NO303693B1 - Rent humant korboksyterminalt propeptid av type I prokollagen, antistoff og anvendelse av antistoff fremstilt mot dette, samt analysesett som omfatter antistoffet - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår et rent humant karboksyterminalt propeptid av type I prokollagen (PICP) fritt for karboksyterminalt propeptid av type III prokollagen (PIIICP) som er istand til å indusere dannelse av et antistoff som spesifikt reagerer med PICP, samt anvendelse for måling av syntese av type I prokollagen hos mennesker.

Type I kollagen finnes i flere forskjellige typer bindevev i hele menneskekroppen, men mesteparten finnes i ben, hvor det utgjør mer enn 95% av den organiske matriks. Mange sykdommer er knyttet til en økning i mengden av syntetisert kollagen, d.v.s. en økning i hastigheten av benmatriksdannelse og -omsetning. Spesielt ville det være ønskelig å være i stand til å fastsette denne hastighet, siden osteoporose og andre metabolske bensykdommer er et vanlig helseproblem og slik fastsettelse ville tilveiebringe veiledning ved utforming av en behandling for disse forstyrrelser.

Type I kollagen syntetiseres som et prokollagen som inneholder propeptid-forlengelser i begge ender av molekylet. Hastigheten av type I kollagen-syntese kan således fastsettes ved bestemmelse av mengden propeptid som frigjøres under omdannelsen av prokollagenet til kollagen. En analyse med hensyn til et propeptid av type I prokollagen er blitt beskrevet (Taubman et al., Science 186, 1115-1117, 1974) og angår et antigen som er blitt antatt å være det aminoterminale propeptid av type I prokollagen. Det målte antigen ble imidlertid senere vist mest sannsynlig å stamme fra den karboksyterminale del.

Videre er det blitt vist at propeptid-antigenet anvendt ved denne analyse, idet det er blitt renset fra prokollagen dannet av dyrkede fibroblaster, også reagerer med det tilsvarende propeptid av type III prokollagen (Simon et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 58, 110-120, 1984). Når propeptid-antigenet reduseres og deretter undersøkes ved SDS-polyakrylamidgel-elektroforese, er resultatet 3-4 forskjellige bånd (Goldberg et al., Collagen Rel. Res. 5, 393-403, 1985; Fig. 3 på side 398). Dette er i overensstemmelse med den ekstra tilstedeværelse av kjeder som stammer fra karboksypropeptid av type III prokollagen. Således er den tidligere beskrevne analyse ikke spesifikk for type I prokollagen.

Dyrkede humane hudfibroblaster danner alltid både type I- og III prokollagener. Det er imidlertid teknisk vanskelig fullstendig å skille de to typer fra hverandre. Saltfraksjonering, den mest alminnelig anvendte separasjonsmetode, resulterer ikke i fullstendig separasjon. Konsentrasjonen av type III prokollagen undersøkes ofte ved anvendelse av en analyse med hensyn til det aminoterminale propeptid av type III prokollagen. Denne er imidlertid ikke tilstrekkelig følsom, siden den ikke oppfatter molekyler som inneholder det karboksyterminale propeptid, men har mistet det aminoterminale propeptid (slike molekyler er kjent som type III pC-kollagen).

Den foreliggende oppfinnelse søker derfor å utvikle et karboksyterminalt propeptid av type I'prokollagen (forkortet PICP), fritt for det tilsvarende propeptid av type III prokollagen (forkortet PIIICP), og å frembringe en kvantitativ fremgangsmåte som er hurtig og enkel å utføre, for fastsettelse av mengden av karboksyterminalt propeptid av type I prokollagen i humant serum.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer karboksyterminalt propeptid av type I prokollagen, fritt for propeptid av type III prokollagen.

Fremstillingen av det rensede propeptid starter ut fra et materiale som inneholder en tilstrekkelig konsentrasjon av enten det frie propeptid eller type I prokollagen. Eksempler på førstnevnte innbefatter f.eks. ascitesvæske, interstitialvæske fra et sår under tilheling, og serum. Celledyrkningsmedium for humane fibroblaster er et eksempel på sistnevnte. Dyrkede humane fibroblaster er imidlertid forskjellige når det gjelder sin egnethet ved dannelse av prokollagen-utgangsmateriale. Primærkulturer som opprettholdes i nærvær av forholdsvis høye konsentrasjoner av kalveserum (høyere enn 10%), danner de største mengder prokollagen. Disse er selvfølgelig bare eksempler; andre kilder kan også anvendes.

Hvis man starter ut fra prokollagen-kilden, er det hensiktsmessig å skille mestedelen av type III prokollagen fra type I prokollagen på prokollagen-trinnet. Dette kan gjøres ved en serie utfellinger f.eks. under anvendelse av ammoniumsulfat og natriumklorid. Dette følges av gelfiltrering og ionebytterkromatografier.

Endelig separasjon av PICP fra PIIICP fås på propeptid-trinnet. Bakteriell kollagenasenedbrytning av prokollagenet gir propeptidet, som så renses ved lektinbinding, gelfiltrering og kromatografi.

Både PICP og PIIICP inneholder mannose-rike oligosakkarid-sidekjeder, og de bindes således til concanavalin A-lektin. Effektiv separasjon av PICP fra det forurensende PIIICP er så basert på det faktum at sistnevnte, når det dannes av dyrkede humane fibroblaster, fosforyleres, og elueres således, på grunn av sin mer negative ladning, mye senere enn PICP ved kromatografi. Det er foretrukket at kromatograferingen utføres ved anvendelse av ionebytterkromatografi og reversert fase-kromatografi ved pH over 4,0. NaCl-gradienten i f.eks. en DEAE-Sephacel-ionebytterkromatografikolonne eluerer differensielt PIIICP og PICP.

Avsaltingen av preparatet og den endelige rensing av PICP kan oppnås ved reversert fase-kromatografi. Kromatograferingene bør utføres under slike betingelser at propeptidet ikke denatureres. Det er foretrukket at ovennevnte kromatograferinger utføres ved slike betingelser at pH i preparatet holdes på mellom 4,0 og 8,5. Det er kjent at håndtering av prokollagener og propeptider er vanskelig i praksis og fører til lave utbytter. Detaljerte betingelser for en typisk rensningsmetode hvorved PICP kan isoleres hovedsakelig fri for PIIICP,.er gitt i eksemplet som følger.

Når man starter ut fra en blanding av propeptider (type

I og type III), kan type I propeptidet fås ved gelfiltrering f.eks. på Sephacryl S-300, lektinaffinitetsbinding f.eks. under anvendelse av concanavalin A-lektin, ionebytter-kromatograf i f.eks. på DEAE-cellulose og reversert-fase-kromatografi over pH 4,0.

Det isolerte propeptid er homogent på SDS-polyakrylamidgel-elektroforese. Ved reduksjon gir elektroforesen, i motsetning til tidligere prepareringer, bare to bånd, med omtrentlige molekylmasser på rundt 30 000 og med et omtrentlig forhold på 2:1. Dette viser at propeptid av type III prokollagen er fraværende. Aminoterminal sekvensanalyse bekrefter også at ingen kjeder som stammer fra karboksyterminalt propeptid av type III prokollagen, er tilstede.

Oppfinnelsen tilveiebringer dessuten et antistoff dannet mot det karboksyterminale propeptid av type I prokollagen, spesielt et antistoff som ikke har affinitet for det karboksyterminale propeptid av type III prokollagen. Dette antistoff kan dannes ved anvendelse av teknikker kjent på området. For eksempel kan immunisering med propeptidet utføres som beskrevet for et annet prokollagenpropeptid-antigen i O. Niemela, L. Risteli, J. Parkkinen & J. Risteli, Biochem. J. 232, 145-150, 1985.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer dessuten en anvendelse av antistoffet og analysesett for analysering av karboksyterminalt propeptid av type I kollagen, som omfatter at en prøve som skal analyseres, bringes i kontakt med et antistoff ifølge oppfinnelsen, i nærvær av et merkingsmateriale, slik at merkingsmaterialet bindes til det dannede propeptid-antistoff-kompleks, og mengden bundet og/eller ubundet merkingsmateriale analyseres.

Den nye analyse sikrer hurtig og nøyaktig analysering av propeptidkonsentrasjonen. Den er særlig egnet ved slike kliniske tilstander hvor de virkelige forandringer i konsentrasjon mellom etter hverandre følgende analyser ikke er meget stor. Eksempler på dette er virkningen av østrogenbehandling hos osteroporose-pasienter og veksthormonbehandling hos barn som mangler veksthormon.

Analysen kan utføres ved at dette første antistoff, -i nærvær av et merkingsmateriale, bringes i kontakt med karboksyterminalt propeptid av type I prokollagen og prøven som skal analyseres; det således dannede merkede propeptid-antistoff-kompleks skilles fra det ikke kompleksbundne materiale, og det kompleksbundne og/eller ikke kompleksbundne merkingsmateriale analyseres. Propeptid-antistoff-komplekset kan bringes i kontakt med et andre antistoff som er spesifikt overfor det første antistoff og som kan bindes til en fast bærer. Propeptid-antistoff-antistoff-komplekset kan så skilles fra det ikke kompleksbundne materiale.

Det merkede propeptid som anvendes ved analysen, må også være fritt for karboksyterminalt propeptid av type III prokollagen (PIIICP).

Denne immunologiske analyse av propeptidet, hvor reagensene fremstilt på den beskrevne måte anvendes, kan utføres f.eks. med et radioaktivt, fluorescerende, luminescerende eller enzymatisk merkingsmateriale enten i indeks-antigenet eller i antistoffet. Det er hensiktsmessig at merkingsmateriale festes til indeks-antigenet, renset karboksyterminalt propeptid av type I kollagen. Enten polyklonale eller monoklonale antistoffer kan anvendes. Hos voksne er konsentrasjonen av propeptidet normalt ca. 40-200 ii<3 pr. liter serum. Hos spedbarn og barn er konsentrasjonen betydelig høyere.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et analysesett som omfatter et antistoff som er spesifikt for karboksyterminalt propeptid type I prokollagen og som ikke kryssreagerer med PIIICP og eventuelt et antistoff som er et antistoff til det første og et merkingsmateriale.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen. I eksempel 1 ble det anvendt dyrkningsmedium for humane fibroblaster. Det er imidlertid også. mulig å anvende celler og fluider fra andre arter, såsom bovine, saue- og griseceller, for oppnåelse av antistoffer som viser

tilstrekkelig kryssreaksjon med det humane PICP.

EKSEMPEL 1

Isolering av det karboksyterminale propeptid av human type I prokollagen fritt for karboksyterminalt propeptid av type III prokollagen.

3 0 liter dyrkningsmedium for humane hud-fibroblaster utfelles med fast (NH4)2S04(20% metning). De utfelte proteiner oppsamles ved sentrifugering ved 15 000 xg i 30 minutter, oppløses i og dialyseres mot 50 mM Tris/HCl, pH 7,4, IM NaCl inneholdende proteaseinhibitorer (3 milligram/liter fenylmetylsulfonylfluorid, N-etylmaleimid og p-hydroksymerkuribenzoat og 10 mM EDTA), og utfelles med fast NaCl (endelig konsentrasjon 1,7 M). Supernatanten, som inneholder mestedelen av type I prokollagenet, kromatograferes på en kolonne av Sephacryl S-500, og fraksjonene som svarer til prokollagener, blandes og dialyseres mot DEAE-utgangsbuffer (se nedenfor). Prøven blir så kromatografert på en DEAE-Sephacel-kolonne (5 x 30 cm) ekvilibrert i 50 mM Tris/HCl, pH 8,0, 6 M urea, inneholdende protease-inhibitorene som ovenfor. Eluering utføres med en lineær gradient av NaCl; 3000 + 3000 ml. Fraksjonene som inneholder type I prokollagen, blandes og dialyseres mot 50 mM Tris/HCl-buffer inneholdende 0,5 M NaCl og protease-inhibitorene nevnt ovenfor. Prokollagen-preparatet ledes så over en kolonne (2 x 20 cm) av Con-A Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Sverige) og elueres etter binding til kolonnen med 0,5 M alfa-metylmannosid. Etter dialysering mot 0,2 M NH4HC03, lyofiliseres preparatet. Det isolerte prokollagen, som fremdeles inneholder spor av type III prokollagen, bedømt ved en analyse med hensyn til det aminoterminale propeptid av type III prokollagen, nedbrytes i 15 timer ved +30°C med høyrenset bakteriell kollagenase (Worthington, kvalitet CLSPA), under anvendelse av 9 mg enzym/3 0 1 opprinnelig medium-volum. Etter gelfiltrering på Sephacryl S-300 (2,5 x 120 cm i 0,2 M NH4HC03) og lyofilisering, dialyseres propeptid-preparatet mot 50 mN

Tris/acetatbuffer pH 8,6 og kromatograferes under anvendelse av et HPLC-instrument på en kolonne av typen Protein Pak DEAE 5PV (Waters, Milford, Massachusetts, USA) og eluering av det bundne propeptid med en lineær gradient av NaCl (0-60 min., 0-0,5 M). Sluttrensing oppnås ved den pH-stabile reversert fase-kolonne (500 mM ammoniumacetat pH 8,0; Kolonne: Vydac 228 TP, The Separations Group, Hesperia, California, USA) på et HPLC-instrument.

Fig. 1 viser resultatene av SDS-polyakrylamid-gelelektroforese av det rensede PICP. I figuren viser de to kjøringene, en av uredusert materiale (-R) og en av materiale som har blitt redusert med 2-merkaptoetanol (+R) . Pilene viser posisjonene for standardproteiner (94000=fosforylase b, 67000=bovint serumalbumin, 43 00 0=ovalbumin og 3 0000 =karbonsyreanhydrase.

Som vist på fig. 1, gir det rensede PICP bare ett bånd ved SDS-polyakrylamidgel-elektroforese og ved reduksjonsprosesser bare to bånd med et molart forhold på ca. 2:1, hvilket viser at produktet er fritt for type III karboksyterminalt propeptid.

EKSEMPEL 2

Utførelse av likevekts-radioimmunanalyse-typen:

10 [ ig av det karboksyterminale propeptid av type I prokollagen merkes med 1 mCi jod-125 ved hjelp av kloramin-T (5 fig) , og det merkede propeptid skilles fra fritt jod ved gelfiltrering på en kolonne av typen Sephacryl S-300 (1 x 200 cm) ekvilibrert i PBS-buffer inneholdende 1 mg/ml bovint serumalbumin. Det merkede propeptid (eller sporingsstoff) elueres fra kolonnen som en skarp topp godt foran fritt jod. Kalibrering utføres ved opprettelse av antiserumbindings-kurver preparert med 50 000 radioaktivitetstellinger pr. minutt for det merkede propeptid. Propeptid-konsentrasjonen i en ukjent prøve av serum eller andre kroppsvæsker bestemmes i følgende radio-immuninhiberingsanalyse: en for-undersøkt mengde av antiserumet inkuberes med den ukjente prøve og 50 000 tellinger pr. minutt av sporingsstoffet i 2 timer ved 37°. Deretter tilsettes et andre fastfase-antistoff mot kanin-gammaglobulin, og etter 15 minutters inkubering ved 20° separeres antigenet bundet i immunkomplekset ved sentrifugering fra løsningen. Inhiberingsaktiviteten for den ukjente prøve sammenliknes med aktiviteten av standardkonsentrasjonene av umerket karboksyterminalt propeptid av type I prokollagen.

Claims (13)

1. Rent humant karboksyterminalt propeptid av type I prokollagen (PICP) fritt for karboksyterminalt propeptid av type III prokollagen (PIIICP) som er i stand til å indusere dannelse av et antistoff som spesifikt reagerer med PICP,karakterisert vedat det fremstilles under ikke-denaturerende betingelser ved concanavalin A-lectin-ionebytte-kromatografi av en blanding av PICP og PIIICP, etterfulgt av HPLC og sluttrensing ved pH stabil reversfasekromatografi.

2. Propeptid som krevd i krav 1, karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter kromatografering av propeptid-blandingen under anvendelse av reversert faseseparasjon ved pH over 4,0.

3. Humant karboksyterminalt propeptid av type I prokollagen (PICP) fritt for karboksyterminalt propeptid av type III prokollagen (PIIICP) som er i stand til å indusere dannelse av et antistoff som spesifikt reagerer med PICP,karakterisert vedat det fra en blanding av type I prokollagen og type III prokollagen fjernes endel av type III prokollagenet tilstede, omdannelse av prokollagenene til de tilsvarende karboksyterminale propeptidene og deretter utførelse av fremgangsmåten ifølge krav 1 eller 2.

4. Antistoff,karakterisert vedat antistoffet er fremstilt mot et karboksyterminalt propeptid av type I prokollagen (PICP) fritt for karboksyterminalt propeptid av type III prokollagen (PIIICP) ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3 hvor antistoffet har affinitet for type I prokollagen karboksy-terminalt propeptid, men mangler affinitet for type III prokollagen karboksyterminalt propeptid.

5. Anvendelse av antistoff ifølge krav 4 for in vitro analysering av karboksyterminalt propeptid av type I prokollagen, karakterisert vedat den omfatter at en prøve som skal analyseres, bringes i kontakt med et antistoff, som spesifikt binder seg til karboksyterminalt propeptid type I prokollagen, men ikke til type III prokollagen karboksy-terminalt propeptid, i nærvær av et merkingsmateriale som bindes til det dannede propeptid-antistoff-kompleks, og mengden av det bundne og/eller ubundne merkingsmateriale analyseres slik at nærvær av eventuelt nivå av karboksyterminalt propeptid type I prokollagen i prøven kan bestemmes.

6. Anvendelse ifølge krav 5,karakterisertved at merket karboksyterminalt propeptid av type I prokollagen og prøven som skal analyseres, bringes i kontakt med antistoffet, det således dannede propeptid-antistoff-kompleks skilles fra det ikke kompleksbundne materiale, og det kompleksbundne eller ikke kompleksbundne merkingsmateriale analyseres.

7. Anvendelse ifølge krav 5 eller 6, karakterisert vedat propeptid-antistoff-komplekset bringes i kontakt med et andre antistoff som er spesifikt for det første antistoff, og propeptid-antistoff-antistoff-komplekset skilles fra det ikke kompleksbundne materiale.

8. Anvendelse ifølge krav 7,karakterisert vedat det annet antistoff er bundet til en fast bærer.

9. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 5-8,karakterisert vedat merkingsmaterialet er et radioaktivt, enzym-, luminescerende eller fluorescerende merkings materiale.

10. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 5-9,karakterisert vedat prøven som skal analyseres er en kroppsvæske fra menneske, slik som serum, sårvæske eller ascitesvæske.

11. Anvendelse ifølge krav 10,karakterisert vedat kroppsvæsken er serum.

12. Analysesett,karakterisert vedat det omfatter et antistoff som er spesifikt for karboksyterminalt propeptid type I prokollagen og som ikke kryssreagerer med PIIICP ifølge krav 4, og et merkingsmateriale.

13. Analysesett,karakterisert vedat det omfatter et første antistoff som er spesifikt for karboksy-terminalt propeptid type I prokollagen og som ikke kryssreagerer med PIIICP ifølge krav 4, et andre antistoff som er et antistoff til det første, et merkingsmateriale og en fast bærer til hvilken er bundet det første eller det andre antistoffet.