående antigent aktive aminosyresekvenser er bundet, utgjør en ytterligere utførelsesform.

Ved betraktning av foreliggende oppfinnelse er det

viktig å erkjenne følgende definisjon av de antigent aktive aminosyre-restsekvenser som betraktes som én utførelsesform. F.eks. er den sekvens som svarer til1 stilling 141 til 160

av type 0, subtype 1, stamme Kaufbeuren fra venstre mot høyre i retning fra amino- til carboxy-ende

ValProAsnLeuArgGlyAspLeuGlnValLeuAlaGlnLysVal AlaArgThrLeuPro

når denne er adskilt fra andre peptider, gen-fragmenter, aminosyre og aminosyresekvenser som er tilbøyelige til å maskere eller interferere med eller kryssreagere eller komplisere den antigene effekt av peptidet, en spesifikk utførelsesform. Selv om man således kan finne den spesi-

fiserte sekvens som en 'del av et stort protein eller større

peptid inneholdende f.eks. ca. 30 aminosyrer eller mer, utgjør slike større materialer ikke noen del av oppfinnelsen fordi et protein eller et større peptid ikke vil utvise aktiviteten, den uvanlige og uventede høye grad av hovedsakelig monospesi-fikk antigen aktivitet som utvises av et ca. 20 aminosyre langt peptid fremstilt ifølge oppfinnelsen.

Uttrykket "FMDV mono-spesifikk syntetisk antigent determinantpeptid" angir det bestemte peptid spesifisert som ovenfor beskrevet resulterende fra en kjemisk syntese som eli-minerer muligheten for fragmenter av gener, proteiner eller peptider, eller enhver aminosyreforbindelse som stammer direkte eller indirekte fra FMDV og fri for peptid eller aminosyresekvenser som ville kunne interferere med eller forandre den monospesifikke antigene aktivitet av det spesifiserte peptid når det gjelder å fremkalle antistoffproduksjon overfor FMDV i dyr. Det skal bemerkes at selv om uttrykket "mono-spesifikk" anvendes her, utviser de individuelle peptider poly-spesifikk antigen aktivitet med et flertall av FMDV-typer, subtyper og stammer. Denne brede spesifisitet finnes i særdeleshet hvor en radikalsubstitusjon foretaes i et peptid hvis sekvens ellers tilsvarer hovedsakelig eh aminosyre-restsekvens av et bestemt FMDV-capsid og den radikalt substituerte aminosyrerest er en rest som finnes ved substi-sjonsstillingen i en annen viral stamme. Anvendelse av uttrykket "mono-spesifikk" er således en kort beskrivelse (i stenografistil) for den bredere spesifisitet av peptidene ifølge oppfinnelsen.

Når de syntetiske, antigene peptider fremstilt ifølge oppfinnelsen, alene i rettkjedet eller cyclisk ringform, som en polymer hvori tilstøtende peptidrepeterende enheter er bundet sammen med oxyderte cysteinrester, eller som et konjugat kjedet til en bærer, innføres i en effektiv mengde som en vaksine i en dyrevert, er disse typisk i stand til å indusere produksjon av antistoffer i verten som immunoreagerer med det relaterte Picornavirus og beskytter verten mot infeksjon fremkalt av dette Picornavirus. Imidlertid kan et peptid fremstilt ifølge oppfinnelsen ytterligere defineres ved en enhetstest av dets antigene karakteristika som er uavhengig av den form i hvilken peptidet endelig anvendes, dvs. i rettkjedet, cyclisk ringform, i polymerform eller kjedet som et konjugat. Ifølge denne enhetstest er et peptid i rettkjedet form og når det er kjedet til en albuskjell-hemocyanin-bærer som et konjugat og. innført i en effektiv mengde som en vaksine i et vertsdyr, i stand til å indusere produksjon av antistoff som immunoreagerer med dets relaterte Picornavirus og beskytter verten mot dette virus. Mengdene av peptid og bærer, dg de- spesifikke reaksjons-betingelser for konjugatreaksjonen og vaksinefremstilling, er gitt i Bittle et al., Nature, 298:30-33 (juli, 1982).

En vaksine omfatter en effektiv mengde av et peptidantigen som kan alene tjene som vaksinen når ,det er til stede med et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel slik som vann eller saltvann. Vaksinen kan innbefatte en bærer som kan være hvilke

i som helst av de utallige bærere slik som albuskjell-hemocyanin-bærer (KLH), tetanus toxoid, poly-L-(Lys:Glu), peanøtt-agglu-tinin, ovalbumin, soyabønne-agglutinin, okseserumalbumin (BSA) og lignende, til hvilke det FMDV mono-spesifikke syntetiske antigene determinant-peptid kjedes. En polymer fremstilt ved kjeding av et flertall av peptider fremstilt ifølge oppfinnelsen gjennom ende-til-endekjeding av oxyderte cystein-endegrupper, kan også omfatte en exogen bærerfri vaksine sammen med et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel. I hvert tilfelle virker peptidet som den spesifikke antigene determinant.

Den "effektive mengde" av antigent peptid avhenger av et utall faktorer. Innbefattet blant disse faktorer er kroppsvekt og art av den dyrevert som skal beskyttes, bæreren når slik anvendes, hjelpestoff når et slikt anvendes, antall inokuleringer som ønskes å bli utført, og varigheten av den ønskede beskyttelse for dyret. Individuelle inokuleringer inneholder typisk ca. 20 yg antigent peptid til 2 mg, eksklusiv enhver bærer til hvilken peptidet kan være bundet.

Når den antigene vaksine innføres i den ønskede vert, initierer den produksjonen av antistoff i verten overfor det ovenfor angitte antigene peptid og o<y>erfor det relaterte Picornavirus slik som FMDV. Vaksiner .inneholdende effektive mengder av peptidene, initierer ikke bare produksjon av antistoffer i verten, men disse antistoffer produseres i en tilstrekkelig mengde til å beskytte dyreverten mot infeksjon med FMDV eller annet Picornavirus. Beskyttelse av verten kan bestemmes ved nivået av nøytraliserende antistoff som dannes og/eller den nøytraliserende indeks, som diskutert nærmere i det etterfølgende.

Det tas også i betraktning antigener hvori alt eller en del av hele bæreren er antigen. Således kan en separat bærer-del anvendes eller ikke anvendes. Det syntetiske antigen dannet ved kjeding av det FMDV mono-spesifikke, syntetiske antigene determinant-peptid til en antigenbærer såvel som metoder for fremstilling av slike syntetiske antigener, er spesifikke sider ved oppfinnelsen.

Generelt kan det syntetiske antigen dannes ved fremstilling av det Picornavirus-relaterte peptid slik som et

FMDV mono-spesifikt syntetisk, antigent determinant-peptid, som immunologisk svarer til eller hovedsakelig svarer til antigene determinanter av FMDV, og kobling av den syntetiske determinant til en farmasøytisk akseptabel bærer i et separat syntesetrinn.

Ved fremstilling av vaksiner omfatter metoden syntetisering av FMDV mono-spesifikt syntetisk, antigent determinant-peptid som antigent . er dubletten eller hovedsakelig dubletten av spesifisert determinantdel av FMDV VP^-proteinet. Det syntetiske peptid kan, men behøver ikke alltid være,

kjedet til en bærer under dannelse av et antigen hvori anti-genisiteten er den av det FMDV mono-spesifikke antigene determinant-peptid og som, når dette innføres i en vert sammen med et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel, initierer produksjon av antistoff overfor FMD-viruset.

Som en metode for fremstilling av antistoff injiseres den ovenfor beskrevne vaksine i en vert, og antistoffer dannet i verten overfor proteinantigenet høstes fra vertens væsker for anvendelse i konvensjonelle diagnostiske prosedyrer for å påvise nærvær av proteinantistoffet eller som terapeutiske midler for passiv immunoprofylakse.

II. Peptidsyntese

Peptider diskutert i det etterfølgende, ble syntetisert under anvendelse av kjente prosedyrer. [Se f.eks. Marglin, A. og Merrifield, R.B., Ann. Rev. Biochem., 39:841-866 (1970.)]. Peptidene ble koblet til proteinbæréren KLH gjennom en cysteinrest som typisk ble tilsatt til carboxy-enden av peptidet med mindre annet er angitt. Det syntetiske bindings-trinn av peptidet til proteinbæréren ble om ikke annet er angitt, utført ved addisjon av cystein-svovelatomet til dobbeltbindingen av reaksjonsproduktet mellom bæreren og N-maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimidester (MBS), ved å følge den generelle prosedyre som er beskrevet av Lieu et al., Biochemistry, 18:690-697 (1979).

Et lavmolekylært, sannsynligvis cyclisk peptid, ble fremstilt ved syntetisering av et peptid med aminosyresekvensen av Olk VP^ ved stillinger' 141-160 (fig. 1) og addering av cystein-(Cys) rester ved både amino- og carboxy-endene (diCys-peptid). Deretter ble 10 mg. av diCys-peptidet (inneholdende Cys-rester i ikke-oxydert form) oppløst i 2 50 ml 0,1 molar ammoniumbicarbonatbuffer i et begerglass. Det oppløste diCys-peptid ble derefter luftoxydert ved forsiktig omrøring av den resulterende løsning i 18 timer. Efter dette tidspunkt indikerte en Ellman-reaksjon nærvær av ikke noe fritt mercaptan. [Ellman,, Arch. Biochem. Biophys., 82:70-77 (1959)].

Den erholdte løsning ble frysetørket. Det således fremstilte tørkede materiale, og here.fter angitt som det cycliske peptid eller cycliske ringpeptid, har den tidligere angitte aminosyresekvens for stillinger 141-160 av Olk VP^-capsidet antatt å være bundet sammen ved amino-ende til carboxy-ende med oxyderte cysteinrester, dvs. med én cysteinrest inneholdende en disulfidbinding. To eller flere diCys-peptider kan også bindes sammen under dannelse av det cycliske ringpeptid.

To polymere peptider ble også fremstilt fra det ovenfor angitte peptid inneholdende ikke-oxyderte Cys-rester ved begge peptid-ender (diCys-peptid) og bundet til disse ender med peptidamidbindinger. Disse polymere peptider er her-

etter angitt som polymere peptider A og B.

Polymert peptid A ble fremstilt fra diCys-peptidet

ved oppløsning av dette peptid i en konsentrasjon på 5 mg pr. ml i den ovenfor angitte ammoniumbicarbonatbuffer. Luftoxydasjon som ovenfor beskrevet, ga et materiale som ikke hadde noe fritt mercaptan ved Ellman-reaksjonen. Reak-sjonsløsningen inneholdt ikke noe partikkelformet materiale etter oxydasjon og ble frysetørret under dannelse av polymert peptid A i tørr form.

Polymert peptid B ble fremstilt i samme buffer med samme oxydasjonsbetingelser som polymert peptid A og det cycliske peptid. Her var imidlertid konsentrasjon av diCys-peptid anvendt under oxydasjonen, 2 3,4 mg pr. 1,2 ml buffer. Ikke noe fritt mercaptan ble observert ved Ellman-reaksjonen efter oxydasjonsreaksjonen, men en liten mengde tilstedeværende bunnfall i reaksjonsblandingen ble observert. Reaksjonsblandingen ble frysetørket under dannelse av polymert peptid B, innbefattende bunnfallet.

Hvert av de ovenfor fremstilte, tørkede, faste materialer (cyclisk peptid og polymere peptider A og B) ble anvendt uten ytterligere rensning. Vaksiner ble fremstilt fra disse tørrede, faste materialer ved suspendering av disse i Freunds fullstendige hjelpestoff ved konsentrasjoner tilstrekkelig til å gi lOOyug peptid pr. inokulering.

III. Immuniseringer

A. Inokuleringer

Vaksinene anvendt her, inneholdt den angitte mengde av peptid alene, i rettkjedet eller cyclisk form, som en polymer av individuelle peptider kjedet gjennom oxyderte cysteinrester (cystin) eller kjedet til en bærer. De angitte mengder av peptider refererer til vekten av peptidet uten vekten av en bærer, når en bærer ble anvendt.

Vaksinene inneholdt også et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel slik som vann eller saltvann, og innbefattet ennvidere typisk et hjelpestoff. Freunds fullstendige hjelpestoff (CFA) og Freunds ufullstendige hjelpestoff (IFA) er materialer som er velkjente innen faget og som er kommersi-elt tilgjengelige fra flere kilder. Saponin, et plante-produsert glycosid, er også et velkjent hjelpestoff, som en 5%-ig løsning, og ble her anvendt sammen med aluminiumhydroxyd.

Vaksine-lagerløsninger ble fremstilt med IPA eller

CFA som følger: En mengde av det syntetiske peptid, polymere peptid eller konjugat tilstrekkelig:til å tilveiebringe den ønskede mengde av peptidet pr. inokulering, ble oppløst i fosfatbufret saltvann (PBS). Like volumer av CFA eller IFA ble deretter blandet med peptidløsningen under dannelse av en vaksine inneholdende peptid, vann og hjelpestoff hvori vann-til-olje-forholdet var 1:1. Blandingen ble deretter homogenisert under dannelse av en vaksine-lagerløsning.

Vaksine-lagerløsninger ble fremstilt med saponin-aluminiumhydroxyd som følger: Aluminiumhydroxyd i en mengde på 10 mg pr. ml ble suspendert i en>vandig 0,85%-ig løsning av natriumklorid. En mengde av det syntetiske peptid, polymere peptid eller konjugat tilstrekkelig til å tilveiebringe den ønskede peptidmengde pr. inokulering efter en for-tynning til 20% ble blandet med aluminiumhydroxydsuspensjon og fikk absorbere inn i aluminiumhydroxydpartiklene i 2 til 3 timer. En del av den således fremstilte suspensjon ble deretter fortynnet med 4 deler av eh på forhånd fortynnet saponinløsning under dannelse av lagerløsningen av vaksinen hvori saponinet var tilstede i 0,125 vekt%.

Preliminært ble screeningsbestemmelser foretatt ved enzym-kjedet immunosorbentbestemmelse (ELISA) som diskutert av Bittle et al., Nature, 298:30-33.(juli, 1982), hvori peptid-antipeptid-antistoff-immunoréaksjoner ble målt. • Viral-nøytralisasjonsindeksmålinger som måler viral inaktivering ved immunoreaksjoner mellom fremkalte antistoffer og levende viruspartikler, ble også utført som'beskrevet av Bittle et al. Ytterligere detaljer med hensyn til de anvendte teknikker og de her erholdte resultater og beslektet med arbeider med FMDV kan finnes i Bittle et al.

i

B. Antistoffer overfor peptider homologe med bestemte FMD- vira

Responser på forskjellige peptidregioner av VP^ av FMDV-type 0, subtype 1, stamme Kaufbeuren, er gitt i

tabell 1. Disse data angir antistoffresponser i kaniner under anvendelse av konvensjonelle protokoller og illustrerer nøytralisering av et FMD-virus inneholdende en aminosyresekvens homolog med den av det anvendte peptid for immuniser-ingen. (Fordetaljer se Lerner et al., U.S. patentsøknad 248 059 innlevert 27. mars 1981, og Bittle et al., supra).

Det skal fremheves at nøytraliseringsindeksene for peptidene med aminosyre-restsekvensen av 141-160-regionen i tabell 1 var hver større enn 3,9 <p>g 3,7, mens indeksene vist for peptidene innen 200-213-regionen, ble funnet å være 3,5

og 3,5. Syntetiske peptider med aminosyre-restsekvenser svarende hovedsakelig til de angitte .141-160 og 200-213 aminosyre-reststillinger, nøytraliserte begge viraene. Imidlertid var nøytraliseringsindeksene for peptidene ifølge oppfinnelsen hvis sekvenser svarer hovedsakelig til sekv-vensen av aminosyre-reststillinger 141-160, i virkeligheten større enn indeksene viser. Størrelsen av den virkelige

j

forskjell i nøytraliseringsindeks er vist i tabell 4 for en annen sammenligning av de samme peptider inokulert i kaniner hvori mer følsomme nøytraliserings-endepunktbestemmelser ble foretatt.

Det ble fastslått at en enkelt inokulering av antigenene var effektiv til å fremkalle nøytraliserende antistoffer i dyr og beskytte disse mot infeksjon. Tabell 2 angir disse resultater på marsvin, utført under anvendelse av standard-

i

prosedyre (se Lerner et al.-patentsøknad og Bittle et al., supra). Tabell 2 viser effektiviteten av antigenene og viser også den markert overraskende antigenisitet av 141-160-regionen av VP^-proteinet. En nøytraliserende indeks på

rundt 1,5 eller større indikerer at dyret var beskyttet mot viruset.

De ovenfor angitte data viser at det særlig foretrukne peptid som har aminosyresekvensen av aminosyre-reststillinger 141 til 160 av Olk VP^-capsidet, innbefatter aminosyrerester på hver side av peptidet av stillinger 146-154 som av Strohmaier et al., supra, ble forutsagt å utvise antigen aktivitet for dette capsid-protein. I tillegg inneholder peptidet som har Olk-sekvensen ved stillinger 141-160 aminosyre-restsekvenser (141-145 og 155-160) som av Strohmaier et al., supra, ble forutsagt å være inaktive, ikke-fremkallende peptider.

Resultatene i tabell 1 og 2 illustrerer at Strohmaier et al. ikke hadde rett i sin forutsigelse med hensyn til hvor i aminosyre-restsekvensen nøytraliserende antistoffer

ville kunne dannes og ikke dannes! Resultatene i tabell 3

i det efterfølgende, hvori det særlig foretrukne peptid ifølge oppfinnelsen og med aminosyre-restsekvensen av stilling 141-160 av Olk VP^ er blitt sammenlignet med peptidet ifølge Strohmaier et al. med sekvensen av stillinger 146-155 av Olk VP.^, viser at peptidet ifølge oppfinnelsen er 1000 til 100.000 ganger mere aktivt når det gjelder produksjon av nøytraliserende antistoffer enn peptidet ifølge Strohmaier et al. En midlere verdi av disse resultater indikerer også at peptidet ifølge Strohmaier et al. ikke fremkaller produksjon av tilstrekkelige mengder av antistoffer til å tilveiebringe beskyttelse av dyreverten (nøytraliséringsindekser på 1,1 og 1,5), mens peptidet ifølge oppfinnelsen gir store

mengder av beskyttende antistoffer (nøytraliséringsindekser lik eller større enn 4,3 og 2,7).

Dataene i den ovenfor angitte tabell illustrerer også at 32 aminosyrepeptidet med sekvensen av stillinger 130-161 av Olk VP^ er inaktivt når det gjelder produksjon av nøytraliser-ende antistoff. Dataene vedrørende KLH-peptidantigenet angitt med C141-160, viser at nøytraliserende antistoffproduksjon ikke er en funksjon av hvilken ende av peptidet som er kjedet til bæreren.

C. Kryssreaktivitet av antigene peptider med heterologe FMD- vira

De antigene peptider fremstilt ifølge oppfinnelsen, er mono-spesif ikke som tidligere definert. Imidlertid har disse peptider også varierende mengder av kryssreaktiviteter med virale serotyper hvis aminosyresekvenser er heterologe med den spesifikke aminosyresekvens for et gitt peptid. Således er peptidene også poly-spesifikke i varierende grad.

Dataene i tabell 4 illustrerer kryssreaktiviteten av antistoffer fremkalt overfor antigene peptidkonjugater med sekvensen av aminosyrestillinger 141-160 og 200-213 av Olk VP^

■ anvendt for å immunisere to kaniner for hver sekvens. Nøy-traliséringsindekser ble bestemt overfor det homologe virus (Olk) og de heterologe vira typer A og C. Disse data viser at serotype-spesifisitet av sera produsert ved inokulering av det syntetiske antigene peptid efterligner de som finnes med sera overfor hele viruset. Kryssnøytraliseringen antaes å gjenspeile sekvens-homologiteten blant forskjellige serotyper som vist i fig. 1.

Tabell 4 viser også den store forskjell i nøytraliserende indeks overfor Olk mellom de syntetiske peptider hvis aminosyre-restsekvenser tilsvarer hovedsakelig stillinger 141-160 og 200-213 av Olk. I de ovenfor angitte data ga peptidet som også var forutsagt som immunologisk aktivt av Strohmaier et al., supra, hvis aminosyre-restsekvens tilsvarer hovedsakelig stillinger 200-213 av Olk nøytraliseringsindeksverdier lik de som er vist i tabell 1 for samme peptid under lignende beting-elser. Nøytraliséringsindekser observert for peptidet ifølge oppfinnelsen hvis aminosyre-restsekvens tilsvarer hovedsakelig stillinger 141-160 av Olk,var imidlertid 1 til 3 enheter høyere, svarende til en forbedring i nøytralisering på 10 til 1000 ganger.

D. Antistoffer fra cystin- kjededé peptider

Lagerløsninger av vaksiner inneholdende 3 cystin-kjedede peptider (cyclisk peptid, og polymere peptider A og B) ble fremstilt i Freunds ufullstendige hjelpestoff som ovenfor

i

angitt. Disse vaksiner ga konsentrasjoner av peptid på lOOyUg pr. peptid pr. inokulering.

Preliminære resultater av en inokulering i marsvin indikerte et område for nøytraliséringsindekser (log^Q) på

2,3 til 3,0 for alle tre vaksiner. Den midlere nøytraliser-ingsindeks var ca. 2,5 som indikerte at hver av de cystin-disulfid-kjedede peptider beskyttet verten mot Olk FMDV-utfordring.

En typisk nøytraliseringsindeksverdi for det monomere, ukonjugerte peptid hvis sekvens tilsvarer hovedsakelig aminosyre-reststillinger på rundt 141 til 160 av Olk FMDV er ca. 0,5. Disse resultater indikerer derfor at en bærer ikke er nødvendig for å oppnå beskyttelse i dyr mot munn- og klovsyke.

IV. Bærere og hjelpestoffer

A. Alternative bærere

De ovenfor angitte resultater ble erholdt under anvendelse av inokuleringer av et KLH-peptidkonjugat pluss et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel slik som vann sammen med hjelpestoffer slik som Freunds fullstendige hjelpestoff (CFA), Freunds ufullstendige hjelpestoff (IFA) og/eller aluminiumhydroxyd. KLH er en akseptabel bærer for anvendelse i dyr, men er relativt kostbar å anvende i kommersiell måle-stokk. Anvendelse av alternative bærere innbefattende soya-bønne-agglutinin, okseserumalbumin (BSA), olvalbunin, peanøtt-agglutinin, tetanus toxoid og poly-L-lysin ble også undersøkt.

De ovenfor angitte resultater ble også erholdt ved kjeding av det antigene peptid til KLH-molekylet via en ytterligere cystein-(Cys) rest addert til amino- eller carboxy-enden av peptidet. Cys-resten ble deretter omsatt med reaksjonsproduktet av KLH og N-maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimidester (MBS) som diskutert i Bittle et al., supra. Både MBS og glutaraldehyd ble anvendt som kjedende midler i de senere diskuterte resultater. Kjeding av det syntetiske peptid til KLH og BSA med glutaraldehyd ble utført under anvendelse av den generelle metode som er beskrevet av Avrameas,

Immunochemistry, 6:13-52 (1969). '

Resultatene vist i tabell 5, ble erholdt ved kjeding av et peptid med aminosyresekvensen av

stillinger 141-160 av Olk FMDV VP-^-capsidet (peptid 65) til den viste bærer under anvendelse av MBS. Vaksiner ble fremstilt i Freunds ufullstendige hjelpestoff. Enkle inokuleringer inneholdende tilstrekkelig konjugat til å gi lOO^ug peptid ble gitt subkutant til hvertav 6 marsvin. De viste peptid-antistoff-titere er et gjennomsnitt av 6 verdier erholdt 4 uker efter inokulering under anvendelse av ELISA-metoden ifølge Bittle et al., supra.

De ovenfor angitte resultater illustrerer at flere bærere er praktisk talt like aktive som KLH mens okseserumalbumin ga en glimrende antistoff-titer.

Preliminære undersøkelser viste også at anvendelse av peptid 65 og tetanus toxoid med glutaraldehyd som kjedende middel ga meget god antistoffrespons med én inokulering. For disse bindingsreaksjoner ble det fremstilt en løsning inneholdende 24,5 mg peptid 65 og 2{ 6 mg tetanus toxoid i 12,5 ml fosfatbufret saltvann (PBS,' pH 7,2). Denne løsning ble omrørt forsiktig mens 1,6 ml av en løsning inneholdende 0,38% glutaraldehyd i PBS ble iblandet. Blandingen ble om-rørt i ca. 18 timer ved romtemperatur, ble dialysert mot vann i dialyserør med kutt på 12.000 i molekylvekt, og ble derefter frysetørket under dannelse av 45 mg tørket konjugat.

B. Hjelpestoffer

Hjelpestoffsystemer ble også undersøkt under anvendelse av de ovenfor peptid 65-kjedede bærere. Resultatene illustrert i tabell 6, viser virkningene ved variasjon av bæreren mellom KLH og BSA, koblingsmidlet mellom MBS og glutaraldehyd, og hjelpestoffet mellom Freunds ufullstendige hjelpestoff (IFA) og saponin-aluminiumhydroxyd, angitt i tabell 6 som saponin. Hvert av 6 marsvin ble inokulert subkutant med vaksiner inneholdende lOO^ug av peptid 65 og hjelpestoffet i to inokuleringer, 4 uker senere. Resultatene er de midlere verdier for de 6 dyr og er angitt som resultatene i tabell 5.

De ovenfor angitte data illustrerer at saponin-aluminiumhydroxyd gir en høyere og mer forlenget antistoffrespons enn Freunds ufullstendige hjelpestoff (IFA) uten hensyn til om peptidet var koblet med enten glutaraldehyd eller MBS, og uten hensyn til om bæreren var KLH eller BSA.

Dataene i etterfølgende tabell 7 viser antistoff-titerresponser og nøytraliseringsresultater under anvendelse av de tidligere beskrevne teknikker, når peptid 65 koblet til KLH ble anvendt som vaksinen sammen med et av to hjelpestoff systemer . Den første horisontale rekke av data for hver vaksine inneholder nøytraliseringsindeksverdiene (log^Q), mens den horisontale rekke av data derunder inneholder peptidantistoff-titrene erholdt ved ELISA.

De ovenfor angitte resultater illustrerer at vaksiner inneholdende de tre hjelpestoffsystemer ga større mengder av antistoffer med lengre varighet enn vaksinene inneholdende saponin-aluminiumhydroxyd. Det' syntes også a være liten forskjell mellom de to doser administrert i saponin-aluminiumhydroxyd .

Dataene i tabell 8 og 9 illustrerer responser i blandede feraser og svin overfor multiple inokuleringer av vaksine inneholdende peptid 65-KLH-konjugatet (MBS-koblet) og saponin-aluminiumhydroxyd. Disse resultater illustrerer at begge dyretyper svarte på de syntetiske antigene peptider ved å utvikle antistoff på et nivå som betraktes som beskyttende.

I hver tabell er den første horisontale rekke av data for hvert dyr nøytraliseringsindeksverdier (log^0), mens den andre horisontale rekke av data er peptidantistoff-titer-verdier erholdt ved ELISA.

De ovenfor angitte resultater i tabell 8 med kveg illustrerer en anamnestisk respons ved at 6-måneders for-sterkningsinokuleringen utløste hukommelse B-celleproduksjon av nøytraliserende antistoffer.

De ovenfor angitte resultater når det gjelder inokuleringer med syntetiske antigene peptider ifølge oppfinnelsen, ble utført under anvendelse av peptider med bare én sekvens for hvert sett av data. Dataene i tabell 3 viser at en viss kryssreaktivitet og poly-spesifisitet ble observert.

Ifølge en annen utførelsesform oppnås kryssreaktivitet og poly-spesifisitet ved inokuleringer under anvendelse av et flertall av peptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen som hvert er mono-spesifikt overfor minst én forskjellig stamme av virus innen en slekt, eller to forskjellige serotyper eller stammer innen slekten. Således gir inokulering med en vaksine inneholdende peptider hvis aminosyre-restsekvenser svarer hovedsakelig til aminosyre-reststillinger rundt 141 til 160 av både type Olk og type A, subtype 10, stamme 61 (A10, 61), beskyttelse både mot type Olk og A10, 61. På tilsvarende måte kan et polymert peptid slik som polymere peptider A og B, som tidligere diskutert, fremstilles som et copolymert peptid hvis repe-terende peptidenheter er tilstede i like mengder og har aminosyre-restsekvenser svarende hovedsakelig til aminosyre-reststillinger rundt 141 til 160 av Olk og A10, 61.

V. Syntetiske peptider relatert til Picornavira

De ovenfor angitte syntetiske peptider kan anvendes alene som en polymer hvori peptidenhetene er kjedet sammen med oxyderte cysteinrester, eller kjedet til en bærer som et konjugat sammen med fysiologisk akseptable fortynnings-midler slik som vann eller et hjelpestoff under dannelse av en vaksine som, når denne innføres i en vert i en effektiv mengde, er i stand til å fremkalle produksjonen av antistoff som reagerer med Picornaviruset til hvis capsid-proteinsekvens peptidet tilsvarer eller hovedsakelig tilsvarer, og beskytte verten mot dette Picornavirus. Dette syntetiske peptid kan alene, som en polymer eller konjugat, også anvendes som diskutert tidligere eller i det etter-følgende, for de 20 aminosyrerest-holdige peptider hvis sekvenser tilsvarer eller hovedsakelig tilsvarer aminosyre-restsekvensen av stillinger rundt 130 til 160 fra amino-enden av FMDV VP,-capsidet.

Ved undersøkelse av de aktive, antistoff-fremkallende regioner av det antigene Picornavirus-capsid bemerkes det at en determinantregion av FMDV VP^ overfor hvilken nøytraliserende antistoffer kan dannes, tilsvarer aminosyre-reststillinger rundt 130 til 160 fra amino-enden av capsidet. VP^-capsidet innbefatter totalt ca. 213 aminosyrerester fra amino-enden til carbpxy-enden under anvendelse av Olk-virus VP^ som referanseprotein.

Den region av proteinet ved hvilken den nøytraliser-ende antistoff-determinant begynner, er således lokalisert ca. 60% (130/213 x 100% = 61%) langsaminosyre-restsekvensen av dette protein fra amino-enden. Denne nøytraliserende antistoff-produserende determinantregion ender rundt aminosyre-reststilling 160 som representerer ca. 75% av aminosyre-restsekvensen fra amino-enden. For de mer foretrukne peptider svarende hovedsakelig til aminosyre-reststillinger rundt 141 til 160 av FMDV VP-^-capsidene er den nøytraliser-ende antistoff-produserende determinantregion innen den region som er lokalisert i en distanse fra amino-enden lik 66 til 75% av den totale aminosyre-restsekvens.

Undersøkelse av aminosyre-restsekvensene i fig. 1

og av de lett tilgjengelige pK 3.-data viser at antallet av rester i hver sekvens som vil bære en positiv ionisk ladning ved fysiologiske pH-verdier (Arg, Lys og His), er tallmessig overlegent antallet av rester som vil bære en negativ ladning ved denne pH-verdi (Asp og Glu) for alle sekvenser bortsett fra én. Denne ene sekvens av FMDV type A, subtype 10, stamme 61 (A10, 61), bærer en nøytral ionisk ladning. Det skal imidlertid bemerkes at den særlig foretrukne region av A10-capsidet svarende hovedsakelig til aminosyre-reststillinger rundt 141 til 160, bærer en netto positiv ladning .

De syntetiske antigene peptider fremstilt ifølge oppfinnelsen, bærer typisk en netto nøytral eller positiv ladning, eksklu-sivt enhver ionisk ladning fremkalt av terminale amino-og/eller carboxylgrupper. Fortrinnsvis bærer disse peptider en netto positiv ionisk ladning. Slike peptider er også fortrinnsvis vannløselige. Det synes imidlertid som om den netto nøytrale til positive ladning på det syntetiske antigene peptid ikke er så nødvendig for peptidets antigenisitet som det faktum at peptidets aminosyre-restsekvens i det minste tilsvarer en region på det antigent nøytral-iserende antistoff-fremkallende capsid som er mellom 60 og 75% av lengden av denne sekvens fra amino-enden.

VI. Metoder og kjent teknikk i

Metoder og materialer som er særpreget for foreliggende i

oppfinnelse, er beskrevet under henvisning til den bestemte prosedyre som taes i betraktning. Generelt er de laboratorie-teknikker, metoder og materialer som anvendes, de som van-ligvis anvendes innen molekylærbiologien og biokjemien generelt.

Særlig henvises det til Methods in Enzymology, Colowick, S.P. og Kaplan, N.O., redaktører, Academic Press, New York; Methods in Immunology and, Immunochemistry,

Academic Press, Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Chemical Rubber Publishing Company, og Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Goldstein og Prescott, Academic Press, N.Y., N.Y. for en beskrivelse av generelle materialer og teknikker av interesse.

VII. Konklusjon

Lerner et al. har arbeidet med FMDV i lang tid, og i

et tidsrom antok de at de hadde idéntifisert det optimale, spesifikke, antigene determinantpeptidfragment for FMDV

for senere å finne at den antatte antigent aktive del ikke fremkalte produksjon av antistoffer til FMDV eller fremkalte antistoffproduksjon i så lave' nivåer at det var av liten eller ingen praktisk verdi. Søkerne er klare over at Strohmaier et al., supra, har trukket enkelte slutninger vedrørende antigent aktive deler av sitt ^VPi^ FMDV serotype 0-gen og at Kelid et al. hadde bestemt nucleotid-sekvensen av VP^ (VP^) FMDV serotype A, subtype 12-gen [Science, 214:1125-1129 (1981)]. Det var selvsagt umulig å bestemme fra nucleotidsekvensene hvilket peptidfragment eller fragmenter som ville kunne være antigene og i særdeleshet var det umulig å forutsi eller til og med gjette hvilke peptidfragmenter som vil kunne ha optimal antigenisitet for FMDV-virus. Som ovenfor vist, ble den antistoff-fremkallende region av Olk VP-^-capsidet angitt av Strohmaier et al., funnet å være meget mindre aktiv enn den relativt lengre region som kreves her og som innbefatter regioner

som av Strohmaier et al. var forutsagt ikke å kunne fremkalle beskyttende antistoffer.

Et utall peptider ble syntetisert, bundet til bærer, f.eks. KLH, og de resulterende antigener ble injisert i dyr. Antistoffer fra dyrene ble derefter utfordret med FMDV for å bestemme hvorvidt antigenet var antigent effektivt når det gjelder fremkallelse av antistoffer mot den infektiøse organisme.

Det var en totalt uventet oppdagelse at et slikt relativt lite peptidfragment i regionen av capsid-stillinger rundt 130 til 160, f.eks. et 20-resters langt peptid, slik som sekvensen svarende til stillinger rundt 141 til 160,

var uhyre antigent. Det er selvsagt umulig å bestemme hvorvidt eller ikke det kan være andre og muligens til og med mere antigene nucleotide sekvenser i FMDV-genet,

selv om det ikke er noen grunn til å forutsi at slike vil eksistere. En 20 aminosyre-restsekvens fra VP^-capsid 130-160 aminosyre-restsekvens ifølge denne oppdagelse synes ganske uforutsigelig og fullstendig overraskende å være det optimale og sannsynligvis endelige FMDV mono-spesifikke, syntetiske, antigene determinantpeptid pluss/minus én eller to (muligens tre) aminosyrerester.

Det er for tiden ikke kjent hvor mye man kan avvike

fra det eksakte peptid uten å tape den høyst uventede aktivitet og effektivitet av vaksinen eller antigenet av hvilke determinanten er den FMDV-mono-spesifikke, syntetiske, antigene determinant, men det er imidlertid kjent fra forsøk at (1) peptidet kan forlenges med noen få aminosyre-enheter, (2) at minst én eller to, muligens opptil fire eller fem substitusjoner kan foretaes, og (3) at peptidsekvensen kan forkortes ubetydelig, sannsynligvis med to eller tre, muligens fire, uten å tape sitt særpreg. Slike uvesent-lige avvik er i prinsippet kjent å være mulig uten å avvike fra det beskrevne begrep og den oppdagelse som er blitt gjort. Slike mindre variasjoner betraktes som ekvivalente varianter av oppfinnelsen.

Våre resultater viser klart at en enkel inokulering av det syntetiske peptid som utgjøres av i ca. 20 aminosyrerester i 130-160-regionen, f.eks. region 141-160, fremkaller tilstrekkelig virus-nøytraliserende antistoff for å beskytte mot en injeksjon av viruset. Beskyttelsen som gies av peptidet, er flere ganger større enn de beste resultater erholdt ved immunisering med capsidproteinet VP^, uten hensyn til hvorvidt dette er fremstilt ved sprengning av viruspartikler eller ved utvikling i E. coli-celler. Det er postulert at et lite, fritt peptid kan være i stand til å oppta en struktur som nærmer seg den det tar opp i virus-partikkelen, en situasjon som ikke er sannsynlig når dette hemmes av nabo-aminosyrerester i et feilaktig foldet VP^.

En alternativ forklaring er at immunodominerende regioner

av VP^ kan begraves i viruset og er irrelevant for nøytral-iseringen.

En klar fordel med det syntetiske peptid fremstilt ifølge oppfinnelsen er dets aktivitet når det gjelder å fremkalle en beskyttende antistoffrespons ved én enkel inokulering.

Denne gode respons på en enkel inokulering er meget viktig fordi vellykket immunisering mot munn- <p>g klovsyke avhenger av at vaksinene er tilstrekkelig aktive til å gi en beskyttende respons med en inokulering. Preliminære arbeider med kveg og svin har vist at det syntetiske peptid kan fremkalle en antistoffrespons som er tilstrekkelig til å beskytte disse arter mot sykdommen.

I

Industriell anvendelse

Den terapeutiske anvendelse av antigenene fremstilt ifølge oppfinnelsen, og vaksinene og antistoffpreparatene derav, er av stor industriell og økonomisk verdi. Dyr slik som svin og kveg, kan beskyttes mot ødeleggelsene av Picornavirus-fremkalte sykdommer slik som munn- og klovsyke, og således øke forrådet av mat og protein for menneske-heten .

Claims (3)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av et terapeutisk aktivt antigent peptid som har følgende aminosyrerestsekvens skrevet fra venstre mot høyre og i retning fra amino-enden mot carboxy-enden: TyrAsn(Asp eller Thr)Gly(Phe)Glu(Thr)Cys(Ser eller Asn eller Thr)Arg(Lys eller Thr)TyrAsn(Ala eller Ser eller Thr)Arg (Val eller Ala eller Asn eller Thr)Asn(Gly eller Ser)Ala (Asp eller Gly)Val(Ser eller Gin eller X)Pro(Gly eller Y) Asn(Z)Leu(Arg eller Val)Arg(Ser eller Ala)GlyAspLeu(Met eller Phe)Gin(Gly)Val(Thr eller Ser eller His)Leu(Ile)AlaGln (Ala eller Pro)Lys(Arg eller Ala)Val(His)Ala(Val)Arg(Thr eller Lys)Thr(Gin eller His)LeuPro og eventuelt Ala, og eventuelt inneholdende ytterligere to Cys-rester knyttet til hver sin ende av peptidene, hvori hver av aminosyrerestene samt symbolene X, Y eller Z i parentes indi-viduelt kan erstatte den tilstøtende aminosyrerest umiddelbart til venstre for parentesen, og hvor X og/eller Y og/eller Z i peptidaminosyre-restsekvensen uavhengig angir fraværet av en aminosyrerest i stillingen av den tilstøtende aminosyrerest umiddelbart til venstre for parentesen, hvorved peptidets lengde forkortes med 1, 2 eller 3 aminosyrerester,karakterisert ved at en utgangsaminosyreharpiks fremstilles ved forestring av Boc-AA-OH til en harpiks hvori AA betegner den relevante aminosyre, hvoretter det foretas en suksessiv kopling av Boc-AA-OH under anvendelse av sidekjedebeskyttende grupper, den beskyttede polypeptidharpiks behandles med flytende HF for å fjerne de beskyttende grupper og spalte polypeptidet fra harpiksen, hvoretter det spaltede, ubeskyttede polypeptid ekstraheres med fortynnet syre, hvoretter, om ønsket, det erholdte polypeptid koples til en proteinbærer, og, om ønsket, at det erholdte peptid oxyderes.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av et polypeptid med aminosyresekvens, fra venstre mot høyre, og i retning fra amino-enden til carboxy-enden som følger: karakterisert ved at tilsvarende utgangs-materialer anvendes.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av et polypeptid med aminosyresekvens, fra venstre mot høyre, og i retning fra amino-enden til carboxy-enden som følger: karakterisert ved at tilsvarende utgangs-materialer anvendes.