NO20121038L - RNAi-prober som malsoker cancer-relaterte proteiner - Google Patents

Abstract

RNAi-sekvenser som er nyttig som terapeutika i behandlingen av cancere av ulike typer, som inkluderer prostatacancer, sarkomer slik som osteosarkom, nyrecellekarcinom, brystcancer, blærecancer, lungecancer, koloncancer, ovariccancer, anaplastisk stor cellelymfom og melanon; og Alzheimer's sykdom. Disse sekvensene målsøker klustrin, IGFBP-5, IGFBP-2, både IGFBP-2 og -5 samtidig, Mitf, og B-raf Oppfinnelsen tilveiebringer ytterligere anvendelsen av disse RNAi-sekvensene i behandlingen av cancere av ulike typer, som inkluderer prostatacancer, sarkomer slik som osteosarkom, nyrecellekarcinom, brystcancer, blærecancer, lungecancer, koloncancer, ovariecancer, anaplastisk stor cellelymfom og melanom; og Alzheimer's sykdom, og en fremgangsmåte for å behandle slike tilstander gjennom administrasjonen av RNA-molekylene med RNAi-aktivitet til et individ, som inkluderer et menneskelig individ med behov for slik behandling.

Description

Denne søknaden krever fordelen og fortrinnsretten av US foreløpige søknadsnr. 60/405,193, arkivert 21. august 2002, 60/408,152, arkivert 3. september 2002 og 60/472,387, arkivert 20. mai 2003, hvor alle er inkorporert her ved referanse i jurisdik-sjon som tillater slik inkorporering.

Foreliggende oppfinnelse angår bispesifikke siRNA molekyler som er effektive i å inhibere både insulin-avhengig vekstfaktor bindingsprotein-2 (IGFBP-2) og insulinavhengig vekstfaktor bindingsprotein-5.

Oppfinnelsen er relatert til korte dobbeltrådede RNAi-prober nyttige i cancerterapi og behandling av andre sykdommer. RNAi-interferens eller "RNAi" er en betegnelse først brukt av Fire og samarbeidspartnere for å beskrive observasjonen at dobbeltrådet RNA (dsRNA) kan blokkere genekspresjon når det er introdusert i ormer (Fire et al. (1998) Nature 391, 806-811, inkorporert her ved referanse). dsRNA styrer gen-spesifikk, post-transkripsjonell silencing i mange organismer, som inkluderer virveldyr, og har til-veiebragt et nytt verktøy for å studere genfunksjon. RNAi involverer mRNA-degradering, men mange av de biokjemiske mekanismene som ligger til grunn for denne interferensen er ukjent. Anvendelsen av RNAi har blitt ytterligere beskrevet i Carthew et al. (2001) Current Opinions in Cell Biology 13,244-248, og Elbashir et al. (2001) Nature 411,494-498, hvor begge er inkorporert her ved referanse.

Innenfor et gitt mRNA-molekyl er det seter som er påvirket ved RNAi-prober, og seter som ikke er det. Derfor kan man bare kutte opp den totale sekvensen i mindre deler av hensiktsmessige lengder (f.eks. 21 til 23 basepar) for å få et funksjonelt RNAi-basert terapeutika. Publisert US patentsøknad 2002-0086356-A1 angir en fremgangsmåte for anvendelse i å fastsette hvor målrettede seter kan bli lokalisert i en mRNA-sekvens, selv om denne fremgangsmåten ikke er den eneste måten for å utvikle effektive RNAi-sekvenser.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer RNAi-sekvenser som er nyttige som terapeutika i behandlingen av cancere av ulike typer, som inkluderer prostatacancer, sarkomer slik som osteosarkom, nyrecellekarcinom, brystcancer, blasrecancer, lungecancer, koloncancer, ovariecancer, anaplastisk stor cellelymfom og melanom; og Alzheimer's sykdom. Disse sekvensene målsøker klustrin, IGFBP-5, IGFBP-2, både IGFBP-2 og -5 samtidig, Mitf, og B-raf.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre anvendelsen av disse RNAi-sekvensene i behandlingen av cancere av ulike typer, som inkluderer prostatacancer, sarkomer slik som osteosarkom, nyrecellekarcinom, brystcancer, blærecancer, lungecancer, koloncancer, ovariecancer, anaplastisk stor cellelymfom og melanom; og Alzheimer' s sykdom og en fremgangsmåte for å behandle slike tilstander gjennom administrasjonen av RNA-molekylene med RNAi-aktivitet til et individ, som inkluderer et humant individ med behov for slik behandling. Figur IA viser relativ veksthastighet, estimert ved telling av celleantall av Sa OS, KH OS og U-2 OS celler etter siRNA-formidlet silencing av klustrin genekspresjon. 5x10 celler/cellelinje ble sådd ut i 6 brønners plater og etter siRNA-behandling i 70 timer ble det totale antallet av celler tellt. En signifikant reduksjon i celleantallet, som er mer tydelig i U-2 OS-celler ble observert i alle klustrin knock-down-cellene. Figur IB og C viser endogene DNA-syntesenivåer og spontan apoptose i klustrin knock-down-KH OS og U-2 OS-celler, som estimert ved hhv. celleproliferasjon ELISA BrdU-kolorimetrisk immuntest og en celledøddeteksjons-ELISA-fotometrisk enzym-immuntest. Klustrin knock-down ble ledsaget ved redusert DNA-syntese og en forsterket grad av endogen spontan apoptose i begge cellelinjer. Figurer 2A og B viser redusert klonogent potensiale til klustrin knock-down-OS-celler. Etter siRNA-behandling i 70 timer, ble 5x10<3>KH OS-celler sådd ut i 6 brønners plater og det totale antallet av celler ble tellt etter 5 dager og dyrket i fullstendig medium (fig. 2A). Figur 2B viser resultatene av et sammenlignbart eksperiment med U-2 OS-celler. Figurer 3 A-F viser effekten av DXR-behandlingn i OS-celler og cellesensibilisering til DNA-skade og oksidativt stress etter siRNA-formidlet klustrin knock-down. De mørke stolpene i figurer 3 A og B viser resultatene når 2x10<4>KH OS- eller U-2 OS-celler ble sådd ut i 6 brønners plater i fullstendig medium, behandlet med siRNA i 70 timer og så tillatt å innhente seg. Cellene ble så eksponert for 0,35 uM DXR i 24 timer, tyrket i fullstendig medium i 72 timer og tellt. De lyse stolpene i figurer 3 A og B viser resultatene når 2x10<4>KH OS- eller U-2 OS-celler ble sådd ut i 6 brønners plater i fullstendig medium, behandlet med siRNA i 70 timer og DXR ble tilsatt direkte til transfeksjonsmediumet til en sluttkonsentrasjon på 0,35 uM. Cellene ble inkubert i medikamentet som inneholdt transfeksjonsmedium i 24 timer, vasket, tillatt å innhente seg i fullstendig medium i 72 timer og tellt. Figur 4 viser kvantitativ analyse av sekvens-spesifikk klustrin gen-silencing med siRNA i PC3-tumorceller. Figur 5 viser effektene av paklitakselbehandling på klustrin knock-down PC3 -cellevekst og apoptose. Cellene ble behandlet med 50 nM av Cl-IIL Cl-IV eller omstokket kontroll-siRNA i 1 dag. To dager etter siRNA-behandlingen, ble celler eksponert for de in-dikerte konsentrasjonene av paklitaksel i 48 timer, og celleviabilitet ble bestemt ved en in vitro MTT-test. Figur 6 viser kvantitative resultater av eksponering av PC3-prostataceller for CLU-5 siRNA (Seq ID nr. 9 og 10). Figur 7 viser kvantitative resultater av eksponering av A549-lungecancerceller for CLU-5 siRNA (Seq ID nr. 9 og 10). Figur 8 viser reduksjonen i klustrintranskript som et resultat av behandling av PC3-celler med klustrin-målrettet siRNA som bestemt ved RT-PCR. Figur 9 viser reduksjonen i klustrintranskript som et resultat av behandlingen av A549-celler med klustrin-målrettet siRNA som bestemt ved RT-PCR. Figur 10 viser reduksjonen i klustrintranskript som et resultat av behandling av PC3-celler med klustrin-målrettet siRNA som bestemt ved Northern blot. Figur 11 viser celleviabilitet etter behandling av PC3-celler med kombinasjoner av siRNA og taksol. Figur 12 viser celleviabilitet etter behandling av A549-celler med kombinasjoner av siRNA og taksol. Figur 13 viser reduksjonen i klustrintranskript som et resultat av behandling av OVCAR3 -celler med klustrin-målrettet siRNA som bestemt ved Northern blot. Figur 14 viser reduksjonen i klustrintranskript som et resultat av behandling av MDA-MB 231-celler med klustrin-målrettet siRNA som bestemt ved Northern blot. Figur 15 viser reduksjonen i klustrintranskript som et resultat av behandling av MDA-MB 231-celler med klustrin-målrettet siRNA som bestemt ved RT-PCR. Figur 16 viser reduksjonen i klustrintranskript som et resultat av behandling av MCF-7-celler med klustrin-målrettet siRNA som bestemt ved Northern blot. Figur 17 viser reduksjonen i klustrintranskript som et resultat av behandling av MCF-7-celler med klustrin-målrettet siRNA som bestemt ved RT-PCR. Figur 18 viser reduksjonen i mengden av klustrinprotein i MCF-7-celler behandlet med siRNA relativt til omstokket kontroll. Figur 19 viser reduksjonen i IGFBP-2-transkript som et resultat av behandling av A549-celler med bispesifikt IGFBP-2- og -5-målrettet siRNA som bestemt ved RT-PCR. Figur 20 viser reduksjonen i IGFBP-5-transkript som et resultat av behandling av PC3-celler med bispesifikt IGFBP-2- og -5-målrettet siRNA som bestemt ved RT-PCR.

Figur 21 viser reduksjon i IGFBP-5 mRNA i PCR-celler.

Figur 22 viser inhiberinger av IGFBP-5-transkript i primær human benfibroblast. Figur 23 viser vekstinhibering av C42-celler ved IGFBP-2/IGFBP-5-bispesifikt siRNA. Figur 24 viser vekstinhibering av A549-celler ved IGFBP-2/IGFBP-5-bispesifikt siRNA.

Den foreliggende oppfinnelsen er relatert til isolerte RNA-molekyler som formidler RNAi. Det betyr at de isolerte RNA-molekylene av den foreliggende oppfinnelsen formidler degradering av mRNA som er det transkripsjonelle produktet av genet, som også er referert til som et målgen. For bekvemmelighet, kan slikt mRNA også bli referert til som mRNA som skal degraderes. Betegnelsen RNA, RNA-molekyl(er), RNA-segment(er) og RNA-fragment(er) kan bli benyttet vekslende for å referere til RNA som formidler RNA-interferens. Disse betegnelsene inkluderer dobbeltrådet RNA, enkelttrå-det RNA, isolert RNA (delvis renset RNA, hovedsakelig rent RNA, syntetisk RNA, rekombinant produsert RNA) så vel som endret RNA som avviker fra naturlig forekommende RNA ved tilføyingen, delesjonen, substitusjonen og/eller endringen av et eller flere nukleotider. Slike endringer kan inkludere tilføying av ikke-nukleotidmateriale, slik som til enden(e) av RNA'et eller innvendig (ved et eller flere nukleotider av RNA'et). Nukleotidene i RNA-molekylene av den foreliggende oppfinnelsen kan også omfatte ikke-standardnukleotider, som inkluderer ikke-naturlig forekommende nukleotider eller deoksyribonukleotider, samlet er alle slike endrede RNAi-forbindelser referert til som analoger eller analoger av naturlig-forekommende RNA. RNA av den foreliggende oppfinnelsen trenger bare å være tilstrekkelig likt naturlig RNA slik at det har evnen til å formidle RNAi. Som benyttet her, refererer frasen "formidle RNAi" til og indikerer evnen til å sjeldne mellom hvilket mRNA som blir påvirket av RNAi-maskineriet eller -prosessen. RNA som formidler RNAi interagerer med RNAi-maskineriet slik at det styrer maskineriet til å degradere bestemte mRNA'er eller til å på annen måte redusere ekspresjonen av målproteinet. I en utførelsesform, er den foreliggende oppfinnelsen relatert til RNA-molekyler som direkte kløver spesifikt mRNA som korresponderer til deres sekvens. Det er ikke nødvendig at det er en perfekt overensstemmelse av sekvensene, men overensstemmelsen må være tilstrekkelig for å gjøre det mulig for RNA'et å styre RNAi-inhibering ved kløving eller mangel på ekspresjon av mål-mRNA'et.

Som bemerket ovenfor, omfatter RNA-molekylene av den foreliggende oppfinnelsen

generelt en RNA-del og en ytterligere del, f.eks. en deoksyribonukleotiddel. Det totale antallet av nukleotider i RNA-molekylet er passende mindre enn 49 for å være effektive formidlere av RNAi. I foretrakkede RNA-molekyler er antallet av nukleotider 16 til 29, mer foretrukket 18 til 23 og mest foretrukket 21 til 23.

En første gruppe av RNA-molekyler i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen er rettet til mRNA som koder for klustrin, et protein også kjent som testosterone-repressede prostate message-2 (TRPM-2) eller sulfatert glykoprotein-2 (SGP-2). Klustrin er uttrykt i økte mengder ved prostatatumorceller etter tilbaketrekking av androgen. Videre har det blitt bestemt at antisens-terapi som reduserer ekspresjonen av klustrin tilveiebringer terapeutiske fordeler i behandlingen av cancer. Nærmere bestemt kan slik antisens-terapi bli anvendt i behandling i prostatacancer og nyrecellecancer.

(PCT søknad nr. WO 00/49937, som er inkorporert her ved referanse). Administrasjon av terapeutiske klustrin-midler kan også forsterke sensitivitet av cancerceller for kjemoterapeutiske midler og for strålingsterapi både in vitro og in vivo. Sekvenser av spesifikke RNA-molekyler som kan bli benyttet for å interferere med ekspresjonen av klustrin er listet opp i tabell 1 og 7. (Se US patentsøknad serienr. 09/967,726 som er inkorporert her ved referanse). Disse sekvensene kan bli benyttet alene eller i kombina-

sjon med andre kjemoterapeutiske midler eller apoptoseinduserende behandlingskonsepter i behandlingen av prostatacancer, sarkomer slik som osteosarkom, nyrecellekarcinom, brystcancer, blærecancer, lungecancer, koloncancer, ovariecancer, anaplastisk stor cellelymfom og melanom. I tillegg har klustrin blitt vist til å fremme dannelse av amyloide plaque og til å være kritisk for neuritisk toksisitet i musemodeller for Alzhei-mers sykdom. (De Mattos et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA) 99: 10843-10848 (2002), som er inkorporert her ved referanse). Sekvensene av oppfinnelsen kan derfor også bli benyttet i behandlingen av Alzheimer's sykdom.

Spesifikke resultater som er relatert til anvendelsen av RNAi-artene vist i tabell 7 er vist i figurene. Disse resultatene demonstrerer effektiviteten av klustrinundertrykkelse ved RNAi-formidlede prosesser for å redusere veksten av og for å fremme apoptose i osteo-sarkomceller, som på denne måten demonstrerer en ytterligere type av tilstand som kan bli behandlet i overensstemmelse med oppfinnelsen. Resultatene demonstrerer også at RNAi-behandling for å redusere nivåer av klustrin resulterer i økte nivåer av p53 og reduserte nivåer av bcl-2.1 overensstemmelse med oppfinnelsen er derfor tilstander hvor aktive p53 eller bcl-2 nivåer er påvirket på grunn av regulering som resultat av mutasjon som gjør tumorsuppressoren fullstendig eller delvis inaktiv overvunnet ved administrasjon av en mengde av klustrin RNAi effektiv til å redusere mengden av klustrin tilstede, og derfor den uønskede klustrinassosierte moduleringen av p53 og bcl-2 nivåer.

En andre gruppe av RNA-molekyler i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen er rettet til mRNA som koder for insulinlignende vekstfaktorbindende protein-5 (IGFBP-5). Det har blitt vist at inhibering av IGFBP-5-ekspresjon kan forsinke pro-gressjonen av hormonregulerte (prostata eller bryst) tumorceller til hormon (f.eks. androgen eller østrogen) uavhengighet, tilveiebringe en terapeutisk fremgangsmåte for behandlingen av individer, som inkluderer mennesker, som lider av hormonregulerte cancere, slik som bryst- eller prostatacancer og inhibere eller forsinke veksten av metastatisk progressjon av prostata, bryst og andre IGF-1-sensitive tumorer i ben. (Publisert PCT-søknad nr. WOO1/05435, som er inkorporert her ved referanse). Disse samme resultatene er oppnådd ved å benytte RNAi-terapi i overensstemmelse med oppfinnelsen ved å benytte siRNA-molekyler som har sekvensene som presentert i tabell 2. Disse sekvensene kan bli benyttet alene eller i kombinasjon med andre kjemoterapeutisk midler eller apoptoseinduserende behandlingskonsepter.

En tredje gruppe av RNA-molekyler i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen er rettet til mRNA som koder for insulinlignende vekstfaktor bindende protein-2 (IGFBP-2). Det har blitt vist at inhibering av ekspresjon av IGFBP-2 forsinker pro-gressjonen av prostatatumorceller til androgen uavhengighet, og tilveiebringer en terapeutisk fordel for mammalske individer, som inkluderer mennesker, som lider av hor-monregulert cancer slik som prostata eller brystcancer. I tillegg kan sammensetningene av oppfinnelsen bli benyttet for å inhibere eller forsinke veksten av metastatisk progressjon av slike cancere. (Publisert PCT-søknad nr. WO02/22642, som er inkorporert her ved referanse). Disse samme resultatene er oppnådd ved å benytte RNAi-terapi i overensstemmelse med oppfinnelsen ved å benytte siRNA-molekyler som har sekvensene presentert i tabell 3. Disse sekvensene kan bli benyttet alene eller i kombinasjon med andre kjemoterapeutiske midler eller apoptoseinduserende behandlingskonsepter. En fjerde gruppe av RNA-molekyler i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen er rettet til mRNA som koder for insulinlignende vekstfaktor-2 og 5 samtidig (IGF-Bis). Inhibering av ekspresjon av både IGFBP-2 og IGFBP-5 kan forsinke pro-gressjonen av hormonregulerte (prostata eller bryst) tumorceller til hormon (f.eks. androgen eller østrogen) uavhengighet, tilveiebringe en terapeutisk fremgangsmåte for behandlingen av individer, som inkluderer mennesker, som lider av hormonregulerte cancere, slik som bryst- eller prostatacancer og inhibere eller forsinke veksten av metastatisk progressjon av prostata-, bryst- og andre IGF-1 sensitive tumorer i ben hovedsakelig mer effektivt enn inhiberingen av hver av disse faktorene (publisert PCT søknad nr. WO01/05435, publisert PCT søknad nr. WO02/22642 og US foreløpig søknad nr. 60/350,046, arkivert 1/17/2002, som er inkorporert her ved referanse.) Disse samme resultatene er oppnådd ved å benytte RNAi-terapi i overensstemmelse med oppfinnelsen ved å benytte siRNA-molekyler som har sekvensene presentert i tabell 4. Disse sekvensene kan bli benyttet alene eller i kombinasjon med andre kjemoterapeutiske midler eller apoptoseinduserende behandlingskonsepter.

En femte gruppe av RNA- eller DNA-antisensmolekyler i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen er rettet til mRNA som koder for gruppen av mikroftala-mitranskripsjonsfaktorer (Mitf). Bcl-2 er regulert i melanom og andre celler ved hoved-regulatoren Mitf som har blitt rapportert til å modulere viabilitet av melanomceller, lin-jeoverlevelse og mottakelighet for apoptose (McGill et al. (2002) CU 109, 707-718, inkorporert her ved referanse). Mitf og Becl-2 regulert ved Mitf er uttrykt i økte mengder i ulike humane tumorer. RNAi eller antisensterapi som reduserer ekspresjonen av Mitf kan tilveiebringe terapeutiske fordeler i behandlingen av cancer. I overensstemmelse med oppfinnelsen kan Mitf også forsterke sensitivitet av cancerceller for kjemoterapeutiske midler og til strålingsterapi både in vitro og in vivo. Sekvenser av spesifikke anti sens eller RNA-molekyler som kan bli benyttet for å interferere med ekspresjonen av Mitf er listet opp i tabell 5. Disse sekvensene kan bli benyttet alene eller i kombinasjon med andre kjemoterapeutiske midler eller apoptoseinduserende behandlingskonsepter i behandlingen av melanom, prostatacancer, nyrecellekarcinom, blærecancer, lungecancer, bencancer og andre tumorer.

En sjette gruppe av RNA eller DNA antisensmolekyler i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen er rettet til mRNA som koder for B-raf. B-raf er en nøkkel-spiller i cellulær signaltransduksjon og er aktivert med en somatiske missensmutasjoner i 66% av ondartede melanomer og ved lavere frekvenser i et bredt utvalgt av humane cancere (Davies et al. (2002) Nature 417,949-954, inkorporert her ved referanse). RNAi eller antisensterapi som reduserer ekspresjonen av aktivert og/eller ikke-aktivert B-raf kan tilveiebringe terapeutiske fordeler i behandingen av cancer. I overensstemmelse med oppfinnelsen kan reduksjon i ekspresjon av B-raf også forsterke sensitivitet av cancerceller for kjemoterapeutiske midler og for strålingsterapi både in vitro og in vivo. Sekvenser av spesifikke antisens eller RNA-molekyler som kan bli benyttet for å interferere med ekspresjonen av B-raf er listet opp i tabell 6. Disse sekvensene kan bli benyttet alene eller i kombinasjon med andre kjemoterapeutiske midler eller apoptoseinduserende behandlingskonsepter i behandlingen av melanom, prostatacancer, nyrecellekarcinom, blærecancer, lungecancer, bencancer og andre tumorer.

siRNA-molekylene av oppfinnelsen er benyttet i terapi for å behandle pasienter, som inkluderer humane pasienter, som har cancere eller andre sykdommer av en type hvor

en terapeutisk fordel er oppnådd ved inhiberingen av ekspresjon av det målrettede proteinet. siRNA-molekyler av oppfinnelsen er administrert til pasienter ved en eller flere daglige injeksjoner (intravenøs, subkutan eller intratekal) eller ved kontinuerlig intrave-nøs eller intratekal administrasjon i en eller flere sykluser av behandling for å nå plasma og vevskonsentrasjoner egnet for reguleringen av det målrettede mRNA'et og proteinet.

Eksempel 1

Protokoll for transfeksjon av LNCaP og PC3-celler med siRNA-duplekser

1) Cellefremstilling:

I hver brønn av 6-brønners plate så ut 0,5 x IO6 LNCaP-celler [PC3-celle ved tettheten 0,3 x IO6 pr. brønn] i hensiktsmessig medium som inneholder 5% FBS uten antibiotika [penicillin/streptomycin].

Inkubere cellene ved 37°C i en fuktig 5% C02-inkubator inntil de når 40-50% kon-fluens.

2) siRNA-fremstilling:

Fremstille den følgende siRNA-fortynningen i mikrosentrifugerør. For hver brønn: 0,01-100 nM.

3) Fremstille den følgende transfeksjonsreagensfortynningen i mikrosentrifugerør:

For hver brønn av 6-brønners plate fortynn 4 ml av 01igoFECTAMINE™-reagens ill ml av OPTI-MEM™ og inkubere i 10 min. ved romtemperatur. 4) Kombinere fortynnet OligoFECTAMINE™ med de fortynnede siRNA-dupleksene og blande forsiktig ved å snu røret opp ned.

5) Inkubere i 20 min. ved romtemperatur.

6) Fjerne mediumet fra brønnen og erstatte med 800 ml av Opti-MEM™.

7) Legge 200 ml av transfeksjonskompleksene over cellene.

8) Inkubere 4 timer ved 37°C i en C02-inkubator.

9) Tilsette 500 ml av medium som inneholder 15% FBS.

10) Sjekke genekspresjon etter 24 timer ved Real-Time PCR eller

11) sjekke proteinekspresjon med Western Blot etter 1,6,12,24,48, 72 og 96 timer.

Eksempel 2

Det humane klustrin cDNA'et ble manuelt scannet for å identifisere sekvenser av AA(Ni9)UU (N, et hvert nukleotid) typen som oppfyller de nødvendige kriteriene for siRNA (Harbourth et al., J. Cell. Sei. 114:4557-4560 (2001)). To slike sekvenser med symmetriske 2' nukleotider 3' overheng ble funnet 433 (Cl-I) og 644 (Cl-II) nukleotider nedstrøm for CLU-gentranskripsjonsstartkodonet. To ytterligere oligonukleotider benyttet målsøkte en region 1620 nukleotider nedstrøm for CLU-gentranskripsjonsstartkodonet (Cl-III) og det humane CLU-transkripsjonsstartstedet (Cl-V) (se tabell). BLAST-analyse viste ingen homologi med andre kjente humane gener. Valgte RNA-oligoer ble syntetisert ved Dharmacon Research, Inc. (Lafayette, CO), fortynnet ved en 20 uM sluttkonsentrasjon i RNase-fritt ddH20 og lagret ved -20°C. Scramble-I™ (Sc-I)

(D-1200-20) og Scramble-II™ (Sc-II) (D-1205-20) oligonukleotidene benyttet ble inn-kjøpt fra Dharmacon Research, Inc.

siRNA-transfeksjon av Cl-I, Cl-II og omstokkede RNA-duplekser i eksponensielt vok-sende OS-celler ble utført som beskrevet (Harbourth et al., Tuschl et al., Genes Dev. 13:3191-3197 (1999)). I korthet ble celler sådd ut dagen før siRNA-transfeksjon i 24-brønners plater som inneholdt 500 ul fullstendig medium og var~40-50% konfluente under transfeksjon. For transfeksjonsblandingen ble 100 nM av siRNA-dupleks benyttet pr. brønn. RNA-duplekset ble fortynnet i Opti-MEM® I (Gibco Life Technologies, Inc., San Diego, CA) serumfritt medium og effektivitet av transfeksjon ble forsterket ved å benytte 01igofectamine™-reagens (Invitrogen Life Technologies, Inc., San Diego, CA). Når celler ble behandlet med både Cl-I og Cl-II oligonukleotider, ble 100 nM av hver siRNA-dupleks benyttet. Behandling av celler med siRNA-oligonukleotidene varte i 2-3 dager.

I PC3-celler ble alternativt Lipofectin™ (Invitrogen Life Technolgies, Inc., San Diego, CA) benyttet for å øke transfeksjon med Cl-III og Cl-V oligonukleotidene. PC3-celler ble behandlet med 100, 50 eller 100 nM av RNA-dupleksene etter pre-inkubasjon med 4 ug/ml av Oligofectamine™-reagens i serumfri OptiMem® I i 20 minutter. Fire timer etter start på inkubasjonen, ble mediumet som inneholdt RNA-dupleksene og lipofek-tamin erstattet med standard celledyrkingsmedium. Cellene ble behandlet en gang på dag 1 og så høstet 48 timer etter behandling på dag 3.1 alle tilfeller inkluderte kontroller benyttet: (a) anvendelsen av Sc-I og Sc-II RNA-dupleksene og (b) null-transfeksjoner i fraværet av en nukleinsyre (Con-I). Silencing av CLU-gen ble bestemt ved RNA-blotanalyse, immunblottinganalyse eller konfokal immunfiuorescens.

Effektiv silencing av CLU-genekspresjonen i OS-celler er oppnådd ved å benytte siRNA. Behandling av de tre OS-cellelinjene med Cl-I eller Cl-II siRNA-oligonukleotidene viste seg å være ganske effektivt og resulterte i å slå ned de cellulære CLU-proteinnivåene signifikant. Interessant viste Cl-I-oligonukleotidet seg å være litt mer effektiv enn Cl-II i å nedregulere CLU-genet. Ingen nedregulering av CLU-gen ble sett under tilstedeværelsen av kontroll Sc-I- eller Sc-II-oligonukleotidene eller i fraværet av RNA-duplekser fra transfeksjonsmediumet.

Videre adresserte vi spørsmålet om hvorvidt de CLU-spesifikke siRNA-oligonukleotidene også kunne inhibere akkumuleringen av CLU-proteinet etter cellulær eksponering for DXR. Eksponering av KH OS og U-2 OS-cellene for DXR i 24 timer under tilstedeværelsen av Cl-I, Cl-II eller en blanding av både Cl-I og Cl-II oligonukleotidene opphevet effektivt akkumulering av CLU-protein. Det er derfor åpenbart at under tilstedeværelsen av Cl-I eller Cl-II oligonukleotidene kan ikke det cellulære CLU-proteinet bli indusert etter celleeksponering for apoptoseinduserende midler.

Eksempel 3

Fenotypiske effekter i OS-celler etter silencing av CLU-genekspresjon med siRNA. Effektene av silencing av CLU-genekspresjon i OS-celler ble studert ved direkte å telle cellene etter siRNA-behandling, ved å registrere cellulær morfologi og fenotype, så vel som ved klonogeniske tester. CLU knock-down i KH OS- og Sa OS-celler resulterte ikke i noen synlig fenotype. CLU knock-down-cellene ble imidlertid funnet til å være signifikant vekstretarderte sammenlignet med deres kontrollmotstykker (fig. IA). I mot-setning til U-2 OS-cellene, som uttrykker høyere endogen mengde av CLU-proteinet, viste effektene av CLU knock-down seg å være ganske signifikante. Spesifikt, mistet CLU siRNA-behandlede (i tre dager) U-2 OS-celler sin stabile evne til å feste seg til plastikk og oppnådde en rund form. Denne fenotypen ble ledsaget ved en kraftig vekst-retarderende effekt. For å studere hvorvidt en kombinasjon av både Cl-I- og Cl-II RNA-duplekser vil være mer effektive i å inhibere cellevekst behandlet vi celler med begge disse oligonukleotidene. For KH OS- og U-2 OS-cellene ble bare en liten økning i vekstretardasjon observert sammenlignet med de Cl-I-behandlede cellene. For å sjeldne mellom de cytostatiske og cytotoksiske effektene av CLU-proteineliminering testet vi direkte CLU knock-down KH OS- og U-2 OS-celler for DNA-syntese og endogen spontan apoptose. CLU knock-down cellene viste en redusert grad av DNA-syntese (fig. IA) og høyere nivåer av endogen spontan apoptose (fig. IB) sammenlignet med deres kontrollmotstykker. Effektene var igjen mer tydelige i U-2 OS-celler. Samlet antyder disse resultatene at det reduserte antallet av CLU knock-down celler er på grunn av en redusert grad av celleproliferasjon så vel som et økt nivå av spontan apoptose.

Effekten av CLU knock-down i platingseffektivitet og vekst etter siRNA ble også studert ved klonogeniske tester ettersom nyere studier har demonstrert at gensilencing er opprettholdt i mer enn 7 cellulære doblinger (Harbourth et al.). KH OS- og U-2 OS-celler ble valgt for disse testene siden de representerer to ekstremt motsatte tilfeller tatt i betraktning den endogene CLU-mengden og intensiteten av CLU-akkumulering under stress. CLU knock-down KH OS-celler når platet festet seg stabilt til plastikken (mer enn 90% av de utsådde cellene var festet) og bare noen fa av de festede cellene viste en unormal morfologi. Vekstpotensialet til de adherente cellene var imidlertid svekket som funnet 5 dager etter plating etter å analysere det totale koloniantallet og størrelsen av de dannede koloniene (fig. 2A). CLU knock-down U-2 OS-celler var dårlig festet til plastikken etter trypsinering (bare~70% av de utsådde cellene var festet) og de fleste av de adherente cellene viste seg å være ganske unormale i form. Celler viste et ekstremt lavt proliferasjonspotensiale (fig. 2B) og etter 9 dager i kultur kunne bare noen få små kolo-nier ses.

Eksempel 4

Vedvarende silencing av CLU-genekspresjon i OS-celler ved siRNA resulterer i signifikant sensibilisering for apoptose indusert ved gentoksisk og oksidativt stress. Før CLU-funksjonelle tester analyserte vi DXR-effektene i OS-celler siden de medikamentrelater-te rapporterte effektene varierer i ulike celletyper (Gewritz et al., Biochem. Pharmacol. 57: 727-741 (1999)). Ettersom DXR-plasmakonsentasjonen i behandlede pasienter fal-ler innenfor et område på 1-2 uM og reduseres til et område på 0,025-0,25 uM innenfor 1 time (Muller et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 32: 379-384 (1993)) ble celler behandlet med 0,353 og 1 uM av DXR. For å analysere omfanget av den DXR-formidlede celledøden skåret vi apoptose ved TUNEL. Festede celler etter medikament-behandling i 24 timer gjennomgikk signifikante endringer i morfologi sammenlignet med ikke-behandlede kontrollceller. På dette tidspunktet viste cellene en forstørret og flat morfologi som minner om en aldrende lignende fenotype, mens et sigifikant antall av dem er TUNEL-positive. Pågående apoptose er også tydelig 24 timer senere, som verifiserer at apoptose er en dynamisk prosess som fortsetter til og med etter DXR er fjernet fra mediumet. I overensstemmelse med resultatene oppnådd ved TUNEL, ble DXR-behandling ledsaget ved PARP-kløving; det anti-apoptotiske proteinet bcl-2 viste ingen endret ekspresjon i medikamentbehandlede KH OS- og U-2 OS-celler. Etter DXR-behandling, ble akkumulering av p53-protein og dets nedstrøm effektorer relatert til enten vekstarrestasjon (p21) eller apoptose (bax) funnet bare i U-2 OS-celler som indikerer at de cytostatiske og cytotoksiske effektene formidlet ved DXR i OS-cellelinjer beror på både p53-avhengige og p53-uavhengige mekanismer.

Videre, fulgte vi to komplementære metoder for å studere effektene av CLU knock-down i OS-celler eksponert for DXR (fig. 3 A og B). siRNA-behandlede celler ble enten re-platet i fullstendig medium og ble deretter eksponert for 0,35 uM DXR i 24 timer, eller de ble eksponert for 0,35 uM DXR under tilstedeværelsen av Cl-II- eller Cl-I-oligonukleotidene. I begge tilfeller ble viable celler tellt 3 dager etter DXR-behandling. CLU knock-down KH OS-celler viste seg å være mer sensitive for DXR enn deres kontroll-motstykker (fig. 3 A - mørke stolper), imens DXR-behandling viste seg å være signifikant mer effektivt når det ble kombinert med tilstedeværelsen av de CLU-spesifikke siRNA-oligonukleotidene i mediumet (fig. 3 A - lyse stolper). På lignende måte var CLU knock-down Sa OS-celler mer sensitive for DXR-behandlingen. I U-2 OS-celler viste begge strategier seg å være effektive og CLU knock-down celler var signifikant mer sensitive for medikamentet sammenlignet med kontroller (fig. 3B). Når DXR-behandling ble utført under tilstedeværelsen av de CLU-spesifikke siRNA-oligonukleotidene, viste CLU knock-down cellene seg å være signifikant mer sensitive for medikamentet (fig. 3B - lyse stolper) og en massiv apoptose ble observert. Når U-2 OS-celler ble behandlet med både Cl-I- og Cl-II-oligonukleotidene var celler neste eli-minert.

For å forstå mekanismen for cellesensibilisering etter CLU knock-down testet vi direkte intensiteten av apoptoseinduksjon rett etter celleeksponering for medikamenter som

inkluderer gentoksisk (DXR) eller oksidativt stress (H2O2). Som vist i fig. 3C-F. Eksponering av CLU knock-down cellene for enten DXR eller H2O2resulterte i en signifikant større grad av apoptose i både KH OS- og U-2 OS-celler. Denne observasjonen antyder at CLU direkte påvirker eller interagerer med det cellulære maskineriet involvert i apoptose, ved å tilveiebringe cytobeskyttende signaler.

Eksempel 5

OS-cellesensibilisering for gentoksisk og oksidativt stress på grunn av silencing av CLU-gen er relatert til aktivering av det cellulære apoptotiske maskineriet. Ved å analysere ekspresjonsnivåene av andre nylig identifiserte CLU-proteinformer, fant vi, til vår overraskelse at Cl-I- og Cl-II-oligonukleotidene ikke hadde noen signifikant effekt på det antatte 55 kDa n-CLU<35>CLU-proteinformen i både KH OS- og U-2 OS-celler; en mindre effekt på den 49 kDa c-CLU<49>proteinformnivået ble detektert til tross for det faktum at bindingscelet for Cl-I- eller Cl-II-oligonukleotidene er felles mellom s-CLU og n-CLU mRNA'ene (Leskov et al., J. Biol. Chem. 278:11590-16000 (2003)). Vi formoder at forklaringen av denne effekten beror på vår observasjon at at n-CLU-proteinet er ekstremt stabilt. Cl-I- og Cl-II-oligonukleotidene slår derfor spesifikt ut den utskilte CLU (s-CLU) proteinformen.

Vi testet så ekspresjonsnivåene av flere proteiner involvert i å regulere apoptose i humane celler. CLU knock-down i både KH OS- og U-2 OS-celler resulterte i nedregule-ringen av det anti-apoptotiske molekylet bcl-2. Ingen effekt ble detektert på nivåer av Ku70, et protein involvert i reparasjon av DNA-skade og signallering, som videre bin-der n-CLU (Yang et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 97: 5907-5912 (2000)). I U-2 OS-celler, som bærer et funksjonelt p53-molekyl, er CLU knock-down adskilt fra bcl-2 nedregulering også ledsaget av p53-akkumulering og oppregulering av dens nedstrøm pro-apoptiske effektor, bax. CLU knock-down U-2 OS-celler når eksponert for DXR viste en mer intens og robust akkumulering av p53-proteinet sammenlignet med de Sc-I-behandlede cellene. Vi antyder at sensibilisering av OS-celler etter CLU knock-down for det meste avhenger av aktiveringen av det cellulære pro-apoptotiske maskineriet. Pågående studier i våre laboratorier undersøker innblandingen av CLU på cellesignalle-ringskaskadene relatert til apoptoseregulering.

Eksempel 6

Effekter av å slå ut CLU-gen i PC-3 prostatacancerceller ble bestemt etter å ha etablert de signifikante effektene av CLU knock-down i OS-celler benyttet vi så CLU siRNA i

PC3-humane prostatacancerceller. PC3-celler er p53 null (Rohlff, et al., Prostate 37:51-59 (1998)) og uttrykker relativt lav endogen mengde av s-CLU-proteinformen lignende Sa OS-cellene. I PC3-celler, bortsett fra å bruke Cl-I- og Cl-II-oligonukleotidene, testet vi også to ytterligere CLU-spesifikke siRNA-oligonukleotider (Cl-III, Cl-V). Fra disse oligoene, målsøkte Cl-V s-CLU-transkripsjonsstartstedet. Anvendelse av Cl-I- og Cl-II-oligonukleotidene i PC3-celler resulterte i lignende effekter som dem beskrevet for OS-cellelinjer. Som kan bli sett i fig. 4 er både Cl-III- og Cl-V-oligonukleotidene ganske effektive i å slå ut CLU RNA og proteinekspresjon på en sekvensavhengig, men dose-uavhengig måte. Behandling av PC3 -cellene i en dag, med 10, 50 og 100 nM av enten Cl-III eller Cl-V siRNA-oligonukleotider reduserte kraftig CLU mRNA-nivåer varie-rende fra 60% til 98% (fig. 4). Denne effekten på mRNA-nivåer var også synlig på pro-teinnivået. I tillegg og i overensstemmelse med funnene i U-2 OS-cellene, resulterte CLU knock-down i PC3-celler i signifikante morfologiske endringer som lignet en pågående apoptose.

For å bestemme hvorvidt behandling av PC3-celler med CLU siRNA-oligonukleotider kan forsterke de cytotoksiske effektene av kjemoterapeutiske medikamenter, ble PC3-celler behandlet først med Cl-III-, Cl-V- eller Sc-I siRNA-oligonukleotidene og så inkubert med medium som inneholdt ulike konsentrasjoner av paklitaksel i 2 dager. En MTT-test ble så utført for å bestemme celleviabilitet. Som vist i fig. 5 forsterket CLU siRNA-behandling signifikant kjemosensitivitet for paklitaksel på en doseavhengig måte som reduserer IC50(konsentrasjonen som reduserer celleviabilitet med 50%) for paklitaksel med mer enn 90%, imens omstokket siRNA ikke hadde effekt.

Eksempel 7

8 arter av siRNA målrettet mot klustrin ble dannet som dobbeltrådet RNA fra hhv. Seq.

id. nr. 1 og 2, 3 og 4, 5 og 6, 7 og 8, 9 og 10,11 og 12,13 og 14, og 15 og 16, og merket som CLU1-CLU8. PC3-celler ble transfektert med ulike doser (10, 50 og 100 nM) av de 8 artene av siRNA eller omstokket kontroll. Tre dager etter behandling ble proteiner

ekstrahert og analysert ved Western blotting for klustrinnivåer (MW = 40 og 60 kDa). Reduksjon i mengden av klustrin ble observert med alle åtte arter av siRNA, selv om de beste resultatene ble oppnådd med CLU-5 (Seq. id. nr. 9 og 10).

Densitometriske målinger ble utført etter normalisering til en vinkulinkontroll for Mot-tene av celler behandlet med CLU-5 (Seq. id. nr. 9 og 10). Resultatene er sammenfattet i fig. 6. "01igo"-celler ble behandlet med bare oligoFECTAMINE™. Som det kan bli sett, ble en doseavhengig respons til siRNA'et observert.

Eksempel 8

Eksperimentet fra eksempel 7 ble repetert ved å benytte A549-lungecancerceller i stedet for PC3-prostataceller, og sammenlignbare resultater ble observert. Densitometriske målinger ble utført etter normalisering til en vinkulinkontroll av blottene for cellene behandlet med CLU-5 (Seq. id. nr. 9 og 10). Resultatene er sammenfattet i fig. 7. "Oli-go"-celler ble behandlet med bare oligoFECTAMINE™. Som kan bli sett, ble en dose-avhengig respons til siRNA'et observert.

Eksempel 9

PC3-celler ble transfektert med siRNA ved nivåer på 10, 50 eller 100 nM eller med 100 nM omstokket kontroll. To dager etter transfeksjon, ble total-RNA ekstrahert og nivået av klustrintranskript kvantifisert ved Real Time PCR. Resultatene er vist i fig. 8. Som kan bli sett, resulterte hver av de 8 artene av siRNA testet i en reduksjon i mengden av klustrintranskript.

Eksempel 10

Eksperimentet i eksempel 9 ble repetert ved benytte A549-celler i stedet for PC3-celler. Resultatene er vist i fig. 9. Som kan bli sett, resulterte hver av de 8 artene av siRNA testet i en reduksjon i mengden av klustrintranskript.

Eksempel 11

PC3-celler ble behandlet (1 puls) med CLU-3 (Seq. id. nr. 5 og 6) eller CLU-5 (Seq. id. nr. 9 og 10) eller med en omstokket kontroll ved nivåer på 10, 50 eller 100 nM, eller med bare oligoFECTAMINE™. Etter to dager ble total-RNA ekstrahert og analysert for klustrin og GADPH ved Northern blotting. Densitometriske målinger ble utført. Fig. 10 presenterer resultater av disse målingene etter normalisering til GAPDH. Reduksjon i mengden av klustrintranskript ble observert ved alle doser av CLU-3 og CLU-5.

Eksempel 12

PC3-celler ble behandlet en gang med 25 nM humane klustrin siRNA'er (CLU-3 og CLU-5), en omstokket kontroll, eller bare oligoFECTAMINE™. Etter to dager med behandlet ble mediumet erstattet med medium som inneholdt ulike konsentrasjoner av taksol (paklitaksel). Etter tre dagers inkubasjon ble celleviabilitet bestemt ved MTT-test. Fig. 11 sammenfatter resultatene. Som kan bli sett, arbeidet siRNA og taksol i sy-nergi for å redusere antallet av viable celler.

Eksempel 13

Eksperimentet i eksempel 12 ble utført med A549-celler i stedet for PC3-celler. Resultatene er sammenfattet i fig. 12.

Eksempel 14

OVCAR3-ovariecancerceller ble behandlet en gang med 1,10 eller 50 nM CLU-5, omstokket kontroll eller bare befordringsmiddel. En ubehandlet kontroll ble også kjørt. Ettere to dager ble total-RNA ekstrahert og analysert for klustrin og GAPDH mRNA ved Northern blot. Densitometriske målinger av klustrinn mRNA-nivåer etter normalisering til GAPDH mRNA er vist i fig. 13. Vesentlig doseavhengig reduksjon i mengden av klustrintranskript ble observert.

Eksempel 15

MDA-MB 231 humane brystcancerceller ble transfektert med 5, 50 eller 100 nM CLU-5 eller en omstokket kontroll, eller med bare oligoFECTAMINE™. To dager etter transfeksjon ble RNA ekstrahert og analysert for klustrin og GAPDH ved Northern blotting. Densitometriske målinger av klustrin mRNA-nivåer etter normalisering til GAPDH mRNA er vist i fig. 14. Vesentlig reduksjon i mengden av klustrintranskript ble observert.

Eksempel 16

Eksperimentet i eksempel 15 ble repetert, med unntak av at klustrintranskript ble kvantifisert ved å benytte RT-PCR. Resultatene er sammenfattet i fig. 15. Vesentlig reduksjon i mengden av klustrintranskript ble observert.

Eksempel 17

MCF-7 humane brystcancerceller ble transfektert med 5,25 eller 50 nM CLU-5 eller en omstokket kontroll, eller med bare oligoFECTAMINE™. To dager etter transfeksjon,

ble RNA ekstrahert og analysert for klustrin og GAPDH ved Northern blotting. Densitometriske målinger av klustrin mRNA-nivåer etter normalisering til GAPDH mRNA er vist i fig. 16. Vesentlig dose-avhengig reduksjon mengden av klustrintranskript ble observert.

Eksempel 18

Eksperimentet i eksempel 17 ble repetert, med unntak av at klustrintranskript ble kvantifisert ved å benytte RT-PCR. Resultatene er sammenfattet i fig. 17. Vesentlig reduksjon i mengden av klustrintranskript ble observert.

Eksempel 19

MCF-7-celler ble transfektert med ulike doser (5 og 50 nM) av CLU-5 siRNA eller omstokket kontroll. Tre dager etter behandling, ble proteiner ekstrahert og analysert ved Western blotting for klustrinnivåer (MW = 40 og 60 kDa). Fig. 18 viser reduksjonen i mengden av klustrinprotein i celler behandlet med siRNA relativt til den omstokkede kontrollen.

Eksempel 20

Klustrin overuttrykkende LNCaP)/Tl-celler ble transfektert (1 puls) med 10 nM CLU-5 siRNA eller omstokket kontroll. Tre dager etter behandling, ble proteiner ekstrahert og analysert ved Western blotting for klustrin. Ikke noe klustrin ble detektert i cellene behandlet med siRNA'et.

Eksempel 21

3 arter av siRNA som målsøker IGFBP-2 og -5 ble dannet som dobbelttrådet RNA fra Seq. id. nr. 39 og 40,41 og 42 og 43 og 44 og merket som hhv. BS-l-BS-3. A549-celler ble transfektert med ulike doser (10, 50 og 100 nM) av de 3 artene av siRNA eller omstokket kontroll. En kontroll med bare befordringsmiddel og en ubehandlet kontroll ble også evaluert. Total-RNA ble ekstrahert og analysert ved RT-PCR for IGFBP-2-transkript. Som vist i fig. 19, var reduksjon i mengden av IGFBP-2-transkript observert med alle tre arter av siRNA.

Eksempel 22

PC3-celler ble transfektert med ulike doser (10, 50 og 100 nM) av de 3 artene av bispe-sifikk siRNA (BS-1, BS-2 og BS-3) eller omstokket kontroll. En kontroll for bare befordringsmiddel ble også evaluert. Total-RNA ble ekstrahert og analysert ved RT-PCR for IGFBP-5-transkript. Som vist i fig. 20 og 21, var reduksjon i mengden av IGFBP-5-transkript observert med alle tre arter av siRNA.

Eksempel 23

Primære humane benfibroblaster ble transfektert med 50 nM av de 3 artene av bispesi-fikk siRNA (BS-1, BS-2 og BS-3) eller omstokket kontroll. En kontroll med bare befordringsmiddel og en ubehandlet kontroll ble også evaluert. Total-RNA ble ekstrahert og analysert ved RT-PCR for IGFBP-5-transkript. Som vist i fig. 22, ble reduksjon i mengden av IGFBP-5-transkript observert med alle tre artene av siRNA.

Eksempel 24

C42-celler (en underlinje av LNCaP-prostatacancerceller) ble behandlet med BS-1, BS-2 og BS-3, og vekstinhibering ble bestemt ved å benytte en krystallfiolett test. Resultatene er vist i fig. 23.

Eksempel 25

A549-lungecancerceller ble behandlet med BS-1, BS-2 og BS-3, og vekstinhibering ble bestemt ved å benytte en krystallfiolett test. Resultatene er vist i fig. 24.

Claims (8)

1. Dupleks RNA molekyl som har en sekvens som er effektiv i å formidle degradering av mRNA,karakterisert vedat dupleks RNA molekylet formidler degradering av både et gen som koder for humant IGFB-2 og et gen som koder for humant IGFB-5 samtidig og RNA molekylet består av et dupleks RNA dannet fra SEQ ID NO: 39 og 40, SEQ ID NO:41 og 42 eller SEQ ID NO:43 og 44.

2. Dupleks RNA molekyl i følge krav 1,karakterisertved at RNA molekylet består av et dupleks RNA dannet fra SEQ ID NO: 39 og 40.

3. Dupleks RNA molekyl i følge krav 1,karakterisertv e d at RNA molekylet består av et dupleks RNA dannet fra SEQ ID NO: 41 og 42.

4. Dupleks RNA molekylet i følge krav 1,karakterisertved at RNA molekylet består av et dupleks RNA dannet fra SEQ ID NO: 43 og 44.

5. Farmasøytisk sammensetning,karakterisert vedat den omfatter et RNA molekyl i følge kravene 1-4 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

6. Farmasøytisk sammensetning i følge krav 6,karakterisertved at den farmasøytiske akseptable bæreren er steril injiserbar løsning.

7. Anvendelse av et RNA molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 1-6, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning, for behandling av cancer.

8. RNA molekyl i følge et hvilket som helst av kravene 1-6, for behandling av cancer.