NO20031523L - Kombinasjons-biosensor - Google Patents

Abstract

Forekomsten av hvilke som helst av N2 biomidler i en prøve, idet N er et helt tall større enn 1, kan raskt bestemmes i to hovedtriim: (1) gjennomføring av N separate ELISA prosesser (f.eks. test 1, test 2 og test 3, hvor N=3) på porsjoner av prøven samtidig for å identifisere (INDIK.A) en gruppe av N biomidler som inneholder biomiddelet, hvor hver av de N separate ELISA prosesser er i stand til å identifisere tilstedeværelsen av et biomiddel som faller innenfor en entydig gruppe av N biomidler og hvor biomidlene som er detekterbare ved hjelp av hvilke som helst av disse prosesser er forskjellige fira biomidlene som er detekterbare ved hjelp av hvilke som helst andre av de N prosessene. Deretter, når en test viser positivt, gjennomføres N ytterligere ELISA prosesser (f eks. test 4, test 5 og test 6, hvor N=3) på porsjoner av prøven samtidig for å identifisere (INDIK.B) det spesielle biomiddel. Hver av de sistnevnte N prosesser kan kun identifisere et respektivt ett av de individuelle biomidler som danner gruppen av N biomidler identifisert i det foregående trinn.

Description

Kombinasj ons-biosensor

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører deteksjon av biomidler (og/eller nukleinsyrer), og mere spesielt en fremgangsmåte for å identifisere tilstedeværelsen av biomidler og/eller nukleinsyrer av spesifikk interesse i en spesimen på kortest mulig tid, med et minimum av nødvendig utstyr og med kjente tester.

Bakgrunn

Helsemyndigheter er stadig på vakt overfor utbrudd av en smittsom sykdom som, dersom den ikke undersøkes tidlig, vil kunne vokse til epidemisk omfang blant den generelle befolkningen. For dette formål er helsemyndighetene pålagt å overvåke omgivelsene for forekomsten av uvanlige sykdommer,

som er symptomatiske på en sykdom, oppnå og analysere prøver for å identifisere det biologiske middel som fører til sykdommen og, når identifisert, offentliggjøre forholdsregler som må gjennomføres for å stanse spredningen av sykdommen. Biologiske midler slik som viruser og bakterier er en del av naturen, og utbrudd av sykdom forekommer typisk naturlig. Biologisk terrorisme, som er den overlagte frigjøring av et skadelig virus eller bakterie eller annet biologisk middel (heretter "biomiddel") blant en generell befolkning, og biologisk krigføring, den overlagte frigjøring av et biomiddel mot militære tropper som er i kamp, er imidlertid også av betydning.

En kjent forsøksprosedyre eller fremgangsmåte for deteksjon

av et spesifikt biomiddel som kan anvendes innen en rekke områder, slik som bioteknologi, miljøbeskyttelse og offentlig helse, er "enzyme linked immunoassay" (heretter omtalt som "ELISA"). ELISA prosessen utgjør en identifikasjonsprosess som anvender molekylære interaksjoner for å entydig identifisere målsubstanser. En grunnleggende definisjon av ELISA er en kvantitativ in vitro test for et antistoff eller antigen (f.eks. et biomiddel) hvor testmaterialet adsorberes på en overflate og eksponeres for et kompleks av et enzym

bundet til et antistoff som er spesifikt for den substans som det testes for og hvor et positivt resultat indikeres ved en behandling som gir en farge i forhold til mengden antigen eller antistoff i testmaterialet. Den grunnleggende ELISA prosedyre er beskrevet mere spesifikt i blant annet en bok med tittelen Methods in Molecular Biology Vol 42, John R. Crowther, Humana Press, 1995.

"Antistoffet spesifikt for den substans som det testes for" i den foregående definisjon utgjør et gjenkjenningsmolekyl, et molekyl som har begrenset oppførsel. Det vil si at gjen-kj enningsmolekylet binder til en spesifikk tre-dimensjonal struktur av et molekyl eller til en to-dimensjonal overflate som er elektrisk ladet og/eller hydrofob i et spesifikt overflatemønster. Det skal også bemerkes at ELISA-lignende måter hvor det anvendes andre gjenkjenningsmolekyler kan anvendes, slik som aptamerer, DNA, RNA og molekylære avtrykkspolymerer.

Mere nylig er den foregående definisjonen for ELISA blitt utvidet ut over den kolorimetriske måte, hvor farge og farge-intensitet anvendes som en reporter eller tegn på antigenet eller antistoffet, til å inkludere en voltametrisk eller amperiometrisk deteksjonsmåte, hvor en grad av forandring av spenning eller strømledningsevne i forhold til mengden av antigen eller antistoff inneholdt i testmaterialet tilveiebringer tegnene derpå. Internasjonal patentsøknad PCT/US98/16714, innsendt 12. august 1998 (internasjonal publikasjon No. WO 99/07870 med tittel "Electrochemical Reporter System for Detecting Analytical Immunoassay and Molecular Biology Procedures" (heretter "16714 PCT søknaden"), med prioritet fra US patentsøknader nr. 09/105.538 og 09/105.539) som leseren kan referere til, beskriver både et kolorimetrisk og et elektrokjemisk reportersystem for å detektere og kvantifisere enzymer og andre biomidler i analytiske og kliniske anvendelser. Det elektrokjemiske reportersystem i 16714 PCT søknaden anvender en sensor for å detektere voltametriske og/eller amperio-metriske signaler som dannes i forhold til konsentrasjonen av organiske (eller uorganiske) reportermolekyler ved redoks (f.eks. reduksjon-oksydasjon) resirkulering ved sensoren.

Kort, i ELISA testen, blir det mistenkte biomiddel først anbragt i en vannbasert buffer, slik som en fosfatbufret saltoppløsning, for å danne en prøveoppløsning. Denne prøve-oppløsning blandes med en mengde partikler, slik som kuler, hvis overflate er belagt med et antistoff overfor det mistenkte biomiddel, her også omtalt som et gjenkjenningsmolekyl og noen ganger som et reseptormolekyl. De spesielle antistoffer som anvendes for å belegge kulene er kjent for å binde til biomiddelet av interesse eller av betydning og er et primært antistoff eller "l°Ab". Det vil si at antistoff-belegget utviser en kjemisk "klebrighet" som er selektiv for spesifikke biomidler.

Et hvilket som helst biomiddel tilstede i prøveoppløsningen binder med en ikke-kovalent binding til et respektivt antistoff og blir derved festet til en respektiv en av kulene i blandingsoppløsningen. Dersom prøveoppløsningen ikke inneholder et biomiddel eller dersom biomiddelet som er tilstede i oppløsningen ikke er ett som binder til det valgte antistoff, da binder ingenting til det foregående antistoff. Videre prosessering av ELISA prosessen viser da ingenting.

Ved å anta at det mistenkte biomiddel er tilstede i prøven, vil biomiddelet binde til antistoffet som er belagt på kulene.Oppløsningen inneholder da en mengde av biomiddel-molekyler som henholdsvis er bundet til like stor mengde belagte kuler, en l°Ab/biomiddel kombinasjon. Blandingen vaskes eventuelt for eksempel i fosfatbufret saltvann og et andre antistoff, mere spesifikt et antistoff og enzym-bundet kombinasjon, tilsettes deretter til blandingen. Det andre antistoffet er også ett som er kjent til å binde til det mistenkte biomiddel, et annet gjenkjenningsmolekyl. Det andre antistoff kan enten være ett som er monoklonalt, f.eks. ett som binder til kun ett spesifikt molekyl, eller poly-klonalt, f.eks. en blanding av forskjellige antistoffer som hvert deler egenskapen med binding til målbiomiddelet. Enzymet er kovalent bundet til det andre antistoff og danner et kompleks som omtales som et sekundært antistoff-enzym konjugat eller "2°Ab-eriz". Som kjent av fagkyndige på området, er et enzym en "molecular scissors", et protein som katalyserer en biologisk reaksjon, en reaksjon som ikke forekommer i tilstrekkelig grad i fravær av enzymet. Enzymet velges til å tillate den påfølgende produksjon av en elektrokjemisk aktiv reporter.

2°Ab-enz binder til den eksponerte overflaten av det immobiliserte biomiddel for å danne en"antistoff sandwich"med biomiddelet som danner det midtre lag av denne sandwich. Antistoff-sandwichbelagte kuler vaskes igjen for å vaske bort eventuelt overskudd av 2°Ab-enz i oppløsningen som forblir ubundet.

Kulene og den festede antistoff-sandwich, l°Ab/biomiddel/2°Ab-enz komplekset, i oppløsningen anbringes over den eksponerte overflaten av en redoks resirkuleringsensor. Substratet til det foregående enzym tilsettes til oppløsningen og substratet spaltes ved hjelp av en enzymet til å danne en elektrokjemisk aktiv reporter. Substratet til enzymet, omtalt som PAP-GP, er en hvilken som helst substans som reagerer med et enzym for å modifisere substratet. Effekten av enzymet er å separere, kutte, PAP, en para-aminofenol, den elektrokjemisk aktive reporter, fra GP, en elektrokjemisk inaktiv substans.

Den foregående kjemiske reaksjon er konsentrert på overflaten av sensoren. Graden av produksjon av den foregående reporter (PAP) er proporsjonal med den initiale konsentrasjon av biomiddel. Reporteren reagerer i sensorens overflate og produserer en elektrisk strøm gjennom sensoren som varierer med tid og som er proporsjonal med konsentrasjonen av biomiddelet, omtalt som redoks resirkulering. Forekomsten av elektrisk strøm utgjør en positiv indikasjon på tilstedeværelsen av det mistenkte biomiddel i prøven. Analyse av de elektriske strømmer som produsert i løpet av et tidsintervall og sammenligning av verdiene for denne elektriske strøm med eksisterende laboratoriestandarder av kjente biomidler tillater kvantifisering av konsentrasjonen av biomiddel tilstede i den opprinnelige prøve.

ELISA prosessen har en omfattende anvendelse med hensyn til å detektere biomidler. Desto større antall laboratorier som er utstyrt for å undersøke med hensyn på spesifikke biomidler og jo mere disse laboratorier er fordelt utover et geografisk område, desto lettere kan et biomiddel som forekommer i miljøet gjenkjennes og håndteres av helsemyndighetene. Dessverre er antall slike anlegg relativt lite. Ved å erkjenne at fordeling av ELISA testkapabilitet blant den generelle befolkning, ikke bare laboratorier, er et ønskelig mål i forbindelse med biomiddeldeteksjon, ser man at det er mangel på trent personale som også er problematisk. Omfattende utbredelse av ELISA testkapabilitet vil i praksis ikke være mulig dersom ELISA testen ikke kan gjennomføres av personer med mindre fagkunnskap.

Som et eksempel fremstår den elektrokjemiske ELISA prosedyre og apparat som omtalt i PCT søknad 16714 og forgjenger ELISA prosedyrene som godt egnet for utførelse i et mikrobiologisk laboratorium av høyt utdannet personale som er oppmerksom på detaljer i testprosessen. Andre områder eller miljøer hvor en slik analyse er ønskelig kan imidlertid ikke benytte seg av hverken tilgjengeligheten av høyt utdannet personale eller av et passende utstyrt laboratorium. I slike omgivelser er tilgjengelighet en av et idiotsikkert, brukervennlig testapparat som kan analysere en prøve og rapportere et meni rig s" f y l"t— "resu 11 at" med m i n i rna 1 jrte nn e s k elig_^n_nb 1 and ing absolutt ønskelig.

Ved å anerkjenne dette behov har en av de foreliggende oppfinnere sammen med andre ko-oppfinnere frembragt en automatisert testprosedyre som er beskrevet i US patentsøknad nr. 09/837.946, innsendt 19. april 2001 med tittelen "Automated Computer Controlled Reporter Device for Conducting Immunoassay and Molecular Biology Procedures" (heretter "946 søknaden"), overdratt til søkeren av den foreliggende søknad, hvis innhold er innlemmet heri ved referanse. Apparatet i 946 søknaden tilveiebringer en brukervennlig alenestående bærbar enhet som kan gjennomføre en ELISA test automatisk og som kan opereres av personer som ikke er biologer og som krever minimal trening. Det automatiserte system inneholder en rekke oppløsninger og pumper som styres ved hjelp av en programmert computer.

Det foregående system anvender også kuler av magnetisk material som er belagt med gjenkjenningsmolekylet og en magnetisk posisjoneringsanordning for å manipulere og posisjonere de belagte magnetiske kuler under kontroll av computeren, slik som under vasketrinnene i ELISA prosessen, og for å posisjonere kulene i sensoren under redoks resirkulering. Den automatiserte testanordning i 946 søknaden tilveiebringer en løsning på utbredelse av testenheter som tar hensyn til eventuelle mindre fagkyndige operatører. Imidlertid, som den tidligere manuelle prosedyre, vil den automatiserte prosedyre ikke bestemme hvilket mistenkt virus som det skal søkes etter eller hva som skal prioriteres i søket for å identifisere det mistenkte biomiddel.

Hver av de foregående ELISA testprosedyrer, enten manuell eller automatisk, og/eller kolorimetrisk eller amperiometrisk, søker etter et enkelt mistenkt biomiddel og bestemmer konsentrasjonen av dette biomiddel dersom det detekteres. Identifikasjonen er i alt vesentlig en "go" eller"no-go" prosedyre. Ved en fremgangsmåte for identifikasjon, gjentas testprosedyren i serie ved anvendelse av forskjellige reseptormolekyler inntil biomiddelet er identifisert. Dersom resultatet av en test er en "no-go", da gjøres et annet biomiddel til det mistenkte og testen gjentas for dette andre biomiddelet. Den foregående testprosedyre kan fortsettes en rekke ganger inntil det ene eller det andre spesielle biomiddel er detektert, idet man forbruker forrådet av kjente reseptormolekyler eller man forbruker forrådet av kjente biomidler.

Skjønt ELISA testen er automatisert, som når man benytter testapparatet i 946 søknaden, kan identifikasjon av et biomiddel ta ganske mye tid å gjennomføre dersom testing gjennomføres i serierekkefølge, særlig dersom biomiddelet viser seg å være det minst sannsynlige i en omfattende liste av mistenkte biomidler. En løsning for å redusere tiden for identifikasjon er å benytte en bank av testapparater, ett testapparat for hvert biomiddel i gruppen av muligheter, og gjennomføre de separate ELISA testprosedyrer samtidig. En slik tilnærming krever ganske mye utstyr, særlig dersom man tester for en rekke forskjellige biomidler og er i realiteten upraktisk. Som eksempel, dersom man interesserer seg for omtrent femten forskjellige biomidler som mulige tilfeller,

er det mulig å teste samtidig ved å anvende en bank av femten automatiserte ELISA testapparater eller andre testapparater,

som hvert sørger for et respektivt biomiddel. Men så mye testapparatur er kostbar, krever ganske mye plass totalt eller forminsking, og vil kreve mye arbeid å lagre med reagenser og vedlikeholde. Følgelig menes fremgangsmåten å

være upraktisk.

En oppfinnelse med hensyn til å løse det foregående problem

er angitt i en tidligere US patentsøknad nr. 10/055318, Zooiinnsendt 23. oktober 2001 med tittelen "Combinational Strategy for Identification of Biological Agents" (heretter

318 søknaden), som navngir en av de foreliggende oppfinnere, ..-*^J"p"p ^^^^ ^ nnhold_^e r innl. e.mmeJ:. heri^ve^_j£e^^ oppfinnelse gjenkjenner eksplisitt at forskjellige gjenkjenningsmolekyler (f.eks. forskjellige typer) kan være gruppert sammen og anvendt samtidig i en ELISA test for å

bestemme om et biomiddel er tilstede som kobler til hvilken som helst av disse forskjellige gjenkjenningsmolekyler og faller følgelig innenfor gruppen av tilsvarende biomidler.

Ved oppfinnelsen beskrevet i 318 søknaden, bestemmes ett av

opp til2N<->1 biomidler i en prøve og identifiseres ved å

oppdele prøven i N deler og gjennomføre N separate

identifikasjonsprosesser (f.eks. ELISA), en prosess for hver av N delene, idet N er et helt tall større enn 1. Hver av disse N identifikasjonsprosesser assignert en respektiv

gruppe eller kombinasjon av biomidler for identifisering. Denne gruppe er unik for den respektive identifikasjonsprosess, hvor biomidlene i gruppen eller kombinasjonen er valgt fra2N<->1biomidlene og hvor summen av disse biomidler som utgjør denne gruppe eller kombinasjon er 2 (N_1) biomidler, som er mindre enn 2N<->1 biomidler.

Hver slik identifikasjonsprosess kan identifisere hvilke som helst av en rekke biomidler i gruppen eller kombinasjon av biomidler assignert for deteksjon hva angår den respektive identifikasjonsprosess. Minst noen av biomidlene i gruppen eller kombinasjon av biomidler assignert for en identifikasjonsprosess deles også av gruppen eller kombinasjon av biomidler som er assignert for identifikasjon i minst en annen av identifikasjonsprosessene og hver gruppe eller kombinasjon er assignert et biomiddel som er unikt for den respektive identifikasjonsprosess. Hver av de N separate identifikasjonsprosesser har følgelig evnen til på unik måte å identifisere et respektivt enkelt middel av biomidlene fra2N<->l biomiddelkombinasjonen som ingen av de andre identifikasjonsprosesser er i stand til å identifisere. Ved anvendelse av kombinasjonslogikk kan et spesielt biomiddel lett identifiseres.

Som eksempel, i en utførelse hvor N er lik to, er antallet biomidler som kan påvises ved anvendelse av to ELISA prosesser lik tre (dvs. 2<2->l). Prøven som inneholder ett av biomidlene (eller ingen) analyseres ("parsed") i to (dvs. N) deler og hver av disse deler testes separat for biomidlene (dvs. N tester). Den ene ELISA prosess for å teste en analysert prøve tilrettelegges slik at prosessen er i stand til å identifisere kun biomidler A og B; den andre ELISA prosess tilrettelegges slik at den kan identifisere kun biomidler B og C, hvorved identifikasjonen av biomiddel B, som er felles for begge prosesser, deles. Videre, er kun en av disse to prosesser entydig i stand til å identifisere biomiddel A, og den andre prosess er entydig i stand til å identifisere biomiddel C. Således, dersom begge identifikasjonsprosesser identifiserer et biomiddel, er en tolkning at biomiddelet i prøven er B, ellers vil kun en av de to identifikasjonsprosesser identifisere biomiddel A eller C dersom det er tilstede. En annen tolkning er at en kombinasjon av biomidler er tilstede, slik som både A og C,

som er mulig, og som er en tvetydighet. Da taes en annen test, slik som for enten A eller C, for å løse eventuell slik tvetydighet. I hovedsak i et enkelt hovedtrinn ved anvendelse av to ELISA testapparater samtidig, kan to mulige biomidler identifiseres samtidig og et tredje kan bestemmes uten tvetydighet med en etterfølgende test, som reduserer nødvendigheten av å bruke tre testapparater eller nedsetter tiden med hensyn til et enkelt testapparat for å gjennomføre tre separate tester. Idet antallet biomidler øker, øker også besparingene. Som et ytterligere eksempel, gitt trettien biomidler av interesse, behøves kun fem testapparater som opererer samtidig for å identifisere det spesielle biomiddel i en prøve, noe som reduserer behovet for tjueseks testapparater som opererer samtidig, eller som reduserer den tiden som kreves sammenlignet med den som kreves for å gjennomføre trettien tester med et enkelt testapparat.

Den foreliggende oppfinnelse har i alt vesentlig de samme Øfv ^ ——~~~~~~VF7^v5s& generelle fordeler som oppfinnelsen i 318 søknaden og oppfyller et lignende formål, men på en annen måte. Idet antallet biomidler som man ønsker å påvise og identifisere øker, vil den potensielle mengde av tvetydighet som resulterer fra de positive testresultater oppnådd fra testapparatet i oppfinnelsen i 318 søknaden øke sterkt. Det å redusere kompleksiteten av testprosedyren og gjøre denne prosedyre raskere og mindre kostbar å klargjøre, operere og vedlikeholde uten at man signifikant reduserer de fordeler som er oppnådd ved oppfinnelsen i 318 søknaden er klart ønskelig. Det er en fordel ved den foreliggende oppfinnelse at den oppfyller dette formål.

Et formål med den foreliggende oppfinnelse er således å redusere antallet individuelle tester som må gjennomføres for

å identifisere tilstedeværelsen av ett av flere mistenkte biomidler i en prøve, og å redusere den tiden som kreves for

å gjøre en slik identifikasjon uten kompleksiteten til den tidligere kombinasjons-testprosedyre.

Et ytterligere formål med den foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en prosedyre for å identifisere et biomiddel i en prøve som er blant biomidlene som er inkludert i en forhåndsdefinert liste av biomidler.

Et videre formål med den foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe midlene for å søke etter spesifikke biomidler med økt hastighet og effektivitet.

Et ytterligere formål med den foreliggende oppfinnelse er å definere en enestående brukervennlig protokoll for raskt å identifisere et ukjent biomiddel i en prøve ved å anvende ELISA prosessen.

Oppsummering av oppfinnelsen

I overensstemmelse med det foregående, bestemmer fremgangsmåten raskt eksistensen av hvilke som helst av N<2>biomidler i en prøve, i to hovedtrinn, idet N er et helt tall som er større enn 1: (1) først gjennomføres N separate ELISA prosesser på respektive porsjoner av prøven samtidig for å identifisere en gruppe av N biomidler som inneholder biomiddelet, idet hver av N separate ELISA prosesser er i stand til å identifisere tilstedeværelsen av et biomiddel som faller innenfor en unik gruppe av N biomidler og hvori biomidlene som kan påvises ved hvilke som helst av disse N prosesser er forskjellige fra biomidlene som kan påvises ved hvilke som helst andre av de N prosessene, og deretter (2), når en test viser positivt, gjennomføres N ytterligere ELISA prosesser på porsjoner av prøven samtidig for å identifisere det spesielle biomiddel; idet hver av de sistnevnte N prosessene kun kan identifisere et respektivt ett av de individuelle biomidler som danner gruppen av N biomidler identifisert som positive i det foregående trinn.

De foregående og ytterligere formål og fordeler ved oppfinnelsen, sammen med strukturegenskapen derav, som kun er kort oppsummert i de foregående avsnitt, vil fremkomme klarere for fagkyndige innen området ved å lese den detaljerte beskrivelsen av en foretrukket utførelse av oppfinnelsen, som omtalt i det etterfølgende, sammen med illustrasjonene derav som vist i de vedlagte tegninger.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 og 2 er høynivå figurlige fremstillinger av en utførelse for å identifisere et biomiddel blant ni forskjellige mulige biomidler, som respektivt representerer de primære og sekundære prosedyrer som anvendes for å identifisere biomiddelet. Fig. 3 illustrerer utførelsen i fig. 1 og 2 mere

detalj ert.

Detaljert beskrivelse av de foretrukne utførelser

Den etterfølgende beskrivelse antar en beslektethet med ELISA prosessen som beskrevet i den foregående bakgrunn og mere detaljert i 16714 PCT søknaden og 946 søknaden. Et utgangs-punkt i en ELISA test er å belegge reseptormolekyler på kuler. Spesifikt belegges kulene med et reseptormolekyl

(f. eks. gjenkjenningsmolekyl eller som også betegnet "l°Ab")

som adsorberer et spesifikt antigen (heretter omtalt som et biomiddel). Likeledes krever ELISA testen et sekundært antistoff-enzymkonjugat som er spesifikt for biomiddelet (f.eks. 2°Ab-enz). ELISA testen for dette spesifikke biomiddelet bestemmer både tilstedeværelsen av dette biomiddel i oppløsningen og, om tilstede, konsentrasjonen av biomiddelet. Formålet med den foreliggende oppfinnelse er å identifisere tilstedeværelsen av et mistenkt biomiddel fra et stort antall forhåndsbestemte kandidater.

Fig. 1 og 2 er høynivå figurlige fremstillinger av en utførelse for å identifisere et biomiddel blant ni forskjellige mulige biomidler, som henholdsvis representerer de primære og sekundære prosedyrer anvendt for å identifisere biomiddelet. For enkelthets skyld betraktes nomenklaturen anvendt for å betegne elementene i disse figurer. I denne beskrivelse representerer bokstaven XI et kulebelegg (f.eks.

gjenkjenningsmolekylet) som tjener som en reseptor for et spesifikt biomiddel (og kan også anvendes for å representere det sekundære antistoff-enzymkonjugat spesifikt for biomiddelet (f.eks. 2°Ab-enz)). Det spesifikke biomiddelet er gitt en tilsvarende betegnelse AX1. Som eksempel er kule-beleggene for tre biomidler AX1, AX2 og AX3 representert som XI, X2 og X3.

For å kjøre en ELISA test for tre biomidler ved anvendelse av en konvensjonell ELISA testprosedyre, er det nødvendig å ha tre separate gjenkjenningsmolekyler for disse biomidler, gjennomført for eksempel med et første rør med kuler belagt med reseptormolekyl XI, et annet rør med kuler belagt med reseptormolekyl X2 og et tredje rør belagt med reseptormolekyl X3. I ELISA prosessen er det også nødvendig å ha tre separate sekundært antistoff-enzymkonjugat (f.eks. 2°Ab-enz) som er spesifikke for biomiddelet assosiert med AX1, AX2 og AX3. En gitt prøve av biomiddelet deles i tre deler og plasseres i det tilsvarende rør med belagte kuler. Hvert rør testes i sin tur ved å anvende ELISA prosedyren for å bestemme eksistensen av det tilsvarende middel i prøven og om tilstede, konsentrasjonen av hvert middel. Den foreliggende oppfinnelse og fremgangsmåte anvender denne tidligere teknikk som en sekundær identifikasjonsprosedyre, som illustrert i fig. 2.

Alternativt, dersom man anvender ELISA testen for kun å bestemme om noen av biomidler AX1, AX2 og AX3 er tilstede i en prøve uten å identifisere det spesifikke biomiddel, kan man kombinere belagte kuler fra hver av de foregående tre rør i et enkelt rør for å danne en enkelt blanding av belagte kuler eller kule-sett. Deretter kjøres ELISA testen for denne blanding ved anvendelse av de passende antistoff-enzym-bundne kombinasjoner for hvert av de tre midler samtidig.

Det foregående kan betegnes som en "kombinert" testprosedyre. Det foregående identifiserer ikke hvilke biomidler som er tilstede, kun at minst ett av de tre biomidlene er tilstede. Den foregående kombinerte prosedyre er beskrevet i 318 søknaden og anvendes i oppfinnelsen som angitt i denne søknad. Som det klart fremgår fra beskrivelsen, er denne kombinerte testing, som illustrert i fig. 1, innlemmet i den foreliggende oppfinnelse og fremgangsmåte.

I en primær prosedyre for den nye fremgangsmåte testes en

prøve som inneholder et biomiddel (f.eks. de primære tester eller prosedyrer) for tilstedeværelsen av en rekke grupper av mulige biomidler, som beskrevet mere detaljert senere heri. Dersom en gruppe tester positivt, da gjennomføres ytterligere individuelle tester (de sekundære prosedyrer) på prøven for å identifisere det individuelle biomiddel i gruppen.

Den figurlige oversikts-fremstilling som viser de primære og sekundære trinn eller prosedyrer anvendt for å identifisere et individuelt biomiddel inneholdt i en prøve som angitt i henholdsvis fig. 1 og 2, illustrerer en spesifikk utførelse som inneholder tre separate ELISA prosedyrer i en primær prosedyre, vist i fig. 1, og en sekundær prosedyre, vist i fig. 2 som sammen tillater identifikasjon av så mange som ni forskjellige biomidler. Under henvisning til fig. 1, inneholder tre rør I, II og III gjenkjenningsmolekylene for ni forskjellige biomidler som ble valgt av operatøren som monterer utstyret. Disse gjenkjenningsmolekyler ordnes blant de tre rør slik at de tre rør inneholder et likt antall (f.eks. typer) av gjenkjenningsmolekyler. Rør I inneholder gjenkjenningsmolekylene XI, X2 og X3 for biomidler Axl, Ax2

og Ax3; rør II inneholder gjenkjenningsmolekylene X4, X5 og X6 for biomidler Ax4, Ax5 og Ax6 og rør III inneholder gjen-kj enningsmolekylene X7, X8 og X9 for biomidler Ax7, Ax8 og Ax9. De individuelle gjenkjenningsmolekyler for de ni forskjellige pre-selekterte biomidler av betydning utformes effektivt til distinkte grupper, som hver er unik. Hver slik gruppe er i sin tur dannet av individuelle gjenkjenningsmolekyler som også er unike; det vil si at gjenkjenningsmolekylet i et spesielt rør, slik som X4 ikke er inkludert i noe annet rør.

Operatøren sørger for en fortegnelse som korrelerer de respektive rør og biomidlene som representert ved hjelp av disse rør. Prøve VII som inneholder de mistenkte biomidler, typisk en vannbasert bufferoppløsning med det mistenkte biomiddelet, deles i porsjoner og en av disse porsjoner oppdeles i tre deler. Hver av disse tre prøvedeler plasseres i et respektivt ett av de tre rør for eventuelt å gi en reaksjon (f.eks. kobling) med et gjenkjenningsmolekyl ved begynnelsen av ELISA prosessering.

Fig. 2 representerer den andre del av testen. Idet man antar at ett av de ni biomidler i samlingen er tilstede i ett av de tre rør og spesifikt, i forbindelse med denne beskrivelse, er i rør II, da vil innholdene i rør II teste positivt ved den

respektive ELISA prosess. Da gjenkjenningsmolekylene X4, X5 og X6 som er inkludert i røret (og følgelig de tilsvarende biomidler) er kjente, testes prøven deretter for hvert av disse individuelle biomidler. Gjenkjenningsmolekyl X4 er avsatt i rør IV, gjenkjenningsmolekyl X5 er avsatt i rør V og gjenkjenningsmolekyl X6 er avsatt i det tredje rør VI.

En annen del VII' av prøven som inneholder biomiddelet er oppdelt i tre deler og hver del er anbragt i et respektivt rør av de tre rør for eventuelt å danne en koblingsreaksjon med et gjenkjenningsmolekyl. Da hvert rør inneholder et gjenkjenningsmolekyl som er unikt for et spesielt biomiddel, forekommer en reaksjon i kun det rør som inneholder gjenkjenningsmolekylet for biomiddelet inkludert i prøven. Hvert av rørene underkastes en ELISA prosess, ett spesielt rør tester positivt, for eksempel rør V, og det spesielle biomiddel, som her betraktes til å være biomiddel AX5, identifiseres.

Fordelen med å oppdele gjenkjenningsmolekylene likt i grupper med lik størrelse er innlysende. Dersom gjenkjenningsmolekylene for ni mulige biomidler i den foregående utførelse ble oppdelt i forholdet: 4: 3: 2 for å danne de tre gruppene, og dersom det mistenkte middel var lokalisert i gruppen som inneholder de fire forskjellige gjenkjenningsmolekyler, da vil den sekundære testing kreve fire separate ELISA testapparater (eller fire ELISA tester) i stedet for de tre tester som ble beskrevet og illustrert for 3:3:3 oppdelingen. Dette er mindre effektivt og uønsket.

Det foregående er illustrert mere detaljert i fig. 3 som det vises til. Tester 1, 2 og 3 tilsvarer prosedyren i fig. 1 og tester4, 5 og 6 tilsvarer prosedyren i fig. 2. Prøve VII oppdeles initielt i minst to porsjoner, hvorav en anvendes i den primære prosedyre og hvor resten er reservert for senere bruk, etter behov. Den ene del fordeles blant hver av ELISA testene og hver porsjon av disse tre porsjoner anbringes i respektive rør eller andre beholdere som inneholder de respektive grupper av gjenkjenningsmolekyler. ELISA test 1 anvender gjenkjenningsmolekyler som samlet er identifisert som Sett A, som er XI, X2 og X3 i fig. 1, og det passende konjugat identifisert som 2°-Ab Sett A. Andre kjente elementer som er vanlig i forbindelse med en ELISA prosess, slik som PAP-GP reportermolekylene og andre detaljer er ikke illustrert og behøver ikke beskrives ytterligere. ELISA test 2 inkluderer gjenkjenningsmolekylene, samlet identifisert som Sett B, og det passende konjugat identifisert som 2°-Ab Sett B og ELISA test 3 inkluderer gjenkjenningsmolekylene som samlet er identifisert som Sett C, og det passende konjugat identifisert som 2°-Ab Sett C.

Hvert sett av kuler er en blanding av forskjellige belagte kuler. Som et eksempel, for å formulere en enkelt blanding av kuler som kan testes for tilstedeværelsen av mer enn en type biomiddel samtidig slik som tre midler i en gruppe, nemlig midler AXl, AX2 og AX3, fremstilles multiple batcher av belagte kuler, en batch som er belagt med reseptormolekyler XI, en andre batch belagt med reseptormolekyler X2 og en tredje batch belagt med reseptormolekyler X3. Deretter, som et eksempel, blandes like porsjoner av hver batch sammen for å danne en kuleblanding eller, som forøvrig betegnet, kule-sett. Konjugatene for hver biomiddelgruppe fremstilles også som en blanding av de passende individuelle konjugater for de respektive biomidler.

Som et alternativ til å anvende separate belagte kuler, kan en kule være belagt med en rekke forskjellige gjenkjenningsmolekyler for å danne en multi-belagt kule, for eksempel med gjenkjenningsmolekyler XI, X2 og X3, for fremstilling av en ekvivalent til den foregående kuleblandingen. Dette

alternativ, som faller innenfor oppfinnelsesrammen, er formålet til en annen og mindre foretrukket utførelse som er beskrevet senere heri.

Den foregående kuleblanding (eller i utførelsen av en

multibelagt kule, kulen) kan være representert ved en bokstav og deskriptorer som definerer innholdene i blandingen, for eksempel A (XI, X2, X3) eller representert i form av et oppsett av kulesettet, som følger, og midlene AX1, AX2 og AX3

som skal detekteres ved testen av dette kulesett. For ytterligere klarhet i forbindelse med denne beskrivelse, er forordet AX utelatt fra den numeriske betegnelsen bestemt for biomiddelet i de inkluderte oppsett, og identifiserer disse biomidler simpelthen som 1, 2 og 3. Deskriptorene XI, X2 og X3 med hensyn til kulesettet er også utelatt, idet

kuleblandingen simpelthen identifiseres ved bokstav A fordi reseptorbeleggene kan utledes fra identifikasjonen av biomidlene oppført i det etterfølgende oppsett.

I den beskrevne utførelse er kuleblandingen A belagt med gjenkjenningsmolekyler som er mottakelige for biomidler 1, 2

og 3 (f.eks. A(XI, X2, X3)), kuleblanding B er belagt med gjenkjenningsmolekyler som er mottakelige for biomidler 4, 5

og 6 (f.eks. B(X4, X5, X6)) og kuleblanding C er belagt med gjenkjenningsmolekyler som er mottakelige for biomidler 7,8

og 9 (f.eks. C(X7, X8, X9)). Kulesettet og biomidlene i denne spesifikke utførelse er representert i ett oppsett som tilfelle I.

Tilfelle I - Tre kulesett og tre primære/sekundære tester

For å oppnå et resultat raskt, gjennomføres tester for Sett A, B og C samtidig og resultatet fra hver test er indikert, slik som på en indikator, INDIK.A, illustrert i fig. 3. Indikasjonen illustrert av 010 indikerer at biomiddelet faller innenfor gruppen som tilsvarer gjenkjenningsmolekylene i Sett B, og at Sett A og C ikke er tilstede.

Når det er bestemt at et spesielt rør tester positivt for et biomiddel, vet man at biomiddelet inkludert i prøven er ett i gruppen av biomidler representert ved de spesifikke gjen-kj enningsmolekyler som opprinnelig er plassert i dette rør. Det neste trinn er å teste prøven individuelt for hvert av biomidlene i denne gruppen, som er den sekundære prosedyre som tidligere omtalt i forbindelse med fig. 2. Tester 4, 5 og 6 i fig. 3 representerer disse tester. En annen del av prøve VII som inneholder biomiddelet er oppdelt i tre deler, og hver del innføres i en respektiv ELISA test. Da en positiv indikasjon forekom ved anvendelse av Sett B i den primære prosedyre, som representerer gjenkjenningsmolekyler for biomidler AX4, AX5 og AX6, er den sekundære testing individuelt for disse biomidler.

Operatøren har tilgjengelig et forråd av ni grupper belagte kuler hvor hver gruppe er belagt med gjenkjenningsmolekylene for et respektivt middel av de ni kandidatbiomidler og opprettholder også et liknende forråd for de individuelle konjugater for hvert biomiddel. Fra dette forråd utstyres ELISA test 4 med gjenkjenningsmolekyl-belagte kuler X4 for l°Ab i testingen og konjugatet for dette biomiddel, 2°Ab for AX4, anvendes i denne test; ELISA test 5 utstyres med gjenkjenningsmolekyl-belagte kuler X5 for l°Ab i testingen og konjugatet for dette biomiddel, 2°Ab for AX5, anvendes i denne test og ELISA test 6 er utstyrt med gjenkjenningsmolekyl- belagte kuler X6 for l°Ab i testingen og konjugatet for dette biomiddel, 2°Ab for AX6, anvendes i denne test.Testene gjennomføres foretrukket samtidig for å redusere forsinkelse for å sikre et resultat. Resultatet rapporteres, slik som på en indikator INDIK.B, som viser en "010" indikerende identifikasjon av AX5 biomiddelet.

Det skal forståes at ELISA prosessene som omtalt i denne beskrivelse kan gjennomføres manuelt eller automatisk, og kan enten være av en type hvor resultatet er en fargeforandring av oppløsningen, en forandring i elektrisk strøm, en forandring i elektro-kjemisk luminescens eller et hvilket som helst annet reportersystem eller som dannes senere og kan anvendes på ELISA prosessen som en forbedring. En annen variant er å anvende gjenkjenningsmolekyler som er i stand til kovalent binding til deres mål, slik som fotoaptamerer. En annen forbedring av ELISA systemet foreslår anvendelse av et ikke-spesifikt innfangingsmiddel ("capture agent") i stedet for de gjenkjenningsmolekyl-belagte kuler. Gjenkjenningsmolekylet som tjener som det ikke-spesifikke innfangingsmiddel har generell karakter og er i stand til å binde til et stort antall forskjellige biomidler. Fordi dette middel er ikke-spesifikt, må det enzym-bundne gjenkjenningsmolekyl være spesifikt for det spesielle biomiddel eller biomidler som man henvender seg til i testen. Motsatt, er en annen utviklet tilnærming å benytte en ikke-spesif ikk merkingsstrategi. Dette er et reportermolekyl som er i stand til å koble til et stort antall forskjellige biomidler. For dette system bør gjenkjenningsmolekylene til de belagte kuler være spesifikke for biomiddelet eller biomidlene av interesse. For tiden gjennomføres testingen foretrukket ved hjelp av det automatiserte testsystem i 946 søknaden, som er tilgjengelig for øyeblikket, i hvilket tilfelle kulene er dannet av magnetisk material og utbyttet er en målbar forandring i elektrisk strøm.

Bortsett fra bruken av gjenkjenningsmolekyler i identifikasjonstesting, bør det forståes at oppfinnelsen er uavhengig av den spesifikke måte eller type av testing som anvendes. Det foregående automatiserte ELISA system anvender for eksempel fenomenet med redoks resirkulering ved en elektrode for dannelse av målbar elektrisk strøm (f.eks. rapportering). En nyere måleteknikk benytter elektro-kjemi-luminescens ("ECL") i stedet for redoks resirkulering og kan være erstatning for redoks resirkuleringsfunksjonen i det automatiserte system uten noen materiell virkning på den foreliggende oppfinnelse. ECL-teknikken benytter måling av elektro-kjemisk luminescens som sendes ut som reporteren. Denne emisjon er målbar og tjener som en indikator på biomiddelet og konsentrasjonen.

I den foregående beskrivelse kan det være antydet at gjen-kj enningsmolekylet benyttet i konjugatet for et spesifikt biomiddel anvendt i den andre del av testen alltid var identisk med gjenkjenningsmolekylet for dette biomiddel anvendt i den første del av identifikasjonsprosessen. Det er ikke nødvendigvis tilfellet. Man finner at der er en rekke forskjellige gjenkjenningsmolekyler som gjenkjenner et enkelt biomiddel. Således, i den andre del av identifikasjonsprosessen kan gjenkjenningsmolekyler anvendes for biomidlene i gruppen som er forskjellige i struktur fra gjenkjenningsmolekylene for de biomidler som anvendes i den første del av identifikasjonsprosessen. Et slikt alternativ er inkludert i rammen for oppfinnelsen.

Dessuten, vil enkelte gjenkjenningsmolekyler for et spesielt biomiddel, som er kjent, diskriminere mellom stammer av et spesielt biomiddel. Anthrax er for eksempel et biomiddel som er tilgjengelig i forskjellige stammer, slik som den nylig publiserte Ames stammen. De forskjellige stammer er kjenne-tegnet ved forskjellige fysiske forskjeller med hensyn til geometri eller "kode" av molekylet, som har en tre-dimensjonal figur i en mikroskopisk målestokk. Således kan ett gjenkjenningsmolekyl binde til en spesifikk overflate-, geometri av biomiddelet som er tilgjengelig på en stamme av biomiddelet, men denne overflategeometri er ikke funnet på en annen stamme og gjenkjenningsmolekylet kan ikke binde til denne stamme. Den foregående egenskap er anvendbar i for bindelse med den foreliggende oppfinnelse. Som et eksempel, dersom den primære prosedyre viser den mulige tilstedeværelse av et biomiddel, slik som Anthrax, det vil si at Anthrax faller innenfor gruppen av biomidler, og dersom det er kjent at en stamme av Anthrax ikke betraktes som alvorlig, da kan man benytte et spesielt gjenkjenningsmolekyl for Anthrax under den sekundære prosedyre som ignorerer den ikke-alvorlige stammen. Skulle den andre del av testen resultere i at alle rør tester negativt, da vet operatøren at Anthrax var tilstede, men at den var av den ikke-alvorlige typen. Testen identifiserte biomiddelet på en negativ måte.

I tillegg var den foregående utførelse i stand til å teste for så mange som ni forskjellige biomidler. Dersom et fjerde ELISA testapparat adderes slik at fire tester kan gjennom-føres samtidig, er det mulig å teste for så mange som seksten forskjellige biomidler. Hver av de fire tester i den primære prosedyre vil kunne teste for fire forskjellige grupper av fire forskjellige biomidler, som indikert i oppsettet som betegnet tilfelle II. Fire tester anvendes i den primære prosedyre og fire tester anvendes i hver sekundær prosedyre, som lokaliserer biomiddelet i to hovedtrinn. Likeledes dersom to ytterligere ELISA testapparater adderes for et totale på fem, da kan testingen gjennomføres for så mange som tjuefem forskjellige biomidler som indikert i oppsettet som betegnet tilfelle III. Fem tester anvendes i den primære prosedyre og fem tester anvendes i hver sekundære prosedyre, igjen identifiseres biomiddelet i kun to hovedtrinn. Tilfelle IV identifiserer fire mulige biomidler.

Som det skal forståes vil antallet av biomidler som kan detekteres være avhengig av antallet av tilgjengelige ELISA tester. Generelt, gitt N slike ELISA tester, da kan så mange som N2 biomidler identifiseres gjennom utførelsen av de to hovedtrinn, det primære for å identifisere en gruppe av biomidler som inkluderer det fremdeles uidentifiserte biomiddel og de sekundære for å identifisere det spesielle biomiddel i gruppen eller gruppene som viste en positiv respons i den første test.

Antallet midler som detekteres kan økes ut over de tjuefem som gitt i de foregående eksempler til et større antall, avhengig av villigheten til å tilveiebringe ytterligere testapparatur for samtidig testing. Hver slik økning av antallet av testapparater øker N med en. Der er imidlertid en praktisk grense for slik ekspansjon. Denne grense avhenger av måleutstyrets følsomhet, følsomheten til måleutstyret med hensyn til å detektere farge når kolorimetrisk testing anvendes i ELISA prosessen, eller følsomheten av måleutstyret med hensyn til å detektere strøm og/eller spenning under redoks resirkulering når amperiometrisk deteksjon anvendes i ELISA prosessen.

Som det vil forståes kan testing for multiple biomidler i en enkelt reaksjon nedsette følsomheten for de individuelle biomidler. For øyeblikket mener man at grensen med hensyn til følsomhet for kule-basert systemer er tjuefem til etthundre biomidler eller omtrent fem til ti midler pr. reaksjon. Alt ettersom teknologien til måleapparatur forbedres eller alternativer til kuler utvikles i fremtiden vil imidlertid dette antall kunne økes ytterligere.

Fra den foregående omtale skal det også forståes at antallet forskjellige biomidler som kan detekteres, N<2>, i de primære og sekundære tester er et maksimumantall, idet ni i tilfelle I, seksten i tilfelle II og tjuefem i tilfelle III osv. for eksempel er maksimumtall av biomidler. Det er derfor alltid mulig å i realiteten teste for et mindre antall forskjellige biomidler, skjønt den spesielle oppstilling for testing som anvendes kan teste for et større antall forskjellige biomidler.

Apparatet anvendt for tilfelle I er for eksempel i stand til å identifisere ni forskjellige biomidler. Dersom operatøren imidlertid kun er interessert i åtte biomidler (mere enn de fire mulige for apparatet i tilfelle IV), behøver man kun å fremstille og bruke reseptormolekylene (og de tilsvarende enzym-bundne reseptormolekyler) for disse åtte biomidler og betrakte de gjenværende som etterligning eller placebo. Man vil følge metoden og benytte de tre ELISA tester under det primære trinn. I stedet for jevn fordeling av de forskjellige gjenkjenningsmolekyler under testing i det primære trinn, slik som 3:3:3 som i tilfellet av ni biomidler, som ikke er mulig da der kun er åtte forskjellige gjenkjenningsmolekyler som behøves, vil de åtte forskjellige gjenkjenningsmolekyler fordeles 3:3:2 blant de tre testapparater. I den sekundære prosedyre vil kun to individuelle ELISA tester være nødvendig dersom den positive indikasjon forekommer i røret som inneholder gjenkjenningsmolekylene som svarer til de to biomidler.

I den foregående utførelse ble en blanding av kuler anvendt for å tilveiebringe gjenkjenningsmolekylene for en rekke forskjellige biomidler. Det er også mulig å belegge en enkelt kule med gjenkjenningsmolekyler for mange forskjellige biomidler og å kjøre ELISA prosessen som i den tidligere utførelse. Som eksempel, under betraktning av det gitte initiale tilfellet for å bestemme eksistensen av hvilke som helst av ni mulige biomidler i en prøve i tre ELISA prosesser, vil den primære test for tilstedeværelsen av hvilke som helst av biomidler AX1, AX2 og AX3 (vekslende identifisert i oppsettet som biomidler 1, 2 og 3) i en av de tre gruppene kunne kjøres på et enkelt rør av kuler, A, hvor alle kulene i røret er belagt med tre reseptormolekyler XI, X2 og X3 for biomidler 1, 2 og 3.

Man betrakter tilfelle I ytterligere, som diskutert tidligere, hvor hvilket som helst av ni biomidler AX1 til og med AX9, oppstilt i tre grupper, skal detekteres og identifiseres ved anvendelse av tre ELISA tester som kjøres parallelt for hvilke kuleblandinger A, B og C ble anvendt. Kuleblanding A inneholdt kuler som henholdsvis var belagt med gjenkjenningsmolekyler for biomidler AX1, AX2 og AX3; og denne blanding ble dannet ved å blande kuler fra tre separate rør, ett som inneholdt gjenkjenningsmolekylene for biomiddel AX1, det andre som inneholdt gjenkjenningsmolekylene for biomiddel AX2 og det tredje gjenkjenningsmolekylene for biomiddel AX3. Ved å belegge alle kulene med alle tre gjenkjenningsmolekyler for å danne kulesett A, behøves kun et enkelt rør av belagte kuler å opprettholdes. Det samme gjelder for kulene som danner kuleblandinger B og C. De tre gjenkjenningsmolekyler for biomidler AX4, AX5 og AX6 kan belegges på alle kulene som definerer kulesett B, og kun et enkelt rør av kuler behøver å opprettholdes. Kulesett C dannes tilsvarende med tre gjenkjenningsmolekyler for biomidler AX7, AX8 og AX9.

ELISA testen gjennomføres på de foregående multi-belagte kuler på samme måte, og det oppnås det samme resultat som beskrevet tidligere for blandingen av kuler, som ikke skal repeteres her. Det er klart ut fra en forståelse av beskrivelsen av oppfinnelsen at det foregående alternativ er ekvivalent til prosedyren som beskrevet tidligere og faller innenfor oppfinnelsesrammen. Det skal således erkjennes at betegnelsen "kuleblanding" og "kuler" bør tolkes til å være synonymer i de etterfølgende krav, dersom ikke sammenhengen krever særskilt betydning.

Tilsvarende kan gjenkjenningsmolekylene for å koble til gruppen av biomidler i den første fasen av testen og for å koble til de individuelle biomidler i den andre fasen av testen erstattes med et ikke-spesifikt innfangingsmiddel, som nevnt kort i det foregående, dersom slikt innfangingsmiddel er tilgjengelig for biomidlene av interesse. Gjenkjenningsmolekylet som tjener som dette ikke-spesifikke innfangingsmiddel har generell karakter og er i stand til å koble til et større antall forskjellige biomidler, for eksempel til hvilke som helst eller alle biomidlene i kulesett A, B og C. Konjugat-settene, 2°-Ab Sett A, 2°-Ab Sett B og 2°-Ab Sett C anvendt i den første fase av testen vil hvert kunne koble til hvilke som helst av de spesifikke biomidler hvortil det respektive konjugat er utformet til å koble. Likeledes i den andre del av testen er konjugatene spesifikke for individuelle biomidler. Som det fremgår, vil bruk av et innfangingsmiddel for generelt formål redusere lagerbeholdningskravene for testapparaturen.

Det kan også være ønskelig å redusere antallet konjugat-oppløsninger som kreves for å gjennomføre de separate ELISA prosesser for porsjonene av prøven for å minimere vedlikeholdskrav og lagring av forråd. Igjen med henvisning til fig. 3 og tilfelle I (f.eks. N lik 3) som beskrevet tidligere, blir for denne ytterligere utførelse konjugat-oppløsningene for de belagte kuler i ELISA testene av den primære prosedyre, vist i boksene merket 2°-Ab Sett A, 2°-Ab Sett B og 2°-Ab Sett C erstattet med konjugatoppløsningene for reseptormolekylene anvendt på de tre sett av belagte kuler A, B og C som vist i boksen med stiplet linje som 2°-Ab Sett A, B og C. Videre, i de sekundære ELISA tester, tester 4, 5 og 6, for å identifisere et spesifikt biomiddel, blir konjugat-oppløsningene for belagte kuler, X4, X5 og X6, vist i boksen merket 2°-Ab for AX4, 2°-Ab for AX5 og 2°-Ab for AX6 også erstattet med konjugatoppløsningene i boksen med stiplet linje merket 2°-Ab Sett A, B og C inneholdende en konjugat-oppløsning for hvilke som helst av gjenkjenningsmolekylene.

I forbindelse med å kjøre ELISA test 1 på prøven, er de individuelle reseptor ( 2°-Ab-enz) molekylene i konjugat-oppløsningene i stand til kun å binde til de samme biomidlene hvortil de belagte kuler i kulesett A er i stand til å binde. I tilfelle 1, er kulesett A i stand til kun å binde til biomidler 1 og 2, mens reseptormolekylene i den nye konjugat-oppløsningen er i stand til å binde til biomidler 1, 2 og 3. Da der ikke er noen belagte kuler hvortil konjugatoppløsnings-komponenten for biomiddel 3 er i stand til å binde, kan imidlertid ikke noe skje og denne komponent i konjugat-oppløsningen er i alt vesentlig nøytral. De gjenværende komponenter i oppløsningen, komponentene for biomidler 1 og 2 reagerer akkurat som komponentene reagerte i tilfelle I. Den ytterligere komponent (eller, i tilfellet av tilfeller II og III, komponenter) i konjugatoppløsningen er i alt vesentlig overtallig. Den samme effekt forekommer ved kjøring av ELISA test 2. I den siste test er komponenten i konjugatopp-løsningen som er unik for biomiddel1overtallig, da kulene er belagt med reseptormolekyler for kun biomidler 2 og 3 og de gjenværende komponenter i konjugatoppløsningen som er unike for biomidler 2 og 3 reagerer akkurat som disse komponenter reagerte i tilfelle I som beskrevet tidligere.

Som et alternativ til det universelle konjugatkulesett som beskrevet, er en tilnærming som man kort har nevnt tidligere å benytte et ikke - spesifikt merkingsmiddel for konjugatet. Det vil si at det enzym-bundne gjenkjenningsmolekyl som anvendes i konjugatet er i stand til å binde til et større antall forskjellige biomidler. For dette system er gjenkjenningsmolekylet av de belagte kuler spesifikt for biomiddelet eller biomidlene av interesse.

Som det skal forståes, er man i den foregående utførelse og i den alternative sistnevnte utførelse i stand til å kompoundere en enkelt konjugatoppløsning for anvendelse i alle ELISA testene utført på en prøve. Innsparinger med hensyn til tid og lagerbeholdning blir mere signifikant i de ytterligere tilfeller hvor fire, fem eller flere ELISA tester kjøres samtidig, hvor konjugatoppløsningen kan inneholde så mange som henholdsvis seksten, tjuefire eller flere komponenter. Det å adoptere teknikken er særlig attraktiv når den automatiserte ELISA apparatur anvendes som angitt i tidligere 946 søknaden, som gjør apparaturen beskrevet deri enklere for ikke-fagkyndige personer å anvende og vedlikeholde.

Det skal forståes at den foregående metode og apparat lett kan utvides. Dersom antallet biomidler av interesse øker i løpet av årene utover det maksimalt mulige med et eksisterende apparat, er alt man behøver å gjøre å tilføye et annet testapparat for samtidig testing i det primære trinn, og å tilføye ytterligere gjenkjenningsmolekyler og konjugater for de ytterligere biomidler til ELISA testapparatet. De kompliserte omstillinger og kombinasjoner som er nødvendig for å gjøre dette med apparatet i 318 søknaden er ikke nødvendige.

I tillegg til å identifisere et biomiddel blant N<2>kandidater, er fordelene med hensyn til enkelhet og enkel bruk også anvendbare når mer enn ett biomiddel er tilstede. Det menes til og med at det vil være sannsynlig at en slik situasjon vil forekomme ved enkelte krigsscenarier. Det vises igjen til fig. 1 og 2 og utførelsesformen av oppfinnelsen hvor ni forskjellige biomidler målsøkes for deteksjon og identifikasjon. Anta at prøven inneholder biomidler AX3 og AX4. Gjenkjenningsmolekylene for disse biomidler X3 og X4 er tilstede i separate rør, I og II, og følgelig, som et resultat av den primære prosedyre vil begge rør I og II produsere et positivt resultat. Operatøren vil helt riktig konkludere med at minst to biomidler er tilstede. Deretter gjennomføres en sekundær prosedyre på prøven (dvs. ytterligere deler av prøven) ved å anvende gjenkjenningsmolekylene XI, X2 og X3 som er assosiert med det første rør. De individuelle sekundære ELISA tester identifiserer biomiddel AX3 som synderen. Deretter kjøres en andre sekundær prosedyre på prøven (dvs. ytterligere porsjoner av prøven) ved å anvende gjenkjenningsmolekylene X4, X5 og X6 inneholdt i rør II. De individuelle sekundære ELISA tester identifiserer biomiddel AX4 som synderen. Ved å utvide til en ytterligere serie av N ELISA tester identifiseres begge biomidler. Ingen forandringer i apparaturen kreves og ingen ytterligere opplæring av personal er nødvendig.

Enda mindre ekstraarbeid er nødvendig dersom kun ett rør tilfeldigvis tester positivt under den primære prosedyre, for eksempel dersom prøven inneholder biomidler AX2 og AX3. Operatøren vil eventuelt ikke umiddelbart være klar over at to biomidler er tilstede. Når imidlertid de sekundære prosedyrer gjennomføres ved å anvende gjenkjenningsmolekylene XI, X2 og X3 i individuelle tester, vil både AX2 og AX3 lett identifiseres. Logikken med hensyn til den foregående testing kan utvides videre til tre biomidler som er tilstede i prøven, hvor den verste konsekvens er repetisjonen av de sekundære prosedyrene.

Som anvendt heri, når det vises til "antall" gjenkjenningsmolekyler eller forskjellige gjenkjenningsmolekyler skal det forståes at søkeren viser til typer eller sorter av gjenkjenningsmolekyler og ikke til mengde eller volum av gj enkj enningsmolekyler.

ELISA prosessen anerkjennes som en identifikasjonsprosess som er eller kan anvendes innen en rekke forskjellige områder, ikke bare for å identifisere biomidler, men også nukleinsyrer. Imidlertid, ved å mangle terminologi som er generisk for og/eller som omfatter både biomidler og nukleinsyrer, skal det forståes at henvisning til biomidler som anvendt heri og i kravene som følger i denne søknad inkluderer nukleinsyrer. Videre kan identifikasjonsprosesser som er ekvivalente til ELISA utvikles som bruker andre

gjenkjenningsmolekyler, slik som aptamerer, DNA, RNA og molekylære avtrykkspolymerer og som følgelig er ELISA-

liknende av natur. Metoden beskrevet heri kan anvendes for disse prosedyrer. Således, for formålene med denne

oppfinnelse bør betegnelsen ELISA tolkes til å omfatte alle slike ELISA-liknende prosedyrer.

Man er av den oppfatning at den foregående beskrivelse av de foretrukne utførelser av oppfinnelsen er tilstrekkelig detaljert til at en fagkyndig på området kan fremstille og anvende oppfinnelsen uten unødvendig eksperimentering. Det skal imidlertid uttrykkelig forståes at detaljene for elementene som omfatter utførelsen som er angitt for det ^ (i jf nC foregående formal ikke skal begrense oppfmnelsesrammen pa ^ Vl • noen måte, heller ikke ekvivalenter til disse elementer og andre modifikasjoner derav, som alle er innenfor oppfinnelsesrammen, noe som vil fremgå klart for fagkyndige P^^^ n området ved å lese den foreliggende beskrivelse. Således skal oppfinnelsen fortolkes i videste forstand innenfor den omfattende rammen av de etterfølgende krav.

Claims (12)

1. Fremgangsmåte for å bestemme forekomsten av og identifisere hvilke som helst av opp til en pluralitet av N <2> biomidler i en prøve inneholdende et biomiddel, hvor N er et helt tall større enn 1, karakterisert ved at den omfatter trinnene med: (A) gjennomføring av en separat deteksjonsprosess på hver av N deler av prøven for å definere en pluralitet av N deteksjonsprosesser, hvor nevnte deteksjonsprosess anvender molekylære interaksjoner for å entydig identifisere biomidler, hvor nevnte pluralitet av N deteksjonsprosesser har evnen til samlet å identifisere hvilke som helst av N <2> biomidler, hvor hver av de nevnte separate deteksjonsprosesser av nevnte pluralitet av N deteksjonsprosesser har en evne til å detektere hvilke som helst av N forskjellige biomidler fra en samling av opp til N <2> kjente biomidler, og hvor biomidlene som er detekterbare ved hvilke som helst av de nevnte separate deteksjonsprosesser i nevnte pluralitet av N deteksjonsprosesser er forskjellige fra hvilke som helst av biomidlene som er detekterbare ved hvilke som helst av de andre nevnte separate deteksjonsprosesser i nevnte pluralitet av M deteksjonsprosesser, hvorved et positivt resultat av en av nevnte N deteksjonsprosesser identifiserer en gruppe av N biomidler som inkluderer biomiddelet som skal identifiseres; og (B) gjennomføring av en separat deteksjonsprosess på hver av en ytterligere N deler^a v^ prøvenT/ for å definere elT"sredÆ-e^-___ pluralitet av N deteksjonsprosesser, hvor nevnte deteksjonsprosess anvender molekylære interaksjoner for a entydig identifisere biomidler, hvor nevnte andre pluralitet av N deteksjonsprosesser har evnen til samlet å identifisere hvilke som helst av de N biomidler i nevnte gruppe av N biomidler identifisert ved nevnte positive resultat, og hvor hver av de nevnte separate deteksjonsprosesser av nevnte andre pluralitet av N deteksjonsprosesser har en evne til å detektere kun et respektivt ett av biomidlene fra innen nevnte gruppe av N biomidler identifisert ved nevnte positive resultat, hvorved biomiddelet i nevnte prøve identifiseres.

2 . Fremgangsmåte for å bestemme forekomsten av og identifisere hvilke som helst av opp til en pluralitet av N <2> biomidler i en prøve inneholdende et biomiddel som definert i krav 1, karakterisert ved at den videre omfatter trinnet, før trinn (A) og (B), med: (C) oppdeling av en porsjon av prøven i minst 2N deler.

3 . Fremgangsmåte for å bestemme forekomsten av og identifisere hvilke som helst av opp til en pluralitet av N <2> biomidler i en prøve inneholdende et biomiddel som definert i krav 1, karakterisert ved at den videre omfatter trinnene med: (C) oppdeling av en porsjon av prøven i N deler før trinn (A) ; og (D) oppdeling av en andre porsjon av nevnte prøve i en ytterligere N deler før trinn (B).

4 . Fremgangsmåte for å bestemme forekomsten av og identifisere hvilke som helst av opp til en pluralitet av N <2> biomidler i en prøve inneholdende et biomiddel som definert i krav 1, karakterisert ved at den omfatter trinnene med: (A) oppdeling av en porsjon av prøven i N deler; (B) ) gjennomføring av en separat deteksjonsprosess på hver av de N delene av prøven for å definere en pluralitet av N deteksjonsprosesser, hvor nevnte deteksjonsprosess anvender molekylære interaksjoner for å entydig identifisere biomidler, hvor nevnte pluralitet av N deteksjonsprosesser har evnen til samlet å identifisere hvilke som helst av N <2> biomidler, hvor hver av nevnte separate deteksjonsprosesser av nevnte pluralitet av N deteksjonsprosesser har en evne til å detektere hvilke som helst av N forskjellige biomidler fra en samling av opp til N <2> kjente biomidler, og hvor biomidlene som er detekterbare ved hjelp av hvilke som helst av de nevnte separate deteksjonsprosesser i nevnte pluralitet av N deteksjonsprosesser er forskjellige fra hvilke som helst av biomidlene som er detekterbare ved hjelp av hvilken som helst annen av de nevnte separate deteksjonsprosesser i nevnte pluralitet av N deteksjonsprosesser, hvorved et positivt resultat for en av de nevnte N deteksjonsprosesser identifiserer en gruppe av N biomidler som inkluderer biomiddelet som skal identifiseres: (C) oppdeling av en annen porsjon av prøven i N deler; og (D) gjennomføring av en separat deteksjonsprosess for hver av de N delene av den andre porsjon av nevnte prøve for å definere en andre pluralitet av N deteksjonsprosesser, hvor nevnte deteksjonsprosess anvender molekylære interaksjoner for entydig å identifisere biomidler, hvor nevnte andre pluralitet av N deteksjonsprosesser har evnen til samlet å identifisere hvilke som helst av de N biomidlene i nevnte gruppe av N biomidler identifisert ved nevnte positive resultat, og hvor hver av de nevnte separate deteksjonsprosesser av nevnte andre pluralitet av N deteksjonsprosesser har en evne til å detektere kun et respektivt ett av biomidlene fra innen nevnte gruppe av N biomidler identifisert ved nevnte positive resultat, hvorved biomiddelet i nevnte prøve identifiseres.

5. Fremgangsmåte for å bestemme forekomsten av og identifisere hvilke som helst av en pluralitet avN<2> biomidler i en prøve inneholdende et biomiddel som angitt i krav 4, karakterisert ved at nevnte trinn med hensyn til å gjennomføre en separat deteksjonsprosess på hver av nevnte N deler for å definere en pluralitet av N deteksjonsprosesser omfatter trinnet med å gjennomføre nevnte pluralitet av N deteksjonsprosesser samtidig.

6. Fremgangsmåte for å bestemme forekomsten av og identifisere hvilke som helst av en pluralitet av N <2> biomidler i en prøve inneholdende et biomiddel som angitt i krav 5, karakterisert ved at hver av nevnte pluralitet av N deteksjonsprosesser omfatter en "enzyme linked immunoassay" ("ELISA") prosess.

7. Fremgangsmåte for å bestemme forekomsten av og identifisere hvilke som helst av en pluralitet av N <2> biomidler i en prøve inneholdende et biomiddel som angitt i krav 6, karakterisert ved at N er 2.

8 . Fremgangsmåte for å bestemme forekomsten av og identifisere hvilke som helst av en pluralitet av N <2> biomidler i en prøve inneholdende et biomiddel som angitt i krav 6, karakterisert ved at N er 3.

9. Fremgangsmåte for å bestemme forekomsten av og identifisere hvilke som helst av en pluralitet av N <2> biomidler i en prøve inneholdende et biomiddel som angitt i krav 6, karakterisert ved at N er 4.

10. Fremgangsmåte for å bestemme forekomsten av og identifisere hvilke som helst av en pluralitet av N <2> biomidler i en prøve inneholdende et biomiddel som angitt i krav 6, karakterisert ved at Ner 5.

11 . Fremgangsmåte for å bestemme forekomsten av og identifisere hvilke som helst av en pluralitet av N <2> biomidler i en prøve inneholdende et biomiddel som angitt i krav 4, karakterisert ved at nevnte trinn med å gjennomføre nevnte separate identifikasjonsprosess på hver av nevnte N deler inkluderer trinnene med: belegging av kuler i N forskjellige samlinger og belegging av hver samling av kuler i nevnte N forskjellige samlinger med gjenkjenningsmolekyler for mindre enn N <2> multiple biomidler men hvor nevnte N forskjellige samlinger inneholder samlet reseptormolekyler for alle nevnte N <2> multiple biomidler, hvor ett av nevnte reseptormolekyler i hver samling er en reseptor for det samme biomiddel, og hvor en annen av nevnte reseptormolekyler i hver samling er unik blant reseptormolekylene i alle andre samlinger, og anvende hver samling av belagte kuler i en respektiv prosess av nevnte separate identifikasjonsprosesser.

12 .F remgangsmåte for å bestemme forekomsten av og identifisere hvilke som helst av en pluralitet av N <2> biomidler i en prøve inneholdende et biomiddel, hvor N er et tall valgt fra seriene av hele tall omfattende 2, 3, 4, 5....x, karakterisert ved at den omfatter trinnene med: oppdeling av en porsjon av prøven i N deler; og gjennomføring av en separat "enzyme linked immunoassay" ("ELISA") prosess for hver av de N delene samtidig for å detektere om nevnte biomiddel er ett som er i en forhånds-bestemt gruppe av biomidler som den respektive ELISA prosess er i stand til å detektere, idet hver av nevnte N separate ELISA prosesser har evnen til å detektere en respektiv entydig gruppe av biomidler, og hvor hvert detekterbare biomiddel i hver nevnte gruppe er entydig; oppdeling av en annen porsjon av prøven i en ytterligere N deler; og gjennomføring av en separat ELISA prosess på hver av de ytterligere N deler for å detektere et individuelt biomiddel i denne forhåndsbestemte gruppe av biomidler; hvor nevnte trinn med å gjennomføre en separat "enzyme linked immunoassay" ("ELISA") prosess på hver av nevnte N deler inkluderer trinnene med: belegning av kuler i N forskjellige grupper og belegning av hver gruppe av kuler i nevnte M forskjellige grupper med reseptormolekyler for N entydige biomidler; og hvor nevnte trinn med å gjennomføre en separat "enzyme linked immunoassay" (ELISA") prosess på hver av nevnte ytterligere N deler inkluderer trinnene med: belegging av individuelle kuler med reseptormolekyler for N entydige biomidler.