NO172156B - Analytisk elektroforetisk fremgangsmaate samt innretning for gjennomfoering av fremgangsmaaten - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en analytisk elektroforetisk fremgangsmåte for separering av partikler med på forhånd bestemt omtrentlig masse.

Oppfinnelsen angår også en innretning for gjennomføring av denne fremgangsmåten.

Oppfinnelsen som er basert på oppdagelsen av en ny type elektroforese som blant annet gjør det mulig å gjennomføre viktige analyser som ikke har vært mulige tidligere eller som ikke har vært praktiske ved tidligere kjente teknikker. Potensiell anvendelse omfatter separering av kromosomet DNA, kromosomkartiegging, hensiktsmessig fremstilling av genetiske biblioteker, studier av virkninger av forskjellige medikamenter på kromosomalt DNA og hensiktsmessig karakterisering av polymerer. Oppfinnelsen gjør det mulig, med høyere oppløsningsgrad og ved høyere hastigheter, å separere større partikler (molekyler) enn de som kan oppløses ved kjente teknikker, samtidig å separere partikler som skiller seg vesentlig når det gjelder massen. I en foretrukket utførel-sesform gjør oppfinnelsen det mulig å lysere celler for elektroforetisk separering av makromolekyler inneholdt i cellene med minimal nedbrytning eller knusing.

Elektroforese der partikler som en blanding av makromolekyler beveges, for eksempel gjennom en gelmatriks, på grunn av et elektrisk felt, er en hyppig benyttet teknikk for kvalitativ analyse og for separering, gjenvinning og rensing. Den er spesielt viktig ved studie av proteiner, nukleinsyrer og kromosomer. Det skal her henvises til for eksempel CR. Cantor et al., "Biophysical Chemistry", Freeman, 1980, del 2, s. 676, 683. Således er dette sannsynligvis det viktigste verktøy som benyttes ved de fleste DNA- og kromosomale analyser.

Vanskeligheter oppstår når elektroforetisk separering av meget store partikler er ønsket. Ved for eksempel å benytte tidligere kjente teknikker, er størrelsen for de største DNA-molekyler som rutinemessig kan behandles, den til en bakteriofag, 3,2 x IO<7> dalton. En slik størrelsesgrense utelukker mange typer ønskelige analyser fra utførelse. For eksempel er intakte kromosomale DNA større og deres størrelse blir karakteristisk redusert for å gjøre det mulig å arbeide med dem. Dette ødelegger imidlertid viktig informasjon som ligger kodet i DNA og forhindrer mange viktige forsøk.

Det har vært foreslått å utvide gelelektroforesene til gjenstander med høyere masse ved å redusere gelkonsentra-sjonen. Dette påvirker imidlertid på ugunstig måte oppløs-ningen, gjør forsøksbetingelsene vanskelige å regulere og har vikke med hell vært benyttet på DNA-molekyler med molekylvekter over ca. 5 x IO<8> dalton. Det skal her henvises til W.L. Fangman, "Nucleic Acids Research", vol. 5, nr. 3, mars 1978, s. 653-655 samt P. Serwer et al., "Electrophoresis", 1981, Walter deGreuter and Co., s. 237-243.

Det er antatt at oppløsningen i tidligere kjente elektroforese-teknikker er feltavhengig fordi lavere elektriske feltintensiteter generelt gir høyere oppløsning. Som et resultat tar elektroforese-forsøk der høyere oppløsning er ønskelig, ofte opp til 100 timer. Videre antas det at partikkelmobiliteten og derved også oppløsningsevnen, varierer med logaritmen av massen av partiklene som skal separeres, noe som selvfølgelig ikke er en sterk sensitiv basis for å oppnå separering. I tillegg blir, ved gelelektro-foreser ifølge den kjente teknikk, forskjellige gelkonsentrasjoner karakteristisk benyttet for forskjellige masse-eller molekylvektsområder, noe som derved begrenser området av partikler som samtidig kan oppløses. Videre er tidligere kjente elektroforese-teknikker karakteristisk benyttet for å separere kun små mengder partikler og prosessen kan ikke på hensiktsmessig måte utvides til større mengder.

På tross av det faktum at elektroforese har vært benyttet 1 en god tid og på tross av det faktum at teknikkens vesentlige begrensninger og behovet for å overvinne disse også i lang tid har vært kjent, er det ikke kjent noe tidligere forsøk som med hell har overvunnet begrensningene.

Spesielt skal det videre henvises til US-PS 4 148 703 som beskriver separering av fraksjoner av en kontinuerlig strøm av prøve (for eksempel enzymer) i en kontinuerlig strømnings-elektroforetisk fremgangsmåte. Arten og formålet ved '703 er den kontinuerlige strømningselektroforese der preparatet innføres kontinuerlig til gelen ved en langsom, men konstant strøm gjennom et rør inn i et hull som løper gjennom tykkelsen av gelen og der fraksjonene beveger seg langs respektive veier gjennom gelen og strømmer ut via respektive hull gjennom tykkelsen av gelen, elueres med strømningsbuffer som løper under hele driften.

Foreliggende oppfinnelse skiller seg vesentlig fra de etablerte prinsipper for elektroforeser og er basert på den overraskende oppdagelse at elektroforese, gjennom hensiktsmessig varierte elektriske felt i stedet for gjennom enhetlige felt slik det tidligere har vært anvendt, uventet gir meget ønskelige resultater. Mere spesielt er oppfinnelsen basert på den oppdagelse at ønskelige separeringsresultater oppnås når partikler underkastes henholdsvis elektriske felt som beveger dem i en total retning generelt på tvers av de respektive generelle feltretninger.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse en analytisk elektroforetisk fremgangsmåte for separering av partikler med på forhånd bestemt omtrentlig masse ved å utsette partiklene i et egnet medium for minst to elektriske felt (E', E") der feltretningene er på tvers i forhold til hverandre og veksler mellom henholdsvis høy og lav intensitet ute av fase med hverandre for forflytning av partiklene i totalretninger som generelt er på tvers av feltretningene for separering av partiklene, og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at vekslingsfrekvensen velges på basis av den på forhånd bestemte omtrentlige masse hos partiklene som skal separeres.

Oppfinnelsen angår som innledningsvis nevnt også en innretning for gjennomføring av denne fremgangsmåte, omfattende en bærer for et medium i hvilket en eller flere prøver av partiklene som skal separeres og som har en på forhånd bestemt omtrentlig masse kan plasseres; organer for å danne minst to elektriske felt som påvirker partiklene og med feltretninger som er på tvers i forhold til hverandre og organer for gjentatt veksling av respektive felt mellom respektive lave og høye intensiteter ute av fase med hverandre for forflytning av partiklene i totalretninger som generelt er på tvers av feltretningene, og denne innretning karakteriseres ved at vekslingsorganene er anordnet til å virke ved en frekvens, valgt på basis av den på forhånd bestemte omtrentlige masse av partiklene som separeres.

Spesielt ønskelige resultater oppnås i i det minste de tilfeller som har vært undersøkt til i dag når minst ett av de elektriske felt har en tilsiktet intensitetsgradient i en retning på tvers av sitt eget. Som et spesifikt, men ikke begrensende eksempel kan to felt benyttes som alternerer mellom respektive høye og lave intensiteter som ikke er i fase med hverandre og som er rettet på tvers av hverandre. For eksempel kan et av feltene være på, mens det andre er av og så videre. Spesielt gode resultater oppnås når av- og på-tidene for feltene er relatert til massen av partikler som skal separeres, når for eksempel på- og av-periodene er proporsjonale med massene for partiklene opphøyd i for eksempel 1,5.

En av de viktige fordeler ved denne oppdagelse er at den på dramatisk måte utvider masse-området for partikler som ved elektroforetiske teknikker kan separeres ved høy oppløsning. Som et ikke-begrensende eksempel kan den nye teknikk ved høy oppløsning separere partikler hvis masse er ca. 1,2 x 109 dalton, mens den tidligere øvre grense for kjente metoder som gir lavere oppløsning, antas å ligge i området ca. 0,5 x 10^ dalton. Det antas at den nye teknikk også kan oppløse partikler på over 1,2 x 10^ dalton. En annen viktig fordel er at ved den nye teknikk er oppløsningen meget mindre avhengig av elektrisk feltintensitet. Som en konsekvens kan den nye type elektroforese arbeide raskere så lenge varmen som dannes på effektiv måte kan fjernes. Som et resultat kan et typisk laboratorieforsøk gjennomføres til 8 timer, mens tilsvarende forsøk ved bruk av tidligere kjente teknikker krever 12-100 timer. En annen vesentlig fordel ved den nye teknikk er at større mengder av prøven sammenlignet med kjent teknikk kan benyttes, noe som gir øket oppløsning og sensitivitet. En ytterligere fordel er at den nye teknikk samtidig kan oppløse, i den samme gel, partikler fra et videre masseområde enn det som antas mulig med kjente teknikker. Som et ikke-begrensende eksempel kan den nye teknikk samtidig i samme gel oppløse partikler som ligger i masseområdet i ca. 10^ til 10^ dalton. Med tidligere kjente teknikker ville det vært nødvendig med flere forskjellige gelkonsentrasjoner for å oppløse partikler i det snevrere masseområdet fra ca. 10^ til ca. 10<8> dalton. Som ytterligere et viktig trekk ved oppfinnelsen er det funnet en teknikk som minimaliserer behand-lingsskade på celleavledede makromolekyler ved lysering av celler eller sfæroplaster i en blokk av gel som er den samme som, eller forenelig med, elektroforesegelen, og så å inplantere hele blokken i elektroforesekammeret.

Disse og andre fordeler ved oppfinnelsen så vel som ytterligere oppfinneriske trekk vil bli åpenbare fra den detal-jerte beskrivelse som følger.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 er en perspektivskisse, delvis bortskåret, av et elektroforesekammer som kan benyttes for å forklare visse prinsipper ved oppfinnelsen.

Figur 2 er et toppriss av det samme kammer.

Figur 3 er et delvis skjematisk og delvis blokkdiagram som

viser en kobling av eksempelvise kammerelektroder.

Figurene 4-7 viser eksempler på elektriske felt som virker

i elektroforese-kammeret.

Figur 8 viser partikkelbevegelsen ved den nye elektroforese. Figur 9 viser en hypotetisk vridning og en bevegelse for et stort DNA-molekyl gjennom agarosegel under påvirkning av tversliggende elektriske felter som virker ut av fase. Figur 10 viser den hypotetiske virkningen av et enhetlig elektrisk felt på et stort DNA-molekyl i agarosegel. Figur 11 tilsvarer figur 10, men illustrerer den hypotetiske virkningen av et elektrisk felt som har en vesentlig intens!tetsgradient på tvers av feltretningen. Figur 12 viser sirkulasjonen av avkjølt bufferoppløsning

gjennom elektroforesekammeret.

Figur 13 viser den oppløsning som oppnås i et forsøkseksempel

ved bruk av den nye type elektroforese.

Figur 14 er en perspektivskisse av en form som benyttes for lysering av celler eller sfæroplaster in situ i gelblokker som senere innføres i dertil passende brønner i elektroforesegelen.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

En eksempelvis utførelse av en laboratorieinnretning som kan benyttes for å forklare visse prinsipper ifølge oppfinnelsen er i perspektiv og delvis bortskåret vist i figur 1, og sett ovenfra i figur 2. Den omfatter et åpent rektangulært elektroforesekammer 10 bestående av elektrisk isolerende materiale som for eksempel 6,3 mm tykt plexiglass med dimensjoner på ca. 10 cm x 10 cm. Det bærer på bunnen et sjikt av et medium 12 som for eksempel den agarosegel som vanligvis benyttes ved elektroforese, omgitt av elektroder 14. Elektrodene er tynne (,81 mm) platinatråder som strekker seg vertikalt ca. 19 mm hver og er anordnet ca. 1,5 cm fra hverandre slik det vises i figur 2.

Som et eksempel kan elektrodetrådene tre inn i kammeret gjennom respektive hull anordnet i en horisontal rekke ca. 19 mm over den innvendige bunn av kammeret der hver tråd strekker seg nedover langs den respektive sidevegg til den innvendige bunn av kammeret. For å oppnå de ønskede elektriske felt blir elektrodene forbundet med hverandre som vist i figur 3. Spesielt mater en likestrømskilde 16 (for eksempel en Biorad Model 500) likestrøm til reléet 18 (for eksempel et DPDT, 115 volt vekselstrømsrelé) som styres med en program-merbar tidsregulator 20 (for eksempel en kronotrol 4-kanals CT) for å forbinde et valgt av sine to par av uttak til likestrømmen fra kilden 16. Et uttakspar til reléet 18 (bestående av en negativ og en positiv uttakskontakt) er forbundet med topp- og bunnrekken av elektroder 14 (som vist i figur 3), via en respektiv diode for hver elektrode. Det er imidlertid kun når en bryter 22 er lukket at alle elektrodene i topprekken er forbundet med den negative uttakskontakt for reléet 18; når bryteren 22 er åpen, er kun elektroden 14 helt til høyre forbundet på denne måten. De andre par av uttaks-kontakter fra reléet 18 er på tilsvarende måte forbundet med de høyre og venstre rekker av elektroder 14 ved bruk av en tilsvarende bryter 24 for det samme formål. Variable resistorer R kan benyttes for å regulere de relevante spenninger på samme måte som kontrollene til kraftkilden 16. Kontrollene for tidsregulatoren 20 bestemmer når et spesielt par av relé 18-kontakter gis energi og når de ikke mates med energi.

Når bryteren 22 er lukket og reléuttaket som mater energi til topp- og bunnrekken av elektrodene 14 er på, for eksempel ved henholdsvis ved +200 og -200 volt, blir et i det vesentlige enhetlig elektrisk felt E lagt på over bunnen av elektroforesekammeret som vist skjematisk i figur 4. De korte piler i figur 4 har en enhetlig lengde for å indikere den vesentlige enhetlighet for feltet, og de lengre piler antyder den generelle retning for feltet (fra den positive til den negative elektrode). Mens i realiteten feltet ikke er perfekt enhetlig i intensitet gjennom gelen på grunn av den fysikalske anordning av individuelle, i avstand fra hverandre anordnede elektroder, og av andre grunner, og fordi den generelle retning kan avvike noe fra den vertikale (som vist i figur 4), vil den for oppfinnelsens formål kalles enhetlig, og adskilles fra det elektriske felt som tilsiktet gjøres uenhetlig, for eksempel ved med vilje å forårsake en signifikant intensitetsgradient i en retning på tvers av den totale feltretning.

Et felt El som ikke er enhetlig, det vil si at det har en operativt signifikant intensitetsgradient i en retning på tvers av den generelle feltretning, er vist i figur 5, og oppnås i dette tilfellet ved å åpne bryteren 22 slik at kun elektroden i det øvre høyre hjørnet av figur 5 forblir under +200 volts spenning, mens hver av bunnelektrodene befinner seg ved —200 volts spenning. Det elektriske felt som vises i figur 5 er noe vifteformet, men har fremdeles den generelle retning, illustrert ved den lengre pil, som kan ansees som vektorsummen av de individuelle felt som skyldes de respektive spenningsforskjeller mellom elektroden i det øvre høyre hjørnet og de individuelle elektroder i underrekken. Intensitetsgradienten av interesse har en retning på tvers av den generelle feltretning, slik som vist ved pilen G, og skyldes det faktum at avstanden mellom den øvre høyre elektrode og elektrodene i bunnrekken øker (og intensiteten pr. volumenhet eller flateenhet for de individuelle felt derved synker) når man beveger seg mot venstre langs bunnrekken, slik det antydes ved de synkende lengder for de kortere piler.

Når på tilsvarende måte bryteren 24 er åpen og reléuttaket forbundet med elektroden i det nedre venstre hjørnet og elektroden langs den høyre rekke gis energi, dannes det et tilsvarende felt E2 slik som vist i figur 6. Den eneste signifikante forskjell mellom feltene i figur 5 og figur 6 er at det i figur 6 har en annen generell retning som er på tvers av feltet El i figur 5.

En av de uventede oppdagelser som ligger til grunn for foreliggende oppfinnelse er at hvis felt som El og E2 alternerer ute av fase med hverandre mellom henholdsvis høye og lave intensiteter ved frekvenser som er valgt på basis av partikkelmassen (for eksempel makromolekyler) som elektroforetisk skal separeres, beveger partiklene seg fra en startposisjon som 26 i en total retning D som er på tvers av begge feltene i El og E2 og for enhver partikkel avhenger bevegelseshastigheten av massen (eller ladningen). Som et resultat beveger partikler med forskjellige masser (lad-ninger) seg i forskjellige avstander fra startposisjonen 26 og gir bånd slik som Ml, M2 og M4 i figur 8 der lettere partikler beveger seg lengere fra startposisjon.

Det skal bemerkes at uttrykket "på tvers av" slik det her benyttes ikke er begrenset til vinkelen 90" eller en vinkel nær denne, men omfatter enhver klar skjæringsvinkel. Benyttet med henblikk på vinkelen mellom de elektriske felter El og E2 er uttrykket ment å utelukke kun de vinkler mellom elektriske felt i den kjente teknikk som stammet fra tilfeldige hendelser eller fra den manglende evne til i praksis å oppnå det ønskede mål med enhetlig og ensrettet kombinasjon av feltene. Benyttet med henblikk på vinkelen mellom den totale retning for partikkelbevegelsen er uttrykket "på tvers av" igjen ment å utelukke kun vinkler som oppstår på grunn av tilfeldige hendelser eller på grunn av mangelen på de tidligere kjente innretningers muligheter til å la den elektroforetiske bevegelse falle sammen med den ønskede feltretning. Uttrykket "operativ signifikant" intensitetsgradient som er tilstrekkelig til å gjøre det mulig for de relevante felt å bevege de relevante partikler i en retning på tvers av de generelle feltretninger for eksempel er vist i figur 7.

Tilfredsstillende resultater kan oppnås i enkelte tilfeller med elektriske felt som alternerer og som er på tvers av hverandre som diskutert ovenfor, men som er i det vesentlige enhetlige som feltet E i figur 4. Karakteristisk bedre resultater oppnås imidlertid når et av feltene har den antydede intensitetsgradient i en retning på tvers av sin generelle retning. Karakteristisk blir de beste resultater oppnådd når begge feltene har slike intensitetsgradienter.

Mens mekanismen som ligger til grunn for den nye type elektroforese ikke helt er forstått, antas det at pålegning av alternerende felt forårsaker at større partikler slik som et oppviklet DNA-molekyl trenger seg inn i agarosematriksen ved å orientere seg selv først langs den generelle retning for et av feltene og derefter langs den generelle retning for det andre og så videre. Videre antas det at ved å bruke gradientfelt (slik som El og E2) i stedet for enhetlige felt

(E) gis det en skjærekraftvirkning som understøtter utstrek-king av molekylet i den ønskede retning. Figur 9 illustrerer

denne hypotese ved å vise et vilkårlig oppviklet DNA-molekyl som skyves inn i en agarosegel ved hjelp av et enhetlig elektrisk felt E' og presses inn i gelen ved at det omdannes til langstrakt sylindrisk form, her kalt "slange". Denne slange underkastes så et enhetlig elektrisk felt E2' og vris

gradvis bort fra sin opprinnelige slangeform inntil den danner en ny slange, denne gang orientert langs den generelle retning for felt E" og så videre, slik at molekylets totale bevegelsesretning er langs den omtrentlige vektorsum av retningene for feltene E' og E". Denne utgangshypotese er imidlertid modifisert ved en senere antagelse at langkjedede makromolekyler som DNA sannsynligvis ikke slangevikles når deres rotasjonsradius er større enn den effektive gelpore-radius. I stedet samles sannsynligvis slike makromolekyler til en form mer lik "ølboks" enn en slange, slik det er vist i figur 10, og beveger seg derfor ikke så lett i en retning på tvers av lengdeaksen for "ølboksen".

Således antas det at bruken av gradient i stedet for et enhetlig felt er en av de vesentlige faktorer for å tvinge store molekyler som DNA-molekyler, inn i den ønskede langstrakte sylindriske eller slangeform som vist i figur 11. Videre antas det at egnet valg av frekvens ved hvilken endringen fra et felt til et annet skjer, er relatert til den tid det tar for partikkelen eller molekylet å orientere seg selv til den ønskede langstrakte sylindriske eller slangeform og at denne tid t er relatert til partikkelmassen (molekylvekten) M, den effektive poreradius for gelen r, og den målte hastighet for partikkelen i gelen v, i henhold til ligningen t = M1'5/^^).

Det skal understrekes at den hypotese som er gitt ovenfor, selv om den stemmer overens med eksperimentelle forsøk opptil nu, Ikke skal tas som en begrensende faktor for oppfinnelsens ramme, da oppfinnelsen gir sine fordelaktige resultater uavhengig av hvilket fenomen som ligger til grunn og som ennu ikke er forstått, og på tvers av muligheten for at en helt forskjellig mekanisme kan være involvert.

De følgende eksempler viser visse aspekter ved oppfinnelsen, men er ikke begrensende. t

Generelle elektroforesebetlngelser for eksempel A. B og C. Geler med en tykkelse på ca. 1 cm ble støpt i 10 cm<2> engangs Petrl-skåler. Brønner for prøven ble tildannet på konvensjonell måte ved bruk av en plastkam med tenner på 0,63 mm x 2 mm, anbragt 0,315 mm fra hverandre. Gelene bestod av en 1,5$ lav end endoosmoseagarose (Miles Biochemlcal Company), oppløst 1 TBE (10,3 g Tris, 5,5 g borsyre og 0,93 g dinatrlum-EDA pr. 1). Elektroforesebuffer (TBE) ble kontinuerlig sirkulert via en magnetisk drevet polypropylen-innkapslet viftepumpe (Fischer Scientific) og avkjølt i et resirkuleringskjølebad (Haake, type T-52) som illustrert i figur 12. Inntaks- og utløpsenden for sirkulasjonsrørene var nær gelen og ga og trakk av flytende buffer i to diametralt motsatte hjørner av gelkvadratet. Pulveret ble fylt i brønnene ved bruk av en Gilson Pipetman med pipettespiss-endene skåret for minimal skjærkraft. DNA ble visualisert efter dynking av gelen i 0,5 >jg etidiumbromid pr. ml TBE. Fotografier ble tatt ved bruk av polaroid 107 film med kortbølget UV-belysning. Disponeringstidene varierte fra 15-180 sekunder ved f8 avhengig av prøvene.

Eksempel A: Preparering og elektroforese av markør- DNA. Bakteriofagviruser T7, T2 og G ble preparert ved lysering av en gitt mengde av virus over natten ved 50° C i NDS som beskrevet i Laurer et al., "Journal of Microbiology", 1975, 95: 309-326. De resulterende lysater ble så dialysert over natten mot elektroforesebufferen. Bakteriofag-DNA-massene i dalton var antatt å være: T7 - 2,7 x 10<7>; T2 = 1,2 x 10<8>. En 0,02 jjg prøve av hvert DNA ble fylt i brønnene i 5 jil 1056 glycerin, TBE og 0,001556 bromfenolblått. Prøvene ble kjørt inn 1 gelen med et enkelt felt i 15 minutter før pul sing. Optimale pulstider i sekunder for oppløsning av makromolekyler nær molekylvekten for de følgende eksempler var T7 - 0,25; T2 = 4; og G = 20. Uttrykket "pulstid" henviser til pulsbredden, det vil si tidsintervallet i løpet av hvilket et av feltene er på (eller høyt), mens det andre er av (eller lavt). I dette forsøk ble det benyttet felt av den type og det spenningsnivå som er illustrert i figurene 5 og 6, det vil si at begge feltene hadde intensitetsgradienter. Den relative mobilitet som ble oppnådd ved dette forsøk er G = 1; T2 = 2,5 og T7 - 8.

Eksempel B: G. 1ær- DNA

Forskjellige gjærstammer ble dyrket til midtlogfase i 100 til 1000 ml YPD (YPD = 1 g gjærekstrakt, 2 g dekstrose og 2 g baktopepton satt til 1 1 destillert vann). Sfæroplaster ble fremstilt som beskrevet av Cryer et al. i "Progress in Cell Biology", vol. 12, 1975, s. 39-44. Sfæroplastene ble derefter lysert i DNS over natten ved 50'C. Gjærlysater ble fremstilt i NDS med konsentrasjoner fra ca. 10^ til 2 x 10<10> celler pr. ml lysat. Generelt ble 90 pl lysat fylt 1 ved bruk av en blåspisset (1 ml kapasitet) Pipetman. Prøvene ble kjørt inn i 1, 5% agarosegel ved 100 volt i 45 minutter med et enkelt felt. Pulstider på 15-45 sekunder ved 200 volt (feltene El og E2 i figurene 5 og 6) ga de molekyl vektsoppløsninger som er vist i redusert målestokk i figur 13.

Eksempel C: Etldlumbromid.

Man benyttet forsøksbetingelsene fra eksempel B bortsett fra at gelene ble kjørt i mørke og inneholdt 0,5 >jg pr. ml etldlumbromid i gelen så vel som sirkulasjonsbuffere, og pulstidene var 30 og 45 sekunder ved bruk av D-273 gjærlysater. Det ble oppnådd klar oppløsning av mange kromosomer.

I de ovenfor angitte eksempler skjedde lyseringen på konvensjonell måte og lysatene ble overført til elektroforesegelen på konvensjonell måte. Det er kjent at en slik behandling av lysater kan resultere i knusing eller annen skade på ømfintlige makromolekyler. Det ble imidlertid funnet en måte som i det vesentlige unngikk slike ugunstige virkninger og den utgjør endel av oppfinnelsen. Spesielt kan ifølge oppfinnelsen celler eller sfæroplaster (celler minus cellevegger) suspenderes i agarosegel og denne gel kan helles i former for å danne innskudd. Disse innskudd anbringes så i lyseringsoppløsning for å lysere de suspenderte celler eller sfæroplaster hvorefter de Intakte innskudd plasseres i tilpassede brønner i elektroforesegelen. Gelen som utgjør Innskuddet kan være den samme som eller forenelig med elektroforesegelen.

En illustrerende form som ble benyttet for denne teknikk er vist i perspektiv i figur 14 og omfatter et par til hverandre passende rektangulære blokker 14a og 14b som kan festes 1 den viste konfigurasjon ved hjelp av skruer 14c. Toppblokken 14a har et antall støpekanaler 14d som går gjennom hele blokkens tykkelse, mens bunnblokken 14b er fast. Når blokkene er montert i den i figur 14 viste konfigurasjon blir egnet agarosegel med suspenderte celler eller sfæroplaster helt i støpekanalene 14d og tillatt å størkne. Blokkene 14a og 14b separeres så og de innskutte blokker slik som 14e trekkes forsiktig ut, anbringes i lyserende materiale under betin-gelser tilstrekkelige til tilfredsstillende lysering, og innføres derefter omhyggelig og nøyaktig i tilpassede brønner tildannet i elektroforesedelen, for eksempel ved hjelp av en kam hvis ytre form og dimensjon passer til støpekanalen 14d. Det følgende eksempel D viser elektroforese ved bruk av denne nye teknikk.

Eksempel D: LyserIng i gel innskudd.

Gjærsfæroplaster (IO10 til IO11 celler pr. ml av den 1 56-ig lavgelagarose i TBE) ble suspendert i agarosegel og helt i støpekanalen for å danne innskudd. Disse ble så anbragt i en DNC ved 50°C over natten, for derved å lysere de suspenderte sfæroplaster. Gjærceller, på forhånd behandlet med merkapto-metanol, ble også suspendert i 156 agarosegel, men i dette tilfellet ble 75 pl av en zymolyase 5000-blanding (2 mg pr. ml 0,01M natriumfosfat, 5056 glycerin) tilsatt til innskudds-blandingen før forming av innskuddene. 75 pl zymolyase ble også tilsatt til 0,8 ml LET (0,5M tetranatrium EDTA, 0,01M Tris, pH=7,5). Støpte propper med gjærcellene ble tilsatt til LET, og inkubert over natten ved 37°C. De resulterende suspenderte sfæroplaster ble derefter lysert 1 NDS. Både celle- og sfæroplastpropper ble anbragt i tilpassede brønner i elektroforesegelen. Elektroforese ved bruk av de betingel-ser som er angitt ovenfor i forbindelse med eksemplene A-C ga god oppløsning av kromosomal DNA.

Eksempel E: " Double Minute DNA".

2,5 x IO<7> muse-3T3-R500-celler ble lysert i 0,3 ml NDS ved 50°C i 4 dager. Lysatet ble derefter fylt i 1,556 agarose-celler i TBE og kjørt ved 200 volt ved 30 sekunders pulsing. Det ble oppnådd et diffust bånd. Det beveget seg som om det hadde molekylvekten for det intakte "doble minute DNA" med molekylvekt ca. 600 x IO<6>. Markør var G-fag (molvekt ca. 500 x IO<6>).

Den nye type elektroforese som er beskrevet ovenfor har tallrike anvendelser. Som et eksempel er ved bruk av denne teknikk gjærkromosomale DNA for første gang med hell separert og karakterisert ved størrelse. En annen bruk av den nye teknikk er å utforske arten av DNA-gyrasekomplekser i E. coli-superviklede kromosomalområder for å kartlegge gyrase-lokaliseringer og således gi verktøy for eukaryotiske kromosomalanalyser. Den nye teknikk er spesielt fordelaktig når forskjellige molekyler som forskjellige DNA-molekyler har masser som ligger nær hverandre. Bruken av alternerende felter, hver med en intensitetsgradient, har en tendens til å skjerpe oppløsningen drastisk og tillater uventet oppløsning for molekyler med masser nær hverandre. En annen bruk er oppløsning av et stort antall bånd i samme gel, et viktig våpen når eukaryotisk DNA skal analyseres. Ytterligere en anvendelse av denne nye type elektroforese er for rensing av molekyler som enzymer, for eksempel urokinase, myosiner eller hyaluronsyrer for å tilveiebringe en renset prøve som kan tjene som basis for å utvikle en måte for fremstilling av den samme eller et ekvivalent molekyl. Som ytterligere en anvendelse kan virkningen av forskjellige midler som medikamenter, bedømmes med henblikk på deres virkning på kromosomer, nukleinsyrer og proteiner på grunn av den mulighet oppfinnelsen gir for å separere slike stoffer. Som et ytterligere eksempel kan polymerer nøyaktig og hurtig analyseres med henblikk på molekylvektsfordeling, forgrening og andre fysikalske egenskaper ved bruk av den nye type elektroforese. Som ytterligere et eksempel skal intakte eller oppkuttede humane, animalske eller plantekromosomer analyseres ved bruk av den nye type elektroforese.

Det skal være klart at den laboratorieinnretning som er diskutert i forbindelse med figurene 1-8, og den spesielle type elektrisk felt som derved benyttes, og den proppstøpe-innretning som er diskutert i forbindelse med figur 14, kun er eksempler som er hensiktsmessige for å forklare visse av oppfinnelsens prinsipper. Tallrike variasjoner er mulige og innenfor oppfinnelsens ramme. For eksempel kan et forskjellig formet elektroforesekammer eller forskjellig tilveiebragte, fordelte eller varierte elektriske felt benyttes så lengde partiklene påvirkes av elektriske felt som varieres med tiden for å bevege dem i totale retninger generelt på tvers av minst to av de relevante, operativt signifikante felt. For eksempel kan de ønskede felt dannes ved forskjellig formede elektroder, ved egnet anbragte viklinger eller ved andre kilder eller kombinasjoner av forskjellige kilder, og relevante feltretninger kan kontrolleres på andre måter som uten begrensning og endre nettretningen for feltet eller å endre elektrodens karakteristika (for eksempel spenning). Videre kan den ønskede feltgradient oppnås på en hvilken som helst av et antall måter, for eksempel ved å velge en egnet form for de relevante elektroder, ved å holde forskjellige elektrodedeler ved forskjellige spenninger eller ved gjensidig påvirkning av to eller flere felt. Videre kan flere enn to felt benyttes så lenge den totale virkning er minst og virker på ønsket måte på en partikkel først i en retning, så i en annen retning på tvers av den første og så videre, for å bevege partikkelen i en tredje retning på tvers av de to første.

Det er i den ovenfor beskrevne, foretrukne eksempelvise utførelsesform av den nye elektroforeselnnretning, funnet ønskelig å ha et antall diskrete elektroder, og å forbinde disse med hverandre ved innretninger som dioder som tillater at strøm føres til hver i kun en på forhånd valgt retning. Videre er det funnet ønskelig å ha trådelektroder som strekker seg langs de indre sidevegger av kammeret vertikalt eller noe nær vertikalt, fordi slike elektroder gjør det spesielt hensiktsmessig å danne de ønskede elektriske felt, og fordi det med slike elektroder, når de er lange nok i vertikal retning, er mulig å ha flere gelsjikt på hverandre, hvert inneholdende prøver av partikler, og å underkaste alle disse i det vesentlige identiske elektriske felt for å gjennomføre elektroforese av alle sammen samtidig. For å danne mere komplekse felt eller for å tilveiebringe større valgfrihet ved fremstilling av felt med valte egenskaper som feltene E, El og E2 i figurene 4-6, kan hver elektrode (eller i det minste en elektrode gi et valgt antall elektroder) av sin egen med bryter utstyrte energitilførsel slik at hver selektivt kan holdes på en hvilken som helst positiv eller negativ spenning innen et visst område (eller mot jord). I enkelte tilfelle vil helt ned til tre elektroder være tilstrekkelig og to av dem kan (intermittent) være forbundet til samme spenning så lenge de samarbeider med hverandre for å gi minst to elektriske felt som har de ønskede karakteristika (det vil si de er på tvers av hverandre).

Som en variasjon kan den nye type elektroforese som er beskrevet ovenfor benytte høyfrekvent skifting mellom på tvers av hverandre liggende felt, for eksempel ved frekvenser i området fra ca. IO<6> til IO<9> Hz, lagt på et eller flere stabile eller mere langsomt skiftende felt som feltene E, El og E2 ovenfor. Det antas da at de hurtig skiftene felt kan hjelpe til å rotere (eller orientere) sluttpartikler slik som makromolekyler på ønskelig måte, mens det stabile eller langsomt skiftende felt kan tjene til å bevege partiklene i den ønskede totale retning. Dette arrangement med hurtig skiftende felt og stabile eller langsomt skiftende felt kan således bruke helt ned til to felt på tvers av hverandre der minst et har en stabil eller langsomt skiftende intensitetskomponent og en hurtig skiftende intensitetskomponent lagt på den første. For eksempel kan gjensidig tverrgående felt i El og E2 som i figur 7 benyttes, men minst en av elektrodene kan ha pålagt på den viste firkants spennlngsbølgeform en meget høyere frekvent spennlngsbølgeform med valgt amplitude som ved en frekvens fra ca. IO<6> til ca. IO<9> Hz.

Claims (17)

1. Analytisk elektroforetisk fremgangsmåte for separering av partikler med på forhånd bestemt omtrentlig masse ved å utsette partiklene i et egnet medium for minst to elektriske felt (E', E") der feltretningene er på tvers i forhold til hverandre og veksler mellom henholdsvis høy og lav intensitet ute av fase med hverandre for forflytning av partiklene i totalretninger som generelt er på tvers av feltretningene for separering av partiklene, karakterisert ved at veksl ingsf rekvensen velges på basis av den på forhånd bestemte omtrentlige masse hos partiklene som skal separeres.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at minst et av feltene har en intensitetsgradient i en retning på tvers av sin feltretning for i det minste en del av den tiden det virker på partiklene.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at feltstyrken for feltene som virker på partiklene for å forårsake at de beveger seg innstilles til å være proporsjonale med massen opphøyd i 1,5.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man som partikler anvender polypeptidmolekyler.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man som partikler anvender myosin- eller hyaluron-syremolekyler.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man som partikler anvender nukleinsyremolekyler.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man som nukleinsyremolekyler anvender DNA-molekyler.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man som partikler anvender kromosomer.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at kromosomene avledes fra en eukaryot.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man som partikler anvender humankromosomer.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man som partikler anvender animalkromosomer.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man som partikler anvender plantekromosomer.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man som partikler anvender gjærkromosomer.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at partiklene bringes til bevegelse i et gelmedium med en effektiv porestørrelse mindre enn størrelsen til partiklene.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at partikkelsepareringen oppnås ved å lysere hele celler eller sfæroplaster i det samme eller en forenelig gel og at elektroforetisk separering gjennomføres uten først å separere partiklene fra de lyserte hele celler eller sfæroplaster.

16. Innretning for gjennomføring av fremgangsmåten ifølge krav 1, omfattende en hærer (10) for et medium i hvilket en eller flere prøver av partiklene som skal separeres og som har en på forhånd bestemt omtrentlig masse kan plasseres; organer (14) for å danne minst to elektriske felt som påvirker partiklene og med feltretninger som er på tvers i forhold til hverandre og organer (16, 18, 20) for gjentatt veksling av respektive felt mellom respektive lave og høye intensiteter ute av fase med hverandre for forflytning av partiklene i totalretninger som generelt er på tvers av feltretningene, karakterisert ved at vekslingsorganene (16, 18, 20) er anordnet til å virke ved en frekvens, valgt på basis av den på forhånd bestemte omtrentlige masse av partiklene som separeres.

17. Innretning ifølge krav 16, karakterisert ved at feltgenereringsorganet (14) omfatter minst tre separate elektroder i avstand fra hverandre og organet (18, 20, 22, 24) for å holde respektive elektroder ved respektive valgte potensialer under respektive valgte tidsrom.