NO20141517L - Ny type III-sekresjonsvei i Aeromonas salmonicida og anvendelse derav - Google Patents

Description

NY TYPE III-SEKRESJONSVEI IAEROMONAS SALMONICIDA OG

ANVENDELSE DERAV

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Denne oppfinnelsen angår bakterielle sekresjonssystemer og spesielt et nylig identifisert ogkarakteriserttype III-sekresjonssystem i Aeromonas salmonicida. Oppfinnelsen omfatter også anvendelsen av komponenter av det nye sekresjonssystemet i immunbeskyttelse mot A. salmonicida- inféksion så vel som andre diagnostiske og terapeutiske anvendelser derav.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Det er referert til forskjellige publikasjoner gjennom hele denne publikasjonen, og fulle referanser for hver av disse publikasjonene er tilveiebrakt på slutten av den detaljerte beskrivelsen.

Aeromonas salmonicida, en Gram-negativ, fakultativ, anaerob, ikke-bevegelig, stavformet bakterie som vokser ved temperaturer på omkring 20°C, er det etiologiske middelet for furunkulose i laks som forårsaker alvorlige økonomiske tap i produksjonsanlegg for laks og ørret. Sykdommen erkarakterisert vedden subakutte eller kroniske formen ved nærværet av blødende nekrotiske sår i gjellene, tarmene og musklene, mens fisk dør i den akutte formen sannsynligvis fra toksemi uten å vise spesifikke ytre tegn.

Som følge av sykdommens høye smittsomhet og den høye dødeligheten i laks i alle aldere, spesielt i sjøanlegg, anvendes store mengder antibiotika i lukkede og åpne vann i furunkuloseterapi (Munro og Hastings, 1993). Vaksinering har blitt en viktig strategi for å kontrollere furunkulose i fiskeoppdrettsanlegg (Ellis, 1997). De for tiden anvendte hele celleantigenvaksinene synes imidlertid å vise betydelig effektivitetsvariasjon, og hvor årsaken fortsatt ikke er kjent (Thornton et al., 1993).

Kunnskap om mekanismene til patogenisiteten i A. salmonicida, og spesielt de viktigste virulensfaktorene som er involvert, er essensielle i utviklingen av effektive strategier for å forebygge furunkuloseutbrudd forårsaket av A. salmonicida. For tiden har flere potensielle virulensfaktorer fra A. salmonicida blitt rapportert, inkludert et overflatelagsprotein (Chu et al., 1991), hemolysinene ASH1, ASH3 og ASH4 (Hirono og Aoki, 1993), salmolysin (Titball og Munn, 1985), serinproteasen AspA (Whitby et al., 1992) og glyserolipid-kolesterolacyltransferasen (GCAT) (Lee og Ellis, 1990), men deres rolle i patogenese er uklar og mange synes ikke å spille en primær rolle i virulens. Dette ble demonstrert gjennom A. salmonicida- stammer med delesjonsmutanter i GCAT og aspA-genene, som ikke hadde noen påvirkning på virulens av stammene ved induksjon av furunkulose.

SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN

Et nytt ADP-ribosylerende toksin kalt AexT { Aeromonas eksoenzym T) som er kodet av aexT- genet ble identifisert i en virulent Æ salmonicida- stamme. A. salmonicida- stammer som ble dyrket gjennom flere passasjer i kulturmedium hadde tapt ekspresjonen av AexT, men bibeholdt fortsatt aexT- genet. AexT viser aminosyresekvenslikheter med ADP-ribosyltransferasetoksinene ExoS og ExoT fra Pseudomonas aeruginosa som utskilles gjennom en type Ill-avhengig sekresjonsmekanisme (Yahr et al., 1996). Regulering av aexTble vist å være avhengig av kontakt med fiskeceller og kunne også induseres gjennom Ca<2+->utarming av mediet. Det ble funnet at en konsensussekvens for binding av en transkripsjonsaktivator kjent i P. aeruginosa som ExsA som er involvert i type III-mediert genekspresjon, kommer foran aexT- genet (Frank, 1997).

Basert på disse observasjonene, ble det anvendt genprober for et bredt område for å identifisere et nytt type III-sekresjonssystem i A. salmonicida ved hjelp av acrD-genet ( Aeromonas calcium respons D) som koder for et transmembrant" spanning"-protein. acrD- genet har en høy likhet med IcrD, et protein fra Yersinia sp. som er et indre membranprotein i type III-sekresjonsapparatet i Yersinia sp. acrD- genet omgis av ytterligere typiske type III-sekresjonsgener som ble kalt acrl, acr2, acr3, acr4, acrD, acrR, acrG, acrV og acrH og som viser signifikante likheter med perl, pcr2, per3, per4, pcrD, pcrR, pcrG, pcrV og pcrH fra Pseudomonas aeruginosa og til tye A, sycN, yscX, yscY, IcrD, IcrR, IcrG, IcrV og IcrH fra Yersinia enter ocolitica. Alle disse genene spiller en viktig rolle i oppbyggingen av type III-sekresjonsapparatet i de respektive bakteriene, inkludert reguleringen av den lave kalsiumresponsen (LCR) og anstandsfunksjoner. Genene som er isolert fra A. salmonicida tilhører analogen av vz/vl-operonet som er sentralt i type III-sekresjonsveien i mange Gram-negative patogen er i mennesker, dyr og planter (Fenselau et al., 1992; Gough et al., 1992; Michiels og Cornelis, 1991).

Det er også blitt bestemt at type III-sekresjonssystemet i A. salmonicida er lokalisert på et 84 kb plasmid som raskt tapes ved vekst i kulturmediet. Biosyntese av AcrV i A. salmonicida, analogen til LcrV i Yersinia, krever enten lave Ca<2+->betingelser eller kontakt med fiskeceller for å utløses. Ved infeksjon med A. salmonicida som uttrykker AcrV, gjennomgår de dyrkede cellene signifikante morfologiske endringer. Kulturer utledet fra opprinnelig virulente Æ salmonicida-stammer som hadde mistet type III-sekresjonsgenene inkludert AcrV, mistet virulensen etter infeksjon, ettersom de morfologisk ikke påvirket gonadeceller fra regnbueørret. Samtidig med tap av type III-sekresjonsgenene, tapte disse kulturene ekspresjonen av aexT- genet som spesifiserer ADP-ribosylerende toksin fra A. salmonicida.

Gonadeceller fra regnbueørret som er infisert med den virulente A. salmonicida og inkubert i antiserum rettet mot rekombinant AcrV-His-protein kunne bli beskyttet fra denne toksiske effekten og viste kun svake morfologiske endringer. AcrV som tilhører de type III-sekresjonsproteinene, er en bestemmende faktor som er involvert i virulensmekanismer i A. salmonicida og er forventet å tilveiebringe ny innsikt i hovedmekanismene ved patogenisiteten til bakteriearter. Komponentene av type III sekresjonssystemet fra A. salmonicida kan anvendes som antigener for utviklingen av underenhetsvaksiner mot infeksjon av fisk gjennom A. salmonicida.

I en utførelsesform omfatter oppfinnelsen et isolert 5,7 kb nukleinsyresegment (SEKV.ID. NR. 10) som inneholder type III sekresjonsgenene fra A. salmonicida. I en annen utførelsesform omfatter oppfinnelsen et nukleinsyresegment som koder for proteinet med aminosyresekvensen SEKV.ID. NR.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 og 9, inkludert varianter som bibeholder enten biologisk aktivitet eller immunogenisitet eller begge deler. Som følge av degenerering av den genetiske koden og det mulige nærværet av flankerende nukleinsyrefragmenter på utsiden av de kodende regionene, skal det forstås at mange forskjellige nukleinsyresekvenser kan kode for aminosyresekvensene i SEKV.ID. NR.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 eller 9 og varianter, og at alle slike sekvenser er omfattet innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelsen.

I en ytterligere utførelsesform, angår oppfinnelsen anvendelsen av AcrV som et immunogen og anvendelsen av AcrV i en rekombinant eller tradisjonell vaksine for å redusere tilfellene av infeksjon av A. salmonicida.

I en annen utførelsesform, tilveiebringer oppfinnelsen et middel for å diagnostisere A. salmonicida eller andre bakterier som er funnet å inneholde AcrV-homologer gjennom påvisningen av AcrV-proteinet eller de homologe proteinene.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

FIGUR 1 er et genkart av type III sekresjonsgenene funnet i A. salmonicida. Bokser med pilhoder inkluderer åpne leserammer ("open reading frames", ORF). Størrelsen til de forskjellige genene (i kilobaser) er vist ved stolpediagrammet. Et restriksjonskart som inneholder restriksjonsenzymene Sacl, Pstl, Noti, BamYll og Sali er vist. Anvendte forkortelser: acr, Aeromonas kalsiumrespons. FIGUR 2 er en segregeringskurve av A. salmonicida JF2267. En A. salmonicida JF2267 LB-kultur ble først inkubert i 2,5 timer ved 19°C og deretter ved 22°C i 7 timer. Koloniavtrykk ble utført ved å analysere LB-kulturen ved forskjellige tidspunkter for positive, henholdsvis negative kolonier. FIGUR 3 viser en pulsfelt gelelektroforese av A. salmonicida- stammen JF2267 og stammen JF2397. (Spor 1) JF2267, ufordøyd (spor 2) JF2397, ufordøyd. (Spor 3) JF2267 fordøyd med Noti. (Spor 4) JF2397 fordøyd med Noti. (Spor 5) PFG-markør i det lave området (New England Biolabs). De hvite pilene indikerer båndene som hybridiserer med Southern blot med ac/*Z)-genproben. FIGUR 4 viser infeksjon av fiskeceller med A. salmonicida ATCC 33658T, JF2267 og JF2397. RTG-2-celler infisert med JF2267 (A), ATCC 33658T (B), JF2397 (C) og rent PBS (D). RTG-2-celler infisert med JF2267 og monospesifikke polyklonale antistoffer mot AcrV var beskyttet (E), mens RTG-2-celler infisert med JF2267 og anti-AcrV-preserum ikke var beskyttet. Bilder ble tatt 24 timer etter infeksjon, henholdsvis 21 timer etter beskyttelsesanalysen under et fasekontrastmikroskop. FIGUR 5 viser lav Ca<2+->responsindusert AcrV-ekspresjon i A. salmonicida JF2267. Bildet viser et immunoblot omsatt med spesifikke anti-AcrV kaninserum. Stammene ATCC 33658T (spor 2), JF2267 (spor 3) og JF2397 (spor 4) ble dyrket i Ca<2+->uttømt medium, høstet gjennom sentrifugering og analysert på 15% SDS PAGE etterfulgt av immunoblotting. Spor 1 inneholder renset rekombinant AcrV-His-protein som en kontroll.

DETALJERT BESKRIVELSE

Et 5,7 kb segment som inneholder type III sekresjonsgenet fra A. salmonicida ble klonet og sekvensert tilsvarende til />c/*-lokuset ( Pseudomonas kalsiumrespons) fra Pseudomonas aeruginosa (Frank, 1997; Yahr et al., 1997b) og vz/vl-operonet og genene av det følgende operonet i Yersinia enterocolitica (Cheng og Schneewind, 2000; Iriarte og Cornelis, 1999; Piano et al., 1991; Skrzypek og Straley, 1993; Motin et al., 1994; Price og Straley, 1989) og andre Gram-negative dyre- og plantepatogener (Fenselau et al., 1992; Gough et al., 1992; Michiels og Cornelis, 1991). De mest konserverte genene ved dette lokuset ble avslørt å være acrD- genet som koder for AcrD-proteinet som viste 82% identisk aa til de transmembrane "spanning" kj erneproteinene LcrD fra injektisomet fra Y. enter ocolitica type III-sekresjonsapparatet og PcrD fra injektisomet fra P. aeruginosa type III-sekresjonsapparatet (Yahr et al., 1997b; Piano et al, 1991). Som følge av den høye likheten, konkluderte vi med at AcrD har de analoge funksjonene i injektisomet til A. salmonicida type III-sekresjonsveien.

De minst konserverte proteinene som kodet for det klonede og analyserte segmentet er AcrV som kun viser 35% identisk aa med PcrV fra P. aeruginosa og 37% identitet med LcrV fra Y. enter ocolitica. Hovedrollen til LcrV og PcrV, og følgelig også AcrV, er antatt å være involvert i sansingen av bakterievertsinteraksj onene (Sawa et al., 1999; Bergman et al., 1991). Vi antar derfor at den signifikant høyere forskjellen mellom AcrV og LcrV eller PcrV, sammenlignet med de andre genproduktene av type III-sekresjonslokuset (tabell 2) skyldes at det synes som om vertsspesifiteten bestemmes av AcrV, LcrV eller PcrV.

Våre analyser avslørte at A. salmonicida type III-sekresjonsgenene var lokalisert på et 84 kb plasmid. Det ble vist at plasmidet svært lett ble tapt i standard vekstmedia, spesielt etter en lett økning i veksttemperatur. Samtidig med tapet av type III-genene i A. salmonicida, ble det påvist tap av virulens i stammens som målt gjennom infeksjonen av RTG-2 fiskecellekulturer, så vel som tapet av produksjon av ADP-ribosylerende toksin aexTi supernatanter og bakteriecellepelleter ved lav Ca<2+->respons indusert i A. salmonicida- kultureT. Det skal også bemerkes at AexT-biosyntesen som induseres gjennom kontakt mellom A. salmonicida og RTG-2 fiskeceller forsvant i de stammer eller underkulturer som hadde mistet type III-sekresjonsgenene. Ekspresjonen av aexT- genet må derfor reguleres gjennom en mekanisme som er avhengig av type III-sekresjonsgenene. I denne betydningen må det bemerkes at flere gener av type III-sekresjonsveien i Yersinia spp., spesielt LcrV, er nedregulert og sekresjon og produksjon av effektorproteiner er fullstendig blokkert i nærværet av millimolare mengder av Ca<2+>(Forsberg et al., 1987). Det ble også tydelig fra vevskultur infeksjonsmodeller at fraværet av Ca<2+>in vitro etterligner et hittil udefinert signal som mottas av 7e/*sz'/w'a-arter når de er festet til eukaryote celler og som induserer både type III-sekresjonsgener og effektormolekyler slik som YopE og Yops (Cornelis, 1998).

Type III-sekresjonsmekanismens avhengighet av aexJ-ekspresjon ble også indikert ved hjelp av nærværet av en konsensussekvens oppstrøms for aexTtoksingenet i A. salmonicida som viser full homologi med bindingssetet til en transkripsjonsaktivator kjent i P. aeruginosa som ExsA som er involvert i type III-avhengig genekspresjon (Frank, 1997). aexJ-ekspresj onen i A. salmonicida er følgelig avhengig av en funksjonell type III-sekresjonsmekanisme. Mangelen på AexT-produksjon som påvist i A. salmonicida ATCC 33658T<->stammetypen så vel som i stammen JF2397 som ble utledet fra en opprinnelig virulent Æ salmonicida-stamme, JF2267, må derfor skyldes tapet av type III-sekresjonsveien til tross for nærværet av et funksjonelt aexT- gen.

AcrV-proteinet til den nye type III-sekresjonsveien i A. salmonicida spiller en viktig rolle i patogenesen gjennom dets rolle som en sensor og regulator av systemet som vist i andre type III-sekresjonssystemer. En viktig rolle i den sekresjonsrelaterte regulatoriske rollen i den lave Ca<2+->responsen i Y. pestis skyldes LcrV som er lokalisert til bakterieoverflaten og nødvendig for å målrette Yops i Y. pestis (Fields og Straley, 1999; Nilles et al., 1997). I tillegg ble det postulert at LcrV også utskilles gjennom en spesifikk reaksjonsvei som resulterer i dens lokalisering i infiserte cellers cytosol, men ikke i det omliggende medium (Fields og Straley, 1999). Ved anvendelse av en vevscellemodell ble det vist at antiserum som var rettet mot LcrV forhindret injeksjon av Yop effektormolekyler fra Y. pestis i vertscellene (Pettersson et al., 1999; Hueck, 1998). Aktiv immunisering av mus med rekombinant LcrV-antigen beskytter effektivt mus mot utfordring med Y. pestis (Leary et al., 1995). Våre resultater viser at antistoffer rettet mot rekombinant AcrV, det analoge proteinet til LcrV, beskyttet kRTG-2-fiskeceller fra skade forårsaket av virulent A. salmonicida- stamme JF2267 og demonstrerte at AcrV spiller en viktig rolle i type III-sekresjonsveimediert virulens av A. salmonicida.

Den nylig oppdagede type III-sekresjonsveien spiller en sentral rolle i patogenisiteten til A. salmonicida via sekresjonen og direkte injeksjon av ADP-ribosylerende toksin AexT inn i måleceller. Tap av type III-sekresjonsvei som ofte observeres skyldes ustabiliteten i et kb-plasmid under dyrkningsbetingelser. Tap av type III sekresjonsgener slik som acrD og acrV opphevet videre ekspresjonen av aexT- genet og medførte tap av virulens av A. salmonicida. Som vist er overflateeksponerte genprodukter av denne type III-sekresjonsveien, spesielt AcrV, potente kandidater for nye vaksiner for immunprofylakse av fisk mot furunkulose.

Oppfinnelsen beskrives ytterligere gjennom de følgende eksempler og resultater

som ikke skal betraktes som begrensende for rammen av oppfinnelsen. Det vil være tydelig for fagfolk på området, i lys av denne beskrivelsen, at mange endringer kan gjøres i de spesifikke utførelsesformene som er beskrevet uten å avvike fra rammen av oppfinnelsen.

EKSEMPLER OG RESULTATER

Materialer og metoder

Bakteriestammer, vekstbetingelser og kloningsvektorer:

A. salmonicida- stammer er angitt i tabell 1. A. salmonicida- type stamme ATCC 33658T ble kjøpt fra the American Type Culture Collection. A. salmonicida- stamme JF2267 ble ferskt isolert fra en arktisk røye ( Savelinus alpinus) som viste typiske symptomer på furunkulose. A. salmonicida- stammen JF2397 ble utledet fra stamme JF2267 gjennom repeterende enkle koloni isoleringer etter hver av ni passasjer dyrket på LB agarmedium ved 22°C i 2 dager for hver passasje.

A. salmonicida- stammeT ble rutinemessig dyrket på blodagarplater (Trypticase soyaagar supplert med 0,1% CaCh og 5% saueblod) ved 19°C om ikke annet er angitt.

Flytende kulturer av A. salmonicida ble dannet gjennom inokulering av Trypticase soyabuljong (TSB) (2,75 g/100 ml Trypticase soyabuljong uten Dextrose (BBL 11774, Becton Dickinson AG, Basel, Sveits), 0,1% glyserol, 0,1 M L-glutaminsyre pH 7,3) med fersk kultur fra fast medium og påfølgende dyrkning i 18 timer ved 19°C. For vekst i Ca<2+->begrenset medium, ble TSB supplert med 10 mM nitrilotrieddiksyre (Titriplex I, Merck 1.08416, Darmstadt, Tyskland).

For kloning og ekspresjon av klonede gener, ble Escherichia co//'-stammer XL-1-blå

( recAl andAl gyr A96 thi- 1 hsdR17 supE44 relAl lac [F' proAB lacFZAMlS Tn70 Tef)] (Bullock et al., 1987) og BL21(DE3) ( Fdcm ompThsdS( rB- mB-) gal X(DE3))

(Studier et al., 1990) anvendt. Plasmidet pBluescriptll-SK" (Stratagene, La Jolla, CA, USA) ble anvendt som hovedkloningsvektor. For konstruksjonen av gener som koder for polyhistidinfusjonsproteiner og deres ekspresjon, ble pETFHS-1-plasmidet, en T7-promotorbasert ekspresjonsvektor (Schaller et al., 1999) anvendt. E. co//'-stammer ble dyrket ved 37°C i Luria-Bertanibuljong (LB) supplert ved behov med ampicillin (50 u.g/ml) for seleksjon og opprettholdelse av rekombinante plasmider. Når blåhvit seleksjon med pBluescriptllSK" ble utført, ble 125 uM X-Gal-medium supplert med 5-brom-4-klor-3-indolyl-P-D-tiogalaktopyranosid.

Fremstilling av genomisk DNA, klonings- og sekvenseringsprosedyrer:

Genomisk DNA fra A. salmonicida ble ekstrahert gjennom

guanidiumhydrokloridfremgangsmåten (Pitcher et al., 1989). Et delvis genbibliotek av A. salmonicida JF2267 ble konstruert gjennom kloning av agarosegelrensede SacI- Sall- fordøyde fragmenter på 4 til 6 kb i størrelse i pBluescriptll-SK"-vektor ved anvendelse av standard fremgangsmåter (Ausubel et al., 1999). Rekombinante plasmider ble analysert gjennom koloniblot (Ausubel et al., 1999) ved anvendelse av digoksigenin (DIG)-merkede DNA-prober som beskrevet tidligere (Braun et al., 1999). Plasmider fra A. salmonicida ble renset ved anvendelse av fremgangsmåten til Birnboim og Doly (Birnboim og Doly, 1979).

For å konstruere et genombibliotek fra A. salmonicida JF 2267, ble 0,1 u.g DNA delvis fordøyd med Sau3a og ligert til ZapEkspress ifa/wHI-fremstilte armer (Pharmacia, Uppsala, Sverige) og pakket i fag lambda. 200 ul ferskt dyrket XL-1-blå MRF'-celler (Pharmacia) resuspendert i 10 mM MgSC>4 ble infisert med de pakkede fagene i løpet av 15 minutter ved 37°C. 3 ml av på forhånd oppvarmet (50°C) toppagaraose (LB-buljong som inneholdt 0,7% agarose) supplert med IPTG og X-Gal for blå/hvit seleksjon ble tilsatt og blandingen ble helt på en LB-agarplate. Plater ble inkubert over natten ved 37°C og deretter anvendt for analysering av plakk. Positive plakk ble kuttet ut og lagret over natten ved 4°C i 0,5 ml SM-buffer (100 mM NaCl, 8 mM MgS04, 50 mM Tris, pH 7,5 og 0,01% gelatin) inneholdende 20 ul kloroform. 20 ml av over natten-kulturer av XL-1-blå MRF dyrket i LB supplert med 0,2% maltose og 10 mM MgSC>4 og 20 ml XLOLR-celler (Pharmacia) dyrket i LB-medium ble sentrifugert i 5 minutter ved 4000 rpm og resuspendert i 10 mM MgS04til en endelig OD6oo= 1. 200 ul av XL-1-blå MRF'-celler ble tilsatt 250 ul av SM-buffer som inneholdt de positive fagene og 1 ul (IO<7>pfu) ExAssist™ hjelpefag. Denne blandingen ble inkubert i 15 minutter ved 37°C og 3 ml LB-buljong ble tilsatt og ristet i ytterligere 3 timer ved 37°C. Kulturene ble deretter oppvarmet i 15 minutter til 70°C, sentrifugert i løpet av 15 minutter ved 5700 rpm, 4°C og supernatanten som inneholdt det pBK-CMV-fagemidfilamentøse fagen ble dekantert over i ferske rør. 200 ul XLOLR-celler ble blandet med 100 ul supernatant og inkubert i 15 minutter ved 37°C, 300 ul LB-buljong ble tilsatt og kulturene ble inkubert i ytterligere 1 time ved 37°C. 200 ul av denne kulturen ble fordelt på LB-plater som inneholdt 50 mg/l kanamycin over natten ved 37°C. Kolonier ble plukket og miniprep (ved anvendelse av QIAaprep Spin Miniprep-sett, Qiagen AG, Basel, Sveits) ble utført for plasmidrensing.

For sekvensering ble subkloner av sekvensielle DNA-segmenter dannet med et dobbeltrådet "nested" delesjonssett (Pharmacia LKB, Biotechnology AB, Uppsala, Sverige). Sekvensering ble utført med dRhodamin terminator syklussekvenseringssettet (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i henhold til forhandlerens protokoll ved anvendelse av enten T3- og T7-primere som flankerer det klonede innskuddet i pBluescriptll-SK" eller kundesyntetiserte indre primere. Alle sekvensene ble bestemt for begge trådene. Reaksjonsprodukter ble analysert på en ABI Prism 310 genanalysator (Applied Biosystems).

Sekvensdataanalyser:

Sekvenssammenstilling og redigering ble utført ved anvendelse programvaren Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI, USA). Sammenligninger av DNA-sekvenser og deres deduserte aminosyresekvenser med EMBL/genBank og NBRF-databaser ble utført ved anvendelse av programmene BLASTN, BLASTX og BLASTP (Altschul et al., 1990). Potensielle antigene segmenter av AcrV ble bestemt ved anvendelse av programvaren ProtScale ( http:// www. exp asy. ch/ c gi - bin/ protscale. pl) (Bairoch et al., 1995) og programvaren Coils output (http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html) (Lupas et al., 1991). De molekylære massene til proteinet og dets teoretiske isoelektriske pH (pl) ble beregnet ved anvendelse av ProtParam-verktøy

(http://www.expasy.ch(tools/protparam.html) (Gill og von Hippell, 1989). Transmembran produksjon av proteinet ble utført ved anvendelse av "Tmpred"

(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED form.html) (Hofmann og Stoffell, 1993).

PCR-amplifiseringer og fremstillinger av DIG-merkede genprober:

Templat-DNA ble fremstilt enten ved ekstraksjon av genomisk DNA eller gjennom fremstilling av lysater fra bakteriekolonier. Lysater ble oppnådd gjennom resuspendering av fem kolonier av de korresponderende bakteriekulturene i 200 ul lysisbuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,5, 0,05% Tween 20 (Merck), 0,24 mg/ml proteinase K (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Sveits) oppløst i pyrogenfritt vann, filtrert gjennom et 0,22 um lavere proteinbindingsmembranfilter) etterfulgt av påfølgende innkubering i 60 minutter ved 60°C og 15 minutter ved 97°C. Lysatene ble deretter avkjølt på is og anvendt som PCR-templater.

PCR-amplifisering ble utført med enten en PE9600 eller PE2400 automatisert termosykler med MicroAmp rør (Applied Biosystems). Reaksjonen ble utført i en 50 ul reaksjonsblanding (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KC1, 0,005% Tween 20, 0,005% NP-40-detergent, 170 uM av hvert deoksynukleosidtrifosfat (dATP, dCTP, dGTP og dTTP), 0,25 uM av hver primer, 2,5 enheter Taq DNA-polymerase (Roche Diagnostics) og 100 ng av templat DNA eller 5 ul lysat. For fremstillingen av DIG-merkede prober ble PCR-blandinger supplert med 40 uM digoksigenin-ll-dUTP (Roche Diagnostics). PCR-betingelsene var som følger: 3 minutter ved 94°C etterfulgt av 35 sykluser ved 30 sekunder ved 94°C, 1 minutt ved den korresponderende herdingstemperaturen (tabell 2) og 30 sekunder ved 72°C. I tillegg ble et forlengelsestrinn på 7 minutter ved 72°C tilført ved slutten av den siste syklusen for å sikre fullengde syntese av fragmentene.

Lagring av type III sekresjonsgener fra A. salmonicida:

For å studere segregeringen av type III sekresjonsgenene i A. salmonicida- stammen JF2267, ble stammen inokulert i LB-buljong ved en tetthet på A6oo= 0,08 og inkubert i 2,5 timer ved 19°C. Deretter ble kulturen del i to. En del ble oppbevart for fortsatt vekst ved 19°C, mens den andre delen ble inkubert ved 22°C. Prøver ble tatt ved ulike tidsrom fra begge kulturer og fordelt på LB-agarmedium. Platene ble deretter inkubert ved 19°C i 24 timer. Deretter ble koloniblot hybridiseringer utført ved anvendelse av genprober for å bestemme tapet av spesifikke gener.

Pulsfelt gelelektroforese (PFGE):

Bakteriestammene A. salmonicida JF2267 og JF2397 ble dyrket på LB-agar i 1 dag ved romtemperatur. Deretter ble bakteriesuspensjonene i 10 mM Tris, 10 mM

ED TA, pH 8,0, sterile, fremstilt til et endelig OD6oopå 5. 300 ul av 1,5% "Sea Kem gullagarose" (FMC Bioproducts, Maine, USA) i 100 mM Tris, 100 mM ED TA, pH 8,0, ble tilsatt til 300 ul av bakteriecellesuspensjon. Plugger ble umiddelbart overført i sterile former og oppbevart på is inntil de var stivnet. Pluggene ble deretter inkubert ved 50°C over natten i steril 1,5 ml M EDTA, 1% N-lauroylsarkosin, 2 mg/ml proteinase K (Roche Diagnostics), pH 8,0 gjennom risting. Den neste dagen ble pluggene nøye vasket 5 ganger i løpet av hele dagen ved romtemperatur i steril TE-buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) og lagret i steril 0,5 M EDTA, pH 8,0 ved 4°C inntil den skulle anvendes videre. For å fordøye pluggene ble de først inkubert i 3 x buffer H (Roche Diagnostics) i 10 minutter ved 22°C. Deretter ble pluggene inkubert ved 37°C gjennom risting i 7,5 timer i 2 x buffer H som inneholdt 40 U Noti (Roche Diagnostics). De ble deretter plassert i slisser i en 1% "Sea Kem" gullagarosegel i 0,5 x TBE og forseglet med 1% "Sea Kem" gullagarose. Gelen ble deretter ekvilibrert i 0,5 x TBE ved 12°C ved anvendelse av et elektroforese CHEF-DR III-system (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA). For å separere Noti DNA-fragmenter, var feltet 6 V/cm med en vinkel på 120° og ved å starte med 1 sekund og slutte med 12 sekunder. Varigheten av PFGE var 14 timer og den ble utført ved 12°C. Gelen ble farget 30 minutter ved romtemperatur i vann som inneholdt 0,5 ug/ml etidiumbromid, vasket to ganger med vann og analysert under et UV-lys. I tillegg ble gelen ytterligere anvendt for Southern blotting.

Southern blot-analyse:

Southern blotting ble utført ved alkalisk overføring på positivt ladede nylonmembraner (Roche Diagnostisk) med en LKB 2016 VacuGene vakuumblottingpumpe (Pharmacia LKB). For å depurinere agarosegelen ble den inkubert i 10 minutter i 0,2 M HC1 og deretter ble overføring utført med 0,4 M NaOH i 1,5 timer. Etter blotting ble membranene bakt i 30 minutter ved 80°C under vakuum. Etter i det minste 1 time med prehybridisering, ble hybridisering utført i 5 x SSC (1 x SSC i 0,15 M NaCl pluss 0,15 M natriumcitrat) - 1% blokkeringsreagens (Roche Diagnostics) - 0,1% N-lauroylsarkosinnatriumsalt - 0,02% natriumdodecylsulfat (SDS) ved 68°C over natten ved anvendelse av DIG-merket DNA som probe. Membranene ble vasket under ikke-stringente betingelser to ganger i 5 minutter hver med 50 ml 2 x SSC - 0,1% SDS pr 100 cm<2>ved 22°C etterfulgt av middels høy stringensvasking to ganger i 15 minutter hver med 50 ml 0,2 x SSC - 0,1% SDS pr 100 cm<2>ved 68°C. Membranene ble deretter bearbeidet med fosfatasemerket anti-DIG antistoff (Roche Diagnostics) i henhold til forhandlerens protokoll. Signaler ble produsert med kjemiluminescenssubstrat (CSPD, Roche Diagnostics).

Pulsfeltgeler ble behandlet for Southern blotting ved anvendelse av de samme løsningene som beskrevet ovenfor. For å depurinere agarosegelene effektivt, ble de inkubert i 20 minutter i 0,25 M HC1 og deretter ekvilibrert i 20 minutter i 0,2 M NaOH. Overføring ble utført i 3 timer og gelene ble behandlet som beskrevet ovenfor.

Ekspresjon og rensing av His-halemerket fusjonsprotein AcrV: Oligonukleotidprimere som ble anvendt for å amplifisere hele acrF-genet er gitt i tabell 2. PCR-reaksj onene ble utført som beskrevet ovenfor med unntak av anvendelse av Pwo DNA-polymerase (Expand Long Template PCR System-sett, Roche Diagnostics) i stedet for Taq DNA-polymerase og genomisk DNA fra A. salmonicida JF2267. PCR-produktene ble renset ved anvendelse av High PureJM PCRr produktrensesettet (Roche Diagnostics) som beskrevet i forhandlerens protokoll. Deretter ble acr V PCR-produktet klonet inn i pGEM-T-vektor (Promega, Madison, WI, USA), med 3'-T overheng ved innsettingsstedet som beskrevet i forhandlerens protokoll og transformert i E. co//'-stammer XL-1 Blue. Det resulterende plasmidet ble betegnet pJFFIVB873. Kloningen av PCR-produktene i pGEM-T-vektoren ble anvendt for å tilveiebringe effektiv restriksjon av de subklonede fragmentene. Plasmid pJFFIVB873 ble deretter fordøyd med EcoRI og Noti og DNA-fragmentet ble satt inn i den T7-promotorbaserte ekspresjonsvektoren pETHIS-1 (Schaller et al., 1999). Det resulterende plasmidet, pJFFETHISacrV4 ble renset og kontrollert gjennom DNA-sekvensering for å sikre fusjonene med vektorens poly-His-kodoner og deretter transformert inn i Escherichia coli BL21(DE3)-celler (Novagen) for ekspresjon. Ekspresjon ble indusert ved tilsetning av 1 mM IPTG til kulturene og fortsatt innkubering i ytterligere 3 timer. Cellene ble sedimentert gjennom sentrifugering ved 3000 x g i 10 minutter, resuspendert i 5 ml PN-buffer (50 mM NaH2P04, pH 8,0, 300 mM NaCl), sonikert med en mikrotupp i 4 minutter med krafteffektkontrollen ved 1 og en driftssyklus på 50% (1 sekunds pulser) i en Branson Sonifier 250 (Branson Ultrasonics, Danbury, CT, USA). Deretter ble guanidinhydroklorid tilsatt til en endelig konsentrasjon på 6 M og ble inkubert over natten ved 4°C på en rister. Blandingen ble satt på en på forhånd vasket 2,5 ml volums Ni<2+->chelaterende kromatografikolonne (Qiagen) og vasket en gang til med 30 ml PNG-buffer (50 mM NaH2P04, pH 8,0, 300 mM NaCl, 6 M guanidinhydroklorid). Trinnelueringer av proteinene ble utført ved tilsetning av 10 ml PNG-buffer ved hver forskjellige pH (7,0, 6,0, 5,5, 5,0 og 4,5) og fraksjoner på 1 ml ble oppsamlet. Fraksjonene ble dialysert og analysert på 15% PAGE. De rensede fusjonsproteinene ble eluert ved pH 4,5.

Produksjon av monospesifikke anti-AcrV kaninantistoffer og immunoblotanalyser: Monospesifikke, polyklonale antistoffer som var rettet mot AcrV ble oppnådd gjennom subkutan immunisering av kaniner med 80 ug rekombinant polyhistidinhale AcrV-protein i 200 ul PN-buffer og 150 ul NaCl (0,85%) blandet med 350 ul Freunds fullstendige adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) etterfulgt av en forsterkende immunisering med den samme mengden protein i Freunds ufullstendige adjuvans (Difco) 3 uker senere. Dyrene ble blodtappet 22 dager etter den forsterkende immuniseringen i henhold til standardprotokoller (Harlow og Lane, 1988).

Infeksjon av fiskecellekulturer med A. salmonicida:

Regnbueørret (Oncorhynchus mykiss) gonadeceller (RTG-2, ATCC CCL-55) ble dyrket i 75 cm<2>vevskulturfl asker (Techno plasti products AG, Trasadingen, Sveits) ved 22°C i minimalt essensielt medium (GibcoBRL Life Technologies, Basel, Sveits) supplert med 2 mM L-glutamin (GibcoBRL), 1 x ikke-essensielle aminosyrer (GibcoBRL), 3 g/l natriumbikarbonat og 10% føtalt storfeserum. Tre dager før injeksjon ble cellene trypsinert og 4 mioceller ble sådd i en 25 cm<2>vevskulturflaske. Monolag av RTG-2-celler ble infisert med A. salmonicida- céller som var resuspendert i fosfatbufret saltoppløsning (PBS), pH 7,4 ved et flertall av infeksjoner av 20:1 eller 2:1 (bakterie/fiskeceller). Som en kontroll ble også 100 ul rent PBS, pH 7,4, tilsatt de dyrkede fiskecellene. Etter 24 timer med infeksjon ved 15°C ble fiskecellene fotografert under et grønnfiltrert fasekontrastmikroskop (Aixovert 100, Zeiss, Jena, Tyskland). For å påvise de dyrkede cellene fra flasken, ble flasken ristet for hånd. De resuspenderte cellene ble sentrifugert i 5 minutter ved 4000 rpm. Lysis av fiskecellene ble utført i 100 ul destillert vann med to påfølgende fryse-tine-trinn og verifisert gjennom mikroskopi. De lyserte fiskecellene ble deretter anvendt for ytterligere analyser på Western blot.

Beskyttelsesanalyse ved anvendelse av kaninantiserum AcrV:

RTG-2-fiskeceller ble dyrket som beskrevet ovenfor. To dager før infeksjon ble 20 mio av trypsinerte RTG-2-fiskeceller sådd i 24 brønners kulturplater (1,9 cm<2>)

(Techno plastic products AG, Trasadingen, Sveits). Kaninantiserum rettet mot AcrV så vel som kontroll preserum ble dekomplementert i 30 minutter ved 56°C. En fersk A. salmonicida- kultuT (ved slutten av eksponentiell vekstfase) ble vasket og resuspendert i PBS pH 7,4 og blande4t med enten preserum eller anti AcrV antiserumi et forhold på 1:1, 1:10, 1:100, 1:1000 eller 1:10000. Bakterier ble inkubert med serumet ved 18°C i 30 minutter. De opsoniserte bakteriene ble tilsatt fiskecellene i et forhold på 20:1 eller 2:1 (bakterier/fiskeceller). Etter 21 timer med

infeksjon ved 15°C ble fiskecellene fotografert som beskrevet tidligere og inspisert for morfologiske endringer.

SDS-PAGE og immunoblotanalyse:

Proteiner ble separert ved hjelp av polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) som beskrevet av Laemmli, 1970) ved å anvende 15% eller 10% polyakridgeler og overført til en nitrocellulosemembran (BioRad Laboratories). For immunblotting, ble Western blot blokkert med 1% melkebuffer i det minste i 1 time og deretter inkubert med kaninantiserum AcrV (1:2000) eller med kanin preserum (1:1000) i melkebuffer over natten ved 4°C. Membranene ble deretter vasket nøye med vann før fosfatasemerket konjugat (geit anti-kanin IgG (H+L) [katalog nr. 075-1506], Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD, USA) fortynnet 1:2000 i melkebuffer ble tilsatt. Reaksjonen ble synliggjort 90 minutter senere gjennom innkubering med BCIP-NBT (Ausubel et al., 1999).

Eksempler/resultater

Kloning og sekvensanalyse av virA- lokus i en type III-vei i A. salmonicida: Analyse av A. salmonicida- stammen JF2267 med en oppstilling av bredspekterprober for påvisning av type III-sekresjonsveier avslørte et sterkt signal med /c/*Z)-undersettet av probene, hvilket indikerer nærværet av en ny type III-sekresjonsvei. Påfølgende Southern blot-analyser viste et 4,8 kb fragment av Sacl-SaÆ-fordøyd genomisk DNA fra stamme JF2267 som reagerte med IcrD- proben. Dette fragmentet ble klonet på vektor pBluescriptll-SK", hvilket ga plasmidet pJFFIVB638 som deretter ble sekvensert. DNA-sekvensanalyser avslørte nærværet av 8 åpne leserammer ("open reading frames", ORF) (figur 1) som viste sterk likhet med genene kodet på vz/vl-operonet av type III-sekresjonsveien i Yersinia pestis og Pseudomonas aeruginosa. Analogt med Y. pestis- genene, kalte vi dem acrl, acr2, acr3, acr4 og acrD (Aeromonas kalsiumrespons (figur 1)). De er lokalisert på et enkelt operon etterfulgt av et transkripsjons termineringssignal som svarer til virA-operonet i Y. pestis, Y. enter ocolitica og Pseudomonas aeruginosa (Boland et al., 1996; Iriarte og Cornelis, 1999; Piano et al., 1991; Cornelis, 1998; Yahr et al., 1997a). Likhetene av genene acrl, acr2, acr3, acr4 og acrD med analogene i Y. enterocolitica og i P. aeruginosa er gitt i tabell 2. Nedstrøms for IcrD identifiserte vi et lokus med en kanonisk promotorsekvens ytterligere etterfulgt av genene acrR, acrG og acrVpå et separat operon (figur 1) i henhold til de korresponderende genene i Y. pestis (tabell 3) (Barve og Straley, 1990; Skrzypek og Straley, 1993; Nilles et al., 1998). ORF til det antatte acrF-genet synes å være ufullstendig på 4,8 kb SacI-Sall-fragmentet til pJFFIVB638 og representerer kun 5'-delen av genet. Den gjenværende delen av acrV og delen av acrH som er lokalisert nedstrøms for acrV ble klonet separat fra X-fag genbiblioteket til A. salmonicida som en overlappende klon som ble oppnådd gjennom analysering av genbiblioteket ved anvendelse av en genprobe for 5'-delen av acrV som ble fremstilt ved hjelp av PCR med primerne AcrV-L og AcrV-R (tabell 2). Det resulterende plasmidet basert på vektor pBK-CMV ble kalt pJFFIVB832. Fra dette plasmidet ble et 0,9 kb Sall-fragment som inneholdt 3'-enden av acrV og del av nedstrømsgenet acrH subklonet på pBluescriptll-SK kalt pJFFIVB828.

Ustabilitet i genene som tilhører type III-veien i A. salmonicida:

Når vi analyserte de forskjellige Æ salmonicida- stammene med en spesifikk probe for acrD, oppdaget vi ved anvendelse av Southern blot-hybridisering at acrD- genet bare var tilstede i stammen JF2267, men ikke i derivatstammen JF2397 som hadde gjennomgått ni påfølgende passeringer gjennom enkel kolonikloningsisolering. I tillegg viste ^4. salmonicida, ATCC 33658T<->stammetypen ikke et signal med acrD-proben. Flere A. salmonicida- stammer som var ferskt isolert fra laks og ørret med furunkulose, inneholdt imidlertid acrD (tabell 4). Disse resultatene indikerer at type III-sekresjonsveien i A. salmonicida lett kan tapes. For å få et estimat på tapet av type III-sekresjonsgener, har vi analysert forsvinningskinetikkene til acrD etter et skifte i veksttemperatur for stamme JF2267 fra 19°C til 22°C. Kolonihybridisering med acrF-proben avslørte at i en fersk kultur av stamme JF2267, var acrD- genet tilstede i alle cellene som var dyrket ved 19°C. Etter et skifte til 22°C var acrD fortsatt tilstede i ytterligere 5,5 timer, hvoretter det ble tapt svært raskt i løpet av mindre enn 1 time (figur 2). Tatt i betraktning generasjon sti den på 2 timer forÆ salmonicida under de gitte vekstbetingelsene, ble acrD- genet tapt i løpet av to generasjoner. For å analysere tapet av acrD ytterligere, ble ufordøyd Notl-fordøyd genomisk DNA fra A. salmonicida- stamme JF2267 og ac/*Z)-manglende derivatstamme JF2397 utsatt for pulsfelt gel elektroforese (PFGE) og påfølgende Southern blot-hybridisering med acrD- proben. PFGE-analysen av totalt ufordøyd DNA avslørte nærværet av to større plasmider i JF2267-stammen, mens JF2397-stammen kun avslørte ett av de to plasmidene (figur 3). Fordøying av det totale DNA fra disse to stammene med det sjeldne kutteenzymet Noti avslørte mangelen på et 84 kb bånd i JFf2397-stammen sammenlignet med JF2267 som den eneste påvisbare forskjellen (figur 3). Southern blot hybridisering av DNA på disse gelene med acrD- proben bekreftet det større plasmidet og at 84 kb iVbrl-fragmentet til JF2267-stammen inneholdt acrD- genet. Ingen av de gjenværende større plasmidene i JF2397, ei heller noen av dets iVorl-fragmenter, hybridiserte med AcrV- proben. Dette indikerer at type III-sekresjonsgenene, eller i det minste vz/vl-operonet derav, er lokalisert på et større plasmid i størrelsesorden 84 kb.

Nærvær av acrD i A. salmonicida- stammer:

For å vurdere nærværet av acrD- genet i forskjellige A. salmonicida- stammer, ble DNA-prøver ekstrahert fra A. salmonicida typestamme ATCC33658 og forskjellige områdestammer isolert fra laks eller røye fordøyd med restriksjonsenzymene Sali og SacI, separert ved hjelp av 0,7% agarosegelelektroforese, overført på nylonmembraner og hybridisert med ac/*Z)-genproben. Southern blottet avslørte nærværet av acrD- genet på et 4,8 kb fragment i alle stammene bortsett fra i stammetypen ATCC33658, laboratoriestammen JF2396 som ble anvendt for type III sekresjonsgenene og A. salmonicida- stammen MT44 som er kjent for å være avirulent for ørret. En områdestamme, # 24, viste et svært svakt hybridiseringssignal, hvilket indikerte at kulturen inneholder acrD kun i en mindre populasjon av cellene (tabell 1).

Infeksjon av RTG-2 fiskeceller og beskyttelse av celleskade med anti-AcrV anti serum: Ferskt dyrket A. salmonicida- stamme JF2267 ble anvendt for å infisere RTG-2-celler. Etter 24 timers innkubering ble fiskecellene rundet av og løsnet fra pastikkstøtten (figur 4A). I kontrast til dette, viste celler som var infisert med A. salmonicida stammetype ATCC 33658T eller JF2397-stammen (figurene 4B og C), begge kjent for å være fri for acrD og acrV, ingen morfologiske endringer i det hele tatt til tross for massiv multiplisering av bakterien i kulturen. RTG-2 fiskecellene som var inkubert med PBS-buffer som kontroll viste ingen morfologiske endringer slik som cellene som var infisert med de acrD- og acrF-manglende stammene JF2397 eller ATCC 33658<1>(figur 4D).

For ytterligere å studere rollen til den nylig påviste type III-sekresjonsveien i virulens av A. salmonicida, inkuberte vi JF2267-stammen med monospesifikke polyklonale anti-AcrV antistoffer forut for infeksjon av RTG-2 fiskecellekulturene. Når RTG-2 fiskeceller var infisert med JF2267-stammen som var inkubert med kanin anti-AcrV antistoffer fortynnet 1:1 eller 1:10, var de karakteristiske morfologiske endringene av cellene redusert, og påvirket signifikant bare 20% av cellene eller mindre (figur 4E) sammenlignet med infeksjonen med ikke-behandlet JF2267-stamme (figur 4A) eller med infeksjonen med JF2267 som på forhånd var behandlet med serum fra den samme kaninen tatt før immuniseringen (figur 4F). Titrering av anti-AcrV-serumet viste at en beskyttelse på omtrent 50% av RTG-2-cellene fortsatt kunne nås med en seriefortynning på 1:100, mens ytterligere fortynninger ikke hadde noen synlig effekt på beskyttelsen.

Ekspresjon av AcrV i A. salmonicida:

Ekspresjonen av AcrV i A. salmonicida- stammen JF2267 ble vurdert gjennom immunoblot ved anvendelse av AcrV-His-antistoffer. NårÆ salmonicida ble dyrket under standard dyrkningsbetingelser i TSB-medium, kunne intet AcrV-protein påvises fra totale celler, ei heller fra kultur sup ernatanten fra JF2267-stammen, ei heller i kontrollen av JF2397- og ATCC33658<T->stammene. Når cellene ble utsatt for en lav Ca<2+->respons gjennom gelatering av frie Ca<2+->ioner i vekstmediet gjennom tilsetning av 10 mM NT A, påviste vi imidlertid AcrV med anti-AcrV-anti stoffer i pelleten til JF2267 som et protein på omtrent 37 kDa (figur 5), men ikke i JF2397-og ATCC33658<T->stammene, som begge er frie for AcrV- genet (figur 5). Intet AcrV-protein kunne påvises i supernatantene til kulturene fra JF2267-, JF2396- og ATCC33658<T->stammene som var dyrket i Ca<2+->utarmet medium.

Når JF2267-stammen ble dyrket under standard kulturbetingelser (inneholdende frie Ca<2+->ioner) og deretter brakt i kontakt med RTG-2-celler i et forhold på 2:1 (bakterier:celler) i 30 minutter, kunne AcrV-proteinet bli overvåket på immunoblot omsatt med anti-AcrV, tilsvarende kulturer fra Ca<2+->utarmet medium.

Rekombinant AcrV-vaksinestudie

(se appendiks A)

Mens spesifikke elementer, utførelsesformer og anvendelser av den foreliggende oppfinnelsen er blitt vist og beskrevet, skal det selvfølgelig forstås at oppfinnelsen ikke er begrenset til dette, ettersom modifikasjoner kan utføres av fagfolk på området i de egnede teknologier, spesielt i lys av den foregående beskrivelsen. De vedlagte kravene inkluderer innenfor omfanget slike modifikasjoner og varianter av de eksemplifiserte utførelsesformene av oppfinnelsen beskrevet heri, hvilket vil være tydelig for fagfolk på området i de anvendelige teknologiene.

REFERANSER

Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. and Lipman, D.J.: Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215 (1990) 403-410.

Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A. and Struhl, K.: Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y., 1999.

Bairoch, A., Bucher, P. and Hofmann, K.: The PROSITE database, its status in 1995. Nucleic Acids Res. 24 (1995) 189-196.

Barve, S.S. and Straley, S.C.: lcrR, a low-Ca<2+>response locus with dual Ca<2+>dependent functions in Yersinia pestis. J. Bacteriol. 172 (1990) 4661-4671.

Bergman, T., Håkansson, S., Forsberg, A., Norlander, L., Macellaro, A., Backman, A., Bolin, I. and Wolf-Watz, H.: Analysis of the V antigen IcrGVH- yopBD operon of Yersinia pseudotuberculosis: evidence for a regulatory role of LcrH and LcrV. J. Bacteriol. 173 (1991) 1607-1616.

Birnboim, H.C. and Doly, J.: A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (1979) 1513-1523.

Boland, A., Sory, M.P., Iriarte, M., Kerbourch, C, Wattiau, P. and Cornelis, G.R.: Status of YopM and YopN in the Yersinia Yop virulon: YopM of Y. enter ocolitica is internalized inside the cytosol of PU5-1.8 macrophages by the YopB, D, N delivery apparatus. EMBO J. 15 (1996) 5191-5201.

Braun, M., Kuhnert, P., Nicolet, J., Burnens, A.P. and Frey, J.: Cloning and characterization of two bistructural S-layer-RTX proteins from Campylobacter rectus. J. Bacteriol. 181 (1999) 2501-2506.

Bullock, W.O., Fernandez, J.M. and Short, J.M.: XLl-Blue: A high frequency efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with beta-galactosidase selection. Biotechniques 5 (1987) 376-378.

Cheng, L.W. and Schneewind, O.: Yersinia enter ocolitica TyeA, an intracellular regulator of the type III machinery, is required for specific targeting of YopE, YopH, YopM, and YopN into the cytosol of eukaryotic cells. J. Bacteriol. 182

(2000) 3183-3190.

Chu, S., Cavaignac, S., Feutrier, J., Phipps, B.M., Kostrzynska, M., Kay, W.W. and Trust, T.J.: Structure of the tetragonal surface virulence array protein and gene of Aeromonas salmonicida. J. Biol. Chem. 266 (1991) 15258-15265.

Cornelis, G.R.: The Yersinia Yop virulon, a bacterial system to subvert cells of the primary host defense. Folia Microbiol. (Praha) 43 (1998) 253-261.

Ellis, A.E.: Immunization with bacterial antigens: furunculosis. Dev. Biol. Stand. 90

(1997) 107-116.

Fenselau, S., Balbo, I. and Bonas, U.: Determinants of pathogenicity in Xanthomonas campestris pv. vesicatoria are related to proteins involved in secretion in bacterial pathogens of animals. Mol. Plant Microbe Interact. 5 (1992) 390-396.

Fields, K.A. and Straley, S.C.: LcrV of Yersinia pestis enters infected eukaryotic cells by a virulence plasmid-independent mechanism. Infect. Immun. 67 (1999) 48011-4813.

Forsberg, A., Bolin, I, Norlander, L. and Wolf-Watz, H.: Molecular cloning and expression of calcium-regulated, plasmid-coded proteins of Y. pseudotuberculosis. Microb. Pathog. 2 (1987) 123-137.

Frank, D.W.: The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 26 (1997) 621-629.

Gill, S.C. and von Hippell, P.H.: Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data [published erratum appears in Anal Biochem 1990 Sep; 189(2): 283]. Anal. Biochem. 182 (1989) 319-326.

Gough, C.L., Genin, S., Zischek, C. and Boucher, C.A.: hrp genes oi Pseudomonas solanacearum are homologous to pathogenicity determinants of animal pathogenic bacteria and are conserved among plant pathogenic bacteria. Mol. Plant. Microbe Interact. 5 (1992) 384-389.

Harlow, E. and Lane, D.: Antibodies. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

Hirono, I. and Aoki, T.: Cloning and characterization of three hemolysin genes from aeromonas salmonicida. Microb. Pathog. 15 (1993) 269-282.

Hofmann, K. and Stoffell, W.: TMbase - A database of membrane spanning proteins segments. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 347 (1993) 166.

Hueck, C.J.: Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (1998) 379-433.

Iriarte, M. and Cornelis, G.R.: Identification of SycN, YscX, and YscY, three new elements of the Yersinia yop virulon. J. Bacteriol. 181 (1999) 675-680.

Laemmli, U.K.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature 227 (1970) 680-685.

Leary, S.E., Williamson, E.D., Griffin, K.F., Russell, P., Eley, S.M. and Titball, R. W.: Active immunization with recombinant V antigen from Yersinia pestis protects mice against plague. Infect. Immun. 63 (1995) 2854-2858.

Lee, K.K. and Ellis, A.E.: Glycerophospholipid:cholesterol acyltransferase complexed with lipopolysaccharide (LPS) is a major lethal exotoxin and cytolysin oi Aeromonas salmonicida: LPS stabilizes and enhances toxicity of the enzyme. J. Bacteriol. 172 (1990) 5382-5393.

Lupas, A., Van, D.M. and Stock, J.: Predieting coiled coils from protein sequences. Science 252 (1991) 1162-1164.

Michiels, T. and Cornelis, G.R.: Secretion of hybrid proteins by the Yersinia Yop export system. J. Bacteriol. 173 (1991) 1677-1685.

Motin, V.L., Nakajima, R., Smirnov, G.B. and Brubaker, R.R.: Passive immunity to yersiniae mediated by anti-recombinant V antigen and protein A-V antigen fusion peptide. Infect. Immun. 62 (1994) 4192-4201.

Munro, A.L. and Hastings, T.S.: Furunculosis. In Inglis, V., Roberts, R.J. and Bromage, N.R. (Eds.), Bacterial diseases of fish. Blackwell Scientific, Oxford, 1993, pp. 122-142.

Nilles, M.L., Fields, K.A. and Straley, S.C.: The V antigen of Yersinia pestis regulates Yop vectorial targeting as well as Yop secretion through effects on YopB and LcrG. J. Bacteriol. 180 (1998) 3410-3420.

Nilles, M.L., Williams, A.W., Skrzypek, E. and Straley, S.C.: Yersinia pestis LcrV forms a stable complex with LcrG and may have a secretion-related regulatory role in the low-Ca<2+>response. J. Bacteriol. 179 (1997) 1307-1316.

Pettersson, J., Holmstrom, A., Hill, J., Leary, S., Frithz-Lindsten, E., Von Euler-Matell, A., Carlsson, E., Titball, R., Forsberg, A. and Wolf-Watz, H.: The V-antigen of yersinia is surface exposed before target cell contact and involved in virulence protein translocation. Mol. Microbiol. 32 (1999) 961-976.

Pitcher, D.G., Saunders, N.A. and Owen, R.J.: Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanat. Lett. Appl. Microbiol. 8 (1989) 151-156.

Piano, G.V., Barve, S.S. and Straley, S.C.: LcrD, a membrane-bound regulator of the Yersinia pestis low-calcium response. J. Bacteriol. 173 (1991) 7293-7303.

Price, S.B. and Straley, S.C.: IcrH, a gene necessary for virulence of Yersinia pestis and for the normal response of Y. pestis to ATP and calcium. Infect. Immuno. 57

(1989) 1491-1498.

Sawa, T., Yahr, T.L., Ohara, M., Kurahashi, K., Gropper, M.A., Wiener-Kronish, J.P. and Frank, D.W.: Active and passive immunization with the Pseudomonas V antigen protects against type III intoxication and lung injury [see comments]. Nat. Med 5 (1999) 392-398.

Schaller, A., Kuhn, R., Kuhnert, P., Nicolet, J., Anderson, T.J., Maclnnes, J.I., Segers, R.P.A.M. and Frey, J.: Characterization of apxIVA, a new RTX determinant of Actinobacillus pleuropneumoniae. Microbiology 145 (1999) 2105-2116.

Skrzypek, E. and Straley, S.C.: LerG, a secreted protein involved in negative regulation of the low-calcium response in Yersinia pestis. J. Bacteriol. 175 (1993) 3520-3528.

Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J. and Dubendorff, J.W.: Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185 (1990) 60-89.

Thornton, J.C., Garduno, R.A., Carlos, S.J. and Kay, W.W.: Novel antigens expressed by Aeromonas salmonicida grown in vivo. Infect. Immun. 61 (1993) 4582-4589.

Titball, R.W. and Munn, C.B.: The purification and some properties of H-lysin from Aeromonas salmonicida. J. Gen. Microbiol. 131 (1985) 1603-1609.

Whitby, P.W., Landon, M. and Coleman, G.: The cloning and nucleotid sequence of the serine protease gene (aspA) of Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida. FEMS Microbiol. Lett. 78 (1992) 65-71.

Yahr, T.L., Goranson, J. and Frank, D.W.: Exoenzyme S oi Pseudomonas aeruginosa is secreted by a type III pathway. Mol. Microbiol. 22 (1996) 991-1003.

Yahr, T.L., Mende-Mueller, L.M., Friese, M.B. and Frank, D.W.: Identification of type III secreted products of the Pseudomonas aeruginosa exoenzyme S regulon. J. Bacteriol. 179 (1997b) 7165-7168.

Yahr, T.L., Mende-Mueller, L.M., Friese, M.B. and Frank, D.W.: Identification of type III secreted products of the Pseudomonas aeruginosa exoenzyme S regulon. J. Bacteriol. 179 (1997a) 7165-7168.

Appendiks A

Rekombinant AcrV vaksinestudie

Materialer:

VAKSINEFORMULERINGER:

1. AcrV-vaksinen ble formulert ved anvendelse av rekombinant histidin-merket AcrV som var resuspendert i 10 mM fosfatbuffer, pH 7,0 til 112,5 ug/ml. 4 deler av denne proteinløsningen ble blandet med 1 del oljeadjuvans for en endelig AcrV-konsentrasjon på 90 ug/ml. Testdosen var 0,1 ml eller 9 ug/fisk. 2. Den kommersielle konkurrerende vaksinen var serie 4-13 av vaksinen MultiVacc4 (Bayotek International Ltd.). 3. Placebovaksinen (kontroll) besto av fosfatbufret saltoppløsning (PBS) (10 mM fosfat, 150 mM NaCl, pH 7,2).

4. Alle vaksiner ble oppbevart ved 4°C inntil anvendelse

Fremgangsmåter

STUDIEDESIGN:

Fisk (regnbueørret Oncorhynchus mykiss) som var blitt bestemt å være patogenfri og i det minste 15 g i størrelse, ble oppbevart i det minste i 1 uke forut for vaksinering for akklimatiseringsformål. I løpet av akklimatiseringsperioden ble fisken tilbudt 1% kroppsvekt i laksefiskfor hver dag, men ble imidlertid nektet for 24 timer forut for og etter vaksinering.

I det minste 50 fisk ble vaksinert med 0,1 ml av AcrV-vaksine via intraperitoneal (IP) injeksjon eller med 0,2 ml av den kommersielle vaksinen MultiVacc4. Ved det samme tidspunktet ble en gruppe på i det minste 50 fisk fra den samme beholdningen vaksinert med 0,1 ml PBS (kontroll). Vaksinerte fisk ble deretter oppbevart i et tidsrom på i det minste 350 graddager for å tillate spesifikk immunresponsdannelse i en akklimatiseringstank med en kontinuerlig vanngjennomstrømning ved en temperatur på 12-13°C. Fisken ble tilbudt 1% kroppsvekt laksefiskfor daglig inntil 24 timer forut for og etter utfordring.

Etter i det minste 350 graddager etter vaksinering, ble 50 fisk fra hver gruppe utfordret ved hjelp av IP injeksjon med en på forhånd bestemt konsentrasjon av virulent Aeromonas salmonicida. Dosen avhenger av fiskekilden og vanntemperaturen (dette er bestemt empirisk umiddelbart forut for utfordring av testfisken). Den identiske prosedyren ble utført med placebovaksinerte kontrollfisk. Fisken ble observert daglig for dødelighet i 21 dager etter utfordring og årsaken til død ble vurdert og eksaminert for å sikre at døden skyldes utfordringsorganismen. Etter 24 timer etter utfordring ble fisken igjen tilbudt 1% kroppsvekt laksefiskfor daglig. Tanker ble oppbevart med en kontinuerlig vanngjennomstrømning ved en temperatur på 12-13°C. For at en utfordringsserie skal betraktes som tilfredsstillende, må alle de utfordrede gruppene møte de følgende kriteriene: 1. I det minste 70% av de ikke-immuniserte kontrollene må dø i løpet av 21 dager etter utfordring. 2. En relativ prosent overlevelse (RPS) på mindre enn 25% må oppnås for den utfordrende sykdommen før en vaksine betraktes som i det hele tatt delvis effektiv for denne sykdommen.

RPS = [l-(% dødelighet vaksinerte/% dødelighet kontroller] x 100

Utviklet fra: De gjeldende reglene for medisinske produkter i den Europeiske Unionen, volum VII, regningslinjer for testing av medisinske veterinærprodukter. 1994. Spesifikke krav for fremstillingen og kontroll av levende og inaktiverte vaksiner ment for fisk. Seksjon 3.2. Kraft.

RESULTATER

Gruppe % Dødelighet RPS

PBS 82 -

AcrV 49 40

MultiVacc4 30 63

1. Det var en sterk utfordring med 82% dødelig i kontrollene.

DNA sekvensinformasion

LOKUS A. salmonicida type III vir 1 5678 bp DNA BCT 26. mars 2001

DEFINISJON Aeromonas salmonicida.

TILGANG tmpseg_l

VERSJON

NØKKELORD

KILDE Aeromonas salmonicida.

ORGANISME Aeromonas salmonicida

Bakterie; proteobakterie; gamma underavdeling; Aeromonas-gruppe; Aeromonas.

REFERANSE 1 (basene 1 til 5678)

FORFATTERE Stuber, K. og Frey, J.

TITTEL Deteksjon av en ny type III-sekresjonsvei i Aeromonas

Salmonicida og dets virkning på virulens

JOURNAL Upublisert

REFERANSE 2 (basene 1 til 5678)

FORFATTERE Stuber, K. og Frey, J.

TITTEL Direkte underkastelse

JOURNAL Avgitt (26. mars 2001) Institute for Veterinary Bacteriology,

University of Berne, Laenggass-Strasse 122, Berne, BE 3008, Sveits

TREKK Lokalisering/kvalifisering

Claims (13)

1. Isolert polypeptid, karakterisert ved at det omfatter i det minste én epitop eller epitopregion valgt fra klassen Acrl ; Acrl; Acr3; AcrA; AcrD; AcrK; AcrG; AcrV; og AcrH..

2. Isolert nukleinsyrefragment, karakterisert ved at det koder for et protein med en aminosyresekvens som gitt i klassen som omfatter SEKV.ID. NR. 1; SEKV.ID. NR. 2; SEKV.ID. NR.

3; SEKV. ID. NR. 4; SEKV. ID. NR. 5; SEKV. ID. NR. 6; SEKV. ID. NR. 7; SEKV. ID. NR. 8; og SEKV. ID. NR. 9.

3. Isolert nukleinsyrefragment, karakterisert ved at det omfatter SEKV.ID. NR. 10 eller komplementet derav.

4. Immunogent, immunologisk eller vaksinesammensetning, karakterisert ved at det omfatter et polypeptid i følge krav 1.

5. Immunogent, immunologisk eller vaksinesammensetning, karakterisert v e d at det omfatter et nukleinsyrefragment i følge ett av kravene 2 og 3.

6. Fremgangsmåte for a redusere fisks mottakelighet for infeksjon av en virulent A. salmonicida- stamme, karakterisert ved å omfatte den intraperitoneale, intramuskulære, intradermale, intracellulære, spray, immersjon eller orale administrering av en sammensetning som omfatter en immunogen mengde av i det minste en epitop eller epitopregion av AcrV, et hvilket som helst annet protein av A. salmonicida type III sekresjonsapparat, en naturlig eller genetisk modifisert variant derav eller et antigent peptid utledet eller syntetisert derav, til nevnte fisk.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at i det minste en epitop eller epitopregion av et protein av A. salmonicida type III sekresjonsapparatet, en naturlig eller genetisk modifisert variant derav eller et antigent peptid utledet eller syntetisert derav, er fusjonert til idet minste ett annet polypeptid ved N'-enden, C-enden eller begge deler, og hvori nevnte i det minste ene andre polypeptid letter ekspresjon.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at i det minste en epitop eller epitopregion av et protein av A. salmonicida type III sekresjonsapparatet, en naturlig eller genetisk modifisert variant derav, eller et antigent peptid utledet eller syntetisert derav, er fusjonert til idet minste ett annet polypeptid ved N'-enden, C-enden eller begge deler, og hvori nevnte i det minste ene andre polypeptid letter dannelsen av uløselige intracellulære aggregater.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at i det minste ene epitop eller epitopregion av et protein av A. salmonicida type III-sekresjonsapparat, en naturlig eller genetisk modifisert variant derav eller et antigent peptid utledet eller syntetisert derav er fusjonert til i det minste ett annet polypeptid ved N'-enden, C'-enden eller begge deler, og hvori det nevnte i det minste ene andre polypeptidet er en T-celleepitop eller en B-celleepitop.

10. Fremgangsmåte for a redusere fisks mottakelighet for infeksjon av en virulent A. salmonicida- stamme, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter intraperitoneal, intramuskulær, intradermal, intracellulær, spray, immersjon eller oral administrering av en immunogen mengde av et preparat som omfatter acr V-genet, genet for ethvert annet protein av A. salmonicida type III-sekresjonsapparat, homologer, fragmenter eller syntetiske oligonukleotider utledet derav til nevnte fisk.

11. Fremgangsmåte for å redusere fisks mottakelighet for infeksjon av en virulent A. salmonicida- stamme, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter den intraperitoneale, intramuskulære, intradermale, intracellulære, spray, immersion eller orale administreringen av en immunogen mengde av en sammensetning som omfatter det isolerte nukleinsyrefragmentet av SEKV.ID. NR. 10 til nevnte fisk.

12. Terapeutisk fremgangsmåte for a beskytte fisk fra den toksiske effekten av en virulent A. salmonicida- stamme, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter anvendelsen av antiserum rettet mot^crV, varianter eller fragmenter derav eller syntetiske peptider derav.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at antiserumet er rettet mot rekombinant AcrV.