NO180558B - Ligandholdig medium for kromatografisk adsorpsjon, fremgangsmåte for fremstilling av mediet, samt anvendelse av mediet - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et ligandholdig medium, for kromatografisk adsorpsjon.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av mediet.

Dessuten vedrører oppfinnelsen anvendelse av det ligandholdige medium for isolering av syntetiske eller naturlige molekyler fra en fluidblanding hvor molekylene har affinitet for avidin, eller kan biotinyleres til å ha affinitet for avidin, eller deres rekombinante eller biotinylerte rekombinante versjoner med affinitet for avidin.

Fremstillingen av visse peptider og proteiner for bruk på humanhelse-, animalhelse-, industri-, nærings-middel- og agrikulturmarkedet har vært hemmet av høye omkostninger og dårlig tilgang, spesielt på det forebyggende helseområde. Peptider og proteiner for humanhelseanvend-elser blir naturlig syntetisert av levende organismer for deres egne behov, og til nå har dyr, planter, kadavere, serum og urin vært de eneste kilder hvorfra disse verdi-fulle biomolekyler kunne oppnås. F.eks. ble porsin- eller bovininsulin ekstrahert fra pankreas fra svin eller kveg for bruk av diabetikere, og HGH (humanveksthormon) ble oppnådd i små mengder fra kadavere for å behandle infantil dvergvekst. Disse biomolekyler ble vanligvis oppnådd i meget små mengder fordi kun begrensete mengder ble fremstilt biologisk, eller de ble hurtig nedbrutt av enzymer i sine omgivelser. To nye teknologier er utviklet som gjør det mulig med fremstilling av så og si et hvert peptid eller protein i relativt store mengder: kjemisk og biologisk syntese.

Den kjemiske vei oppnås ved fastfase (Merrifield-teknikken) og oppløsningsfasepeptidsyntese. Denne måte er vanligvis begrenset til peptider med mindre enn 20 amino-syrerester. Biologiske synteser benytter genetisk kon-struksjon og rekombinante DNA teknologier og produksjonen av celler i vevkulturer eller ved mikrobiell fermentering. Den biologiske måte er den eneste praktiske måte for fremstilling av høyere molekylvektspeptider i relativt store mengder.

Fordi interessen for disse biomolekyler er basert på deres ytelse er rensingen av de ønskede biomolekyler blitt en meget viktig faktor, spesielt i helse- og næringsaddi-tivindustrien, der omkostningene ved rensing alene, vanligvis omfattende flere prosesstrinn, kan representere mer enn halvparten av de totale omkostninger ved fremstilling av de ønskede biomolekyler.

Den kjente teknikk har antydet mange teknikker for kovalent å binde materialer som proteiner til faste substrater som en teknikk for separering av de bundne spesier, f.eks. beskriver US-4.732.811 bruken av polymerer inneholdende polyaldehydgrupper som er i stand til å binde forbindelser inneholdende primære aminogrupper (f.eks. protein, antistoffer og medikamenter).

Uansett den benyttede syntetiske rute er rensing nødvendig, og væskekromatografi har vært universalverk-tøyet som har vært benyttet for disse biosepareringer. Blant de kromatografiske tilnærmelser som har vært til-gjengelige (ionebytting, størrelsesutelukkelse, revers-fase, hydrofobinteraksjon og affinitet) har affinitetskromatografi potensiale for signifikant å redusere antall rensetrinn som er nødvendig. Affinitetskolonner basert på avidin er kjent å være brukbare for isolasjon av forskjellige biomolekyler, se D.A. Fuccillo, "Biotechniques",

3 (6),494-501 (1985). Spesielt har avidin-biotin interak sjon vært anvendt for isolering av proteiner fra biologisk syntetiske arbeidsrutiner. Avidin er et basisk høymolekyl-vekts glykoprotein som finnes i eggehvite; biotin er et lavmolekylvekts molekyl med et kondensert imidazol-tiofen-ringsystem som virker som merkelapp ved erkjennelsen av avidin, noe som resulterer i et ekstremt stabilt avidin-biotinkompleks. Fordi den syntetiske rute som velges vanligvis krever isolasjon av det ønskede biomolekyl fra meget lave konsentrasjoner i sin omgivelse, har avidinets ekstremt høye affinitet for biotin blitt eksploatert ved kromatografisk konsentrasjon og isolasjon av biotinmerkede ("biotinylerte") molekyler ved bruk av avidinaffinitetskolonner. Spesifisiteten og affiniteten for avidin (nativ tetramerform av fire identiske subenheter) for biotin er ekstremt høy, og kromatografikolonner basert på dette prinsipp har vært benyttet for analytiske formål. Imidlertid kan proteiner og peptider inneholdende biotinmerke-lappen ikke gjenvinnes fra en avidintetramer kolonne uten bruk av strenge betingelser som uungåelig ødelegger selve biomolekylet som isoleres. Forsøk på å overvinne den sterke binding mellom biotin og avidin uten å miste den høye spesifisitet for binding av biotinylerte molekyler har konsentrert seg til bruk av faste bærere for å stabilisere den dissosierte form av avidin. Imidlertid har disse kolonner ikke vært tilfredsstillende for preparativ anvendelse på grunn av nærværet av flere klasser av bindingsseter med mindre enn ønskelige bindingskapasiteter såvel som andre mangler forbundet med de spesielle faste bærermatriser som benyttes, se KP Henrikson, et.al. i "Analytical Biochemistry", 94, 366-370 (1979) .

Forskjellige måter har vært benyttet for å forankre avidindelen til en fast bærer. Hyppigst blir agarose, aktivert til en egnet form for kovalent kopling av primære aminogrupper av avidin, benyttet som bærer, se A.D. Landman et.al. i "J. Chem.Educ", 53 (9), 591 (1976). Imidlertid har disse kovalente bindinger ikke vist seg tilfredstillende på grunn av kjemisk ustabilitet og resulterende lekking av avidin fra bæreren, noe som har redusert driftslevetiden for kolonnen og også forurenset de tilsiktede rensede produkter.. Andre hovedmangler for disse spesielle kolonner er ikke spesifikk adsorpsjon av proteiner, kompressibilitet av kolonnematriksen ved høye væskestrømningshastigheter, noe som resulterer i et til-baketrykk og redusert strøm, og videre sensitiviteten for agarose mot mikrobiell nedbrytning. I tillegg er disse agarosematerialer ikke lette å rense eller sterilisere. Andre bærere basert på polystyren eller silisiumdioksid (Japansk Kokai patentsøknad nr. JP 64-003129 A) har vært benyttet, men disse lider av enda lavere bindingskapasiteter enn agarose såvel som en inkompatibilitet med visse biologisk viktige ioner.

Av disse grunner foreligger det et behov for et rensemedium som tillater effektiv separering og etter-følgende isolasjon av biologisk viktige molekyler i en form som er tilfredsstillende for de kritiske behov på slike områder som helse og næringsadditiver.

Det ligandholdige medium ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at det omfatter et substrat av en fornettet, organisk polymer hvortil det via en kjemisk stabil, ikke-hydrolyserbar bindingsgruppe er kovalent bundet en avidinpolypeptidligand i dissosiert, renaturert form, at mer enn 50 vekt% av avidinliganden er i monomer form, som binder seg til biotin under dannelse av et kompleks med en dissosiasjonskonstant på over lO-^ molar, og at den fornettede polymer er i stand til å holde avidinet i den monomere form, men at det ligandholdige medium ikke inneholder en spacer som er en non-ionisk, hydrofil polymerisk spacer.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kjennetegnes ved

a) omsetning, ved en pH nær nøytral verdi, en effektiv mengde av en avidintetramer med funksjonelle

grupper i et fornettet, organisk polymersubstrat for å

danne kjemisk stabile, ikke hydrolyserbare iminobindings-grupper mellom substratet og avidinet inntil det med de polymere funksjonelle grupper er dannet 1 til 3 kovalente bindinger, for hvert avidintetramermolekyl;

b) separering av det avidinholdige substrat og reduksjon av den dannede iminobinding til den tilsvarende

aminobinding; c) denaturering av avidintetrameren for å danne monomert avidin bundet til det kjemisk stabile substrat;

og

d) separering av det denaturerte avidin fra dissosierte subenheter av avidin og renaturering av det

avidinholdige substrat ved fjerning av denatureringsmidlet for å danne det ligandholdige medium.

Det ligandholdige medium vil heretter ofte bli benevnt avidinaffinitetsmedium.

Uttrykket "adsorpsjon" og "kromatografisk adsorpsjon" er ment i bredeste, eventuelt ikke helt rent teknisk, forstand å omfatte enhver form for binding mellom kjemiske spesier andre enn kovalentbinding. Således er binding ved affinitet eller Van der Waals krefter begge ment å ligge innenfor den brede mening av "adsorpsjon" slik uttrykket her benyttes, selv om de teknisk er å skille fra hverandre.

Som heri benyttet er uttrykkene "kjemisk inert" og "vann- og oppløsningsmiddeluoppløselig", når det henvises til substratet som er tilstede i mediet ifølge oppfinnelsen, ment å bety at substratet er "kjemisk inert" og "vann- og oppløsningsmiddeluoppløselig" under de tilsiktede bruksbetingelser som her beskrevet. På samme måte betyr uttrykket "kjemisk stabilt" når man henviser til bindingsgruppen som er tilstede i mediet ifølge oppfinnelsen, at bindingsgruppene er kjemisk stabile under de tilsiktede bruksbetingelser som her beskrives.

Foreliggende oppfinnelse muliggjør isolasjon av syntetiske eller naturlige molekyler og/eller biotinylerte derivater derav, ved adsorpsjon av molekylene på nye affinitetsmedier inneholdende avidin fiksert til en fast inert bærer, og bruken av preparatene for affinitetsmedier som er basert på kjemisk stabile, ikke hydrolyserbare bindinger av avidin til et polymer substrat.

Som heri benyttet betyr uttrykket "kolonne" i bredeste betydning en beholder som inneholder adsorpsjons-media. Karakteristisk er, ved kromatografisk separering, kolonnene fremstilt av glass, silisiumdioksid, rustfritt stål eller lignende og foreligger i form av hule rør (eller kapillarfibre), ofte viklet i en spiral, eller lange sylindriske rør som i motsatte ender har innløp og utløp. Ved preparativ kromatografi eller industriell separering kan kolonnen være en vertikal beholder, vanligvis sylindrisk, for å inneholde et stasjonært sjikt av adsorpsjonsmiddel. Foreliggende oppfinnelse egner seg for bruk med enhver ønsket kolonnekonfigurasjon.

Kjente avidintetramerkolonner inneholdende bundne enzymer/proteiner har begrensede levetider på grunn av aktivitetstap ("begrodd"harpiks), på hvilket tidspunkt hele harpiksmassen må kasseres på grunn av den irrever-sible binding av det angjeldende enzym. Når imidlertid kolonnene inneholder oppfinnelsens avidinmonomeraffinitetsmedier for å immobilisere enzymer, kan kolonnen re-genereres lett ved tap av enzymaktivitet på grunn av reverserbarheten av avidinmonomer/enzymkomplekset.

Ifølge oppfinnelsen er det tilveiebrakt et medium som er bemerkelsesverdig brukbart for isolering av biotinylerte molekyler og omfatter et inert, fornettet poly-mert substrat med kovalent bundet dertil via en ikke hydrolyserbar binding med formelen NH2CH2, en avidinpolypeptidligand i den dissosierte renaturerte monomere form.

Fremstilling av disse avidinmonomeraffinitetsmedier ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er basert på bindingen av avidin til et kompatibelt, kjemisk inert substrat via en kjemisk stabil binding som ikke brytes ned eller dissosierer under den etterfølgende kjemiske behandling som er nødvendig for å frigjøre bundne biomole kyler. Egnede inerte faste substrater for mediet ifølge oppfinnelsen inkluderer et vidt spektrum av polymerer (f.eks. fornettede, organiske polymerer) og uorganiske faststoffer. Fortrinnsvis er substratene meget inerte, porøse og partikkelformige (fortrinnsvis sfæriske). En velkjent og meget foretrukket type substrat er de partikkelformige, porøse fornettede organiske polymere adsorpsjonsmidler eller ionebytterharpikser med en makro-retikulær (presipitert) struktur. Denne type partikler benyttes vanligvis ved kromatografisk separering såvel som ved industrielle renseteknikker. Illustrerende materialer er Toyopearl-harpikser ("Toyopearl" er et varemerke for TOOSOH i Japan) og Amberlite XAD serien polymerer ("Amberlite" og "XAD" er varemerker for Rohm and Haas Company, USA). Akryl- og styrenbaserte polymerer og ko-polymerer med meget høy porøsitet og overflateareal er den mest foretrukne klasse substrater (se f.eks. US-patent 4.382.124). Av de mindre foretrukne substrater skal nevnes glasskuler, silisiumdioksid, gelpolymerer og lignende.

Egnede bindingsgrupper som benyttes for å kovalent binde avidin til de faste substrater inkluderer de som inneholder en karbon-nitrogengruppe eller en svovel-nitrogengruppe, f.eks. CH2NH-, C(0)NH-, NHC(0)NH-, C(0)NHNHC(0)NH- og S02NH-grupper, der NH-delen på høyre side av gruppeformlene skyldes avidinet. En meget foretrukket type binding involverer den reduserte iminogruppe med formelen NHCH2. Bindingsgrupper kan også omfatte alkylen-, cykloalkyl-, aryl- eller aralkylengrupper eller karboksyl-, hydroksy- eller alkoksysubstituerte derivater derav som avstandsstrukturer mellom skjelettet i polymersubstratet og det virkelige bindingssete for avidin-molekylet. Representative strukturer er: NH(CH2)n og NH(CH2)nCgH4der n er 1 til 4 og fortrinnsvis der n er 1 eller 2. Bindingen kan involvere et hvilket som helst antall av aminogruppene som finnes i avidinpolypeptidet, f.eks. e-aminogruppen i lysin, imidazolgruppen i histidin eller en hvilken som helst av a-aminogruppene i de N- terminale aminosyrer. Ligningene 1 og 2 er illustrerende for de kjemiske reaksjoner som skjer for å danne bindingen mellom avidin og det polymere substrat (i dette tilfelle inneholdende formylgrupper):

Aminogruppene i avidin reagerer kjemisk med egnede funksjonelle grupper som er posisjonert på det ovenfor nevnte polymere substrat, f.eks. formylgrupper, hvorved det dannes mellomproduktaminobindingen, CH=N, som deretter behandles med et egnet reduksjonsmiddel for å gi den kjemisk stabile aminbinding med formelen CH£NH. Egnede reduksjonsmidler er karakteristisk metallhydridkomplekser, NaCNBH3, NaBH4, H2og BH3. Fortrinnsvis benyttes salter av cyanoborhydrid for å tilveiebringe reduksjonen til aminobinding.

Et viktig karakteristikum for avidinaffinitetsmediet er arten av avidinenhetene som er bundet til den inerte bærer. Avidin opptrer naturlig i en tetramerform med fire identiske subenheter, hver bestående av 128 aminosyre-rester, 6 mannoserester og 3 glukosaminrester, med en kombinert molekylvekt på 68.000. Tetramert avidin, selv når det er bundet til et polymersubstrat som agarose (et polysakkarid), danner ekstremt stabile komplekser med biotinylerte molekyler (dissosiasjonskonstantK(d) 10~<15>), noe som gjør bundne biotinylerte enzymer, peptider og lignende, så og si umulige å gjenvinne i høye utbytter og med høy renhet på grunn av de kjemisk aggresive reaksjoner som må benyttes for å frigjøre de bundne biotinylerte molekyler fra sine komplekser med tetramere avidinmedier. Det er derfor et karakteristikum ved foreliggende opp finnelse at en overveiende mengde av det bundne avidin som er tilstede i sin monomere form og der dissosiasjons-konstanten for avidin-biotinkomplekset er betydelig over lO<-1>^, og fortrinnsvis ikke mindre enn 10"^, absolutt foretrukket mellom 10~<9>og 10~<7>. Det antas at den unike kombinasjon av den kjemisk stabile binding for avidin til polymersubstratet, den kjemiske struktur av substratet (hydrofob interaksjon, hydrogenbinding og lignende), og den fysikalske struktur for substratet (porøsitet, for-netningsnivå og lignende) er ansvarlig for å opprette de rombegrensninger på molekylnivå som opprettholder det bundne avidin i sin monomere form der dets høye spesifisitet for biotingruppen opprettholdes, mens de større dissosiative karakteristika for det monomere avidin-biotinkompleks gjør isolasjon og gjenvinning av biotinylerte molekyler virkelig reversersible. Fremgangsmåten for fremstilling av de monomere avidinaffinitetsmedia ifølge oppfinnelsen er basert på innføring av den kjemisk stabile aminobinding mellom substratet og avidin, fulgt av velkjent denaturering og renaturering som gir det endelige affinitetsmedium med bundet monomert avidin. Det første trinn ved fremgangsmåten involverer omsetning av avidin (vanligvis et overskudd) med de funksjonelle grupper i polymersubstratet. Parametrene som kontrollerer den grad i hvilken avidinet bindes til substratet i dette trinn omfatter tid, pH-verdi, temperatur, reaktantkonsentrasjoner

(avidin, substratfunksjonelle grupper, reduksjonsmiddel)

samt substratets sammensetning.

Reaksjonstemperaturene er på grunn av de fleste proteiners sensitivitet begrenset til moderate temperaturer, imidlertid er avidin ekstremt temperaturinsensitiv og et område på 5 til 35°C kan karakteristisk benyttes; fordi de fleste reaksjoner skjer langsommere ved reduserte temperaturer er 20 til 25°C å foretrekke for å trekke fordel av de høyere reaksjonshastigheter man kan tillate seg på grunn av avidinets gode temperaturstabilitet. Reak-sjonstider på mindre enn 10 timer resulterer i lavere avidinfikseringsnivåer mens tider utover 15 timer ikke i vesentlig grad synes å øke fikseringen av avidin. Reak-sjonstider på 24 timer kan benyttes for å sikre maksimalt avidinopptak uten uproduktive eller ugunstige virkende sidereaksjoner.

Et pH område på 5 til 10 kan benyttes for å gjennom-føre avidinfikseringsreaksjonen. Området på 6,5 til 8 er det mest egnede for å balansere tendensen av chargerte funksjonelle grupper som er tilstede i proteinet til å

danne intramolekylære bindinger og behovet for å maksi-malisere konsentrasjonen av frie ikke protonerte aminogrupper for reaksjoner med de substratfunksjonelle grupper, f.eks. formylgrupper. En egnet buffer som opprettholder pH-verdien i dette området er å foretrekke, pH-verdier på 6,5 til 7,5 er mest foretrukket.

Konsentrasjonen av avidin (mg/ml harpiks) som chargeres for å lade proteinet på substratet inneholdende funksjonelle grupper, f.eks. formyl funksjonelle grupper,

kan ligge fra 0,5 til 10 mg/ml. Konsentrasjoner på 2 til 5 mg/ml er foretrukket idet forholdet tetramert avidin: aminobindinger opprettholdes slik at den etterfølgende omdanning til bundet monomert avidin, er foretrukket. Konsentrasjonen av funksjonelle grupper, f.eks. formylgrupper, i substratpolymeren kan variere over vide om-

råder: 10 til 100 (imol funksjonelle grupper (f.eks. CHO) /

ml harpiks; konsentrasjoner på 35 til 70^mol/ml er foretrukket idet en god balanse opprettholdes med henblikk på antallet aminobindinger som dannes mellom polymersubstratet og det bundne avidin mens man opprettholder rom-begrensningene i avidinpolymermatriksen som tillater lett omdanning til den monomere form av det bundne avidin. Konsentrasjonen av reduserende kan variere fra en ekvi-molar til et ti ganger molart overskudd i forhold til konsentrasjonen av den funksjonelle gruppe, f.eks. formyl-gruppen. Molarforhold (reduksjonsmiddel:funksjonell gruppe [f.eks. formylgruppe]) utover 5 resulterer i at mindre bundet avidin omdannes til sin monomere form, forhold fra 1 til 3 tilsvarende ca. 3 til 10 mg reduksjonsmiddel pr. ml (når man benyttet natriumcyanoborhydrid som funksjonell gruppe, f.eks. formylgruppe, konsentrasjoner på 55 mol/ml f.eks.) betyr et foretrukket område med henblikk på omdanning av det bundne avidin til sin monomere form.

Omdanning av det bundne avidin fra den tetramere form til den monomere form oppnås ved konvensjonelle de-naturerings/renatureringsbehandlinger ved bruk av et antall reagenser som vandig dimetylsulfoksyl DMSO, urea, litiumklorid, guanidin-HCl. Fortrinnsvis benyttes en opp-løsning av guanidinhydroklorid inneholdende ca. 10%, vol/ vol eddiksyre, pH 2, for å omdanne bundet avidin til den monomere form. "Denaturering" henviser til dissosiering av avidin til sin monomere form og "renaturering" henviser til fjerning av denatureringsmiddel, stabilisering av pH-verdien og opprettholdelse av omgivelser som fører til opprettholdelse av den monomere form.

Isolasjon og rensing av naturlige og syntetiske molekyler ved bruk av affinitetsmedier kan oppnås ved kontakt med en vandig eller organisk blanding inneholdende det ønskede målmolekyl sammen med andre uønskede bestand-deler, med partikler inneholdende blandingen ifølge oppfinnelsen, det vil si bundet monomert avidin. Proteiner, peptider, enzymer, nukleotider, oligonukleotider og deres tilsvarende rekombinante eller biotinylerte rekombinant-versjoner kan isoleres og renses og kvantiteres for analytiske formål ved bruk av avidinaffinitetskromato-grafi. I tillegg kan de nye affinitetsmedier benyttes for: lokalisering og separering av antigener; utvikling av immunoanalyseteknikker; produksjon, rensing og/eller gjenvinning av DNA eller RNA eller renset probe molekyler for hybridiseringsstudier; rensing eller sekvensering av genetisk informasjon fra et antall organismer; og andre anvendelser som ville trekke fordel av bruken av avidin-af f initetskromatograf i .

Avidinaffinitetsmediet kan benyttes i flere former for å oppnå de ovenfor nevnte separeringer. Hyppigst benytter man medier i form av partikkelformige kuler, størrelsen kan ligge i området fra 5 |im og opptil 1000 |im. I tillegg kan man benytte medier enten i kolonnedrift eller satsdrift. Ved satsdrift kan f.eks. fermenterings-buljonger av rekombinantproteiner behandles med en mengde av avidinaffinitetsmediet for å fjernes sekreterte proteiner av interesse; de behandlede fermenterings-buljonger kan rekombineres med ytterligere strømmer for behandling (resirkulering) for å fjerne så mye som mulig av målmolekylene. Satsdrift er spesielt brukbart for isolering i preperativskala av relativt store mengder biomolekyler. På den annen side er kolonnemåten fortrinnsvis å benytte for analytiske og preliminære bedømmelsesformål såvel som for preperativ behov i liten skala.

Når så målmolekylet er isolert, det vil si konsentrert på avidinaffinitetsmediet, må det fjernes fra dette og separeres. Dette trinn gjennomføres ved hjelp av en hvilken som helst av et antall konvensjonelle prosesser som er velkjente for spesialistene for bioseparering. Blant prosessene som skal benyttes for å eluere målmolekylene fra affinitetsmediene er: behandling med oppløs-ninger av urea, glysin eller eddiksyre; variasjon av salt-innholdet; behandling med biotin; variering av pH-verdien og lignende.

Målmolekylene som kan isoleres og renses ved bruk av avidinaffinitetsmedier har et av flere karakteristika som tillater at separering skjer. Et karakteristikum er nærværet av biotingruppen i molekylet som skal isoleres. D(+)biotin (struktur I), også kjent som vitamin H eller koenzym R, har en molekylvekt på 244 og reagerer kjemisk (ved kjente reaksjoner) via sin karboksylsyre med aminogruppene på enzymer, peptider, proteiner og lignende, for å binde seg selv til målmolekylet via den resulterende amidbinding (ligning 2). Andre former av biotin, f.eks. iminobiotin eller lipoinsyre kan også understøtte separering av biomolekyler.

Det resulterende molekyl med ligning II er nå biotinylert, det vil si at det inneholder biotingruppen. Biotingruppen virker som identifiserende element når dette molekyl så eksponeres til det avidinmonomere affinitetsmedium; den sterke kompleksering av avidin med biotin forårsaker at det biotinylerte molekyl absorberes på mediet og derved separeres fra alle andre ikke biotinylerte molekyler som er tilstede i den spesielle blanding. Konvensjonelle metoder som beskrevet ovenfor benyttes så for å fjerne det biotinylerte molekyl.

For fullt ut å illustrere oppfinnelsens natur og måten for gjennomføring av den henvises det til de følgende eksempler. Disse eksempler resulterer kun noen av de mange anvendelser og preparater ifølge oppfinnelsen; eksemplene er ment å være illustrerende uten å være be-grensende. Forskjellige modifikasjoner, alternativer og forbedringer vil være åpenbare for fagmannen uten at man går utenfor oppfinnelsens ånd og ramme.

EKSEMPEL 1

Generell prosedyre for fremstilling av avidinaffinitetskolonner.

Akrylharpiks (partikkelstørrelse 44 til 88^lm) inneholdende 55 |imol formyl (CHO) -grupper/ml harpiks (AF-formyl Toyopearl (TM) 650M (TOSOH)) ble anbrakt på et sintret glassfilter og vasket med omtrent 10 sjiktvolumer 100 mM kaliumfosfat bufferoppløsning (pH=7,5). Den våte harpiks ble deretter overført til en polypropylenflaske. Renset avidin (Sigma Chemical Co.) ble veiet ut og oppløst i 100 mM fosfatbufferoppløsning (pH=7,5); slutt avidin-konsentrasjonen ble målt ved absorbsjonsverdier ved 282 nm (E(1%)=15,5), der E er ekstinksjonskoeffesienten og angir absorbsjonsintensiteten. Avidin (4,0 mg/ml harpiks) ble tilsatt til den på forhånd vaskede harpiks i polypropylen flasken, blandingen ble omrørt forsiktig i 10 til 15 minutter og natriumcyanoborhydrid (7,5 mg/ml harpiks) ble så tilsatt. Flasken ble lukket og anbrakt i en horisontal-ryster (lav hastighet), holdt ved 23 til 25°C i 24 timer. Den modifiserte harpiks ble så overført til en kolonne og deretter vasket med 100 mM kaliumfosfatbuffer med pH=7,5, eluatet ble gjenvunnet og målt med henblikk på ikke bundet avidin (absorbansmetoden); den totale mengde harpiksbundet avidin ble så beregnet ved differanse.

Den avidinfylte harpiks ble så vasket med 4 M guanidin-HCl-oppløsning inneholdende 10% eddiksyre (vol/ vol), pH 2, for å dissosiere det tetramere avidin til monomerform. Eluatene ble samlet, og mengden avidin som var fjernet fra harpiksen ble bestemt via absorbansavlesninger. Avidinmonomeraffinitetsharpiksen ble så opp-slemmingspakket i HPLC-kolonner (Upchurch Scientific, Inc.) for etterfølgende bruk ved rensing av proteiner.

EKSEMPEL 2

Evaluering av avidinmonomeraffinitetskolonne ytelsen.

Dette eksempel bruker avidinmonomeraffinitets-harpikskolonnen som ble fremstilt i eksempel 1.

Den totale biotinbindingskapasitet ble bedømt ved beregning av mengden avidinmonomer som ble immobilisert pr. ml harpiks. Biotinbindingsaffinitetene og -kapasi-tetene ble bestemt ved bruk av D(<14>C)biotin. Råekstrakter av 24 timers kulturer av E.coli inneholdende plasmidet ptac l,3t ble benyttet for å bestemme bindingskapasiteten for biotinylerte peptider (V.L. Murtif, et al, "Proe. Nati. Acad. Sei.", USA 82, 5617-5621 (1985)) og for å be-dømme kolonnen med henblikk på rensing av rekombinante proteiner.

Karakteristika for den bedømte harpiks: Avidinmonomerkapasitet (beregnet) = 74,9 nmol/ml Total -^C biotinbindingskapasitet = 58,7 nmol/ml Reversibel<14>C bindingskapasitet = 51,2 nmol/ml Reversibelt biotinylert protein

(l,3Se) cap = 68,4 nmol/ml.

Ca. 78 vekt% harpiks immobilisert avidin binder biotin, og 87 vekt% av disse gjør det reversibelt; med l,3Se peptidet viste 91 vekt% av avidin reversibel bindingsevne, noe som antydet så og si total omdanning av avidin til den monomere form (redusert/reversibelbinding).

EKSEMPLENE 3 TIL 6

Forskjellige betingelser benyttet for å fremstille avidin-af f initetskolonner .

På en måte tilsvarende det som er beskrevet i eksempel 1 ble forskjellige avidinaffinitetskolonner fremstilt under et antall betingelser og bedømt med henblikk på effektiviteten for binding av proteiner (ifølge eksempel 2). Konsentrasjonene er uttrykt pr. ml harpiks.

EKSEMPEL 3

På en måte tilsvarende det som er beskrevet i eksempel 1 ble det benyttet en acetatbuffer (pH 5,5), avidin ble tilsatt ved 2,3 mg/ml og natriumcyanoborhydrid ble tilsatt i en mengde av 7,5 mg/ml.

Karakteristika for den oppnådde harpiks var: Avidinmonomerkapasitet (beregnet) = 57 nmol/ml Protein l,3Se bindingskapasitet = 21,5 nmol/ml

EKSEMPEL 4

På en måte tilsvarende det som er beskrevet i eksempel 1 benyttet man en fosfatbuffer (pH 7,5), avidin ble tilsatt ved 4,0 mg/ml og natriumcyanoborhydrid ble tilsatt ved 7,6 mg/ml.

Karakteristika for den oppnådde harpiks: Avidinmonomerkapasitet (beregnet) = 75 nmol/ml Protein l,3Se bindingskapasitet = 64 nmol/ml

EKSEMPEL 5

På en måte tilsvarende det som er beskrevet i eksempel 1 benyttet man en fosfatbuffer (pH 6,5), avidin ble tilsatt ved 3,85 mg/ml og natriumcyanoborhydrid ble tilsatt ved 23,0 mg/ml.

Karakteristika for den oppnådde harpiks: Avidinmonomerkapasitet (beregnet) = 161 nmol/ml Protein l,3Se bindingskapasitet = 115 nmol/ml

EKSEMPEL 6

På samme måte som i eksempel 1 ble det tilsatt en buffer av tris(hydroksymetyl)aminometan (pH 7,8), avidin ble tilsatt ved 3,0 mg/ml og natriumcyanoborhydrid ble tilsatt ved 30,0 mg/ml.

Karakteristika for den oppnådde harpiks: Avidinmonomerkapasitet (beregnet) = 43 nmol/ml

EKSEMPEL 7

Fremstilling av proteinprøver/ rensing ved affinitetskromatografi .

A. Rekombinant biotinvlsubenhet fra " E. Coli".

En rå ekstrakt ble fremstilt ved å føre en suspen-sjon av celler (10g av CSR26 "E. Coli" som overeksprimerer en l,3Se subenhet) i buffer A (100 mM ammoniumbikarbonat, 1,0 mM etylendiamintetraacetat dinatriumsalt, 2,0 mM PMSF (fenylmetylsulfonylfluorid), 0,01 vekt% natriumazid og 1,0 mM DTT (ditiotreitol), pH 8,3) gjennom en fransk presse eller ved lysering ved sondikering. Denne prosedyre ble gjennomført to ganger og celledebris fjernet ved sentri-fugering. Den klare supernatant ble behandlet med strepto-mycinsulfat for å fjerne nukleinsyre og deretter frak-sjonert ved differensial ammoniumsulfatmetning. Den resulterende proteinpellet fra 30 til 60 vekt% ammoniumsulfat metning inneholdt de biotinylerte l,3Se proteiner og ble oppløst i 14 ml buffer A. Denne oppløsning ble så dialy-sert mot buffer B (100 mM kaliumfosfat, 0,15 M natriumklorid, pH 6,8) .

B. Transkarboksvlate Biotinyl subenhet fra " Propioni-bacterium Shermanii".

En råekstrakt av transkarboksylase ble fremstilt som beskrevet HG Wood, B. Jacobson, BI. Gerwin og DB. Northrup i "Methods Enzymol.", 13, 215-131 (1969).

EKSEMPEL 8

Rensing av biotinylert l, 3Se subenhet og transkarboksylase fra råekstrakter.

I dette eksempel beskriver seksjon A den generelle prosedyre som ble benyttet i seksjonene C og D mens seksjon B beskriver affinitetskromatografikolonne som ble benyttet i seksjonene A, C og D.

A. Generell metode.

Høyytelsesvæskekromatografi (HPLC) ble benyttet for å karakterisere kvaliteten av separeringen og gjenvin-ningen av proteinene og peptidene etter at råekstraktene var underkastet affinitetskromatografi: Shimadzu HPLC systemet med en variabel bølgelengde detektor (regulert ved 220 nm). Andre kromatografiske metoder ble eventuelt benyttet for ytterligere å karakterisere rensingen av råekstraktene : reversf ase HPLC (Synchropak RP-C4 kolonne, 0,1 vekt% trifluoreddiksyre (TFA)/vann 0,1 vekt% TFA/aceto-nitril oppløsningsmiddelsystem); hydrofobinteraksjons-kromatografi (HI-HPLC) ved bruk av en Progel-TSK eter 5PW (Supelco, Inc.) kolonne med et tooppløsningsmiddelsystem (2,0 M ammoniumsulfat i 100 mM kaliumfosfatbuffer (pH 6,8) og 100 mM kaliumfosfatbuffer (pH 6,8)).

Bindingskapasitetene for forskjellige avidinaffinitetskolonner ble evaluert ved å ekvilibrere kolonnen med buffer B (beskrevet i eksempel 7) og metning av kolonnen ved multipelinjeksjoner av kjente konsentrasjoner av råekstrakter (beskrevet i eksempel 7). Kolonnene ble først vasket ekstensivt med buffer B inntil absorbansen for eluatene ved 220 nm ble redusert til 0,01 OD (optisk densitet). Kolonnene ble så vasket med buffer C (100 mM glycin-HCl buffer, pH 2,0) for å eluere tidligere bundet l,3Se biotinylsubenhet. SDS-PAGE ble benyttet for å veri-fisere identiteten til subenheten.

B_. Bedømte af f initetskromatograf ikolonner.

En kolonne fremstilt i henhold til foreliggende oppfinnelse (eksempel 1), kalt avidin-HPLC, og representer-ende den kjente teknikk, kalt avidinagarose (Sigma Chemical Co., subenhet av avidin bundet til 4 vekt% fornettet agarosekuler) ble bedømt side ved side.

C_. Kolonnevtelse ( rekombinant l, 3Se subenhet fra " E. Coli").

Biotin- og proteininneholdet for fraksjonene eluert med buffer C ved bruk av affinitetsmediet ifølge oppfinnelsen (avidin-HPCL) og et konvensjonelt affinitetsmedium (avidin-agarose) ble bestemt ved de foregående metoder. Sjiktvolumene som ble benyttet var 1,26 og 5,0 ml for avidin-HPLC- henholdsvis avidin-agarosekolonnene; strøm-ningshastighetene som ble benyttet var 1,0 ml/min.

Driftsbetingelsene for affinitetskolonnene inklu-derte flere viktige parametre. Forvasking av kolonnene før fylling var typisk nødvendig: ekvilibrering med 4 sjiktvolumer 100 mM kaliumfosfatbuffer (pH 6,8) inneholdende 150 mM natriumklorid og biotin (1,0 mg/ml) fulgt av eluering med 100 sjiktvolumer buffer C; disse betingelser ble også benyttet for å regenerere nye eller lagrede kolonner.

Fylling av proteinprøven ble ansett komplett når

kolonnevakevæsken gav absorbansverdier på mindre enn 0,05 OD for avidin-agarosekolonnen og 0,01 OD for avidin-HPLC-kolonnen. Eluering av de bundne proteiner ble gjennomført med buffer C og absorbansavlesninger ble igjen benyttet for å bestemme sluttpunktene for elueringsprosessen. Gjen-tatt bruk av den samme kolonne resulterte i signifikante differanser mellom de to typer kolonner: kolonnekrymping

for avidin-agarosesystemet og stabil reduksjon i bindingskapasiteten over 6 sykler mens ingen krymping ble observert for avidin-HPCL-kolonnen over 10 til 15 sykler uten reduksjon i bindingskapasiteten.

Bindingskapasiteten for avidin-HPLC-kolonnen var 4 ganger større enn den til den konvensjonelle avidin-agarosekolonnen og kunne arbeide 6 ganger hurtigere (4 0 min. i motsetning til 4 timer pr. syklus, etter forvasking). Ingen degradering av avidin-HPLC-kolonnenes kapasitet ble observert over levetiden i disse studier mens den konvensjonelle harpiks hadde mindre enn 50% av sin initialkapasitet etter 6 sykler. En oppsummering av resultatene ved bruk av rekombinant biotinylsubenhet fra E. Coli finnes i tabell 8c. D. Kolonnevtelse ( l, 3Se subenhet fra P. shermanii).

Rensing av biotinylenzymet, transkarboksylase ("P. shermanii"), fra råekstrakt ble gjennomført på samme måte som den for rekombinant l,3Se subenhet fra "E. Coli". I dette tilfelle ble imidlertid intet av enzymet gjenvunnet ved bruk av den kjente harpiks (avidin-agarose) mens 25 til 50 vekt% rent enzym ble oppnådd ved bruk av avidin-HPLC harpiksen. Tabell 8D oppsummerer ytelseskarakte-ristika for de to harpikser med henblikk på P. shermanii transkarboksylaze-enzymrensing.

E . Diskusjon av resultatene.

Tabell 8C oppsummerer kapasiteten (l,3Se subenhet fra E. Coli) og driftstidsfordelene for avidinaffinitetsmediet ifølge oppfinnelsen.

Tabell 8D oppsummerer anrikningen i renhet oppnådd under isolasjonen av transkarboksylaseenzym ("P. shermanii") ved bruk av avidinaffinitetsmediet ifølge oppfinnelsen. I motsetning til dette gav konvensjonelt avidin-agarose medium ikke noen anrikning i det hele tatt.

De følgende spesifikke eksempler illustrerer varia-sjoner i syntesen av nye ligandholdige medier ifølge oppfinnelsen. Spesielt kan akryliskskjelettpolymerer inneholdende formyl (CHO)grupper fremstilles ved en teknikk ifølge A. Kanamori et al., beskrevet i "J. Chromato-graphy", 363, 231-242. (1986); denne prosedyre ble benyttet i eksempel 9 og 10 som følger:

EKSEMPEL 9

Fremstilling av formvlgruppe ( CHO) holdig substrat basert på akrylskielettpolymer.

AF-epoksy Toyopearl 650M harpiks (tørr, 45 til 90 \ im, 10, Og) inneholdende 89 \ mol/ q epoksygrupper, ble tilsatt til en blanding av 5g dekstrose (glukose) og 40 ml 0,1 M natiumhydroksid i en 113,4g beholder. Den lukkede beholder ble så inkumbert ved 40°C i 24 timer i en opp-varmings/rysteapparatur ved 200 omdr./min. Den resulterende harpiks ble anbrakt i en kolonne, vasket grundig med vann og overført til en 113,4g beholder. Natrium-periodatoppløsning (0,1 M, 15 ml) ble så tilsatt og den resulterende blanding rystet i et isbad i 1 time. Kulene ble vasket med vann på en Buchner-trakt og deretter inkubert i 25 ml 0,1 M HCL ved 25°C i 30 minutter i en oppvarmings/rysteapparatur. Kulene ble til slutt vasket grundig med vann. Formylgruppeanalyse indikerte et CHO-innhold på 55fimol/g (tørr harpiks) .

EKSEMPEL 10

Fremstilling av formvlgruppe ( CHO) holdig substrat basert på akrylskielettpolymer.

På samme måte som i eksempel 9 ble 10,0 g AF-epoksy Toyopearl 650M harpiks blandet med 100g 0,1 M natrium-hydroksidoppløsning inneholdende 0,020 g natriumborhydrid i en 226,8 g beholder. Blandingen ble inkubert ved 40°C i en oppvarmings/rysteapparatur ved 200 omdr./min i 24 timer. Den resulterende harpiks ble anbrakt i en kolonne, vasket grundig med vann og overført til en 113,4 g beholder. Natriumperiodatoppløsning (0,1 M, 15 ml) ble så tilsatt og den resulterende blanding rystet i et isbad i 1 time. Kulene ble vasket med vann på en Buchner-trakt og deretter inkubert i 25 ml 0,1 M HC1 ved 25°C i 30 minutter i en oppvarmings/rysteapparatur. Kulene ble til slutt vasket grundig med vann, formylgruppeanalyse indikerte et CHO-innhold på 55 (imol/g (tørr harpiks) .

EKSEMPEL 11

Fremstilling av formvlgruppe-( CHO)- holdig substrat basert på styrenskjelettpolymer.

A. Kopolvmer sammensetning.

En makroporøs kopolymer inneholdende klormetyl-grupper ble fremstilt ved suspensjonspolymerisering av 55 vekt% vinylbenzylklorid VBC, 36 vekt% divenylbenzen DVB, 9 vekt% etylvinylbenzen EVB; 40 vol% pentanol og 20 vol% toluen ble benyttet som porogener (fasedrøyere). Produktet kopolymeren inneholdt 8,2 vekt% Cl.

B. Omdanning til formylgruppeholdig polymer.

Ved bruk av en prosedyre som beskrevet av JT. Ayres og CK. Mann i "Journal of Polymer Science, PolymerLetters", 3, 505-508, (1965), ble klormetylgruppene i styrenkopolymeren omdannet til formyl(CHO)grupper ved hjelp av dimetylsulfoksid (DMSO) oksidasjon. 10 g klor-metylert harpiks (som beskrevet ovenfor) ble blandet med 14 g natriumbikarbonat i 200 ml DMSO ved 155°C i 6 timer. Produktet ble filtrert, vasket med DMSO, varmt vann og aceton og så tørket ved 100°C under vakuum.

EKSEMPEL 12

Fremstilling av formvlgruppene- Idig substrat basert på en stvrenskielettpolvmer.

A. Kopolymer sammensetning.

På samme måte som i eksempel 11 ble en makroporøs kopolymer med følgende sammensetning, fremstilt: 29 vekt% VBC/ 38 vekt% DVB / 9 vekt% EVB / 24 vekt% Styren (S) med porogennivåer som i eksempel 11. Produktkopolymeren inneholdt 5,4 vekt% Cl.

B_.Omdanning til formvlgruppeholdig polymer.

På en måte tilsvarende eksempel 11 ble den ovenfor angitte klormetylerte kopolymer omdannet til formyl-derivat.

EKSEMPEL 13

Fremstilling av formvlgruppe( CHO) holdig substrat basert på stvrenskielettpolvmer.

A. Kopolymer sammensetning.

På en måte tilsvarende eksempel 11 ble det fremstilt en makroporøs kopolymer med følgende sammensetning: 15 vekt% VBC / 39 vekt% DVB /IO vekt% EVB / 36 vekt% S med porogennivåer som i eksempel 11. Produktkopolymeren inneholdt 2,7 vekt% Cl.

B_. Omdanning til f ormvlgruppeholdig polymer.

På en måte tilsvarende eksempel 11 ble den ovenfor angitte klormetylerte kopolymer omdannet til formyl-derivat.

EKSEMPEL 14

Fremstilling av formvlgruppe( CHO) holdig substrat basert på stvrenskielettpolvmer.

A. Kopolymer sammensetning.

På en måte tilsvarende eksempel 11 ble det fremstilt en makroporøs kopolymer med følgende sammensetning: 7 vekt% VBC / 40 vekt% DVB / 10 vekt% EVB / 43 vekt% S med porogennivåer som i eksempel 11. Produktkopolymeren inneholdt 1,6 vekt% Cl.

B. Omdanning til formvlgruppeholdig polymer.

På en måte tilsvarende eksempel 11 ble den ovenfor angitte klormetylerte kopolymer omdannet til formyl-derivat.

Claims (11)

1. Ligandholdig medium for kromatografisk adsorpsjon, karakterisert ved at det omfatter et substrat av en fornettet, organisk polymer hvortil det via en kjemisk stabil, ikke-hydrolyserbar bindingsgruppe er kovalent bundet en avidinpolypeptidligand i dissosiert, renaturert form, at mer enn 50 vekt% av avidinliganden er i monomer form, som binder seg til biotin under dannelse av et kompleks med en dissosiasjonskonstant på over 10-1(^ molar, og at den fornettede polymer er i stand til å holde avidinet i den monomere form, men at det ligandholdige medium ikke inneholder en spacer som er en non-ionisk, hydrofil polymerisk spacer.

2. Medium i samsvar med krav 1, karakterisert ved at den ikke hydrolyserbare bindingsgruppe inneholder en karbon-nitrogengruppe eller en svovel-nitrogengruppe, f.eks. at den ikke hydrolyserbare bindingsgruppe er valgt blant -CH2 NH-, -C(0)NH-, -NHC(0)NH-, -C(0)NHNC(0)NH- og -S02 NH-.

3. Medium i samsvar med krav 1 eller 2, karakterisert ved at den fornettede polymer er en porøs, polymerisk adsorpsjons- eller ionebytteharpiks i partikkelform, fortrinnsvis avledet fra en akrylisk eller styrenisk monomer.

4 . Medium i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert ved at avidinaffinitets-gruppen er i en monomer form som binder seg til biotin til dannelse av et kompleks med en dissosiasjonkonstant på ikke mindre enn IO <-9> molar.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av avidinaffinitets-mediumet ifølge et av kravene 1-4, karakterisert ved a) omsetning, ved en pH nær nøytral verdi, en effektiv mengde av en avidintetramer med funksjonelle grupper i et fornettet, organisk polymersubstrat for å danne kjemisk stabile, ikke hydrolyserbare iminobindings-grupper mellom substratet og avidinet inntil det med de polymere funksjonelle grupper er dannet 1 til 3 kovalente bindinger, for hvert avidintetramermolekyl; b) separering av det avidinholdige substrat og reduksjon av den dannede iminobinding til den tilsvarende aminobinding; c) denaturering av avidintetrameren for å danne monomert avidin bundet til det kjemisk stabile substrat; og d) separering av det denaturerte avidin fra dissosierte subenheter av avidin og renaturering av det avidinholdige substrat ved fjerning av denatureringsmidlet for å danne det ligandholdige medium.

6. Fremgangsmåte i samsvar med krav 5, karakterisert ved at i) pH-verdien i trinn a) er fra 6,5 til 8,5; og/eller ii) pH-verdien i avidinaffinitetsmediet i trinn d) justeres til nær nøytral verdi.

7 . Anvendelse av det ligandholdige medium ifølge et av kravene 1-4 for isolering av syntetiske eller naturlige molekyler fra en fluidblanding hvor molekylene har affinitet for avidin, eller kan biotinyleres til å ha affinitet for avidin, eller deres rekombinante eller biotinylerte rekombinante versjoner med affinitet for avidin.

8 . Anvendelse i samsvar med krav 7 hvor fluidblandingen er en organisk eller vandig, flytende blanding.

9. Anvendelse i samsvar med krav 7 eller 8, hvor de syntetiske eller naturlige molekyler består av peptider, proteiner, enzymer, nukleotider, oligonukleotider eller rekombinante eller biotinylerte eller rekombinant-biotinylerte versjoner derav.

10. Anvendelse i samsvar med et av kravene 7-9, hvor fluidblandingen som inneholder de syntetiske eller naturlige molekyler bringes i kontakt med det ligandholdige medium i en kromatografisk kolonne.

11. Anvendelse i samsvar med et av kravene 7-9, hvor en flytende blanding omfattende syntetiske eller naturlige molekyler separeres ved væskeaffinitetskromatografi i en kolonne som inneholder det ligandholdige medium.