NO177639B - Luminescensforbindelse og luminescensanalyse under anvendelse av forbindelsen - Google Patents

Description

Oppfinnelsens gjenstand er kjemiluminescerende acridinfor-bindelser og deres anvendelse i luminescensimmunoanalyser.

Lumineseerende forbindelser har allerede mangfoldig anvendelse. De anvendes som indikatorer i bioanalyser, enzymimmunoanalyser og luminescensimmunoanalyser (sammenlign W.P. Collins "Alternative Immunoassays", Verlag John Wiley & Sons Ltd., Chichester, 1985), anvendes imidlertid også i nukleinsyre-hybridiseringsanalyser (sammenlign J.A. Matthews et al. "Analytical Biochemistry". 151, 205-209, 1985). Dessuten anvendes kjemiluminescerende forbindelser i vaeskekromatograf i, i strømningsforkning og i kunstige lyskilder.

Ved kjemiluminescensimmunoanalyser har spesielt to struktur-typer av kjemiluminescerende markeringsstoffer fått større betydning. Det dreier seg herved på den ene side om luminol-resp. isoluminolderivater, som er beskrevet ved H.R. Schroeder et al., "Methods in Enzymology", Academic Press Inc., New York, Vol. LVII, 1978, 424 og følgende, samt i GB-PS 2 008 247 og 2 041 920, i DE-PS 26 18 419 og 26 18 511, samt i EP-søknad 135 071. Et oversyn over den praktiske anvendelse av isoluminolforbindeler som luminescensindika-torer finnes hos W.G. Wood, "J. Clin. Chem. Clin. Biochem." 22, 1984, 905-918.

På den annen side har også acridiniumesterforbindelser funnet anvendelse som kjemiluminescerende markeringsstoffer. Slike acridiumestere er kjent fra US-PS 3 352 791, GB-PS 1 316 363 og 1 461 877, samt fra EP-søknad 82 636. Anvendelsen av acridiniumestere som markeringsstoffer i immunoanalyser er omtalt i Weeks et al., "Clin. Chem." 29/8 (1983), 1474-1479. Også anvendelsen av fenantridiniumestere som markeringsstoff i luminescensimmunoanalyser er allerede kjent fra EP-søknad 170 415.

Kjemiluminescensen av acridiniumestere kan startes ved tilsetning av alkalisk I^C^-oppløsning. For mekanismen av kjemiluminescensen har F. McCapra, "Acc.Chem.Res." 9, 201, 1976, gitt en overbevisende forklaring. Derved er tydelig typen av den avspaltbare gruppe avgjørende så vel for lysquantutbyttet som også for den hydrolyttiske stabilitet.

De hittil allerede kjente acridiniumestere har i forhold til luminol- og isoluminolforbindelsene fordelen av høyere lysquantutbytte, som også ikke påvirkes av til indikatoren bundede proteiner (sammenlign Weeks et al., "Clin.Chem." 29/8

(1983), 1474-1479).

Skjønt de fra EP-søknad 82 636 kjente acridiniumfenylestere ved energisering av kjemiluminescensen ved milde oksydasjons-midler, utmerker seg ved en høy påvisningsfølsomhet, har de for den praktiske anvendelse forstyrrende ulemper. Fremfor alt er fenylesterbindingene i vandige systemer også allerede ved værelsestemperatur meget labil. Dertil kommer at under de der angitte oksydasjonsbetingelsene viser acridiniumfenyl-esterene en lysemmisjon som er først sterkt avsluttet efter ca. 10 sek., det vil si til over 95 #. Sammenligning hertil har andre ikke isotopiske analysefremgangsmåter meget kortere måletider, og muliggjør derved en høyere prøveproduksjon.

Oppfinnelsens oppgave var derfor å stille til disposisjon nye acridiniumforbindelser som ved høy lysquanteutbytte har en hurtigere reaksjonskinetik og dermed muliggjør kortere måletider for en luminescensimmunoanalyse.

Det ble nå funnet at disse krav oppfylles av kjemiluminescerende forbindelser som inneholder acridiniumderivater med formel I

der

R<1> er hydrogen, C1_4alkyl, R2 og R<3> er hydrogen, R<4> er en substituert sulfonamidgruppe med formel V

eller med formel VI eller en tioalkyl- eller tioarylrest med formel II

hvorved

X er en metylen-, etylen-, propylen- eller en orto-, meta-eller parafenylengruppe og R<5> er en reaktiv gruppe,

A~ er et anion som ikke påvirker kjemiluminescensen, og R<6> i formel V og VI er fenyl eller naftyl som også kan være substituert med C^_4alkoksy,

bundet direkte til eller over et bro-molekyl til et protein, et polypeptid eller til et annet stoff av biologisk interesse under dannelse av et stabilt, immunologisk aktivt konjugat.

Stoffer av biologisk interesse er fremfor alt antigener. Under dette begrep faller også hormoner, steroider, lege-midler, legemiddelmetabolitter, toksiner, alkaloider og også antistoffer.

Anionene som ikke påvirker kjemiluminescensen kan være et tetrafluoroborat-, perklorat-, halogenid-, alkylsulfat-, halosulfonat-, alkylsulfonat- eller arylsulfonatantion. Også et hvert annet anion kan anvendes så vidt det ikke slukker eller svekker kjemiluminescensen.

Med aryl menes aromatiske hydrokarboner, spesielt fenyl og naftyl. Med heteroatomholdige aromatiske grupper menes aromatiske hydrokarboner som inneholder et nitrogen- eller oksygenatom, spesielt kinolin, indol, pyrol og pyridin. Med halogener menes fluor, klor, brom og jod.

De substituerte aminogrupper er fortrinnsvis C^_4~alkyl-eller Ci_4-dialkylaminer, idet alkylrestene på sin side for eksempel kan være monosubstituert med hydroksy. Likeledes jan det ved de substituerte aminer dreie seg om en morfolinrest. De for R<2> og R<3> angitte alkoksyrester er fortrinnsvis slike med 1 til 4 C-atomer i alkyldelen.

De for X angitte forgrenede eller uforgrenede alifatiske grupper er fortrinnsvis C-j^alkylengrupper.

Vanligvis velges acridiniumderivater der X betyr en metylen-, etylen-, propylen- eller en orto-, meta- eller para-fenylen-gruppe. Til forbedring av acridiniumderivatenes vannopp-løselighet kan disse grupper også ha heteroatomholdige hydrofile substituenter.

Av spesiell betydning for anvendelsesmulighetene av acri-diniumder ivatene ifølge oppfinnelsen er substituenten R^. Ved det egnede valg av denne gruppe får acridinderivatet en så høy reaktivitet, at det allerede under milde betingelser selektivt kan inngå en binding med en funksjonell gruppe av det biologiske stoff som skal påvises. Egnede reaktive grupper fremgår av følgende oppstilling:

I mange tilfeller har acridiniumsalter ifølge oppfinnelsen hvor R<5> betyr en gruppe med formel III vist seg egnet:

Dessuten foretrekkes også acridiniumforbindelser der R<1> er en metylgruppe. Spesielt ofte anvendes acridiniumforbindelser ifølge oppfinnelsen som tilsvarer formel IV:

der A og X har ovennevnte betydning.

Når i acridiniumderivatene ifølge oppfinnelsen resten R<4> er en sulfonamidrest, kan den fortrinnsvis tilsvare formel V: eller formel VI: i det X og R15 har den ovenfor nevnte betydning, og R^ i formel V kan bety en Ci_irj-alkyl- eller C^_10-alkenylrest, en fortrinnsvis med C^_4-alkylmono- eller disubstituert aminogruppe, en morfolino-, en benzyl- eller en arylgruppe som også kan være substituert med hydroksy, amino, 4alkoksy eller aryloksy, og R<6> i formel VI i tillegg også kan bety hydrogen.

Typiske representanter av disse klasser av acridiniumderivater ifølge oppfinnelsen tilsvarer formel VII:

der Å og X har ovennevnte betydninger:

Ved foreliggende oppfinnelse stilles det altså til disposisjon to nye klasser av acridiniumf orbindelser idet den ene klasse utmerker seg ved en tiolestergruppering og dne andre ved en sulfonamidstruktur. Acridiniumacylsulfonamidderivatene har en høyere stabilitet, tiolesteren er en hurtigere kinetikk enn de tidligere kjente acridiniumfenylesterfor-bindelsene. Begge forbindelsesklasser utmerker seg dessuten ved et høyere lysutbytte.

En betydelig fordel ved acridiniumforbindelsen ifølge oppfinnelsen med tiolesterholdige avspaltbare grupper, i forhold til de u fra EP-søknad 82 636 kjente acridiniumfenylestere, ligger i den vesentlig hurtigere reaksjons-kinetikk av lysemisjonen. Således gir den ifølge eksempel 1 fremstilte acridiniumtioester ifølge oppfinnelsen (forbindelse 6) ved 1 sekunds måletid, et rundt faktor 10 høyere lysutbytte under de samme oksydasjonsbetingelsene. Dette høye lysutbytte ved samtidig korte måletider, muliggjør et vesentlig høyere prøveproduksjon til luminometeret.

Således viser fig. 1 kinetikken av lysemisjonen av antistoff-konjugat fra den ifølge eksempel 1 fremstilte acridiniumtioester (forbindelse 6) og fig. 2 denne av antistoffkonjugatet av 4-(2-succinimidyl-oksykarbonyletyl)-fenyl-10-metyl-acidinium-9-karboksylat-metosulfat (EP-søknad 82 636, side 10). 100 "pl av de respektive traceroppløsninger energiseres ved tilsetning av 350 pl (0,05 m KCl/NaOH-buffer, pH 13 + 0,1 % H2O2 til kjemiluminescens og opptegnes over et tidsrom på 10 sekunder.

I figur 1 oppnås den maksimale lysemisjon allerede efter 0,66 sek. og er efter 0,88 sek. allerede falt igjen til halvparten. Derimot oppnås i figur 2 den maksimale lysemisjon først efter 1,77 sek. og er først efter 2,88 sek. igjen falt til halvparten.

Helt uventet er at ved amidnitrogenet sulfonylsubstituerte acridinium-9-karboksylsyreamider har en utmerket kjemiluminescens, for det er kjent at acridinium-9-karboksylsyreamid i motsetning til acridinium-9-karboksylsyreesteren ikke viser kjemiluminescens (sammenlign. F. McCapra i "W. Carruthers og J.K. Sutherland: Progess in Organic Chem.", vol. 8, 231-277, 1973, Butterworth, London).

Åcridinium-9-karboksylsyretioesterene ifølge oppfinnelsen lar seg fremstille på følgende måte: Acridin eller dets derivater med R<2> og/eller R<3> i de påkondenserte fenylringer omsettes efter den av Lehmstedt og Hundertmark i "Ber." 63, 1229 (1930) angitte fremgangsmåte i etanol/iseddik med kalsiumcyanid til 9-cyanacridin. Herav fremstilles efter omkrystallisering ved omsetning med svovelsyre og natriumnitritt tilsvarende den av Lehmstedt og Wirth i "Ber." 61, 2044, (1928), omtalte fremgangsmåte acridin-9-karboksylsyre henholdsvis R<2>/R<3->substituerte acridin-9-karboksylsyre. Ved omsetning av acridin-9-karb-oksylsyren henholdsvis den R<2>/R<3->substituerte acridin-9-karboksylsyren med tionyl fremstilles forbindelsen med formel

VIII

der Y er klor. I steden for et halogen kan det i forbindelsen VIII for Y også innføres en oksykarbonyl-Ci_5-alkyl-, oksokarbonylaryl- eller imidazolidgruppe.

De R<2>/R<3->substituerte acridinderivater kan enkelt fremstiles efter litteraturkjente fremgangsmåter. Slike synteser er eksempelvis omtal i: "Comprehensive Heterocyclic Chemistry", Editors A. Katritzky, C.W. Rees, vol. 2, s. 395ff, Pergamon Press, 1984 eller med "Heterocyclic Compounds", vol. 9, "Acridines and Cond." 2<nd> Edition, R.M. Acheson, John Wiley and Sons, 1973.

Syrekloridet (VIII) omsettes derefter med en tiolkarboksyl-syre med formel IX,

for eksempel med 2-merkaptobenzosyre under alkaliske betingelser til tiolesterkarboksylsyre som derefter forestres med en for fremstilling av resten R^ egnet forbindelse, for eksempel med N-hydroksysuccinimid. Derefter alkyleres acridinforbindelsene efter litteraturkjente fremgangsmåter i 10-stilling. For en metylering egner seg fremfor alt trimetyloksoniumtetrafluorsulfonat, imidlertid oppnår man også med dimetylsulfonat, metylfluorsulfonat, toluensulfon-syremetylester eller trifluorometansulfonsyremetylester gode utbytter av den kjemiluminescerende acridiniumforbindelse. Til fremstilling av acridiniumsulfonamidderivatene ifølge oppfinnelsen går man likeledes ut fra acridin-9-karboksyl-syreklorid (VIII). Denne forbindelse omsettes derefter med et primært eller sekundært sulfonamid, fortrinnsvis med en beskyttet sulfonamidkarboksylsyre med formel X eller formel XI

der X og R^ har den ovenfor nevnte betydning og Z betyr en rest som beskytter karboksygruppen som derefter avspaltes. For eksempel kan det for denne reaksjon som beskyttelses-gruppe anvendes en benzensulfonylglycinbenzylester. Den efter avspaltning av beskyttelsesgruppen dannede syre overføres derefter til resten R^ med en egnet imid, for eksempel med N-hydroksysuccinimid. Herav fremstilles det kjemiluminescerende acridiniumforbindelser ifølge litteraturkjente fremgangsmåter ved alkylering ved nitrogenet i 10-stilling.

De dannede acridiniumforbindelser lar seg derefter omsette med et stoff av biologisk interesse, for eksempel et antigen, et antistoff, et hormon, et legemiddel, en legemiddelmeta-bolit, et toksin eller et alkaloid, til en luminescerende forbindelse. Derved bindes acridiniumderivatet enten direkte eller over et bromolekyl som polylysin, polyglutaminsyre eller polyvinylamid, til det biologiske interessante stoff under dannelse av et stabilt immunologisk aktivt konjugat. Dette konjugat betegnes også som tracer og anvendes i den nedenfor omtalte luminescensimmunoanalyse. For luminescensimmunoanalysen ifølge oppfinnelsen til bestemmelsen av et antigent stoff i en vaeskeprøve efter en kompetitiv eller en sandwichfremgangsmåte kreves minst en immunologisk aktiv komponent som er immobilisert på en fast fase og dessuten den luminescerende tracer. Luminescensimmunoanalysen kan nå gjennomføres på forskjellig måte.

En mulighet består i at man inkuberer det med antigenet spesifikt reagerende immobiliserte antistoff med en prøve av væsken som skal undersøkes på et konjugat av antigenet og et kjemiluminescerende acridiniumderivat (antigen-tracer), separerer prøven og den ikke-bundne tracer, sammenfører den bundne tracer med et oksydasjonsmiddel for å frembringe en lysemisjon og derefter bestemmer mengden av det tilstedeværende antigen fra den målte styrke av lysemisjonen.

En annen mulighet for gjennomføring av luminescensimmunoanalysen består i at man inkuberer etmed antigenet spesifikt reagerende immobilisert antistoff med en prøve av væsken som skal undersøkes med et konjugat fra et andre spesifikt reagerende antistoff og et kjemiluminescerende acridiniumderivat, separerer prøven og det ikke-bundne markerte konjugat, sammenfører det bundne markerte konjugat med et oksydasjonsmiddel for å frembringe en lysemisjon, og bestemmer mengden av tilstedeværende antigener fra den målte styrke av lysemisjonen.

De ovenfor luminescensimmunoanalyser kan også gjennomføres slik at man separerer væsken som skal undersøkes fra immobilisert antistoff før tilsetning av det markerte konjugat.

I en annen ifølge oppfinnelsen gjennomførbar luminescensimmunoanalyse, er det ikke antistoffet men antigenet som er immobilisert. Således kan et ved antistoffet spesifikt reagerende immobilisert antigen inkuberes med en prøve av væsken som skal undersøkes og en oppløsning av et konjugat fra antistoffet, og et kjemiluminescerende acridiniumderivat hvorefter prøven separeres fra det ikke-bundne markerte konjugat, og det bundne markerte konjugat sammenføres med et oksydasjonsmiddel. Derefter opptrer en lysemisjon fra hvis styrke kan bestemmes mengden av tilstedeværende antigen.

En ytterligere variant består i at man inkuberer et med antistoffet spesifikt reagerende immobilisert antigen med en oppløsning av et konjugat av antistoffet, og et kjemiluminescerende acridiniumderivat, separerer det ikke omsatte markerte konjugat, tilsetter en prøve av væsken som skal undersøkes, igjen separeres prøven og sammenfører det bundne markerte konjugat med et oksydasjonsmiddel for å frembringe en lysemisjon, og fra denne- derefter bestemmer mengden av tilstedeværende antigen.

Endelig er luminescensimmunoanalysen også gjennomførbar således at man inkuberer et med antistoffet spesifikt reagerende immobilisert antigen med en oppløsning av et konjugat av antistoffet og et kjemiluminescerende acridiniumderivat, tilsetter en prøve av væsken som skal undersøkes, separerer prøven og ikke-bundet konjugat, sammenfører det bundne markerte konjugat med et oksydasjonsmiddel og derefter bestemmer mengden av tilstedeværende antigen fra den målte lysemisjon.

Fremstillingen av acridiniumforbindelsen ifølge oppfinnelsen vises i eksemplene 1 til 3.

Eksempel 1

9- cyanacridin ( 1)

Til acridin (10 g) i 45 ml etanol setter man 3,3 ml iseddik og dråpevis en oppløsning av 5,25 g kaliumcyanid i 8 ml vann, oppvarmer reaksjonsblandingen i 2 timer under tilbake-løp, avkjøler og fjerner de flyktige bestanddeler under vakuum. Resten utrøres med 30 ml 2 N NaOH, suges fra og, efter to gangers vasking med 2 N NaOH og vann, hensettes noen tid fuktig i luften. Råproduktet røres ut i metylenklorid, uoppløst stoff suges fra og vaskes med metylenklorid, de forenede organiske faser sammenføres og det rå 9-cyanacridin omkrystalliseres fra n-butylacetat.

Utbytte: 50 % Smeltepunkt: 183-5°C.

IR: 2 230 cm-<1>.

Acridin- 9- karboksylsyre ( 2 )

9-cyanacridin (5 g) settes langsomt porsjonsvis til 40 ml konsentrert H2SO4 og blandingen oppvarmes i 2 timer ved 90-95°C efter tilsetning av 8,5 g NaN0£ og omrøres ytterligere i 2 timer ved denne temperatur. Den varme oppløsning helles

under hurtig omrøring i 620 ml isvann, precipitatet suges fra og oppløses i minst mulig 2 N NaOH. Oppløsningen filtreres og surgjøres med 50 #-ig H2SO4 hvorefter den utfelte acridin-9-karboksylsyre suges fra og tørkes under vakuum.

Utbytte: 95 % Smeltepunkt 288-9°C.

IR: 3440(br), 3200(br), 2600-2500(br), 1980; 1650; 1605; 1420"<1>.

Acridin- 9- karboksvlsvreklorid- hvdroklorid ( 3)

Acridin-9-karboksylsyre (5 g) settes porsjonsvis til 50 ml nydestillert SOClg og oppvarmes i 5 timer under tilbakeløp hvorefter den klare oppløsning konsentreres ved destillering inntil begynnende precipitering og denne fullføres ved cyklo-heksantilsetning og det hele avkjøles. Frasugning av precipitatet og tørking i vakuum gir acridin-9-karboksylsyre-kloridhydroklorid.

( Fenyl- 2'- karboksvlsvrelacridin- 9- tiokarboksvlat ( 4) Acridin-9-karboksylsyreklorid-hydroklorid (30 g) suspenderes i 720 ml metylenklorid. det tilsettes tiosalicylsyre (17,7 g) og 50 ml trietylamin og oppløsningen som er blitt klar, efteromrøres i 10 minutter ved værelsestemperatur. Efter fjerning av oppløsningsmidlet blandes resten med 35 g soda og 1 400 ml vann' og den resulterende oppløsning dampes inn til opptreden av en utfelling hvorefter denne suges fra. Filtratet mettes med NaCl og det derved dannede precipitat suges fra. Den vandige oppløsning av de forenede precipitater surgjøres ved 80°C med iseddik, det dannede produkt suges fra og tørkes i vakuum.

Utbytte: 80 % Smeltepunkt: 261-5°C

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 7,6-8,4 ppm, kompleks multiplett

IR: 1680 cm-<1> (s), 1720 (m) 1260 (s).

2 ' - ( succinimidoyloksykarbonyl) fenvlacridin- 9- tiokarboksvlat-151

Til suspensjonen av 10 g av tiolesterkarboksylsyren i 190 ml tørr" tetrahydrofuran setter man ved 0°C 3,2 g N-hydroksysuccinimid, derefter, ved -20°C, 6,9 g dicykloheksylkarbodi-imid (DCC) og det omrøres ved -20° C i 2 timer og derefter natten over ved værelsestemperatur. Efter tilsetning av 0,28 ml iseddik omrøres det il time, derefter tilsettes eddik-ester (25 ml) og precipitatet filtreres fra. Filtratet dampes inn og gir efter omkrystallisasjon fra klorbenzen et blekgult 2'-(succinimidoyloksykarbonyl)fenylacridin-9-tiokarboksylat.

Utbytte: 80 % Smeltepunkt: 198-200°C

IR: 1810 cm-<1>, 1780, 1745, 1225, 1205

NMR (DMSO), 100 MHz): S = 2,95 ppm (s, 4H), 7,7-8,4 pm (m,12H).

2'-( succinimidoyloksykarbonyl) fenyl- 10- metylacridinium- 9-tiokarboksylat- tetrafluoroborat ( 6) 3 g N-hydroksysuccinimidester (5) varmes opp med 7,8 g trimetyloksoniumtetrafluoroborat i 40 ml 1,2-dikloretan i 8 timer ved 80° C og efteromrøres natten over ved værelsestemperatur. Precipitatet filtreres fra og kokes ut med 1,2-dikloretan. De forenede organiske faser dampes inn og omkrystalliseres fra aceton-diisopropyleter.

Utbytte: 40 % Smeltepunkt: 245°C.

IR: 3440 cm-<1> (br), 1800, 1780, 1740 (s), 1670, 1065 (s), NMR DMSO, 100 MHz); § = 3,0 ppm (s, 4H), 4,95 ppm (s, svakt utbredt, 3H), 7,9-8,6 (m, 10H), 9,9 ppm (d, 2H).

Eksempel 2

Fremstillingen av succinimidoyloksykarbonylmetyl-10-metyl-acridninium-9-tiokarboksylat-tetrafluoroborat, foregår analogt fremstillingen av (6) idet man går ut fra syreklorid (3) og tiglykolsyre. Utbyttene av de enkelte syntesetrinn, samt den spektroskopiske karakterisering av produkt (7) til

(9) er angitt nedenfor:

Karboksymetylacridin- 9- tioarboksylat ( 7 )

Utbytte: 60 Smeltepunkt: 218°C (de kompo)

IR: 3440 cm_<1>(br), 2400(br), 1950(br), 1710(m), 1660(s),

1070(m)

NMR (DMSO, 100 MHz): 5 = 4,25 ppm (s, 2H); 7,6-8,4 (m, 8H).

Succinimidoyloksykarbonylmetylacridin- 9- tiokarboksylat ( 8) Utbytte: 80 #

IR: 3440 cm-<1>(br), 2930, 1820, 1785, 1740(s), 1205, 1165

NMR (DMSO, 100 MHz); S = 2,95 ppm (s, 4H), 4,77 ppm (s, 2H), 7,6-8,3 ppm (m, 8H).

Succinimidoyloksykarbonylmetyl- 10- metylacridinium- 9- tiokarboksylat- tetrafluoroborat ( 9)

Utbytte: 40 # Smeltepunkt: 250°C

IR: 3440 cm_<1>(br), 1810, 1780, 1735(s), 1538, 1350, 1060

NMR (DMSO, 100 MHz): § =2,9 ppm (s, 4H), 4,8 (s, 2H), 4,9 ppm, (s, 3H), 7,7-9,0 (m, 8H).

Eksempel 3

N- benzensulfonyl- N-( benzyl ok sykarbony Ime tyl ) acridin- 9-karboksylsyreamid ( 10)

3,3 g N-benzensulfonylglycinbenzylester blandes i 110 ml tetrahydrofuran med 130 mg 4(dimetylamino )-pyridin og 6 ml trietylamid, efter 10 minutter tilsetter man 3 g acridin-9-karboksylsyreklorid-hydroklorid og varmer opp den dannede suspensjon i 6 timer under tilbakeløp. Utfellingen suges fra, oppløsningsmidlet fjernes, resten tas opp i metylenklorid og

røres kort ut med 2 N NaOH. Den organiske fase dampes inn efter tørking over MgS04 og den resulterende rest omkrystalliseres fra toluen/heptan.

Utbytte: 70 1o Smeltepunkt: 58° C

IR: 3440 cm_<1>(br), 1735, 1680, 1357, 1165

NMR (DMSO, 100 MHz): § = 5,2 ppm (s, 2H), 5,3 ppm (s, 2H), 7,0-8,4 ppm (m, 18H).

N- benzensul f onyl- N-( karboksymetyl ) acridin- 9- karboksylsyre-amid( 11)

I g N-benzensulfonyl-N(benzyloksykarbonylmetyl)acridin-9-karboksylsyreamid i 60 ml iseddik hydrogeneres under tilsetning av 2 ml konsentrert HC1 og Pd/C (10 %) ved værelsestemperatur og normaltrykk; efter reaksjonens avslutning suges katalysatoren fra og fra filtratet får man ved inndamping karoksylsyren som gult faststoff.

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 5,0 ppm (s, 2H), 7,1-8,5 ppm (m, 13H).

Forbindelsen (11) omsettes med N-hydroksysuccinimid analogt fremstillingen av (5) til N-benzensulfonyl-N-(succinimidoyloksykarbonylmetylacridin-9-karboksylsyreamid (12). (12) quarterniseres med trimetyloksoniumtetrafluoroborat, som omtalt i forbindelse med (6) til N-benzensulfonyl-N-(succinimidoyloksykarbonylmetyl)-10-metylacridinium-9-karboksylsyre-amid-tetrafluoroborat (13).

Eksempel 4

N- fenyl- N( 4 - b enzy 1 ok s yk ar bonyl benzen sul f onyl ) acridin- 9-karboksylsyreamid ( 14)

II g 4(N-fenylsulfamido)benzosyrebenzylester blandes i 300 ml metylenklorid med 360 mg 4(dimetylamino)pyridin og 16,6 ml trietylamin og efter 10. minutter tilsetter man 8,34 g acridin-9-karboksylsyreklorid-hydroklorid (3) og oppvarmer i 16 timer under tilbakeløp. Den avkjølte oppløsning røres kort ut med 2 N NaOH, den separerte organiske fase vaskes med vann, tørkes over Na2S04 og dampes inn. Resten omkrystalliseres fra toluen/heptan.

Utbytte: 70 % Smeltepunkt: 161-163°C

NMR (DMSO, 100 MHz): 5 = 5,5 ppm (s, 2H), § = 6,8-8,6 ppm (m, 22H).

N- f enyl - N-( 4- karboksybenzensulfonyl) acridin- 9- karboksylsyre-amid- hydrobromid ( 15)

8,58 g N-fenyl-N-(4-benzyloksykarbonylbenzensulfonyl)acridin-9-karboksylsyreamid (14) oppvarmes i 30 ml 33 % HBr i iseddik i 2 timer ved 60°C, efter avkjøling tilsetter man 60 ml diisopropyleter, suger fra presipitatet og tørker under vakuum.

Utbytte: 95 % Smeltepunkt: 225°C

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 6,8-9 ppm (m)

N- fenyl- N-( 4- succinimidoyloksykarbonylbenzensulfonyl )-acridin- 9- karboksylsyreamid ( 16)

5,63 g N-fenyl-N-(4-karboksybenzensulfonyl)acridin-9-karboksylsyreamid-hydrobromid (15) i 250 ml tetrahydrofuran blandes med 2,8 ml trietylamin og avkjøles til -15°C og blandes med 0,96 ml klormaursyreetylester. Man efteromrører i 20 minutter, tilsetter 1,15 g N-hydroksysuccinimid, omrører i 3 timer ved -15° C, lar det tine til værelsestemperatur og efteromrører over natten. Precipitatet suges fra, filtratet dampes inn, resten tas opp med metylenklorid, den resulterende oppløsning vaskes med vann, NaHC03~oppløsning og vann og tørkes over Na2S04. Den organiske fase dampes inn og resten' omkrystalliseres fra toluen.

Utbytte: 50 % Smeltepunkt: 226°C (under spaltning). NMR (DMSO, 100 MHz): § = 2,95 ppm (s, 4H), S = 6,8-8,7 ppm (m, 17H). N- f enyl- N-( 4- succinimidovioksykarbonylbenzensul fonyl )- 10-metylacridinium- 9- karboksylsyreamid- fluorosulfonat ( 17). 1,16 g N-feny-N-(4-succinimidoyloksykarbonylbenzensulfonyl)-acridin-9-karboksylsyreamid (16) omrøres i 60 ml 1,2-dikloretan med 0,3 ml metylf luorosulf onat i 24 timer ved værelsestemperatur, det dannede precipitat suges fra og tørkes i vakuum.

Utbytte: 65 %

IR: 3420 cm_<1>(br), 3100(br), 1805(w), 1770(m), 1745(s), 1700(m), 1385(m), 1280(m), 1255(s), 1230(s), 1205(s)

NMR (DMSO, 100 MHz): § = 2,95 ppm (s, 4H), S = 4,75 ppm (s, br, 3H), S = 7,0-9,0 ppm (m, 17H).

Massespektrum: m/z = 594 : M<+> (kation).

Eksempel 5

Fremstillingen av N-(4-metoksyfenyl)-N-(4-succinimidoyloksy-karb onyl benzen sul f onyl) -10-metylacr i dinium-9 -karboksyl syre-amid-fluorosulfonat (21), foregår analogt fremstillingen av (17) (se eksempel 4), idet man går ut fra 4-[N- (4' -metoksy-fenyl)sulfamido]-benzosyrebenzylester og acridin-9-karboksyl-syreklorid-hydroklorid (3). Utbyttene av de enkelte syntesetrinn samt den spektroskopiske karakterisereing er angitt nedenfor.

N- ( 4- metoksyf enyl )- N- ( 4- benzvloksykarbonyl- benzensulfonyl )-acridin- 9- karboksylsyreamid ( 18)

Utbytte: 70 % Smeltepunkt: 182-183°C

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 3,5 ppm (s, 3H), 5 = 5,5 ppm (s, 2H), S = 6,35-6,63 ppm (d, br, 2H), S = 7,05-7,2 ppm (d, br, 2H), $ = 7,35-8,5 ppm (m, 17H).

N-( 4- metoksyf enyl)- N-( 4- karboksybenzensulfonyl ) acridin- 9-karboksylsyreamid- hydrobromid ( 19 ).

Utbytte: 95 % Smeltepunkt: 273°C (under spalting) NMR (DMSO, 100 MHz): $ = 3,5 ppm (s, 3H), § = 6,4-6,6 ppm

(d, br, 2H), S = 7,05-7,2 ppm (d, br, 2E), S = 7,7-8,5 ppm (m, 12H).

N-( 4- metoksyfenyl)- N-( 4- succinimidoyloksykarbonylbenzensulfonyl) acridin- 9- karboksylsyreamid ( 20 ).

Utbytte: 50 % Smeltepunkt: 232-234 °C

NMR (DMSO, 100 MHz): § = 2,95 ppm (s, 4H), § = 3,5 ppm (s, 3H), $ = 6,4-6,6 ppm (d, br, 2H), S = 7,05-7,25 ppm (d, br, 2H), S = 7,8-8,6 ppm (m, 12H).

IR: 3050 cm-<1>, 1805(w), 1780(m), 1740(s), 1700(m), 1505(m), 1370(m), 1250(m), 1200(s), 1185.

N-( 4- metoksyfenyl)- N-( 4- succinimidoyloksykarbonylbenzensulfonyl)- 10- metylacridinium- 9- karboksylsyreamid- fluorosulfonat ( 21)

Stoffet faller ikke ut ved reaksjonen, det utvinnes ved inndamping av oppløsningen og utrøring av resten av diisopropyleter.

Utbytte: 80 %

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 2,95 ppm (s, 4H) , S = 3,5 ppm (s, 3H), § = 4,8 ppm (s, br, 3H), § = 6,45-6,7 ppm (d, br, 2H), S = 7,2-7,4 ppm (d, br, 2H); S = 7,7-9 ppm (m, 12H).

Massespektrum: m/z = 624 M<+> (kation)

IR: 3440 cm_<1>(br), 3100, 2950, 1805(w), 1775(m), 1740(s), 1695(m), 1610(m), 1505(m), 1375(m), 1280(m), 1250(s), 1205(s ) .

Eksempel 6

Fremstillingen av N-(4-metoksyfenyl )-N-(3-succinimidoyloksykarbonyl-benzensulfonyl)-10-metylacridinium-9-karboksylsyre-amid-fluorosulfonat (25) foregår analogt til fremstilingen av (17) (se eksempel 4) idet man går ut fra 3-[N-(4 '-metoksy-fenyl)sulfamido]-benzosyrebenzylester og acridin-9-karboksyl-syreklorid-hydroklorid (3). Utbyttet av de enkelte syntesetrinn, samt den spektroskopiske karakterisering er angitt nedenfor.

N-( 4- metoksyf enyl )- N- ( 3- benzvloksykarbonylbenzensulf onyl )-acridin- 9- karboksylsyreamid ( 22)

Utbytte: 70 % Smeltepunkt: 168-170°C

NMR (DMSO, 100 MHz): B =3,5 ppm (s, 3H), S = 5,45 ppm (s, 2H), § = 6,5 ppm (s, br, 2H), S = 7,1 ppm (br, 2H), S = 7,3-8,8 ppm (m, 17H).

N - ( 4- metoksyf enyl )- N- ( 3- karboksvlbenzensulf onyl ) acridin- 9-karboksylsyreamid- hydrobromid ( 23)

Utbytte: 90 % Smeltepunkt: 264°C

NMR (DMSO, 100 MHz): 5 = 3,5 ppm (s, 3H), S = 6,4-6,6 ppm (d, br, 2H), S = 7,0-7,2 ppm (d, br, 2H), S 7,6-8,8 ppm (m, 12H).

N- ( 4- metoksyfenyl)- N-( 3- succinimidoyloksykarbonylbenzensulfonyl) acridin- 9- karboksylsyreamid ( 24)

Utbytte: 50 SÉ Smeltepunkt: 223-225°C

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 2,95 ppm (s, 4H), § = 3,5 ppm (s, 3H), 5 = 6,4-6,6 ppm (d, br, 2H), S = 7,0-7,2 ppm (d, br, 2H), 5 = 7,4-8,9 ppm (m, 12H).

IR: 3500 cm_<1>(br), 3060, 2950, 2840, 1805(w), 1785(m) 1740(s), 1700(m), 1510(m), 1380(m), 1250(m), 1205(m), 1165(m).

N-( 4- metoksyfenyl)- N-( 3- succinimidoyloksykarbonylbenzen-sul f onyl)- 10- metylacrIdinium- 9- karboksylsvreamid- fluoro-sulf onat ( 25)

Utbytte: 90 %

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 2,95 ppm (s, 4H), S = 3,55 ppm (s, 3H), S = 4,8 ppm (s, br, 3H), S = 6,45-6,7 (d, br, 2H), S = 7,05-7,3 ppm (d, br, 2H), S = 7,5-8,9 ppm (m, 12H).

IR: 3500 cm-<1> (br), 3080, 2950, 1805(w), 1780(m), 1740(s), 35 1700(m), 1610(m), 1510(m), 1380(m), 1250(s), 1205(s), 1170(s ).

Masse: m/z = 624 M<+> (kation).

Eksempel 7

Tracer- fremstilling for a- fetoprotein- kjemiluminescensimmuno-analvse

100 pl antistoff (1 mg/ml), 11,5 pl av den ifølge eksempel 1 fremstilte acridiniumtioester (forbindelse (6)) (1 mg/ml i DMSO og 600 pl konjugasjonsbuffer (0,01 M fosfat, pH 8,0) inkuberes i 15 minutter. Derefter tilsettes 200 pl lysin (10 mg/ml) og det hele inkuberes i ytterligere 15 minutter. Denne blanding overføres på en PD 10-søyle ("Sephadex" G 25 medium, 0,1 M fosfat, pH 6,3 som elueringsmiddel). 10 dråper/fraksjon samles. De enkelte fraksjoner undersøkes efter egnet fortynning på kjemiluminescensaktivitet (350 pl oksydasjonsmiddel: 0,1 % ' E- 2°2 1 °»1 N NaOH). Tracerf raks j onene (1. aktivitetstopp) samles og lagres ved 4°C.

Eksempel 8

Gjennomføring av a- feto<p>roteinkjemoluminescensimmunoanalyse. 50 pl standard/prøve og 150 pl buffer (fosfat; 0,1 M pH 6,3, 1 % Tween 20, 0,1 % storf ealbumin, 0,1 M NaCl, 0,01 % NaN3) rystes i 15 minutter med monoklonalt anti-AFP-antistoff-belagte smårør, derefter vaskes det med 2 x 1 ml buffer. 200 pl tracer tilsettes i egnet fortynning og rystes i 15 minutter. Igjen vaskes det med 2 x 1 ml buffer. Kjemilumin-escensmålingen startes med 350 pl oksydasjonsmiddel (0,1 % > H202 i 0,1 N NaOH, 2 sek. måletid).

Figur 3 viser det typiske forløp av en standardkurve av en immunokjemiluminometrisk analyse (ICMA) for a-fetoprotein

(AFP).

Claims (9)

1. Luminescensforbindelse, karakterisert ved at den omfatter et acridiniumderivat med formel I der R<1> er hydrogen, C^_4alkyl, R<2> og R<3> er hydrogen, R<4> er en substituert sulfonamidgruppe med formel V eller med formel VI eller en tioalkyl- eller tioarylrest med formel II hvorved X er en metylen-, etylen-, propylen- eller en orto-, meta-eller parafenylengruppe og R<5> er en reaktiv gruppe, A" er et anion som ikke påvirker kjemiluminescensen, og i formel V og VI er fenyl eller naftyl som også kan være substituert med C^_4alkoksy, bundet direkte til eller over et bro-molekyl til et protein, et polypeptid eller til et annet stoff av biologisk interesse under dannelse av et stabilt, immunologisk aktivt konjugat.

2. Anvendelse av en luminescens-forbindelse ifølge krav 1 som tracer ved bestemmelse av et antigenstoff i en væskeprøve i hvilken, i en kompetitiv eller en sandwich-fremgangsmåte minst en immunologisk aktiv komponent er immobilisert på en fast fase.

3. Anvendelse ifølge krav 2 der a) et med et antigent, spesifikt reagerende, immobilisert antistoff inkuberes med en prøve av væsken som skal undersøkes og et konjugat av antigenet og en kjemiluminescerende acridiniumforbindelse ifølge krav 1, b) prøven og det ikke bundne, markerte konjugat separeres, c) det bundne, markerte konjugat sammenføres med et oksydasjonsmiddel for å frembringe lysemisjon, og d) mengden av tilstedeværende antigen bestemmes fra den målte styrke av lysemisjonen.

4. Anvendelse ifølge krav 2 der væsken som skal undersøkes separeres fra immobilisert antistoff før tilsetting av det markerte konjugat.

5 . Anvendelse ifølge krav 2 der a) et med et antigent, spesifikt reagerende, immobilisert antistoff inkuberes med en prøve av væsken som skal undersøkes og et konjugat av antigenet og en kjemiluminescerende acridiniumforbindelse ifølge krav 1, b) prøven og det ikke bundne, markerte konjugat separeres, c) det bundne, markerte konjugat sammenføres med et oksydasjonsmiddel for å frembringe lysemisjon, og d) mengden av tilstedeværende antigen bestemmer mengden av tilstedeværende antigen fra den målte styrke av lysemisjonen.

6. Anvendelse ifølge krav 5 der væsken som skal undersøkes separeres fra det immobiliserte antistoff tilsetningen av det markerte konjugat.

7. Anvendelse ifølge krav 2 der a) et med antistoffet spesifikt reagerende immobiliserte antigen inkuberes med en prøve av væsken som skal undersøkes og en oppløsning av et konjugat og antistoffet og den kjemiluminescerende acridinderivat ifølge krav 1, b) prøven av det ikke bundne markerte konjugat separeres, c) det bundne, markerte konjugat sammenføres med et oksydasjonsmiddel for å frembringe lysemisjon, og d) mengden av tilstedeværende antigen bestemmes fra den målte styrke av lysemisjonen.

8. Anvendelse ifølge krav 2 der a) et med antistoffet spesifikt reagerende imobilisert antigen inkuberes med en oppløsning av et konjugat av antistoffet og en kjemiluminescerende acridiniumderivat ifølge krav 1, b) det ikke omsatte, markerte konjugat separeres, c) en prøve av væsken som skal undersøkes tilsettes, d) prøven igjen separeres, e) det bundne, markerte konjugat føres sammen med et oksydasjonsmiddel for å frembringe en lysemisjon, og f) mengden av tilstedeværende antigen bestemmes fra styrken av lys-emisjonen.

9. Anvendelse ifølge krav 2 der a) et med antistoffet spesifikt reagerende immobiliserte antigen inkuberes med en oppløsning av et konjugat av antistoffet og en kjemiluminescerende acridiniumderivat ifølge krav 1, b) en prøve av væsken som skal undersøkes tilsettes, c) prøven og det ikke bundne konjugat separeres, d) det bundne, markerte konjugat føres sammen med et oksydasjonsmiddel for å frembringe en lysemisjon, og e) mengden av tilstedeværende antigen bestemmes fra den målte styrke av lysemisjonen.