NO20151145L - Fremgangsmåte for fremstilling av dipeptidyl IV inhibitorer og mellomprodukter derav - Google Patents

Fremgangsmåte for fremstilling av dipeptidyl IV inhibitorer og mellomprodukter derav

Info

Publication number
NO20151145L
NO20151145L NO20151145A NO20151145A NO20151145L NO 20151145 L NO20151145 L NO 20151145L NO 20151145 A NO20151145 A NO 20151145A NO 20151145 A NO20151145 A NO 20151145A NO 20151145 L NO20151145 L NO 20151145L
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
formula
medium
approx
added
acetic acid
Prior art date
Application number
NO20151145A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Politino
Matthew M Cadin
Paul M Skonezny
Jason G Chen
Original Assignee
Astrazeneca Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Publication of NO20151145L publication Critical patent/NO20151145L/no
Application filed by Astrazeneca Ab filed Critical Astrazeneca Ab

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/52—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring condensed with a ring other than six-membered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • C12N1/066—Lysis of microorganisms by physical processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C12N9/0018—Phenylalanine dehydrogenase (1.4.1.20)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/222—Phenylalanine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P15/00—Preparation of compounds containing at least three condensed carbocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/02—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with a cytochrome as acceptor (1.2.2)
    • C12Y102/02001—Formate dehydrogenase (cytochrome) (1.2.2.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE
Denne søknad krever prioritet fra U.S. Provisional søknad nr. 60/561,986, innlevert 14. april 2004, idet hele beskrivelsen i denne inntas her ved referanse.
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av (aS)-a-[[(1,1 -dimety letoksy)karbonyl] -amino] -3 -hydroksytricyklo [3.3.1.13'7] dekan-1 - eddiksyre som blir anvendt som et mellomprodukt for fremstilling av cyklopropyl-kondenserte pyrrolidin-baserte inhibitorer av dipeptidylpeptidase IV som blir anvendt ved behandling av diabetes og komplikasjoner derav, hyperglykemi, Syndrom X, hyperinsulinisme, fedme og aterosklerose og beslektede sykdommer, så vel som immunomodulerende sykdommer og kronisk inflammatorisk tarmsykdom.
BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN
Dipeptidylpeptidase IV er en membranbundet ikke-klassisk serin-aminopeptidase som er lokalisert i en rekke vev omfattende, men ikke begrenset til, tarm, lever, lunge og nyre. Dette enzym er også lokalisert på sirkulerende T-lymfocytter hvor det er referert til som CD-26. Dipeptidylpeptidase IV er ansvarlig for metabolsk spaltning av de endogene peptider GLP-l(7-36) og glukagoner in vivo og har demonstrert proteolytisk aktivitet mot andre peptider så som GHRH, NPY, GLP-2 og VIP in vitro.
GLP-l(7-36) er et 29 aminosyre peptid avledet fra post-translasjonell prosessering av proglukagon i tynntarmen. Dette peptid har multiple virkninger in vivo. For eksempel stimulerer GLP-l(7-36) insulinsekresjon og hemmer glukagonsekresjon. Dette peptid fremmer metthet og sinker gastrisk tømming. Eksogen administrering av GLP-l(7-36) via kontinuerlig infusjon er vist å være effektiv for diabetiske pasienter. Imidlertid blir det eksogene peptid nedbrutt altfor raskt for kontinuerlig terapeutisk anvendelse.
Inhibitorer av dipeptidylpeptidase IV er utviklet for å forsterke endogene nivåer av GLP-1(7,36). U.S. Patent nr. 6,395,767 til Hamann et al. beskriver cyklopropyl-kondenserte pyrrolidin-baserte inhibitorer av dipeptidylpeptidase IV. Metoder for kjemisk syntetisering av disse inhibitorer er beskrevet i U.S. Patent nr. 6,395,767 så vel som i litteraturen. Se for eksempel Sagnard et al. Tet-Lett. 1995 36:3148-3152; Tverezovsky et al. Tetrahedron 1997 53:14773-14792; og Hanessian et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998 8:2123-2128. En foretrukket inhibitor beskrevet i U.S. Patent nr. 6,395,767 er (lS,3S,5S)-2-[(2S)-2-amino-2-(3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dec-l-yl)-l-oksoetyl]-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-3-karbonitril, som vist i Formel M'.
og det tilsvarende monohydrat av (lS,3S,5S)-2-[(2S)-2-amino-2-(3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dec-l-yl)-l-oksoetyl]-2-azabicyklo-[3.1.0]heksan-3-karbonitril (M")
Metoder tilpasset for fremstilling av mellomprodukter anvendt ved fremstilling av denne dipeptidylpeptidase IV inhibitor er beskrevet i EP 0 808 824 A2. Se også Imashiro og Kuroda Tetrahedron Letters 2001 42:1313-1315, Reetz et al. Chem. Int. Ed. Engl. 1979 18:72, Reetz og Heimbach Chem. Ber. 1983 116:3702-3707, Reetz et al. Chem. Ber. 1983 116:3708-3724.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye produksjonsmetoder og forbindelser for anvendelse ved fremstilling av cyklopropyl-kondenserte pyrrolidin-baserte inhibitorer av dipeptidylpeptidase IV.
U.S. Patent nr. 6,395,767 til Hamann et al. beskriver prosedyrer for syntese av (aS)-a- [[(1,1 -dimetyletoksy)karbonyl] -amino] -3 -hydroksytricyklo[3.3.1.13'7] dekan-1 - eddiksyre, et mellomprodukt for anvendelse ved fremstilling av den frie basen M' eller salt derav, som involverer en åtte-trinns syntese fra adamantan-karboksylsyre.
U.S. søknad nr. 10/716,012 innlevert 18. november 2003 (attorney file LA84 NP) beskriver en metode for fremstilling av (aS)-a-[[(l,l-dimetyletoksy)karbonyl]-amino]-3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre som anvender 3-hydroksy-a-oksotricyklo[3.3.l.l<3>'<7>]-dekan-1-eddiksyre som et utgangsmateriale og hvor en enzymatisk reduktiv aminering blir anvendt for å fremstille og isolere (aS)-a-amino-3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre som blir omdannet til det ønskede produkt i et separat trinn.
Det enzymatiske reduktive amineringstrinn involverer anvendelse av forskjellige former av enzymet fenylalanin-dehydrogenase (PDH) i kombinasjon med enzymet formiat-dehydrogenase enzym (FDH) i nærvær av ammonium-formiat, DTT og NAD ved anvendelse av ammoniumhydroksid for pH-justering. Når overskudd av ammoniumioner er til stede, kan det være nødvendig å fjerne ammoniakk før videre nedstrøms prosessering for å unngå mulig interferens med innføring av en Boc-gruppe.
Cellene fra hvilke PDH- og/eller FDH-enzymer blir produsert blir isolert fra fermenteringsmedium og lagret inntil klare for anvendelse. Før anvendelse blir cellene mikrofluidisert for å frigjøre enzym fra cellene sammen med celledebris som må fjernes før enzymene er klare for anvendelse for reduktiv aminering.
KORT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
I henhold til foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av delvis renset fenylalanin-dehydrogenase og/eller formiat-dehydrogenase enzym- (PDH/FDH) konsentrater som omfatter trinnene: a. fremstilling av av et fermenteringsmedium av en mikroorganisme som er i stand til å produsere fenylalanin-dehydrogenase og/eller formiat-dehydrogenase; b. underkasting av mediet for mikrofluidisering for å frigjøre aktivitet fra de resulterende celler og danne et mikrofluidisert medium som har PDH- og/eller FDH-aktivitet. c. klaring av mediet ved behandling av mediet med et flokkuleringsmiddel for å koagulere celledebris og fjerne DNA og uønskede proteiner;
d. filtering av det klarede medium; og
e. konsentrering av mediet for å gi et delvis renset enzym-konsentrat som har en PDH/FDH-aktivitet på minst ca. 400 IU/ml for PDH og minst ca. 20 IU/ml for
FDH.
I tillegg, i henhold til foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av et amin med strukturen
som omfatter trinnene
a. behandling av en vandig løsning av en ketosyre med strukturen
med et maksimum på ca. 2 molekvivalenter av ammonium-formiat, nikotinamid-adenin-dinukleotid, ditiotreitol og delvis renset fenylalanin-dehydrogenase/formiat-dehydrogenase enzym (PDH/FDH); og
b. opprettholdelse av pH i reaksjonen ved fra ca. 7,0 til ca. 8,6, fortrinnsvis ved 8,0 +/- 0,2 med natriumhydroksid for å danne det ønskede amin som er hovedsakelig fritt for uønsket overskudd av ammoniumioner.
I henhold til foreliggende oppfinnelse tilveiebringes videre en fremgangsmåte for fremstilling av et BOC-beskyttet amin med strukturen
som omfatter trinnene
a. tilveiebringelse av en vandig løsning av aminosyren (aS)-a-amino-3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre med strukturen
(fremstilt ved anvendelse av delvis renset fenylalanin-dehydrogenase/formiat-dehydrogenase enzymer for reduktiv aminering av ketosyre 1
beskrevet ovenfor); og
b. behandling av den vandige løsningen ovenfor med di-tert-butyl-dikarbonat for å danne det BOC-beskyttede amin.
I en annen utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av det BOC-beskyttede amin med strukturen 3
som omfatter trinnene
a. fremstilling av delvis renset fenylamin-dehydrogenase/formiat-dehydrogenase enzymer (PDH/FDH) (som beskrevet ovenfor);
b. behandling av en vandig løsning av en ketosyre med strukturen 1
med ammonium-formiat, nikotinamid-adenin-dinukleotid, ditiotreitol og de delvis rensede fenylalanin-dehydrogenase/formiat-dehydrogenase enzymer (PDH/FDH); c. opprettholdelse av pH i reaksjonsblandingen ved fra ca. 7,0 til ca. 8,6, fortrinnsvis ved 8,0 +/- 0,2 med natriumhydroksid og dannelse av det ønskede amin 2
som er hovedsakelig fritt for uønsket overskudd av ammoniumioner; og
d. uten isolering av aminosyremellomprodukt 2, behandling av den vandige løsning ovenfor med di-tert-butyl-dikarbonat for å danne det BOC-beskyttede amin med strukturen 3. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tilveiebringer betydelig forbedrede prosesseringsprosedyrer ved anvendelse av delvis rensede enzymer og ved anvendelse av natriumhydroksid for pH-justering i motsetning til ammoniumhydroksid, reduserer prosesseringstider og tillater isolering av krystallinsk produkt uten å kreve isolering av mellomprodukter. I tillegg tilveiebringer fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremstilling av delvis rensede PDH/FDH-enzymer ved anvendelse av reaksjonsbetingelser som tillater at en minimumsmengde av ammoniumioner er til stede for nedstrøms prosessering som ikke vil gripe inn i innføring av en Boc-gruppe. Videre tillater anvendelse av delvis renset PDH/FDH-enzymkonsentrat ved reduktiv aminering av formel 1 syre eliminering av kravet om harpiks-kolonne-isolering av ovennevnte aminosyre-mellomprodukt med formel 2 etter bioomdannelse-reaksjonen. Reaksjonsstrømmen vil være tilstrekkelig ren (fri for celledebris og ha reduserte protein-nivåer) til å fortsette direkte med BOC-reaksjon og ekstraksjon og krystallisering av det resulterende ønskede BOC-beskyttede mellomprodukt. I en foretrukket utførelsesform blir den BOC-beskyttede forbindelse 3 anvendt som et mellomprodukt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for fremstilling av dipeptidyl-peptidase IV inhibitor (lS,3S,5S)-2-[(2S)-2-amino-2-(3-hydroksytricyklo[3.3.1. l3'7]dec-l-yl)-l-oksoetyl]-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-3-karbonitril, benzoat (1:1) som vist i Formel M
eller dens frie base M',
og monohydrat M" derav
Disse inhibitorer blir til slutt dannet fra kobling av to fragmenter, BOC-beskyttet (aS)- a-amino-3-hydroksytricyklo [3.3.l.l3'7]dekan-1 -eddiksyre som vist i Formel 3, (fremstilt ved anvendelse av det delvis rensede PDH/FDH-enzym fremstilt i henhold til foreliggende oppfinnelse) og (lS,3S,5S)-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-3-karboksamid-syresalt så som hydrokloridsaltet eller metansulfonsyresaltet (mesyl- eller MSA-salt) som vist i Formel J
Cyklopropyl-kondenserte pyrrolidin-baserte forbindelser så som (lS,3S,5S)-2-[(2S)-2-amino-2-(3 -hydroksytricyklo[3.3.1.13J] dec-1 -yl)-1 -oksoetyl] -2-azabicyklo[3.1.0]heksan-3-karbonitril, benzoat (1:1) og den tilsvarende frie base og monohydrat derav er dipeptidyl-peptidase IV inhibitorer anvendelige ved behandling av diabetes og komplikasjoner derav, hyperglykemi, Syndrom X, hyperinsulinisme, fedme og aterosklerose og beslektede sykdommer, så vel som immunomodulerende sykdommer og kronisk inflammatorisk tarmsykdom. Ved foreliggende oppfinnelse blir BOC-beskyttede forbindelser (fremstilt via en reduktiv amineringsprosess ved anvendelse av delvis rensede PDH/FDH-enzymer i henhold til foreliggende oppfinnelse) anvendt for anvendelse i produksjon av cyklopropyl-kondenserte pyrrolidin-baserte forbindelser så som (lS,3S,5S)-2-[(2S)-2-amino-2-(3-hydroksytricyklo[3.3.1. l3'7]dec-l-yl)-l-oksoetyl]-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-3-karbonitril, benzoat (1:1) og dens tilsvarende frie base og monohydrat derav.
DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
For å utføre fremstilling av det delvis rensede PDH/FDH enzymkonsentrat ifølge oppfinnelsen, blir en mikroorganisme som uttrykker PDH- og/eller FDH-aktivitet fermentert. Fermenteringsmediet vil bli ført gjennom en mikrofluidisator som opererer under et trykk innen området 560 til ca. 2100 kg/cm<2>, fortrinnsvis fra ca. 840 til ca. 1400 kg/cm2 mens mediet holdes ved en temperatur innen området fra ca. 4°C til 30°C, fortrinnsvis fra ca. 8°C til ca. 15°C, mer foretrukket under 40°C. Hele mediet vil fortrinnsvis klares ved tilsetning av en filterhjelp til mediet så som diatoméjord (for eksempel Dicalite® registrert varemerke til Grefco Minerals, Inc. og Celite® registrert varemerke til World Minerals, Inc.) og et flokkuleringsmiddel så som vandig polyetylenimin eller annet flokkuleringsmiddel så som varme, for å fjerne DNA og andre høymolekylære proteiner. Blandingen blir deretter filtrert ved anvendelse av en filterpresse og filtratet blir gjenvunnet. Filterkaken blir vasket med vann og vannet blir gjenvunnet og satt til filtratet som alt er referert til som klaret medium.
Det klarede medium blir ultrafiltrert gjennom en 100.000 MWCO (molekylvekt avkutting) membran for å fjerne lavmolekylære (under 100.000) urenheter.
Det klarede filtrat blir konsentrert for å gi et enzymkonsentrat med PDH-titer fra ca. 400 til ca. 1000 IU/ml, fortrinnsvis fra ca. 500 til ca. 600 IU/ml og FDH-titer fra ca. 20 til ca. 200 IU/ml, fortrinnsvis fra ca. 75 til ca. 150 IU/ml.
Den totale enzymaktivitet-utvinning i konsentratet vil være innen området fra ca. 65 til ca. 95%, fortrinnsvis fra ca. 75 til ca. 90%.
Betegnelsen "delvis rensede" PDH/FDH-enzymer som anvendt her angir PDH/FDH-enzymer hvor minst en del av DNA og andre høymolekylære proteiner og lavmolekylære urenheter er fjernet.
For å utføre reduktiv aminering av 3-hydroksy-a-oksotricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-1 -eddiksyre (Formel 1 syre), blir en vandig blanding av Formel 1 syre fremstilt og blandingen blir regulert til en pH innen området fra ca. 7,0 til omtrent 8,6, fortrinnsvis fra ca. 7,8 til ca. 8,2 med sterk alkalimetall-base så som et alkalimetallhydroksid, fortrinnsvis NaOH, for å danne en løsning av Formel 1 syre. Karbon (for eksempel Darco KB) kan tilsettes og blandingen filtreres og filtrat og vaskevæsker kombineres for å gi en klar løsning.
Ammonium-formiat blir satt til løsningen i en mengde for å gi et molart forhold av ammonium formiat:Formel 1 syre innen området fra ca. 1,9:1 til ca. 2,5:1, fortrinnsvis ca. 2:1. pH i den resulterende blandingen blir regulert innen området fra ca. 7,0 til omtrent 8,6, fortrinnsvis fra ca. 7,8 til ca. 8,2, ved anvendelse av sterk alkalimetall-base, så som et alkalimetallhydroksid, fortrinnsvis NaOH.
Nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) og eventuelt et reduksjonsmiddel så som ditiotreitol eller beta-merkaptoetanol, fortrinnsvis ditiotreitol blir tilsatt ved anvendelse av et molart forhold av NAD:Formel 1 syre innen området fra ca. 500:1 til ca. 1500:1, fortrinnsvis fra ca. 900:1 til ca. 1200:1. Etter at faste stoffer er oppløst blir det delvis rensede PDH/FDH enzymkonsentrat (fra ca. 400 til ca. 600IU PDH/gram Formel 1) tilsatt. pH blir reregulert til området fra ca. 7,0 til omtrent 8,6, fortrinnsvis fra ca. 7,7 til ca. 8,2 med sterk base så som NaOH.
Blandingen blir oppvarmet til en temperatur innen området fra ca. 25 til 45°C, fortrinnsvis fra ca. 37 til ca. 40°C og fortynnet med vann og pH holdt med alkalimetall-base som beskrevet ovenfor, fortrinnsvis NaOH, ved pH innen området fra ca. 7,0 til omtrent 8,6, fortrinnsvis fra ca. 7,8 til ca. 8,2 over en periode for å bevirke reduktiv aminering av formel 1 syre for å danne (aS)-a-3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (formel 2 amin).
BOC-beskyttelse av Formel 2 aminet blir oppnådd uten isolering av Formel 2 amin ettersom aminet 2 vil være fritt for celledebris. Di-tert-butyl-dikarbonat blir satt til minst en porsjon av løsningen av formel 2 amin ved anvendelse av et molart forhold av di-tert-butyl-dikarbonat:Formel 2 amin innen området fra omtrent 2:1 til omtrent 2,5:1, fortrinnsvis fra omtrent 2,0:1 til omtrent 2,2:1. pH i reaksjonsblandingen blir regulert innen området fra omtrent 8,5 til omtrent 12,5, fortrinnsvis fra omtrent 9,5 til omtrent 10,5 ved anvendelse av en sterk base så som NaOH som beskrevet ovenfor.
Den resulterende BOC-beskyttede forbindelse (Formel 3) blir ekstrahert og gjenvunnet og krystallisert for å danne det BOC-beskyttede Formel 3 amin.
Som sett ovenfor, i ett aspekt av foreliggende oppfinnelse, tilveiebringes prosesser for produksjon av fragmentet (aS)-a-amino-3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]- dekan-1-eddiksyre (Formel 2) ved reduktiv aminering av mellomprodukt-forbindelsen 3-hydroksy-a-oksotricyklo[3.3.1. l3'7]dekan-l-eddiksyre (Formel 1). I en foretrukket utførelsesform av denne metoden blir 3-hydroksy-a-oksotricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (Formel 1) omdannet til (aS)-a-amino-3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-1 -eddiksyre (Formel 2) ved reduktiv aminering utført enzymatisk ved anvendelse av det delvis rensede fenylalanin-dehydrogenase/formiat-dehydrogenase enzymkonsentrat ifølge oppfinnelsen som beskrevet ovenfor. Eksempler på fenylalanin-dehydrogenaser anvendelige ved foreliggende oppfinnelse omfatter, men er ikke begrenset til, de fra Sporosarcina- arter eller en fenylalanin-dehydrogenase fra Thermoactinomyces- arter så som Thermoactinomyces intermedius. Det er foretrukket at reduktiv aminering utføres med fenylalanin-dehydrogenase fra Thermoactinomyces intermedius, ATCC 33205, uttrykt i Escherichia coli eller Pichia pastoris. Konstruksjon og vekst av rekombinante stammer av E. coli og Pichia pastoris som uttrykker fenylalanin-dehydrogenase Thermoactinomyces intermedius, ATCC 33205, er beskrevet av Hanson et al. (Enzyme and Microbial Technology 2000 26:348-358). Vekst av Pichia pastoris på metanol fremkaller også produksjon av formiat-dehydrogenase (Hanson et al. Enzyme and Microbial Technology 2000 26:348-358).
E. cø//'-celler inneholdende et plasmid som uttrykker Pichia pastoris (ATCC 20864) formiat-dehydrogenase og en modifisert versjon av Thermoactinomyces intermedius (ATCC 33205) fenylalanin-dehydrogenase gen ble deponert og akseptert av International Depository Authority under forskriftene i Budapest-traktaten. Deponeringen ble utført 25. juni 2002 til the American Type Culture Collection i 10801 University Boulevard i Manassas, Virginia 20110-2209. ATCC-aksesjonsnummer er PTA-4520. Alle restriksjoner på offentlig tilgang til denne cellelinjen vil ugjenkallelig bli fjernet ved bevilgning av denne patentsøknad. Deponeringen vil bli holdt i et offentlig deponeringssted i en periode på tretti år etter datoen for deponering eller fem år etter siste forespørsel etter en prøve eller i det rettskraftige liv til patentet, etter hva som er lengst. Den ovenfor angitte cellelinje var levedyktig på tidspunktet for deponeringen. Deponeringen vil bli erstattet hvis levedyktige prøver ikke kan leveres av deponeringsstedet.
Mest foretrukket er fenylalanin-hydrogenase fra Escherichia coli JM110 inneholdende et plasmid pBMS-2000-PPFDH-PDH mod. som uttrykker Pichia pastoris (ATCC 20864) formiat-dehydrogenase og en modifisert versjon av Thermoactinomyces intermedius (ATCC 33205) fenylalamin-dehydrogenase.
Reduktiv aminering av 3-hydroksy-a-oksotricyklo[3.3.1.13'7]dekan-1 -eddiksyre (Formel 1) til (aS)-a-amino-3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (Formel 2) er vist i det følgende Skjema I:
Som vist i Skjema I krever denne reaksjonen ammoniakk og redusert nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH). Nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) produsert under reaksjonen blir resirkulert til NADH ved oksidering av formiat til karbondioksid av formiat-dehydrogenase. Det forventede utbytte av (aS)-a-amino-3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (Formel 2) fra denne reaksjonen er 80 til 100% og det forventede enantiomere overskudd er større enn 99%. Se også Eksempler 1 til 7 her.
Mellomprodukt-forbindelsen 3-hydroksy-a-oksotricyklo[3.3.1.l<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (Formel 1) kan produseres i henhold til metoden vist i Skjema II:
Som vist i Skjema II blir ved denne metoden adamantylbromid (Formel A) alkylert via sinkklorid-katalyse for å produsere a-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (Formel B). a-hydroksytricyklo[3.3.l.l<3>'<7>]dekan-1-eddiksyre (Formel B) blir deretter forestret ved anvendelse av acetylklorid i metanol for å produsere a-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre-metylester (Formel C). a-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre-metylester (Formel C) blir deretter omdannet til a-oksotricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre-metylester (Formel D) ved Swern-oksidasjon. a-oksotricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre-metylester (Formel D) blir deretter hydroksylert for å danne 3-hydroksy-a-oksotricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre-metylester (Formel la), som deretter blir hydrolysert for å danne 3-hydroksy-a-oksotricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (Formel 1).
Alternativt kan mellomprodukt-forbindelsen 3-hydroksy-a-oksotricyklo[3.3.l.l<3>'<7>]dekan-1-eddiksyre (Formel 1) produseres i henhold til metoden vist i Skjema HI.
Som vist i Skjema IH blir (2,2-diklor-l-metoksy-vinyloksy)-trimethysilan lb fremstilt ved mindre modifikasjon av metoden ifølge Kuroda et al. (EP 08 08 824A3; Imashiro og Kuroda Tetrahedron Letters 2001 42:1313-1315). Behandling av bromadamantan med lb under innvirkning av sinkklorid (Reetz et al. Chem. Int. Ed. Engl. 1979 18:72, Reetz og Heimbach Chem. Ber. 1983 116:3702-3707, Reetz et al. Chem. Ber. 1983 116:3708-3724) gir adamantan-l-yl-diklor-eddiksyre-metylester med formel VII. Adamantan-l-yl-diklor-eddiksyre-metylester med formel VU blir deretter hydroksylert med nitrogenoksid i konsentrert svovelsyre for å gi et kvantitativt utbytte av diklor-(3-hydroksy-adamantan-l-yl)-eddiksyre-metylester med formel VHI. Hydrolyse av formel VM med vandig natriumhydroksid i metanol ved romtemperatur gir diklor-(3-hydroksy-adamantan-l-yl)-eddiksyre med formel IX. Påfølgende behandling av diklor-(3-hydroksy-adamantan-l-yl)-eddiksyre (Formel IX) med en svak base, fortrinnsvis natriumbikarbonat, ved forhøyet temperatur resulterer i eksklusiv dannelse av mellomprodukt-forbindelsen 3-hydroksy-a-oksotricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-1-eddiksyre (Formel 1).
Som vist i Skjema HIA kan mellomprodukt-forbindelsen 3-hydroksy-a-oksotricyklo-[3.3.1.1,3'<7>]dekan-1-eddiksyre (Formel I) fremstilles ved en ett-kar prosedyre. Som sett gir behandling av formel Vm forbindelse med vandig natriumhydroksid i tetrahydrofuran (eller annen base så som kaliumhydroksid eller litiumhydroksid) i en inert atmosfære så som argon, det tilsvarende natriumsalt. Uten utvinning av natriumsaltet blir reaksjonsblandingen inneholdende natriumsaltet behandlet med en syre så som saltsyre for å nedsette pH til mindre enn ca. 0,50 fortrinnsvis ca. 0,20, for å danne den tilsvarende ketosyre n, som kan omkrystalliseres fra vann for å danne krystaller av ketosyre I.
Fragmentet (lS,3S,5S)-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-3-karboksamid (Formel J) anvendt ved fremstilling av (lS,3S,5S)-2-[(2S)-2-amino-2-(3-hydroksytricyklo[3.3.1. l3'7]dec-l-yl)-l-oksoetyl]-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-3-karbonitril kan produseres i henhold til metoden vist i Skjema IV vist nedenfor.
Som vist i Skjema IV blir L-pyroglutaminsyre (Formel E) først forestret for å produsere L-pyroglutaminsyre-etylester (Formel F; SQ 7539). Denne L-pyroglutaminsyre-etylester blir deretter BOC-beskyttet på nitrogenet for å produsere (5S)-2-oksopyrrolidin-l,5-dikarboksylsyre, l-(l,l-dimetyletyl),5-etylester (Formel G). Superhydrid-reduksjon og eliminering blir deretter utført for å danne 4,5-dihydro-lH-pyrrol-l,5-dikarboksylsyre, l-(l,l-dimetyletyl),5-etylester (Formel G). BOC-DHPEE HI blir deretter hydrolysert ved forsåpning med litiumhydroksid for å danne BOC-DHP. Et amid blir deretter dannet på BOC-DHP via blandet anhydrid ved anvendelse av mesylklorid fulgt av ammoniakk for å produsere (5S)-5-aminokarbonyl-4,5-dihydro-lH-pyrrol-l-karboksylsyre, l-(l,l-dimetyletyl)ester (Formel G'). (5S)-5-aminokarbonyl-4,5 -dihydro-1 H-pyrrol-1 -karboksylsyre, 1 -(1,1 -dimetyletyl)ester (Formel G") blir deretter cyklopropanert via Simmons-Smith-reaksjon for å produsere [ 1S -(1 a, 3 p, 5a] -3 -aminokarbonyl)-2-azabicyklo [3.1.0] heksan-2-karboksylsyre, 1,1- dimetyletylester (Formel H). BOC blir deretter fjernet, hvilket resulterer i dannelse av et syresalt så som hydrokloridsaltet eller metansulfonsyresaltet av fragmentet (lS,3S,5S)-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-3-karboksamid (Formel J).
Som sett i Skjema IV blir omdannelse av (5S)-5-aminokarbonyl-4,5-dihydro-lH-pyrrol-l-karboksylsyre, l-(l,l-dimetyletyl)ester (Formel G") til [lS-(la,3p,5a]-3-aminokarbonyl)-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-2-karboksylsyre, 1,1-dimetyletylester (Formel H) utført ved cyklopropanering i en Simmons-Smith reaksjon. I denne reaksjonen blir (5S)-5-aminokarbonyl-4,5-dihydro-lH-pyrrol-l-karboksylsyre, 1-(1,1-dimetyletyl)ester oppløst i metylenklorid i en første reaktor. I en andre reaktor blir metylenklorid avkjølt til -30°C og dimetoksyetan og en 30% løsning av dietylsink i toluen blir tilsatt fulgt av tilsetning av dijodmetan. Denne blandingen blir deretter satt til den første reaktor fulgt av tilsetning av mettet bikarbonat-løsning. Den resulterende reaksjonsblanding blir omrørt inntil et presipitat er dannet. Fellingen blir deretter filtrert, vasket og resuspendert i metylenklorid to eller flere ganger. Filtrater blir deretter separert i vandige og organiske faser og den organiske fasen blir vasket med halvmettet saltløsning. Løsningsmiddel blir fjernet og byttet med heptan for å oppnå en oppslemning av råprodukt av [lS-(la,3p,5a]-3-aminokarbonyl)-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-2-karboksylsyre, 1,1-dimetyletylester (Formel H) i heptan.
Alternativt kan (5S)-5-aminokarbonyl-4,5-dihydro-lH-pyrrol-l-karboksylsyre, l-(1,1-dimet<y>let<y>lester (Formel G") fremstilles som vist i Skjema IVA.
Som vist i Skjema IVA blir DCHA-saltet av 4,5-dihydro-lH-pyrrol-l,5-dikarboksylsyre, 1-(1,1-dimetyletylester X behandlet med alkalimetall-base så som natriumhydroksid for å danne det tilsvarende salt, så som natriumsaltet.
Natriumsaltet av 4,5-dihydro-lH-pyrrol-l,5-dikarboksylsyre, 1-(1,1-dimetyletyl)ester XI kan også fremstilles fra den tilsvarende etylester ved behandling av etylesteren (fortrinnsvis en løsning av etylesteren i toluen) med etanol og natriumhydroksid.
En løsning av natriumsaltet XI blir behandlet med buffer så som ammoniumklorid og natrium-dihydrogenfosfat for å nedsette pH i løsningen til under 7, fortrinnsvis ca. 6 til 6,5 og den bufrede løsningen av natriumsalt blir behandlet med 4-(4,6-dimetoksy-l,3,5-triazin-2-yl)-4-metylmorfoliniumklorid (DMT-MM) for å danne den aktiverte DMT-ester XII som blir behandlet med ammoniakk eller annen base så som ammoniumsulfat, ammoniumklorid eller ammoniumhydroksid, for å danne (5S)-5-aminokarbonyl-4,5-dihydro-1 H-pyrrol-1 -karboksylsyre-1 -(1,1 -dimetyletylester G".
4-(4,6-dimetoksy-l,3,5-triazin-2-yl)-4-metyl-morfoliniumklorid (DTM-MM) kan fremstilles som vist i Skjema VIA ved omsetning av 2-Cl-4,6-dimetoksy-l,3,5-triazin (CDMT) og N-metylmorfolin ved reduserte temperaturer i området fra ca. 0 til ca. 10°C for å danne DMT-MM.
DCHA-saltet av 4,5-dihydro-lH-pyrrol-l,5-dikarboksylsyre, 1-(1,1-dimetyletyl)ester X kan fremstilles fra det tilsvarende natriumsalt XI ved behandling av en vandig løsning av tidligere fremstilt DCHA-salt X med metyl-t-butyleter (MTBE) med regulering av pH i reaksjonsblandingen til 2,5-3 ved anvendelse av en syre så som H3PO4. Det organiske laget blir separert og behandlet med saltvann for å danne det tilsvarende natriumsalt XI. Den resulterende reaksjonsblanding blir avkjølt og behandlet med DCHA for å danne det tilsvarende DCHA salt X.
Forbindelse H i Skjema IVA kan også fremstilles som vist i Skjema IVB ved cyklopropanering av N-BOC 4,5-dehydroprolin-etylester G" som følger.
N-BOC 4,5-dehydroprolin-etylester G" blir behandlet med dietyl-sink og klor-jodmetan i nærvær av tørt organisk løsningsmiddel så som toluen, metylenklorid eller dikloretan ved en redusert temperatur i området fra ca. -30 til ca. 0°C for å danne N-BOC 4,5-metanoprolin-etylester XV.
Den resulterende BOC 4,5-metanoprolin-etylester XV (blanding av syn- og anti-isomerer (8:1)) blir separert ved behandling med vandig metylamin under en inert atmosfære så som en nitrogen-atmosfære og syn (S)-BOC-4,5-metanprolin-etylester XVI (separert fra XVII) blir gjenvunnet.
s-BOC-4,5-metanoprolin-etylester XVI i etanol eller annet organisk løsningsmiddel så som toluen eller THF blir behandlet med base så som vandig litiumhydroksid, natriumhydroksid eller kaliumhydroksid for å danne tilsvarende s-BOC-metanoprolin fri syre XVIII.
Den frie syren XvTfl blir omdannet til det tilsvarende s-BOC-metanoprolin-amid H ved behandling av fri syre XVIII oppløst i et organisk løsningsmiddel så som THF eller metylenklorid; isobutylklorformiat eller mesylklorid, i nærvær av N-metylmorfolin, under reduserte temperaturer som ikke overstiger ca. -8°C og deretter behandling av reaksjonsblandingen med ammoniakk for å danne s-BOC-metanoprolin-amidet H.
Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse angår en metode for kobling av fragmentene (aS)-a-amino-3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (Formel 3) og (lS,3S,5S)-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-3-karboksamid (Formel J) for å produsere (1 S,3S,5S)-2-[(2S)-2-amino-2-(3-hydroksytricyklo[3.3.1. l3'7]dec-l -yl)-l-oksoetyl]-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-3-karbonitril, benzoat (1:1). Kobling av disse fragmenter er vist i Skjema V nedenfor.
Forbindelsen med formel 2 blir anvendt uten isolering fra bioomdannelse ved anvendelse av et isolert (delvis renset) PDH/FDH enzymkonsentrat som angitt i eksempel 3.
Som vist i Skjema V blir fragmentet (aS)-a-amino-3-hydroksytricyklo-[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-1-eddiksyre (Formel 2) først BOC-beskyttet for å produsere (aS)-a[[(l, 1 -dimetyletoksy)karbonyl]amino]-3 -hydroksytricyklo[3.3.1.13'7] dekan-1 - eddiksyre (Formel 3) ved behandling av 2 med BOC2O i nærvær av base så som natriumhydroksid og separert via isopropylacetat-ekstraksjon og deretter krystallisert med isopropylacetat/heptaner for å isolere den frie syre 3 (se Eksempel 3, trinn 3). Alternativt blir fri syre 3 separert via etylacetat- (EtOAc) ekstraksjon (se Eksempel 8M).
En løsning av Formel 3 forbindelse i et passende organisk løsningsmiddel så som tetrahydrofuran (THF) (avkjølt til en temperatur i området fra ca. -10 til ca. 0°C) blir behandlet med metansulfonylklorid (Mesyl Cl) og Hunig base (diisopropyletylamin eller DIPEA) for å danne det tilsvarende metansulfonsyresalt av VI.
En koblingsreaksjon blir deretter anvendt for å koble (aS)-a[[(l,l-dimetyletoksy)karbonyl]amino] -3 -hydroksytricyklo[3.3.1.13'7] dekan-1 -eddiksyre, (Formel 3) metansulfonsyresalt til (lS,3S,5S)-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-3-karboksamid (Formel J) i nærvær av 1-hydroksybenzotriazol (HOBT) eller annet kjent koblingsmiddel for å produsere 3-(aminokarbonyl)-aS)-a-(3-hydroksytricyklo[3.3.1. l3'7]dec-l-yl)-p-okso-(l S,3S,5S)-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-2-etankarbaminsyre, 1,1-dimetyletylester (Formel K). Formel K forbindelse blir underkastet dehydratisering ved å behandle forbindelse K med organisk base så som pyridin eller trietylamin og trifluoreddiksyreanhydrid og deretter underkaste reaksjonen hydrolyse ved avkjøling til ca. 0 til ca. 10°C og tilsette natriumhydroksid eller annen sterk base så som KOH eller LiOH for å danne Forbindelse L. 3-cyano-(aS)-a-(3-hydroksytricyklo[3.3.1. l3'7]dec-l-yl)-p-okso-(l S,3S,5S)-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-2-etankarbaminsyre-1,1 -dimetyletylester (Formel L), som deretter blir avbeskyttet (og behandlet med natriumbenzoat) for å danne dipeptidyl-peptidase IV inhibitoren (1 S,3S,5S)-2-[(2S)-2-amino-2-(3-hydroksytricyklo[3.3.1. l3'7]dec-l -yl)-l-oksoetyl]-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-3-karbonitril-benzoat (1:1) (Formel M).
Med henvisning til Skjema V kan forbindelse L avbeskyttes ved behandling med sterk syre så som saltsyre som beskrevet med hensyn til Skjema VIA.
Med henvisning til Skjema VIA kan det frie base monohydrat M" dannes fra det BOC-beskyttede mellomprodukt L som følger.
BOC-beskyttet mellomprodukt L blir behandlet med konsentrert saltsyre i nærvær av metylenklorid og metanol mens reaksjonstemperaturen holdes innen området fra ca. 20 og 25°C, for å danne hydrokloridsalt L'. Hydrokloridsalt L' blir behandlet med saltsyre og deretter natriumhydroksid eller annen sterk base for å danne den frie basen M'. Fri base M' blir deretter behandlet med vann for å danne fri base monohydrat M".
Dipeptidyl-peptidase IV-hemning produsert ved anvendelse av forbindelsene og metodene ifølge foreliggende oppfinnelse er anvendelige ved behandling av diabetes og komplikasjoner derav, hyperglykemi, Syndrom X, hyperinsulinisme, fedme og aterosklerose og beslektede sykdommer så vel som immunomodulerende sykdommer og kronisk inflammatorisk tarmsykdom.
De følgende Eksempler representerer foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen.
EKSEMPEL 1
Konstruksjon av plasmid pBMS2000-PPFDH-PDHmod
En to-trinns konstruksjon av ekspresjonsvektoren pBMS2000-PPFDH-PDHmod ble anvendt. P. pastoris FDH-gen ble subklonet inn i ekspresjonsvektor pBMS2000 (pBMS2000 er beskrevet i U.S. Patent nr. 6,068,991, bevilget 30. mai 2000 til S.W. Liu et al.) ved anvendelse av oligonukleotid-primere inneholdende 5'- og 3'-enden avP. pastoris FDH-genet sammen med kompatible restriksjons-endonuklease-spaltningsseter:
Høy-kvalitet PCR-amplifisering av P. pastoris FDH-gen ble utført i fire 100 u.1 aliquoter, hver inneholdende 1 X TaqPlus reaksjonsbuffer (Stratagene, LaJolla, CA), 0,2 mM hver av deoksynukleotid-trifosfat (dATP, dCTP, dGTP og dTTP), 0,4 nM hver av oligonukleotid, 2,5 U TaqPlus DNA polymerase (Stratagene) og 10 pg plasmid DNA inneholdende det klonede P. pastoris FDH-gen. Amplifiseringsbetingelsene omfattet inkubering ved 94°C i 4 minutter, fulgt av 25 cykler av inkubering ved 94°C i 1 minutt; 50°C i 1 minutt; og 72°C i 1,5 minutter, ved anvendelse av en Perkin-Elmer Modell 480 termocykler med autoekstensjon.
PCR-reaksjonsblandingen ble ekstrahert med et likt volum av 1:1 fenol:kloroform (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) og sentrifugert ved 13.000 x g i 5 minutter. Den øvre vandige fase ble fjernet og plassert i et nytt mikrosentrifugerør. DNA ble utfelt ved tilsetning av 0,1 volum av 3 M natriumacetat og 2 volumer iskald etanol. Etter sentrifugering ved 13.000 x g i 5 minutter ble væske aspirert fra røret og pelleten vasket med 0,5 ml iskald 70% etanol. Væsken ble aspirert igjen og pelleten fikk lufttørke i 30 minutter ved romtemperatur.
Amplifisert DNA ble fordøyet med 20 enheter hver av BspHl og BamYQ. i 3 timer ved 37°C i et totalt volum på 50 ul. Parallelt ble pBMS2000 vektor (2 ug) fordøyet med BspYQ. og BamYQ.. De fordøyede prøver ble elektroforesert på en 1,0% TAE agarosegel i 2 timer ved 100 v. Båndene svarende til FDH-genet (1100 basepar fragment) og linearisert vektor (4700 basepar fragment) som separat ble tatt ut fra gelen og renset ved anvendelse av QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Chatsworth, CA). Konsentrasjonene av de isolerte fragmenter ble beregnet ved elektroforese mot lav molekylvekt masse-stige ("mass ladder") (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) og ligert i et 5:1 (insersjon:vektor) molart forhold i et totalt volum på 10 ul ved 22°C i 2 timer. DNA ble utfelt ved tilsetning av 15 u.1 dHiO og 250 ul 1-butanol og pelletert ved 13.000 x g i en mikrosentrifuge i 5 minutter. Væske ble fjernet ved aspirering og DNA ble tørket i en SpeedVac (Savant Instruments, Farmingdale, NY) i 5 minutter under lav varme. Pelleten ble resuspendert i 5 ul dRiO.
Det resuspenderte DNA ble transformert ved elektroporering i 0,04 ml E. coli DH10B kompetente celler (Invitrogen) ved 25 uF og 250 £1 SOC-medium ble umiddelbart tilsatt (0,96 ml; SOC = 0,5% gjærekstrakt, 2% trypton, 10 mM NaCl, 2,5 mM KC1, 10 mM MgCb, 10 mM MgSC>4 og 20 mM glukose pr. liter) og cellene inkubert i en shaker i 1 time ved 37°C og 225 rpm. Kolonier som inneholder plasmid DNA ble selektert på LB agarplater inneholdende 50 u.g/ml kanamycin-sulfat (Sigma Chemicals, St. Louis, MO). Plasmider med den ønskede insersjon ble identifisert ved koloni PCR i kapillarrør ved anvendelse av RapidCycler (Idaho Technology, Salt Lake City, UT). Hver reaksjonsblanding inneholdt 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 4 mM MgCh, 0,25 mg/ml bovint serumalbumin, 2% sukrose 400, 0,1 mM kresol-rød, 0,4 nM av hver primer (SEKV ID NR: 1 og SEKV ID NR:2) og 2,5 U Taq DNA polymerase (Promega Corp., Madison, WI). Reaksjonsblandingen ble delt i 10 ul aliquoter og pipettert inn i brønnene av en rundbunnet mikrotiter-plate. En kanamycin-resistent koloni ble tatt opp ved anvendelse av en éngangs plast inokuleringsnål, spunnet inn i reaksjonsblandingen og overført til LB-kanamycin-agar. Hver reaksjonsblanding-aliquot ble trukket opp i et 30 ul kapillarrør og røret ble flamme-forseglet i begge ender. Celler ble lyset og DNA denaturert ved inkubering ved 94°C i 30 sekunder; amplifisering ble utført ved anvendelse av 30 cykler av inkubering ved 94°C i 0 sekunder; 40°C i 0 sekunder og 72°C i 60 sekunder ved anvendelse av en RapidCycler Thermocycler (Idaho Technologies, Salt Lake City, UT). Prøver ble elektroforesert på en 1,0% TAE agarose-gel i 2 timer ved 100 v. Syv prøver ut av 17 testet viste et sterkt bånd ved 1100 basepar. Én koloni inneholdende dette plasmid (referert til her som pBMS2000-PPFDH) ble valgt for neste trinn i plasmidkonstruksjonen.
"PDHmod" angir en modifisert Thermoacitnomycetes intermedius fenylalanin-dehydrogenase som skiller seg fra den publiserte DNA-sekvens (Takada et al., J. Biochem. 109, s. 371-376 [1991]) ved en forandring av de siste to aminosyrer og ytterligere 12 aminosyrer ved karboksyl-terminus som er nødvendig for fullstendig omdannelse av (3-hydroksy-adamantan-l-yl)-okso-eddiksyre til (S)-amino-(3-hydroksy-adamantan-l-yl)-eddiksyre. Denne forandring ble innført i plasmid pPDH9K/10 (beskrevet i detalj i patent WO 200004179, bevilget til Donovan et al, 27. januar 2000), som deretter ble transformert inn i P. pastoris SMD1168 (deponert som stamme ATCC 74408).
Oligonukleotid-primere inneholdende 5'- og 3'-ende av PDHmod gen sammen med kompatible restriksjons-endonuklease-spaltningsseter ble fremstilt:
Reaksjonsbetingelser for amplifisering og rensning av PDHmod ved PCR var identisk med de anvendt for P. pastoris FDH-gen bortsett fra at kromosomalt DNA fremstilt fra ATCC 74408 ble inkludert som templat for reaksjonen. Det resulterende fragment ble fordøyet med 20 enheter hver av Ndel og Smal i 1 time ved 25°C, fulgt av 2 timer ved 37°C, i et totalt volum på 50 ul Parallelt ble en versjon av pBMS2000 vektor med et Ndel sete ved initieringskodonet (2 u.g) fordøyet med Ndel og Smal ved anvendelse av identiske betingelser. De fordøyede prøver ble separat elektroforesert på en 1,0% TAE agarosegel i 2 timer ved 100 v. Båndene svarende til PDHmod genet (1200 basepar fragment) og linearisert vektor (4700 basepar fragment) ble tatt ut fra gelen og renset ved anvendelse av QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Ligering av de to fragmenter, transformasjon avis. coli og screening for kolonier inneholdende insersjoner med PDHmod-gen (som danner pBMS2000-PDHmod) ble utført som beskrevet ovenfor.
For konstruksjon av pBMS2000-PPFDH-PDHmod, ble pBMS2000-PDHmod (2 u.g) spaltet med 10 U hver avHindm og Smal i en 50 u.L reaksjon i 1 time ved 25°C, fulgt av 1 time ved 37°C. Ti enheter av T4 DNA-polymerase (Invitrogen) og 2 u.L av en 2,5 mM blanding av alle fire deoksyribonukleosid-trifosfater ble tilsatt og prøven inkubert ved 11°C i 20 minutter. Reaksjonen ble elektroforesert på en 1,0% TAE agarosegel i 2 timer ved 100 v. 1800 basepar fragmentet ble tatt ut og isolert ved anvendelse av QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Dette fragment inneholder, i rekkefølge, taopromoter, groES gen og PDHmod gen (som en transkripsjonen fusjon). Deretter ble pBMS2000-PPFDH (2 u.g) fordøyet med 10 enheter restriksjons-endonuklease Smal i et 50 uL volum i 2 timer ved 25°C, deretter behandlet med 0,4 U reke alkalisk fosfatase (United States Biochemicals, Cleveland, OH) i 1 time ved 37°C. Plasmid DNA ble elektroforesert i 2 timer ved 100 v på en 1,0% TAE agarosegel, isolert og ekstrahert med QIAquick-settet. De to fragmenter ble ligert i et 6,5:1 (insersjon:vektor) molart forhold ved 16°C i 4 timer i et 10 u.L endelig volum. Etter 1-butanol-ekstraksjon og sentrifugering ble DNA transformert til elektrokompetente DHlOB-celler. Kanamycin-resistente kolonier ble screenet for tilstedeværelse av PDHmod-gen med de to PDHmod-spesifikke primere som tidligere beskrevet for FDH. En andre runde av PCR-screening ble utført ved anvendelse av DNA primere homologe med henholdsvis 5'-enden av PPFDH og 3'-enden av PDHmod genet. Bare de konstruksjoner som var i stand til å støtte amplifisering av et 1400 basepar fragment hadde de to gener i samme orientering. Ett slikt plasmid ble funnet og orienteringen bekreftet ved diagnostisk restriksjonsfordøyelse med Kpril, som ga de forventede fragmenter på 5422 og 1826 basepar. Dette plasmid ble betegnet "pBMS2000-PPFDH-PDHmod."
EKSEMPEL 2
Ekspresjon av FDH og PDHmod
pBMS2000-PPFDH-PDHmod ble transformert til Escheirchia coli JM110. I ristekolbe-undersøkelser, ble JM110(pBMS2000-PPFDH-PDHmod) dyrket i 18 timer ved 28°C, 250 rpm i MT5 medium (2,0% Yeastamin, 4,0% glycerol, 0,6% natriumfosfat [dibasisk], 0,3% kaliumfosfat [monobasisk], 0,125% ammoniumsulfat, 0,0256% magnesiumsulfat [heptahydrat; tilsatt etter autoklavering fra en steril IM løsning] og 50 ug/ml kanamycin sulfat [tilsatt etter autoklavering fra en filter-sterilisert 50 mg/ml løsning]). Den optiske densiteten ved 600 nm (OD600) ble registrert og celler tilstrekkelig til å gi en start OD600på 0,35 ble satt til friskt MT5/kanamycin-medium. Kolber ble ristet ved 250 rpm, 28°C inntil OD600var 0,8-1,0. Ekspresjon av begge gener ble fremkalt ved tilsetning av filter-sterilisert IM isopropyltio-P-D-galaktopyranosid (IPTG) til en endelig konsentrasjon på 35 uM og fermenteringen fortsatt i 24-48 timer. Celler ble pelletert ved sentrifugering ved 6.500 x g i 5 minutter, vasket én gang med et likt volum av 50 mM ammonium-formiat pH 7,0 og repelletert. Celler ble lagret frosset ved -20°C eller anvendt umiddelbart. Pelleten ble resuspendert i 50 mM ammoniumfosfat, pH 7,0 ved 10 ml/g våt cellevekt og ultralydbehandlet 3 x 15 sekunder ved anvendelse av en Fisher Scientific Model 50 Sonic Dismembrator (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), kraftinnstilling 15 med en mikrotip. Debris ble pelletert ved sentrifugering ved 13.000 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
Prøver ble oppvarmet ved 70°C i 10 minutter. En ml av en IM ditiotreitol-løsning ble satt til blandingen og 10 uL påført på en 10% NuPAGE™ Bis-tris polyakrylamid mini-gel. Elektroforese ble utført ved 200 v i 50-60 minutter og gelen merket i en løsning bestående av 0,1% (vekt/volum) Coomassie Blue (Sigma), 40% (volum/volum) etanol og 10% (volum/volum) eddiksyre. Gelen, nedsenket i merket, ble oppvarmet i en mikrobølgeovn inntil koking var åpenbar, deretter ristet ved 40 rpm på en orbital-shaker i 15 minutter. Gelen ble vasket grundig med avionisert vann og dekket med avmerkende løsning (GelClear™; Invitrogen). Løsningen ble igjen oppvarmet akkurat til kokepunktet og ristet forsiktig i minst 2 timer. To fremtredende bånd ved Mr 43.000 og 40.000 ble sett ved induksjon, svarende til den forventede molekylvekt til subenhetene av FDH og PDHmod. Prøver ble også funnet å ha både FDH- og PDH-aktiviteter når testet som beskrevet i Eksempler 4, 6 og 7. Denne rekombinante E. coli-stamme ble gitt den interne betegnelse SC 16496.
SC 16496 ble deretter fermentert med 15 og 250 liter volumer. For en 15 liter fermentering ble et medisinglass inneholdende 1 ml frosset SC 16496 tint ved romtemperatur og satt til 1 liter MT5 medium inneholdende 50 ug/ml kanamycin i en 4 liter kolbe. Kolben ble inkubert ved 28°C, 250 rpm i 24 timer og overført til 13 liter MT5 medium (bestanddeler porsjonert basert på et endelig volum på 15 L) i en Braun fermentator. Kanamycinsulfat og magnesiumsulfat-heptahydrat tilstrekkelig til å gi en endelig konsentrasjon på henholdsvis 50 ug/ml og 0,0246% ble oppløst i 500 ml destillert vann og filter-sterilisert gjennom en 0,2 mikron celluloseacetat-filtreringsenhet. Løsningen ble satt til tanken, umiddelbart fulgt av inokulum. Den innledende ODeoovar ca. 0,35.
Fermenterings- operasjonsparametere var som følger:
16 liter arbeidsvolum
Temperatur: 28°C
Ventilering: 1,0 wm
Trykk: 690 mbar
Agitering: 500 rpm
Kontroll av pH ved 6,8 med NH4OH som nødvendig
Skumming ble kontrollert ved tilsetning av UCON (en fluorkarbon løsningsmiddel-blanding produsert av Dow Chemical Company) som nødvendig.
Ved OD6000,8-1,0 (omtrent to timer etter inokulering) ble filter-sterilisert IPTG (oppløst i 500 ml CIH2O) tilsatt aseptisk, hvilket ga en endelig konsentrasjon på 35 uM. Fermenteringen fortsatte i ytterligere 48 timer, hvoretter innholdet av tanken ble subkjølt til 10°C. Celler ble oppsamlet ved sentrifugering og skyllet én gang med 0,1 vol 50 mM ammoniumformiat, pH 7,0. Cellepastaen ble plassert i plastbeholdere og lagret ved -70°C inntil den trengtes.
For 250 L tanker ble inokulum fremstilt som følger: 1 ml frosset SC 16496 ble tint og satt til 300 ml MT5 medium med 50 ug/ml kanamycin. Kolben ble dyrket ved 28°C, 250 rpm i 24 timer. OD600ble bestemt og det passende volum av celler, som gir 80 OD-enheter ble fjernet og satt til 250 ml friskt MT5 medium. Cellene ble aseptisk satt til 10 L av MT5/kanamycin medium i en Braun fermentator (innledende OD600~0,008) og dyrket under fermenterings-operasjonsparametrene beskrevet ovenfor i 16 timer. Kulturen ble deretter overført til 250 L av MT5 inneholdende de passende konsentrasjoner av kanamycin og magnesiumsulfat. Basert på 90 minutters doblingstid av SC 16496 under disse betingelsene skulle 10 L inokulum i 250 L gi en start OD600på 0,30-0,35. Induksjon, vekst, høsting og lagring ble utført som beskrevet for 15 L fermenteringen.
EKSEMPEL 3
Komprimert produksjon av (aS)-a-[[(l,l-dimetyletoksy)karbonyl]amino]-3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>] dekan-l-eddiksyre (Formel 3) fra 3-hydroksy-a-oksotricyklo-[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (Formel 1) gjennom (aS)-a-amino-3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (Formel 2) ved anvendelse av et isolert (delvis renset) PDH/FDH enzymkonsentrat
Trinn 1: Isolering av PDH/FDH enzymkonsentrat
Fermenteringsmedium (30 liter) av Escherichia coli JM110 (pBMS2000-PPFDH-PDHmod) ble oppnådd fra en 4000L tank-fermentering (fremstilt ved anvendelse av metoden lignende Eksempel 2) og ført gjennom en mikrofluidiserer (Microfluidics model M-l 10Y, som opererer trykk 840-1400 kg/cm<2>) (én passasje) for å frigjøre aktiviteten fra cellene mens temperaturen til mediet ble holdt under 40°. PDH/FDH-aktiviteten til det mikrofluidiserte medium var 32 IU/ML for PDH og 8 IU/ml for FDH.
For å klare hele mediet ble 4,5 kg av Celite satt til godt omrørt medium. Deretter ble 0,201 liter 30% vandig polyetylenimin tilsatt og blandet i 30 minutter. Blandingen ble deretter filtrert ved anvendelse av en filterpresse (Ertel Alsop modell 8-ESSC-10) og 18 liter filtrat ble oppnådd. Filterkaken ble vasket med 12 liter vann for å bringe volumet tilbake til 30 liter. Trinn-utbyttet var 97% aktivitet gjenvinning av PDH med en aktivitet på 31 IU/ml og en FDH aktivitet på 8 IU/ml.
Det klarede medium ble ultrafiltrert gjennom en 100.000 MWCO filterkasett (Millipore Pellicon 2 enhet, polyetersulfon lavprotein bindingskasett, 0,5 m2 filter- areal). Sirkulasjonshastigheten til pumpen var 400 ml/min. Det klarede filtrat ble konsentrert til 1,5 liter og ga et enzymkonsentrat med PDH-titer på 567 IU/ml og FDH-titer på 136 IU/ml. Permeatet ble undersøkt og ingen aktivitet ble funnet. Den totale enzymaktivitet-gjenvinning i konsentratet var 84%.
Trinn 2: Reduktiv aminering
3-hydroksy-a-oksotricyklo-[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (Formel 1) (1,00 kg; 4,46 mol) ble satt til et 20L kar fulgt av vann (5L). Blandingen ble omrørt og pH ble regulert til pH~8 med ION NaOH, hvilket ga en løsning. Darco KBB karbon (100 g) ble tilsatt og blandingen ble omrørt i 5 minutter og deretter filtrert gjennom en Buchner-trakt med 5u. filterpapir. Filteret ble vasket med vann (2xlL) og filtrat og vaskevæsker ble samlet, hvilket ga en klar løsning.
Med omrøring ble ammoniumformiat (0,562Kg; 8,92 mol) tilsatt og pH ble reregulert til -7,5 med 10N NaOH. Nikotinamid-adenin-dinukleotid (2,65 g) og ditiotreitol (1,54 g) ble tilsatt. Da de faste stoffene var oppløst ble PDH/FDH enzym-konsentrat tilsatt (1,03L; 500,000IU of PDH). pH ble igjen regulert til -8,0 med 10N NaOH ved omgivelsestemperatur.
Blandingen ble deretter oppvarmet til~40°C og fortynnet til et totalt volum på 1 OL med vann. pH ble holdt ved 7,7-8,3 under omrøring over 42 timer. Den resulterende løsningen inneholdt 0,955 kg (95,1%) av produktet (aS)-a-amino-3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (Formel 2).
Trinn 3: BO C-beskyttelse
Di-tert-butyl-dikarbonat (l,022kg; 4,68 mol) ble satt til en porsjon av løsningen av (aS)-a-amino-3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (Formel 2) (477,5 g; 2,12 mol). Denne blandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur, med pH regulert til og holdt ved 10 med en pH-stat titrator ved anvendelse av 10N NaOH. Reaksjonen var fullstendig 4 timer etter Boc20-tilsetning da det var mindre enn 1,0% utgangsmateriale igjen.
pH i blandingen ble regulert til~8 med 35% H2SO4og i-PrOAc (5,0L) ble satt til blandingen. pH i blandingen ble deretter regulert til 2,0 med 35% H2SO4og holdt ved denne pH i 5-10 min. Dicalite (250 g) ble tilsatt; blandingen ble omrørt i -lOmin
og deretter filtrert gjennom en pute av Dicalite (250 g) på filterpapir i en Buchner-trakt. Dicalite-puten ble videre vasket med 2,5L i-PrOAc.
Filtratet ble regulert til pH 8 med ION NaOH. Etter setning i 1 time ble det organiske laget omfattende grenseflate fjernet. Til det vandige laget ble i-PrOAc (7,5L) tilsatt. Blandingen ble surgjort med 35% H2SO4til pH~2 og deretter oppvarmet til og holdt ved~40°C i 4 timer med forsiktig omrøring. Lagene ble separert og den organiske ekstrakten ble spart. Det vandige laget med grenseflate ble ekstrahert med i-PrOAc (3,75L) og laget ble igjen separert etter 2 timer ved 40°C. Det vandige laget med grenseflate ble ekstrahert igjen med i-PrOAc (3,75L) og lagene ble separert etter 2 timer ved 40°C.
De samlede organiske ekstrakter (~15L) ble konsentrert ved destillasjon til~4,5L. Til denne løsningen ble heptan (~10L) deretter tilsatt over 10-15 min mens temperaturen ble holdt ved~82-89°C. Reaktormanteltemperaturen ble satt til 70°C og holdt ved denne temperatur i 1 time. Krystallisering skjedde kort etter avkjøling. Reaktormanteltemperaturen ble deretter satt til 40°C og holdt ved denne temperatur i 30 min.
Suspensjonen ble avkjølt til omgivelsestemperatur og deretter videre avkjølt til 0- 5°C. Etter én times omrøring ved 0-5°C ble produktet filtrert. Produktet ble vasket med heptan (2,5L), deretter tørket i vakuum ved 40°C, hvilket ga 607,0 g (88% utbytte) av (aS)-a-[[(1,1 -dimetyletoksy)karbonyl]amino]-3-hydroksytricyklo[3.3.1.13'7]dekan-1- eddiksyre (Formel 3).
EKSEMPEL 4
Fenylalanin-dehydrogenase Forsøk A Fenylalanin-dehydrogenase forsøk A inneholdt i 1 ml ved 40°C: 0,4 mM NADH, 5 mM natrium-fenylpyruvat, 0,75M NH4OH regulert til pH 8,75 med HC1. Absorbans-reduksjon ble overvåket ved 340 nm. Enzymaktivitet-enheter ble beregnet som umol/minutt basert på hastigheten av absorbans-forandring.
EKSEMPEL 5
Fenylalanin-dehydrogenase Forsøk B
Fenylalanin-dehydrogenase forsøk B inneholdt i 1 ml ved 40°C: 1 mM NAD, 10 mM L-fenylalanin, 0,1 M K2HP04 regulert til pH 10,0 med 1 N NaOH. Absorbans-økning ble overvåket ved 340 nm. Enzymaktivitet-enheter ble beregnet som u.mol/minutt basert på hastigheten av absorbans forandring.
EKSEMPEL 6
Fenylalanin-dehydrogenase Forsøk C Fenylalanin-dehydrogenase forsøk C inneholdt i 1,0 ml ved 40° C: 0,4 mM NADH, 50 mM 3-hydroksy-a-oksotricyklo[3.3.1.13'7]dekan-1 -eddiksyre (oppløst i 1 ekvivalent NaOH-løsning), 0,75M NH4OH regulert til pH 8,75 med HC1. Absorbans-reduksjon ble overvåket ved 340 nm. Enzymaktivitet-enheter ble beregnet som u.mol/minutt basert på hastigheten av absorbans-forandring.
EKSEMPEL 7
Formiat-dehydrogenase Forsøk
Formiat-dehydrogenase forsøk inneholdt i 1,0 ml ved 40°C: 1 mM NAD, 100 mM ammonium-formiat, 100 mM kaliumfosfatbuffer, pH 8,0. Absorbans-økning ble overvåket ved 340 nm. Enzymaktivitet-enheter ble beregnet som u.mol/minutt basert på hastighet av absorbans-forandring.
EKSEMPEL 8
Fremstilling av:
A. ZnCh-katalysert adamantyl-bromid- (Formel A) kobling
Et tørt kar ble fylt med 7,5 kg adamantyl-bromid. Metylenklorid (22,5 liter) ble deretter tilsatt ved romtemperatur for å oppløse det faste adamantan-bromid. Oppløsningen er endoterm så før neste trinn fikk temperaturen på reaksjonsblandingen returnere til 20°C. Reaksjonsblandingen ble deretter tilsatt sinkklorid (1,05 kg) og omrørt i omtrent 5 minutter ved 20°C. Reaksjonsblandingen ble deretter tilsatt tris(trimetylsiloksy)-etylen (15,3 kg) mens reaksjonstemperaturen ble holdt mellom 20 til 25°C og den resulterende blandingen ble omrørt i 2 timer. Etter denne blanding ble tris(trimetylsiloksy)-etylen (5,10 kg) tilsatt. Under denne tilsetning ble temperaturen holdt under 30°C. Reaksjonen ble holdt i ytterligere 12 til 15 timer ved 20 til 25°C, på hvilket tidspunkt reaksjonsblandingen ble fortynnet med metylenklorid (15 liter) og avkjølt til 0 til 5°C. Reaksjonsblandingen ble deretter behandlet, ved å begynne dråpevis, med halv-mettet NHÆl-løsning. Under tilsetningen ble temperaturen holdt under 30°C. En tykk suspensjon ble oppnådd. Til denne suspensjonen ble satt etylacetat (93,75 liter). Blandingen ble omrørt kraftig i 15 minutter og de organiske og vandige faser ble skilt. Det organiske laget ble lagret og det vandige laget ble vasket to ganger med etylacetat (18,75 liter i hver vask). Etylacetat-vasker og organisk lag ble deretter kombinert og vasket med vann (37,5 liter) fulgt av vann halvmettet med saltvann (37,5 liter). Det organiske laget ble separert igjen og inndampet for å danne krystaller. En løsningsmiddel-bytting til heptan ble deretter utført med et endelig volum på 22,5 liter. Den resulterende suspensjonen ble avkjølt til 5 til 10°C i 1 time og produktet a-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (Formel B) ble oppnådd ved filtrering. Utbytte av a-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (Formel B) var 6,96 kg (33,11 mol, 95%).
B. Forestring av a-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (Formel B)
for å danne ester med formel C
En inert atmosfære ble først dannet i reaktoren. Reaktoren ble deretter tilsatt metanol (35,00 liters) fulgt av a-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (Formel B) (14,00 kg) for å danne en suspensjon. Suspensjonen ble avkjølt til 0 til 5°C og acetylklorid ble tilsatt på en slik måte at temperaturen til reaksjonsblandingen ble holdt mellom 5 og 10°C. Etter fullføring av tilsetning av acetylklorid ble reaksjonsblandingen oppvarmet til 20 til 25°C og omrørt i 2 timer ved 20 til 25°C. Reaksjonsblandingen ble deretter konsentrert under vakuum ved 40°C og en tynn olje ble oppnådd. Oljen ble oppløst i etylacetat (71,96 liter) og bragt til romtemperatur. Den resulterende blandingen ble vasket to ganger i vann (28,78 liter hver vask) og de organiske og vandige lag ble separert etter hver vask. Det organiske laget ble lagret mens det vandige laget ble samlet og regulert til pH 9,5 med 3 N NaOH-løsning. De samlede vandige lag ble deretter ekstrahert to ganger med etylacetat (14,39 liter ved hver ekstraksjon). De organiske lag etter hver ekstraksjon ble separert og kombinert med det lagrede organiske lag. Disse kombinerte organiske lag ble deretter vasket med mettet natriumbikarbonat-løsning (28,78 liter) fulgt av saltvann (43,18 liter). Alle flyktige stoffer ble deretter fjernet under vakuum ved 40°C og en fargeløs til svakt gul olje som krystalliserte ved henstand ble oppnådd. Denne oljen inneholdt 13,29 kg (59,26 mol, 89%) a-hydroksytricyklo[3.3.l.l<3>'<7>]dekan-1-eddiksyre-metylester (Formel
C).
C. Swern-oksidasjon av a-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre-metylester (Formel C) for å danne a-oksotricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre-metylester (Formel D)
En trehalset kolbe (22 liter) ble utstyrt med en mekanisk rører, temperatur-probe og en tilsetningstrakt og spylt med nitrogen natten over. Oksalylklorid (500 ml, 5,73 mol) ble deretter tilsatt fulgt av CH2CI2(8 liter). Den resulterende løsningen ble avkjølt til -69°C med et aceton/tørris-bad. En løsning av dimetylsulfoksid (DMSO; 700 ml, 9,86 mol) ble deretter langsomt tilsatt over omtrent 30 minutter mens den indre temperatur ble holdt under -60°C. Løsningen ble omrørt i 20 minutter mens temperaturen ble holdt ved -60 til -70°C. En løsning av a-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre-metylester (Formel C) (990 gram, 4,42 mol) i CH2CI2(1,7 liter) ble deretter langsomt tilsatt over omtrent 30 minutter mens den indre temperatur ble holdt under -60°C . Den resulterende løsningen ble omrørt i 30 minutter. NEt3(3 liter, 21,5 mol) ble deretter tilsatt for å danne en tung oppslemning av trietylamin-hydrokloridsalt. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til romtemperatur og vann (1 liter) ble tilsatt for å oppløse trietyl-ammoniumsaltet (TEA-salt). Reaksjonsblandingen ble deretter overført til en rundbunnet kolbe og konsentrert ned for å fjerne diklormetan (DCM) og NEtø. EtOAc (12 liter) ble tilsatt og de resulterende vandige og organiske lag ble separert. Det organiske laget ble vasket tre ganger med vann (2 liter hver vask) fulgt av et saltvanns-vask (2 liter). Den organiske fasen ble deretter tørket over vannfri Na2S04med inndampning for å produsere et svakt gult fast stoff av a-oksotricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre-metylester (Formel D). Utbyttet var omtrent 104%.
D. Hydroksylering av a-oksotricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre-metylester (Formel D) til 3-hydroksy-a-oksotricyklo[3.3.1.13'7]dekan-l-eddiksyre-metylester (Formel la)
En Erlenmeyer-kolbe ble fylt med 95 til 98% H2S04(495 ml) og avkjølt i et isbad til 8°C. HN03(47,5 ml ved 50% fremstilt ved tilsetning av 50 ml 70% HN03til 30 ml vann) ble deretter satt til kolben og blandingen ble igjen avkjølt til 8°C i isbadet. Fast a-oksotricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre-metylester (Formel D) (100 gram, 0,45 mol) ble langsomt satt til blandingen i porsjoner over 30 til 60 minutter for å opprettholde en temperatur under 28°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt under avkjøling i isbadet. Utvikling av reaksjonen ble overvåket ved enten tynnskiktskromatografi (TLC) eller høyytelse væskekromatografi (HPLC). For TLC ble silikagel anvendt og løsningsmidlet var EtOAc/MeOH/heksan (9/1/10); KMn04. For HPLC ble en 4,6 x 50 mm, Cl 8, 3 mikron, 120 Ångstrøm kolonne anvendt med en gradient av 10% acetonitrilÆhO til 100% acetonitril i 7 minutter med en strømningshastighet på 2,5 ml/minutt. Overvåkning-bølgelengde var 200 nm. Da reaksjonen var fullstendig (etter omtrent 1 time) ble reaksjonen stanset ved tilsetning til kaldt vann (1,5 liter) og EtOAc (500 ml). Ytterligere vann og EtOAc (500 ml hver) ble tilsatt for å hjelpe separering av de vandige og organiske lag. Det vandige laget ble deretter ekstrahert med 3 aliquoter, 500 ml hver, av EtOAc. De organiske lag ble samlet og vasket med saltvann (400 ml). De vaskede organiske lag ble deretter konsentrert under redusert trykk til 130 gram av et gult olje-residuum inneholdende 3-hydroksy-a-oksotricyklo[3.3.1.13'7] dekan-1 -eddiksyre-metylester (Formel 1 a).
E. Hydrolyse av 3-hydroksy-a-oksotricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre-metylester (Formel la) til 3-hydroksy-a-oksotricyklo[3.3.1.13'7]dekan-l-eddiksyre (Formel 1)
Det gule oljeresiduet fra Del D ble oppløst i tetrahydrofuran (300 ml) og avkjølt i et isbad til 5°C. Én liter IN natriumhydroksid ble langsomt satt til løsningen for å regulere pH til omtrent 7 mens temperaturen ble holdt under 30°C. Ytterligere 500 ml IN NaOH ble deretter tilsatt for å regulere pH til omtrent 14. Reaksjonsblandingen ble deretter omrørt under avkjøling i et isbad og forløpet ble overvåket ved TLC eller HPLC som beskrevet i Eksempel 23. Da reaksjonen var fullstendig etter omtrent 30 minutter ble EtOAc (500 ml) tilsatt og de vandige og organiske lag ble separert. Det vandige laget ble vasket med ytterligere 500 ml EtOAc. Det vandige laget ble surgjort med konsentrert HC1. Da løsningen nådde pH 7, ble EtOAc (500 ml) tilsatt fulgt av mer konsentrert HC1 inntil pH nådde 0,7. Totalt konsentrert HC1 tilsatt var 150 ml. Det vandige laget ble deretter ekstrahert med EtOAc (4 x 400 ml) og de samlede organiske lag ble vasket med 400 ml vann fulgt av 400 ml saltvann. De vaskede organiske lag ble deretter tørket med MgS04og konsentrert. Utbyttet var 88 gram av et lysegult, fast stoff. Oppløsning av dette faste stoffet i 100 ml EtOAc og 300 ml heptan med omrøring i 30 minutter fulgt av filtrering og lufttørking ga 85 gram av et gyldenbrunt, fast stoff (85% 3-hydroksy-a-oksotricyklo[3.3.l.l<3>'<7>]dekan-1-eddiksyre (Formel 1)).
E'. Fremstilling av 3-hydroksy-a-oksotricyklo-[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (Formel 1) ved anvendelse av en ett-kar prosedyre
1. Fremstilling av diklor-(3-hydroksy-adamantan-l-yl)-eddiksyre-metylester (Formel VHI)
Fremstilling av 10 N HN03: En 100 ml volumetrisk kolbe ble fylt med kons. HN03(88,25 g, -62,58 ml, -1,0 mol) og avkjølt i et isbad. Vann (35 ml) ble tilsatt. Etter at varmen fra blandingen var forsvunnet, fikk løsningen oppvarmes til romtemperatur. Kolben ble deretter fylt opp til merket med vann, hvilket ga 10 N HNO3.
En 250 ml trehalset kolbe utstyrt med et termoelement termometer ble fylt med kons. H2S04(103 g, -56 ml,). Etter avkjøling til 0,4°C i et isbad ble 10 N HN03(5,68 ml, 56,8 mmol) tilsatt over -30 minutter. Da temperaturen til denne syreblandingen var senket til ~1,0°C ble kjølebadet fjernet. Adamantan-l-yl-diklor-eddiksyre-metylester med formel VU (15,0 g, 54,11 mmol; malt lett i morter/støter for å bryte opp store biter/krystaller) ble tilsatt porsjonsvis (1,25 g hver 10 minutter; 1 time 50 minutter tilsetningstid). Etter -5 timer ble reaksjonsblandingen en klar, blekgul løsning.
Etter omrøring i -24 timer ble reaksjonsblandingen en meget blekgul løsning. En firehalset Morton kolbe (1 L) utstyrt med en mekanisk rører og termoelement termometer ble fylt med vann (250 ml) og urinstoff (8,0 g, 0,133 mol, -2,34 ekvivalenter i forhold til HN03). Til den resulterende løsningen ble satt etylacetat (230 ml). Resulterende bifasisk blanding ble avkjølt til~1,0°C i et isbad. Reaksjonsblandingen fra ovenfor ble tilsatt over -15 minutter, til den kalde EtOAc/vann/urinstoff-blanding. Overføringen ble fullført ved anvendelse av ytterligere etylacetat og vann (-50 ml hver). Etter omrøring i -45 minutter ble kjølebadet fjernet og blandingen fikk oppvarmes med omrøring. Etter omrøring i 4,5 timer (fra start av behandlingen) ble den resulterende blandingen overført til en separasjonstrakt (IL) ved anvendelse av ytterligere etylacetat (-100 ml) for å fullføre overføringen. Den vandige fraksjon ble fjernet og ekstrahert med etylacetat (1 x 80 ml). De organiske fraksjoner ble samlet og vasket med vann (2 x 90 ml), 1 N NaHC03(4 x 90 ml) og saltvann. Etter tørking over vannfritt magnesiumsulfat ble løsningsmidlet fjernet ved redusert trykk, hvilket ga diklor-(3-hydroksy-adamantan-l-yl)-eddiksyre-metylester med formel VEI som et nesten fargeløst, fast stoff: 15,67 g (98,7% urenset utbytte). Dette rå materialet kan anvendes for å fremstille diklor-(3-hydroksy-adamantan-l-yl)-eddiksyre med formel IX uten rensning. Om ønsket kan imidlertid det rå materialet (15,65 g) omkrystalliseres fra metanol (102 ml) og vann (85 ml), hvilket gir et dunaktig bomull-lignende fast stoff (Sm.p. 114,8-115,0°C) med 91% gjenvinning.
Element-analyse: C13H18CI2O3:
Beregnet: C, 53,25; H, 6,18; Cl, 24,18%
Funnet: C, 53,24; H, 6,24; Cl, 24,31%<*>H NMR (500,16 MHz, CDCI3) 5 3,857 (s, 3H), 2,298 (br m, 2 H), 1,824 (s, 2 H), 1,793 (d, 4 H, =2,75 Hz), 1,682,1,629 (br AB q, 4 ;H), 1,529 (m, 3 H) ppm;<13>C NMR (127,78 MHz, CDC13)8 165,929, 94,281, 68,932, 54,150, 44,47 8, 44,529, ;44,020, 35,750, 34,759, 30,149 ppm ;Lab HPLC:;YMC ODS-A S3 120 Å (4,6 x 50 mm), X=200 nm, 2,5 ml/minutt Løsningsmidler: A = 0,2% H3PO4i vann ;B = 90% CH3CN i vann;Gradient: 20% A til 100% B over 10 minutter; ; 2. Fremstilling av 3-hydroksy-a-oksotricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre ;En 250 ml trehalset kolbe utstyrt med en trykk-utjevnende tilsetningstrakt og argoninnløp ble fylt med diklor-(3-hydroksy-adamantan-l-yl)eddiksyre-metylester (Formel VIII), fremstilt som beskrevet i Trinn 1 ovenfor (15 g, 51,16 mmol) fulgt av tilsetning av tetrahydrofuran (30 ml, ustabilisert). Etter omrøring i mange minutter var mesteparten av formel VIII metylester oppløst, hvilket ga en uklar løsning. Til denne løsningen ble satt destillert vann (30 ml) og en løs suspensjon ble dannet. Tilsetnings-trakten ble fylt med IN NaOH (69 ml, 69 mmol,~1,35 ekv i forhold til Formel Vm forbindelse innført). NaOH ble tilsatt dråpevis over 70 minutter, hvilket ga en nesten fargeløs løsning som ble omrørt ved omgivelsestemperatur. ;HPLC-analyse etter~16 timer viste at hydrolyse av formel Vm forbindelsen var fullstendig. Reaksjonsblandingen, en klar fargeløs løsning med en pH på 13,24, ble regulert til pH 7,40 ved tilsetning av~6N HC1 (2,8 ml). Fast NaHCOs (11,2 g, 0,133 mol., 2,60 ekv) ble tilsatt for å danne en suspensjon. ;HPLC-analyse etter oppvarmning i 4 timer 15 min viste at reaksjonen var fullstendig. Etter oppvarmning i 5 timer ble varmekilden fjernet og reaksjonsblandingen (klar, fargeløs løsning) fikk avkjøles. Etter avkjøling til romtemperatur ble reaksjonsblandingen lagret i et kjøleskap (+4°C) i 4 dager. ;Etter lagring kaldt i 4 dager var reaksjonsblandingen fortsatt en klar fargeløs løsning og HPLC-analyse viste liten, om noen, forandring etter lagring. Etter oppvarmning til romtemperatur ble blandingen (pH 7,77) surgjort til pH 0,20 ved forsiktig tilsetning av kons. HC1 (11 ml nødvendig, C02utvikling; ved pH -1,40 begynte et fargeløst, fast stoff å felles ut). Den resulterende suspensjonen ble ekstrahert med EtOAc (x 4, -500 ml totalt volum; HPLC-analyse utført på vandig fraksjon etter hver EtOAc-ekstraksjon). Det vandige laget (pH 0,38) etter 1. EtOAc-ekstraksjon ble regulert til pH 0,18 ved tilsetning av kons. HC1 (-1,6 ml nødvendig). Det vandige laget (pH 0,37) etter den 2. EtOAc-ekstraksjon ble regulert til pH 0,17 ved tilsetning av kons. HC1 (-0,8 ml nødvendig). Det vandige laget trengte ingen ytterligere pH-justering etter de resterende EtOAc-ekstraksjoner (ekstraksjon #3, pH 0,19; ekstraksjon #4, pH 0,19). De organiske fraksjoner ble samlet. Etter tørking (MgS04) ble løsningsmidlet fjernet ved redusert trykk, hvilket ga rå tittel Formel II forbindelse som et nesten fargeløst, granulært fast stoff som ble tørket under vakuum (pumpe) i 16 timer: 11,42 g (99,53% utbytte); HPLC, 100% (areal %). ;Element-analyse: C12H16C1203[55465-020-31, TR46373] ;Beregnet: C, 64,27%; H, 7,19%;Funnet: C, 64,19%; H, 7,09%;Rå Formel la forbindelse (5,0 g) ble oppløst med oppvarmning til~85°C i destillert vann (19 ml), deretter fjernet fra varmekilden og fikk avkjøles. Ved ~53°C begynte materialet å krystallisere. Etter henstand ved romtemperatur i -2 timer ble det faste stoffet oppsamlet ved filtrering og vasket med iskaldt vann. Mesteparten av vannet ble fjernet ved å trekke nitrogen gjennom filterkaken. Materialet ble deretter tørket under vakuum (pumpe) i 17 timer, hvilket ga tittel Formel la forbindelsen som store, fargeløse nåler: 4,33 g (86,6% gjenvinning); Sm.p. 164,5-165,6°C (på Mettler FP800 system); HPLC, 100% (areal %). ;Element-analyse: C12H16C1203[55465-023-15, TR46905] ;Beregnet: C, 64,27%; H, 7,19%;Funnet: C, 64,42%; H, 7,04%;F. Forestring av L-pyroglutaminsyre (Formel E) for å danne L-pyroglutaminsyre-etylester (Formel F) ;Et reaksjonskar ble fylt med etanol (49,0 liter) og avkjølt til -5°C. Reaksjonskaret ble deretter fylt med tionylklorid (4,97 kg) på en slik måte at temperaturen til blandingen ikke oversteg 0°C. Etter fullstendig tilsetning av tionylkloridet ble blandingen avkjølt igjen til -5°C og L-pyroglutaminsyre (Formel E) ble tilsatt porsjonsvis slik at temperaturen ble holdt mellom 0 og -5°C under tilsetningen. Etter tilsetning av syren ble reaksjonsblandingen oppvarmet til 20 til 25°C og omrørt i 5 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter inndampet under vakuum (T maks 45°C) til omtrent 15% av dens opprinnelige volum. Den gjenværende oljen ble deretter oppløst i toluen (49 liter). Toluenløsningen ble deretter avkjølt til omtrent 10°C og trietylamin (8,45 kg) ble tilsatt langsomt slik at maksimal temperatur var mellom 20 og 25°C. Den resulterende suspensjonen ble omrørt i 30 minutter og deretter filtrert. Filterkaken ble vasket med toluen (ca. 5 liter). Filtratet ble redusert ved 50°C under vakuum til et totalt volum på ca. 10 liter. Krystallisering ble initiert ved langsom tilsetning av cykloheksan (8 liter) ved 50°C og påfølgende avkjøling til omtrent 30°C. Etter kim-dannelse ble blandingen avkjølt til 20 til 25°C og tilsatt en andre 8 liter porsjon av cykloheksan. Blandingen ble deretter avkjølt til 6 til 8°C, omrørt i én time og de resulterende krystaller ble filtrert fra. Krystallene ble vasket to ganger med cykloheksan (4 liter hver vask). Utbyttet var 4,89 kg (82%) L-pyroglutaminsyre-etylester (Formel F) som fargeløse nåler. ;G. BOC-beskyttelse av L-pyroglutaminsyre-etylester (Formel G) L-pyroglutaminsyre-etylester (Formel F) (5,00 kg) ble oppløst ved romtemperatur i toluen (24,97 liter). 4-dimetylaminopyridin (0,19 kg) ble deretter satt til løsningen. Reaksjonsblandingen ble deretter tilsatt en løsning av BOC-anhydrid (7,29 kg) oppløst i toluen (24,97 liter) på en slik måte at reaksjonstemperaturen ikke oversteg 25°C. Etter fullstendig tilsetning ble reaksjonen omrørt i tre timer ved 25°C. Reaksjonsblandingen ble deretter tilsatt halvmettet NaHC03-løsning (49,94 liter) og omrørt kraftig i 10 minutter før separering av de organiske og vandige faser. Det separerte organiske lag ble vasket to ganger med vann (24,97 liter hver). Det organiske laget ble deretter inndampet fra løsningsmiddel under vakuum ved et maksimum på 50°C. Den gjenværende fargeløse til svakt gulaktige olje krystalliserte ved henstand. Det teoretiske utbytte var 8,18 kg (31,81 mol) av (5S)-2-oksopyrrolidin-l,5-dikarboksylsyre, l-(l,l-dimetyletyl), 5-etylester (Formel G). ;H. Superhydrid reduksjon og eliminering ;(5S)-2-oksopyrrolidin-l,5-dikarboksylsyre, l-(l,l-dimetyletyl),5-etylester (Formel G) (4,80 kg) ble oppløst i toluen (30,97 liter; Kf maks 0,01% vann) og avkjølt til -50°C. Denne løsningen ble fylt med Superhydrid (LiEt3BH 1 M i THF; 19,96 liter) på en slik måte at reaksjonstemperaturen ikke oversteg -45°C. Etter fullstendig tilsetning ble blandingen omrørt ved -45 til -50°C i 30 minutter. N-etyldiisopropylamin (DIPEA; 14,47 liter) ble deretter satt til reaksjonsblandingen på en slik måte at temperaturen ikke oversteg -45°C. Dimetylaminopyridin (0,030 kg) ble tilsatt som et fast stoff til blandingen. Reaksjonsblandingen ble deretter tilsatt trifluoreddiksyreanhydrid (TFAA) (4,70 kg) på en slik måte at reaksjonstemperaturen ikke oversteg -45°C. Etter fullstendig tilsetning ble reaksjonsblandingen oppvarmet til 20 til 25°C innen én time og holdt i ytterligere 2 timer ved denne temperatur. Reaksjonsblandingen ble deretter avkjølt til 0°C og langsomt tilsatt vann (48,00 liter) slik at reaksjonstemperaturen ikke oversteg 5°C. Vandige og organiske faser ble deretter separert og den organiske fasen ble igjen vasket med 48 liter vann (0 til 5°C). Det organiske lag ble deretter inndampet og avgasset ved 40°C. En gulaktig olje ble oppnådd i et utbytte på 4,5 kg (18,66 mol, 100%) av 4,5-dihydro-lH-pyrrol-l,5-dikarboksylsyre, l-(l-dimetyletyl), 5-etylester (BOC-DHPEE) (Formel G'). ;I. Hydrolyse av BOC-DHPEE (Formel G');En løsning fremstilt fra 4,5-dihydro-lH-pyrrol-l,5-dikarboksylsyre, 1-(1,1-dimetyletyl), 5-etylester (BOC-DHPEE) (Formel G') (6,00 kg) og etanol (24,00 liter) ble avkjølt til 0 til 5°C og langsomt behandlet ved denne temperatur med en løsning av litiumhydroksid-hydrat (2,09 kg) i vann (20,87 liter) for å produsere en uklar løsning. Denne uklare løsningen ble deretter oppvarmet til 20 til 25°C og omrørt i 2 timer ved denne temperatur. Reaksjonsblandingen ble deretter inndampet til et volum på omtrent 10,5 liter ved en maksimumstemperatur på 40°C under vakuum og tilsatt vann (24,00 liter) og t-butylmetyleter (TBME eller MTBE), (24 liter) og blandet i 10 minutter. De resulterende organiske og vandige faser ble separert og den vandige fasen ble igjen tilsatt 24 liter TMBE. Denne blandingen ble deretter avkjølt til 5 til 10°C og pH ble regulert til 2,3 til 2,3 ved anvendelse av H3PO485%-vann (1:4) mens den ble kraftig omrørt. Temperaturen ble holdt under denne prosessen ved 5 til 10°C for stabilitet. De resulterende organiske og vandige lag ble separert. Det organiske laget ble lagret og det vandige laget ble igjen ekstrahert med 24 liter forhånds-avkjølt TBME ved 5 til 10°C. Det resulterende organiske lag ble kombinert med det lagrede organiske lag og tilsatt diisopropyletylamin (DIPEA) (4,82 kg). Løsningen ble deretter inndampet og avgasset ved en maksimumstemperatur på 30°C under vakuum. Utbyttet var 7,84 kg (22,88 mol, 92%) [N-BOC dehydroprolin<*>DIPEA (BOC-DHP)].
J. Amid-dannelse på BOC-DHP
BOC-DHP, syntetisert ved forsåpning som beskrevet i Del I kan inneholde vann. Derfor ble en azeotrop destillering med toluen anvendt før kjøring av reaksjonen. Imidlertid, på grunn av overskudd av reagenser, ble beregning av råmaterialer basert på mengden av BOC-DHP før fjerning av noe vann. For azeotrop destillering ble BOC-DHP fortynnet med toluen til en omtrentlig 30% løsning. Toluen ble fjernet under vakuum ved 40°C. Behandlet BOC-DHP (6,00 kg) ble deretter oppløst i THF (48,0 liter). Løsningen ble fylt med DIPEA (2,26 kg) og reaksjonsblandingen ble avkjølt til -20 til -25°C. Mesylklorid (3,01 kg) ble deretter tilsatt langsomt. Under denne tilsetningen utfelles DIPEA-hydroklorid. Den resulterende suspensjonen ble deretter omrørt i 2 timer ved -20°C fulgt av metning med ammoniakk via et sub-overflate gassinnløp. Under tilsetning av ammoniakken ble reaksjonsblandingen oppvarmet til 0°C. Etter metning ble reaksjonsblandingen oppvarmet til 20°C og omrørt i 3 timer. Etter omrøring ble reaksjonsblandingen filtrert for å fjerne hydroklorid. Filterkaken ble vasket med THF (12 liter) i mange porsjoner. Filtratet ble konsentrert under vakuum ved en maksimumstemperatur på 40°C og deretter oppløst i metylenklorid (33,33 liter). Løsningen ble vasket med vann (26,66 liter). De resulterende organiske og vandige faser ble separert og den vandige fasen ble ekstrahert to ganger med metylenklorid (20 liter hver). De resulterende organiske lag ble samlet og konsentrert under vakuum og avgasset for å fjerne eventuelt overskudd av Hiinigs base. Utbyttet var 3,35 kg (15,77 mol, 90%) av (5S)-5-aminokarbonyl-4,5-dihydro-lH-pyrrol-l-karboksylsyre, 1-(1,1-dimetyletyl) ester (BOC-DHPA) (Formel G").
K. Cyklopropanering av (5S)-5-aminokarbonyl-4,5-dihydro-lH-pyrrol-l-karboksylsyre-l-(l,l-dimetyletyl)ester (Formel G")
En første reaktor, Reaktor A, ble fylt med BOC-DHPA (Formel IV) (4 kg) oppløst i metylenklorid (18,0 liter) og holdt ved 20°C. En andre reaktor, Reaktor B, ble fylt med metylenklorid (18,00 liter) og avkjølt til -30°C. Reaktor B ble deretter tilsatt dimetoksyetan (DME) (3,36 kg), fulgt av en 30% løsning av dietylsink (15,36 kg) i toluen, mens temperaturen ble holdt mellom -30 og -25°C. Reaktor B ble deretter tilsatt dijodmetan (19,99 kg) mens reaksjonstemperaturen ble holdt mellom -30
og -25 °C. Etter fullstendig tilsetning av dijodmetanet ble blandingen omrørt i 45 minutter ved -30 til -25°C. Denne blandingen ble deretter satt til Reaktor A via et avkjølt rør (-20 til -25°C). Tilsetning ble utført langsomt i porsjoner på omtrent 5% slik at reaksjonstemperaturen i Reaktor A ble holdt mellom 22 og 24°C inntil reaksjonen var fullført. Etter fullføring av reaksjonen ble blandingen i Reaktor A avkjølt til 5 til 10°C. Reaksjonsblandingen ble deretter langsomt tilsatt mettet bikarbonat-løsning (21,6 liter) på en slik måte at reaksjonstemperaturen ikke oversteg 15°C. Etter denne tilsetning ble reaksjonsblandingen omrørt i minst én time mens et presipitat ble dannet. Suspensjonen ble filtrert. Den resulterende filterkake ble overført tilbake til karet, oppslemmet igjen med metylenklorid (14,4 liter) i 30 minutter; og re-filtrert. Etter denne andre filtrering ble filterkaken vasket ved tilsetning av metylenklorid (7,2 liter). Filtratene ble deretter separert i vandige og organiske faser og den organiske fasen ble vasket med halvmettet saltvann (21,6 liter).
Løsningsmiddel ble deretter fjernet med vakuum ved en maksimumstemperatur på 30°C og byttet med heptan. En oppslemning av råprodukt i heptan ble oppnådd. Endelig volum av suspensjonen etter løsningsmiddel-bytting var 14,4 liter. Råproduktet ble isolert ved filtrering. Filterkaken ble vasket med heptan (2,9 liter) og deretter tørket under vakuum til konstant vekt. Det urensede utbytte var 2,76 kg (12,2 mol, 72%) [lS-(la,3p,5a]-3-aminokarbonyl)-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-2-karboksylsyre, 1,1-dimetyletylester (Formel H). For rensing ble det rå materialet oppslemmet i 8 ganger mengden av en 1:1 blanding av butylacetat/heptan ved 20 til 22°C i 4 timer. Materialet ble filtrert og filterkaken ble vasket med omtrentlig 1 gang mengde av heptan. Utbyttet var 2,11 kg (9,33 mol, 55%) [lS-(la,3p,5a]-3-aminokarbonyl)-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-2-karboksylsyre-1,1 -dimetyletylester (Formel H).
L. Avbeskyttelse av [lS-(la,3p,5a)]-3-(aminokarbonyl)-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-2-karboksylsyre-l,l-dimetyletylester (Formel H) for å danne (lS,3S,5S)-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-3-karboksamid (Formel
<J>)
En 100 ml, 2-halset kolbe utstyrt med en mekanisk rører og et termoelement ble fylt med [lS-(la,3p,5a]-3-aminokarbonyl)-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-2-karboksylsyre-1,1-dimetyletylester (Formel H) (5,0 gram, 22,1 mmol) og THF (20 ml). HC1 (2,5 M i EtOAc, 25 ml, 62,5 mmol) ble deretter satt til suspensjonen. Den resulterende løsningen ble omrørt ved romtemperatur i 18 timer i løpet av hvilken tid utfelling ble observert. Fullføring av reaksjonen ble overvåket ved HPLC. Metyl-t-butyleter (MTBE ) (30 ml) ble satt til suspensjonen og omrøring ble fortsatt i ytterligere 30 minutter. Suspensjonen ble deretter filtrert under N2-beskyttelse for å produsere et hvitt, fast stoff som ble vasket med MTBE (20 ml). Det faste stoffet ble tørket i en ovn under redusert trykk i 48 timer, hvilket ga hydrokloridsaltet av (lS,3S,5S)-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-3-karboksamid (Formel J; 3,6 gram, 100%).
M. BOC-beskyttelse av (aS)-a-amino-3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (Formel 2) for å danne (aS)-a[[(l,l-dimetyletoksy)-karbonyl] amino]-3-hydroksytricyklo [3.3.1.13'7] dekan-l-eddiksyre, Formel 3 syre
En foretrukket metode for fremstilling av den frie syren (Formel 3) er beskrevet i Eksempel 3. Alternativt kan den følgende metode anvendes for å fremstille den frie syren: (aS)-a-amino-3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (Formel 2) (469 gram, 2,08 mol) ble oppløst i iskald IN NaOH (5 liter, 5 mol, 2,4 ekvivalenter) i en faseseparator utstyrt med en temperatur probe og en pH probe. THF (2,5 liters) ble satt til løsningen. Fast B0C2O ble deretter tilsatt og reaksjonsblandingen ble omrørt ved omgivelsestemperatur i omtrent 1 time. EtOAc (4 liter) ble deretter tilsatt med omrøring og de resulterende organiske og vandige lag ble separert. pH i det vandige laget ble regulert til 7 med konsentrert HC1. EtOAc (4 liter) ble deretter tilsatt og ytterligere HC1 ble tilsatt for å senke pH til omtrent 1. Det totale volumet av konsentrert HC1 tilsatt var 510 ml. De organiske og vandige lag ble igjen separert og det vandige laget ble ekstrahert med EtOAc (3x3 liter). De organiske lag ble deretter kombinert og vasket med vann (3 liter) og saltvann (3 liter). Det vaskede organiske lag ble deretter tørket med Na2S04og konsentrert på en rotovap ved romtemperatur inntil tørrhet. Utbyttet var 542 gram av (aS)-a[[(l,l-dimetyletoksy)karbonyl]amino]-3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (Formel 3).
N. Koblings reaksjon for å produsere 3-cyano-(aS)-a-(3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3-7>]dec-l-yl)-p-okso-(lS,3S,5S)-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-2-etankarbaminsyre-l,l-dimetyletylester (Formel
K)
En 2 L trehalset kolbe utstyrt med et termometer, en mekanisk rører og et gass-innløp ble fylt med (aS)-a[[(l,l-dimetyletoksy)karbonyl]amino]-3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dekan-l-eddiksyre (Formel 3) (50 gram, 153,8 mmol). THF (200 ml) ble tilsatt og omrørt for å produsere en klar løsning. Løsningen ble avkjølt til -6°C i et aceton-tørris-vannbad. Metansulfonylklorid (Mes-Cl) (13,1 ml, 169 mmol, 1,1 ekvivalent) ble deretter tilsatt som en enkel porsjon fulgt av diisopropyletylamin (94 ml, 539 mmol, 1,1 ekvivalent). Diisopropyletylaminet ble tilsatt langsomt over en periode på ca. 4 minutter for å holde den indre temperatur under 8°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0°C inntil all syre var omdannet til blandet anhydrid. (lS,3S,5S)-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-3-karboksamidhydrokloridsalt (32,5 gram, 200 mmol, 1,1 ekvivalent) og hydroksybenzotriazol (HOBT) (1,04 gram, 7,6 mmol, 0,05 ekvivalenter) ble deretter tilsatt i en enkel porsjon og kolben ble fjernet fra kjølebadet. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer og fikk deretter stå natten over ved romtemperatur.
O. Dehydratisering og hydrolyse for å produsere 3-cyano-(aS)-a-(3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3-7>]dec-l-yl)-p-okso-(lS,3S,5S)-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-2-etankarbaminsyre-l,l-dimetyletylester (Formel
L)
Pyridin (6 ekvivalenter, 922 mmol, 74,6 ml) ble satt til reaksjonsblandingen fra Del N og reaksjonsblandingen ble avkjølt i et kjølebad til -8°C.
Trifluoreddiksyreanhydrid (TF A A) (4 ekvivalenter, 616 mmol, 87 ml) ble deretter tilsatt langsomt over 6 minutter mens temperaturen ble holdt under 10°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 24°C i 0,5 time og kontrollert ved HPLC (30 ml, 0,5 ml AcN, 0,5 ml H2O) for forsvinning av Del N Forbindelse K.
Reaksjonsblandingen ble deretter avkjølt i et kjølebad til omtrent -3°C. NaOH (5 N, 6 ekvivalenter, 0,925 mol, 185 ml) ble satt til reaksjonen over 10 minutter (vandig pH = 9,9) mens reaksjonstemperaturen ble holdt under 10°C. Vandig K2CO3(319 gram, 15 ekvivalenter, oppløst i 510 ml H2O) ble tilsatt over 5 minutter (temperatur = 8°C, vandig pH 11,1). Reaksjonen fikk løpe i 7 timer 40 minutter. Reaksjonen var fullstendig da alle mellomprodukter var hydrolysert til penultimate som bestemt via HPLC (30 ul, 0,5 ml AcN, 0,5 ml H20).
EtOAc (500 ml) ble deretter satt til reaksjonsblandingen og de resulterende vandige og organiske lag ble separert. Det organiske laget ble vasket med 500 ml bufferløsning (2M H3PO4, IM NaH2P04). Temperaturen steg til 23°C fra 15°C; tilsetningstid: 5 min., vandig V = 560 ml pH = 4,5, 32 mg produkt ved HPLC; org V = 1,080 ml. Det organiske laget ble vasket med en andre 500 ml bufferløsning; vandig V = 780 ml, pH = 2,5, 415 mg produkt ved HPLC; organisk V = 800 ml, 1,02 volum/volum% pyridin. Det organiske lag ble vasket med 300 ml saltvann; vandig V = 350 ml, pH = 1,8, 20 mg produsert ved HPLC. Det organiske lag ble vasket med 130 ml mettet NaHC03-løsning; vandig V = 176 ml, pH = 6,0, 780 mg produkt. Det organiske lag ble vasket med 300 ml halvmettet saltvann; vandig V = 330 ml, pH = 5,2, 25 mg produkt; organisk V = 650 ml, pyridin 0,045 volum/volum%. 5 g Darco ble satt til det organiske lag og omrørt i 5 min, filtrert gjennom 50 g silika, vasket med 4 x 25 ml EtOAc, organisk V = 750 ml, pyridin 0,04 volum/volum%.
Det organiske laget ble deretter destillert til omtrent 133 ml. Det organiske laget ble omrørt i 1 time inntil løsningen ble uklar. 133 ml heptan ble tilsatt over 15 min. og oppslemningen omrørt natten over. 133 ml heptan ble tilsatt natten over. Blandingen ble omrørt kraftig i 20 minutter med mekanisk omrøring. De faste stoffene ble filtrert fra og kaken ble vasket med 50 ml 5% EtOAc/heptan; 3,4 g produkt ble funnet i 8,86 g råmateriale etter fjerning av løsningsmidler fra moderluten. Tørre produktkrystaller ble oppvarmet ved 50°C under vakuum natten over. 467 g produkt ble oppnådd -73%, 96,6 AP.
P. Avbeskyttelse for å produsere (lS,3S,5S)-2-[(2S)-2-amino-2-(3-hydroksytricy klo [3.3.1 .l3'7] dec- 1-yl)- 1-oksoetyl] -2-azabicyklo [3.1.0] heksan-3-karbonitril, benzoat (1:1) (Formel M)
3-cyano-(aS)-a-(3-hydroksytricyklo[3.3.1.1<3>'<7>]dec-l-yl)-p-okso-(lS,3S,5S)-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-2-etankarbaminsyre-l,l-dimetyletylester (Formel L) (5,0 gram, 12,04 mmol) ble satt til en trehalset kolbe utstyrt med et termometer, en mekanisk rører og et gassinnløp. EtOAc, omtrent 45 til 50 ml, ble tilsatt for å oppnå en klar løsning. Konsentrert HC1 (3,00 ml, 37% vekt/vekr%, 36,14 mmol, 3 ekvivalenter) ble tilsatt ved romtemperatur og reaksjonsblandingen ble omrørt inntil et fast stoff ble produsert. Vann (30 ml) ble deretter tilsatt og blandingen ble omrørt i 1 til 2 minutter. Denne reaksjonsblandingen ble overført til en separasjonstrakt og lagene i reaksjonsblandingen fikk separere til en ren fase separasjon. Det vandige laget ble regulert til en lavere pH på omtrent 6 med 25% NaOH mens temperaturen ble holdt under 25°C.
Salt-utbytting ble deretter utført ved tilsetning av isopropylalkohol (IPA; 2 til 3 ml) til det vandige laget fulgt av tilsetning av natriumbenzoat (0,65 ml av en natrium benzoat-løsning fremstilt ved oppløsning av 2,6 gram av natriumbenzoat i 6,5 ml vann). Den resterende natriumbenzoat-løsning ble deretter tilsatt dråpevis via en tilsetningstrakt. Den resulterende reaksjonsblanding ble omrørt ved romtemperatur i 16 til 24 timer. Faste stoffer i reaksjonsblandingen ble deretter filtrert på en Buchner-trakt og vasket med vann inntil det faste stoffet ga en negativ test for Cl- med AgNCb. De faste stoffene ble deretter vasket med heptan (10 ml) for å drive av vannet, lufttørket på trakten, og tørket i en vakuumovn ved 35°C inntil KF < 5%. Utbyttet var 79%, 4,1 gram.
Q.
Avbeskyttelse av L
for å produsere fri base M'
Del O forbindelse (L) (300 g, 0,723 mol, styrke på 90,6%), metylenklorid (3L), metanol (288 ml, 7,23 mol) og konsentrert (36%) saltsyre (288 ml, 7,23 mol) ble satt til en 3-halset 12 L kolbe utstyrt med mekanisk rører, temperatur-probe og N2gassinnløp. Reaksjonen skjedde mens reaksjonstemperaturen ble holdt innen et område fra ca. 20 til ca. 25°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 18 timer, delt i 2 faser og det vandige topplag ble oppsamlet. Til det vandige laget ble satt metylenklorid (6L) og vann (720 ml) og 5N NaOH (-600 ml) ble tilsatt dråpevis for å regulere pH til 9,0 - 10,5.
Den organiske fasen inneholdende saltsyresaltet
(identifisert ved HPLC) (Formel L') ble behandlet med metylenklorid (6L) og vann (720 ml) og 5N natriumhydroksid-løsning (~600 ml) ble tilsatt dråpevis mens reaksjonstemperaturen ble holdt mellom 20 og 25°C for å regulere pH mellom 9 og 10,5. NaCl (120 g) ble tilsatt og blandingen omrørt i 20 min. for å danne en faseseparasjon. Det organiske laget (6,2L) ble oppsamlet (inneholdt - 174 g av forbindelse M') og det vandige laget (1,75L) ble kastet (inneholdt 6,5 g forbindelse M').
Det organiske laget ble vasket med 1% NH4CI saltløsning (450 ml). (1% NH4Cl-løsning inneholdt 1 g NH4CI, 25 g NaCl og 74 g H20). Fra den resulterende faseseparering ble 6,OL organisk lag gjenvunnet (inneholdt - 176 g forbindelse M' i løsning) og det vandige laget (0,45L) inneholdende 1,4 g forbindelse M' (~ 0,4%) ble kastet.
Etylacetat (~4L) ble satt til det organiske laget mens CH2CI2ble avdestillert ved 25°C/50 mm Hg. Destillering ble avbrutt da et endelig volum på 2,5L ble nådd. Det organiske laget ble pressfiltrert ("polish filtered") for å fjerne fast NaCl og ble konsentrert til~1 Kg (~170 g av forbindelse M' i IL etylacetat) GC analyse: DCM < 0,1%. Vann (17 ml) ble tilsatt dråpevis og etter 10 min. begynte krystallisering. 17 ml vann ble tilsatt og den resulterende oppslemningen ble omrørt i 30 min, filtrert, kaken vasket med etylacetat og tørket ved romtemperatur under vakuum, hvilket ga 186 g av forbindelse M', utbytte 81%.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av delvis renset fenylalanin-dehydrogenase og/eller formiat-dehydrogenase enzym- (PDH/FDH) konsentrater, karakterisert v e d at den omfatter: a. fremstilling av et fermenteringsmedium fra en mikroorganisme som er i stand til å produsere fenylalanin-dehydrogenase og/eller formiat-dehydrogenase. b. underkastelse av mediet for mikrofluidisering for å frigjøre aktivitet fra de resulterende celler og danne et mikrofluidisert medium inneholdende PDH- og/eller FDH-enzymer c. klaring av mediet ved behandling av mediet med et flokkulerende middel for å koagulere celledebris og fjerne DNA og uønskede proteiner; d. filtering av det klarede medium; og e. konsentrering av mediet for å gi et delvis renset enzymkonsentrat som har en PDH/FDH-aktivitet på minst ca. 400 IU/ml for PDH og minst ca. 20 IU/ml for FDH.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at mediet blir underkastet mikrofluidisering under et trykk innen området fra ca. 840 til ca. 1400 kg/cm <2> .
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at mediet blir underkastet mikrofluidisering mens temperaturen til mediet blir holdt under ca. 25°C.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at temperaturen til mediet blir holdt under ca. 25°C.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at fenylalanin-dehydrogenase blir oppnådd fra slektene Sporosarcina, thermoactinomyces.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at fenylalanin-dehydrogenase blir oppnådd fra Thermoactinomyces intermedius.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at fenylalanin-dehydogenase blir oppnådd fra Thermoactinomyces intermedius, ATCC 33205, uttrykt i Escherichia coli eller Pichia pastoris.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at mikroorganismen er Escherichia coli JM110 (pBMS 2000-PPDFDH-PDH-mod).
9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det klarede medium blir ultrafiltrert.
NO20151145A 2004-04-14 2015-09-07 Fremgangsmåte for fremstilling av dipeptidyl IV inhibitorer og mellomprodukter derav NO20151145L (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56198604P 2004-04-14 2004-04-14
PCT/US2005/012615 WO2005106011A2 (en) 2004-04-14 2005-04-13 Process for preparing dipeptidyl iv inhibitors and intermediates therefor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NO20151145L true NO20151145L (no) 2006-11-13

Family

ID=35242266

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20065191A NO20065191L (no) 2004-04-14 2006-11-13 Fremgangsmate for fremstilling av dipeptidyl IV inhibitorer og mellomprodukter derav
NO20151145A NO20151145L (no) 2004-04-14 2015-09-07 Fremgangsmåte for fremstilling av dipeptidyl IV inhibitorer og mellomprodukter derav
NO20151146A NO20151146L (no) 2004-04-14 2015-09-07 Fremgangsmåte for fremstilling av dipeptidyl IV inhibitorer og mellomprodukter derav

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20065191A NO20065191L (no) 2004-04-14 2006-11-13 Fremgangsmate for fremstilling av dipeptidyl IV inhibitorer og mellomprodukter derav

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20151146A NO20151146L (no) 2004-04-14 2015-09-07 Fremgangsmåte for fremstilling av dipeptidyl IV inhibitorer og mellomprodukter derav

Country Status (16)

Country Link
US (4) US7741082B2 (no)
EP (3) EP2894227A3 (no)
JP (3) JP4896872B2 (no)
KR (1) KR101269813B1 (no)
CN (3) CN1968925B (no)
AR (1) AR048695A1 (no)
AU (1) AU2005238442A1 (no)
BR (1) BRPI0509890A (no)
CA (1) CA2563903A1 (no)
IL (1) IL178520A0 (no)
NO (3) NO20065191L (no)
PE (1) PE20060255A1 (no)
RU (1) RU2373194C2 (no)
TW (1) TW200540274A (no)
WO (1) WO2005106011A2 (no)
ZA (1) ZA200608304B (no)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7420079B2 (en) * 2002-12-09 2008-09-02 Bristol-Myers Squibb Company Methods and compounds for producing dipeptidyl peptidase IV inhibitors and intermediates thereof
US7741082B2 (en) * 2004-04-14 2010-06-22 Bristol-Myers Squibb Company Process for preparing dipeptidyl peptidase IV inhibitors and intermediates therefor
WO2007085933A2 (en) * 2006-01-25 2007-08-02 Glenmark Pharmaceuticals Limited Process for the preparation of n-[1-(s)-ethoxycarbonyl-1-butyl]-(s)-alanine-dmt complex and its use in the preparation of perindopril
PE20071221A1 (es) 2006-04-11 2007-12-14 Arena Pharm Inc Agonistas del receptor gpr119 en metodos para aumentar la masa osea y para tratar la osteoporosis y otras afecciones caracterizadas por masa osea baja, y la terapia combinada relacionada a estos agonistas
PE20090696A1 (es) 2007-04-20 2009-06-20 Bristol Myers Squibb Co Formas cristalinas de saxagliptina y procesos para preparar las mismas
CL2008002427A1 (es) 2007-08-16 2009-09-11 Boehringer Ingelheim Int Composicion farmaceutica que comprende 1-cloro-4-(b-d-glucopiranos-1-il)-2-[4-((s)-tetrahidrofurano-3-iloxi)bencil]-benceno combinado con 1-[(4-metilquinazolin-2-il)metil]-3-metil-7-(2-butin-1-il)-8-(3-(r)-aminopiperidin-1-il)xantina; y su uso para tratar diabetes mellitus tipo 2.
EP2108960A1 (en) 2008-04-07 2009-10-14 Arena Pharmaceuticals, Inc. Methods of using A G protein-coupled receptor to identify peptide YY (PYY) secretagogues and compounds useful in the treatment of conditons modulated by PYY
UY32030A (es) 2008-08-06 2010-03-26 Boehringer Ingelheim Int "tratamiento para diabetes en pacientes inapropiados para terapia con metformina"
NZ604091A (en) 2008-08-15 2014-08-29 Boehringer Ingelheim Int Purin derivatives for use in the treatment of fab-related diseases
AR074990A1 (es) 2009-01-07 2011-03-02 Boehringer Ingelheim Int Tratamiento de diabetes en pacientes con un control glucemico inadecuado a pesar de la terapia con metformina
AR075204A1 (es) 2009-01-29 2011-03-16 Boehringer Ingelheim Int Inhibidores de dpp-4 y composiciones farmaceuticas que los comprenden, utiles para tratar enfermedades metabolicas en pacientes pediatricos, particularmente diabetes mellitus tipo 2
AU2010212823B2 (en) 2009-02-13 2016-01-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Antidiabetic medications comprising a DPP-4 inhibitor (linagliptin) optionally in combination with other antidiabetics
JP5685550B2 (ja) 2009-02-13 2015-03-18 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｓｇｌｔ２阻害剤、ｄｐｐ−ｉｖ阻害剤、更に必要により抗糖尿病薬を含む医薬組成物及びその使用
WO2010118240A1 (en) * 2009-04-08 2010-10-14 Bristol-Myers Squibb Company A genetically stable plasmid expressing pdh and fdh enzymes
MY145258A (en) * 2009-07-06 2012-01-11 Univ Sains Malaysia A system for producing l-homophenylalanine and a process for producing l-homophenylalanine
KR20240090632A (ko) 2009-11-27 2024-06-21 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 리나글립틴과 같은 ｄｐｐ－ｉｖ 억제제를 사용한 유전자형 검사된 당뇨병 환자의 치료
FR2956400A1 (fr) 2010-02-15 2011-08-19 Finorga Procede de preparation de composes adamantyles
EP2547339A1 (en) 2010-03-18 2013-01-23 Boehringer Ingelheim International GmbH Combination of a gpr119 agonist and the dpp-iv inhibitor linagliptin for use in the treatment of diabetes and related conditions
CN102946875A (zh) 2010-05-05 2013-02-27 贝林格尔.英格海姆国际有限公司 组合疗法
CN103140475A (zh) 2010-05-05 2013-06-05 亚细亚化学工业有限公司 沙格列汀中间体,沙格列汀多晶型物,及其制备方法
WO2011161161A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 Boehringer Ingelheim International Gmbh Diabetes therapy
WO2012028721A1 (en) 2010-09-03 2012-03-08 Sandoz Ag PROCESS FOR THE REDUCTIVE AMINATION OF α-KETO CARBOXYLIC ACIDS
EP2608788A1 (en) 2010-10-04 2013-07-03 Assia Chemical Industries Ltd. Polymorphs of saxagliptin hydrochloride and processes for preparing them
WO2013059817A1 (en) * 2011-10-21 2013-04-25 Murer Kenneth H Buoyancy-based cervical traction system
WO2013081100A1 (ja) * 2011-11-30 2013-06-06 積水メディカル株式会社 アダマンチルヒダントイン化合物
WO2013174767A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh A xanthine derivative as dpp -4 inhibitor for use in modifying food intake and regulating food preference
CA2879824A1 (en) 2012-07-02 2014-01-09 Ranbaxy Laboratories Limited Saxagliptin salts
CN103539724B (zh) * 2012-07-12 2017-09-26 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 沙格列汀单一立体异构体的新晶型和纯化方法
WO2014108830A1 (en) 2013-01-10 2014-07-17 Wockhardt Limited A process for preparing pharmaceutically acceptable salt of saxagliptin
CN103265473A (zh) * 2013-06-04 2013-08-28 上海同昌生物医药科技有限公司 一种生产沙格列汀的方法
ITMI20131029A1 (it) * 2013-06-20 2014-12-21 Chemelectiva S R L Intermedi utili per la preparazione di saxagliptina
CN103555683B (zh) * 2013-11-19 2015-11-18 南京博优康远生物医药科技有限公司 一种沙格列汀手性中间体的合成方法
WO2015087262A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Ranbaxy Laboratories Limited Process for the preparation of saxagliptin and its intermediates
CN103724254A (zh) * 2013-12-23 2014-04-16 上海应用技术学院 一种沙克列汀中间体的制备方法
CN105315189A (zh) * 2014-05-29 2016-02-10 上海医药工业研究院 一种制备（5s）-5-氨基羰基-4,5-二氢-1h-吡咯-1-羧酸-1（1,1-二甲基乙基）酯的方法
CN104098505A (zh) * 2014-07-31 2014-10-15 天津民祥生物医药科技有限公司 一种沙格列汀的制备方法
CN104177284B (zh) * 2014-08-01 2016-08-24 常州大学 合成3-氮杂二环[3,1,0]己基-1-甲醛的方法
CN104293844B (zh) * 2014-08-26 2017-10-10 苏州永健生物医药有限公司 一种特拉匹韦中间体的合成方法
CN104356046B (zh) * 2014-11-02 2017-04-05 浙江医药高等专科学校 环烷基取代的环己烷羧酸酰胺类衍生物及其用途
CN104356048B (zh) * 2014-11-02 2016-08-24 浙江医药高等专科学校 环己烷羧酸酰胺类衍生物、其制备方法和用途
EA201791982A1 (ru) 2015-03-09 2020-02-17 Интекрин Терапьютикс, Инк. Способы лечения неалкогольной жировой болезни печени и/или липодистрофии
CN105130879B (zh) * 2015-07-24 2018-03-02 沧州那瑞化学科技有限公司 （R）‑3‑Boc‑氨基哌啶的制备方法
CN106554301B (zh) * 2015-09-30 2018-09-21 深圳翰宇药业股份有限公司 一种沙格列汀关键中间体的制备方法
CN106755152B (zh) * 2017-01-23 2020-06-16 苏州引航生物科技有限公司 一种制备奥格列汀中间体的方法
JP2020515639A (ja) 2017-04-03 2020-05-28 コヒラス・バイオサイエンシズ・インコーポレイテッド 進行性核上性麻痺の処置のためのＰＰＡＲγアゴニスト
CN109970620B (zh) * 2017-12-27 2022-07-12 江苏威凯尔医药科技有限公司 一种制备沙格列汀中间体的方法
RU2712097C1 (ru) * 2018-09-28 2020-01-24 Общество с ограниченной ответственностью "Необиотек" Ингибитор дипептидилпептидазы-4 для лечения сахарного диабета 2-го типа, соединения (варианты)
CN112391363B (zh) * 2021-01-21 2021-04-06 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 氨基酸脱氢酶突变体及其应用
CN119039583B (zh) * 2024-11-01 2025-03-11 浙江农林大学 一种具有立构复合结晶性能侧链碱基生物可降解聚酯酰胺及其酶促制备方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH1023896A (ja) * 1996-05-07 1998-01-27 Unitika Ltd 組換えプラスミド、それにより形質転換された大腸菌、その培養物及びそれを用いたアミノ酸又はその誘導体の製造方法
IL120873A0 (en) 1996-05-24 1997-09-30 Tanabe Seiyaku Co Process for preparing optically active 2-halogen-3-hydroxypropionic acid ester
US6068991A (en) * 1997-12-16 2000-05-30 Bristol-Myers Squibb Company High expression Escherichia coli expression vector
AU755530B2 (en) 1998-07-15 2002-12-12 Bristol-Myers Squibb Company Stereoselective reductive amination of ketones
CO5150173A1 (es) * 1998-12-10 2002-04-29 Novartis Ag Compuestos n-(glicilo sustituido)-2-cianopirrolidinas inhibidores de peptidasa de dipeptidilo-iv (dpp-iv) los cuales son efectivos en el tratamiento de condiciones mediadas por la inhibicion de dpp-iv
US6395767B2 (en) * 2000-03-10 2002-05-28 Bristol-Myers Squibb Company Cyclopropyl-fused pyrrolidine-based inhibitors of dipeptidyl peptidase IV and method
EP1309714B1 (en) 2000-08-16 2009-05-13 Bristol-Myers Squibb Company Stereoselective reduction of substituted oxo-butanes
US6828119B2 (en) 2001-01-04 2004-12-07 Bristol Myers Squibb Company Enzymatic deprotection of amines and hydroxides
DE60227936D1 (de) 2001-04-03 2008-09-11 Bristol Myers Squibb Co D-hydantoinase aus ochrobactrum anthropi
EP1463807A4 (en) * 2001-12-19 2006-04-12 Bristol Myers Squibb Co FORMATHYDROGENASE FROM PICHIA PASTORIS AND USES THEREOF
US7420079B2 (en) 2002-12-09 2008-09-02 Bristol-Myers Squibb Company Methods and compounds for producing dipeptidyl peptidase IV inhibitors and intermediates thereof
TW200538122A (en) 2004-03-31 2005-12-01 Bristol Myers Squibb Co Process for preparing a dipeptidyl peptidase Ⅳ inhibitor and intermediates employed therein
US7741082B2 (en) 2004-04-14 2010-06-22 Bristol-Myers Squibb Company Process for preparing dipeptidyl peptidase IV inhibitors and intermediates therefor
TW200536827A (en) 2004-05-04 2005-11-16 Bristol Myers Squibb Co Enzymatic ammonolysis process for the preparation of intermediates for DPP IV inhibitors
US7214702B2 (en) 2004-05-25 2007-05-08 Bristol-Myers Squibb Company Process for producing a dipeptidyl peptidase IV inhibitor

Also Published As

Publication number Publication date
EP2894227A3 (en) 2015-08-12
US7741082B2 (en) 2010-06-22
NO20065191L (no) 2006-11-13
JP2007532137A (ja) 2007-11-15
JP5715169B2 (ja) 2015-05-07
PE20060255A1 (es) 2006-03-31
WO2005106011A2 (en) 2005-11-10
CN103215320B (zh) 2015-09-23
JP5210406B2 (ja) 2013-06-12
CN1968925A (zh) 2007-05-23
EP1737970A4 (en) 2011-08-24
EP1737970A2 (en) 2007-01-03
RU2373194C2 (ru) 2009-11-20
CA2563903A1 (en) 2005-11-10
CN103215320A (zh) 2013-07-24
AR048695A1 (es) 2006-05-17
AU2005238442A1 (en) 2005-11-10
JP2011177177A (ja) 2011-09-15
US8222009B2 (en) 2012-07-17
IL178520A0 (en) 2007-02-11
US8809024B2 (en) 2014-08-19
EP3000893A3 (en) 2016-06-29
US8361761B2 (en) 2013-01-29
JP4896872B2 (ja) 2012-03-14
EP3000893A2 (en) 2016-03-30
KR20070006903A (ko) 2007-01-11
KR101269813B1 (ko) 2013-05-30
ZA200608304B (en) 2008-07-30
BRPI0509890A (pt) 2007-10-30
JP2013121351A (ja) 2013-06-20
CN103215321B (zh) 2015-09-09
EP2894227A2 (en) 2015-07-15
CN103215321A (zh) 2013-07-24
WO2005106011A3 (en) 2006-10-26
RU2006140134A (ru) 2008-05-27
CN1968925B (zh) 2013-04-17
TW200540274A (en) 2005-12-16
NO20151146L (no) 2006-11-13
US20120276600A1 (en) 2012-11-01
US20130204012A1 (en) 2013-08-08
US20050260712A1 (en) 2005-11-24
US20100291642A1 (en) 2010-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO20151145L (no) Fremgangsmåte for fremstilling av dipeptidyl IV inhibitorer og mellomprodukter derav
DK2505579T3 (en) Methods and compounds for the preparation of dipeptidyl peptidase IV inhibitors and intermediates thereof
MXPA06011735A (en) Process for preparing dipeptidyl iv inhibitors and intermediates therefor

Legal Events

Date Code Title Description
FC2A Withdrawal, rejection or dismissal of laid open patent application