NO314264B1 - Etylenglykolestere av monohydrobenzoporfyrinderivater, anvendelse derav samt farmasöytisk blanding - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører forbindelser nyttige i fotodynamisk terapi (PDT), anvendelse derav samt farmasøytisk blanding. Den vedrører spesielt etylenglykolestere av monohydrobenzoporfyriner.

Fotodynamisk terapi (PDT) involverer generelt administrering av forbindelser som har evne til å absorbere lys, vanligvis i det synlige området, men også i det nær ultrafiolette området etterfulgt av bestrålning av steder i individet hvor en toksisk eller inhibitorisk effekt er ønskelig. PDT ble opprinnelig utviklet ved anvendelse av hematoporfyrin og beslektete forbindelser for behandling av tumorer, idet det ser ut som om disse forbindelsene var "hjemme" i områder inneholdende hurtig delende celler. Tumoren kunne deretter bli bestrålt med lys absorbert av hematorporfyrin, og destruksjon av omgivende vev var et resultat. PDT har siden vært vist å være nyttig for behandling av aterosklerotiske plaque, restenose, infeksjoner i blodstrømmen, leddgikt, psoriasis og ved behandling av okkulære tilstander som ikke nødvendigvis er begrenset til tumorer.

US patent nr. 5,171,749 og patenter utstedt på beslektete søknader, US patenter nr. 5,283,225; 5,399,583; 4,883,790; 4,920,143; og 5,095,030; som alle er inkorporert heri som referanse, beskriver og krever en klasse av fotoaktive forbindelser som er nyttige i PDT som angir monohydrobenzoporfyriner, eller "BPD". Denne klassen ble oppnådd ved Diels-Alder reaksjon av et mono- eller disubstituert alkyn med protoporfyrin-IX, og resulterende forbindelser kan videre bli isomerisert, redusert og/eller derivatisert for å oppnå en stor klasse BPD. Som beskrevet i disse patentene, resulterer en spesielt nyttig underklasse av denne gruppen fra hydrolyse eller delhydrolyse av estergruppene til 2-karboksyetylsidekjedene på ringene C og D. Forestring som beskyttelse av disse gruppene i løpet av Diels-Alder reaksjonen resulterer i opprinnelige produkter som inneholder 2-karbalkoksyletylgrupper. Det ble oppdaget at enkel hydrolyse av disse estrene lett kunne bli utført og etterlate eventuelle karbalkoksygrupper assosiert med Diels-Alder produktet oppnådd fra en dikarbalkoksyalkyn nesten fullstendig uhydrolisert. Dette resulterte i fire former av forbindelser, BPD-MA, BPD-MB, BPD-DA og BPD-DB som angitt i figur 1, og denne figuren kommer fra US patent nr. 5,171,749.1 denne avbildningen er R og R karbalkoksygrupper, vanligvis karbometoksy eller karboetoksy, og R er alkyl (1-6C).

BPD-MA ble funnet å ha spesielt nyttige egenskaper for PDT og er for tiden i klinisk utvikling. Det er dessuten et fortsatt behov for ytterligere spesifikke former av fotoaktive midler som utvider repertoaret av fotoaktive forbindelser for de forskjellige indikasjonene hvortil PDT anvendes, som angitt ovenfor. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer forbindelser hvor ringene C og D inneholder etylenglykolestere av karboksy-alkylsubstituentene. Disse forbindelsene har farmakokinetiske egenskaper som er fordel-aktige i visse tilfeller hvor PDT anvendes.

Oppfinnelsen ifølge oppfinnelsen er nyttige nye tilførsler til repertoaret av forbindelser som anvendes innen fotodynamisk terapi og beslektete metoder som anvender fotoaktive forbindelser. Tilstedeværelse av etylenglykolestere i disse molekylene tilfører dem karaktertrekk som muliggjør utvidelse av rammen av betingelser hvorved slike fotoaktive forbindelser blir anvendt, og fininnstilling av behandlingen.

I et aspekt er oppfinnelsen følgelig rettet mot forbindelser med formlene

og metalhserte og/eller merkete og/eller konjugerte fonner derav hvor hver R<1> uavhengig er alkyl (1-6C);

hver n er uavhengig et tall fra 0 - 6; og

R<2> er vinyl eller et derivat derav, som kan oppnås ved addisjon eller oksydasjon av vinylgruppen.

Oppfinnelsen er også rettet mot forbindelser med formlene

og metalliserte og/eller merkete og/eller konjugerte former derav. Analogene er avledet fra protoforfyrin III og protoporfyrin XIII på en måte som ligner den hvor forbindelsene med formlene 1 og 2 er avledet fra protoforfyrin DC. Oppfinnelsen innbefatter også isomerer av forskjellige former av formlene 1-4 som er et resultat av ikke-rearrangerte Diels-Alder kondensasjonsprodukter (dvs. 1,4-dien) som beskrevet i US patent 4,833,790 inkorporert heri som referanse.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre farmasøytisk blanding, kjennetegnet ved at den omfatter forbindelsen ifølge et hvilket som helst av kravene 1-9 blandet sammen med minst én farmasøytisk akseptabel eksipient.

Det er videre beskrevet anvendelse av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-9, for fremstilling av et medikament for anvendelse ved fotodynamisk terapi eller diagnostikk.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 viser forbindelsene ifølge teknikkens stand, BPD-MA, BPD-MB, BPD-DA og

BPD-DB.

Figur 2viser kinetikken ved opptak av B-EA6 ved L1210 celler.

Figur 3viser kinetikken til frigjøring av B-EA6 til L1210 celler.

Figur 4viser en grafisk fremstilling av farmakokinetikken til B-EA6 in vivo.

Figur 5 viser en sammenligning av kinetikken ved oppak av B-EA6 til normale splenocyter og L1210 celler. Figur 6viser tidsforløpet til PDT ved anvendelse B-EA6 i mus sammenlignet med mus behandlet med BPD-MA og BPD-MB.

Figur 7viser effekten av B-EA6 på mikrovaskulaturen i mus.

Figur 8viser en sammenligning av spektrene i plasma til BPD-MA og B-EA6.

Figurene 9A og 9B viser cytotoksisk effekt ved fotodynamisk behandling ved anvendelse av A-EA6 sammenlignet med BPD-MA i L1210 celler og i dendritiske celler. Figur 10 viser sammenlignende effekter mellom A-EA6 og BPD-MA ved reduksjon av overflateekspresjonen til MHCI reseptorer. Figur 11 viser effekt av fotodynamisk terapi ved anvendelse av A-EA6 og BPD-MA på stress og mitogene reaksjonsveikinaser i HL60 celler. Figur 12 viser sammenlignende effekt til PDT ved anvendelse av A-EA6 og BPD-MA på kaspaseaktivering i HL60 celler. Figur 13 viser sammenlignende effekt av PDT ved anvendelse av A-EA6 og BPD-MA på DNA fragmentering i HL60 celler.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er relaterte til de som er beskrevet i BPD patentene sitert ovenfor, men er forskjellige ved at de inneholder estere av etylenglykol i substituentene på ringene C og D. Disse forbindelsene kan bli fremstilt ved enkel hydrolyse av karbalkoksy-alkyl eller karbalkoksyl substituenter og reforestring av resulterende karboksylgrupper i C og D ringene til benzoporfyriner, eller kan bli oppnådd direkte ved transforestring.

Det er å bemerke at forbindelsene 1 og 2 er individuelle former av slekten beskrevet i ovennevnte US patenter oppnådd ifølge en fremgangsmåte som omfatter en Diels-Alder reaksjon med protoporfyrin IX. Forbindelsene 3 og 4 blir fremstilt på en fullstendig analog måte, men ved anvendelse av protoporfyrin III eller protoforfyrin XIII som substrater for Diels-Alder reaksjonen. På grunn av at protoporfyrin IX ikke er symmetrisk med hensyn på A og B ringene, resulterer to mulige produkter avhengig av om Diels-Alder addisjon opp-står i A eller B ringen. Derimot er protoporfyrinene III og XIII symmetriske med hensyn på disse ringene, og derfor resulterer bare ett produkt i hvert tilfelle uansett addisjonssetet.

I forbindelsen ifølge oppfinnelsen er R<2> fortrinnsvis vinyl, men kan også være et derivat derav. Vinylgruppen i ring A eller B blir lett derivatisert til andre utførelsesformer av R<2> ved tilsetning eller oksidasjon. Addisjons- eller oksidasjonsproduktene kan bli ytterligere substituert dersom tilsatte substituenter er funksjonelle som avspaltbare grupper, f.eks. kan -Br bli substituert med -OH, -OR", -NH2, -NHR" eller -NR2" osv., hvor R" er en hydrokarbonrest. Blant annet kan en av de tilsatte substituentene være hydrogen og den andre halogen, hydroksy, lavere alkoksy, amino eller et amid, sulfydryl eller et organsulfid eller et ytterligere hydrogen. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen innbefatter forskjellige grupper for R<2> inkludert substituenter som tilveiebringer ytterligere porfyrin eller porfyrin-beslektete ringsystemer.

R<2> kan følgelig være vinyl, -CHOR', -CHO, -COOR', -CH(OR')CH3,

-CH(OR')CH2OR', -CH(SR')CH3, -CHCNR^CHa, -CH(CN)CH3, -CHfCOOROCHz, -CH(OOCR')CH3) -CH(NR,COR')CH3, -CH(CONR'2)CH3, -CH(halogen)CH3 eller -CH(halogen)-CH2(halogen) hvori R' er H eller en hydrokarbonrest (1-6C) eventuelt substituert med en heteroatomsubstituent eller

hvor R2 er en organisk gruppe med mindre enn 12C som er et resultat av direkte eller indirekte derivatisering av en vinylsubstituent, eller

hvor R<2> er en gruppe inneholdende 1-3 tetrapyrrol-type kjerner.

Som anvendt heri, refererer betegnelsen "alkyl" til et mettet lineær eller forgrenet hydrokarbon som kan, dersom det inneholder et tilstrekkelig antall karbonatomer, være cykliske eller inneholde en cyklisk del. Typiske eksempler er metyl, etyl, t-butyl, cyklo-heksyl og lignende.

En "hydrokarbonrest" refererer til en enverdig substituent som kun inneholder karbon og hydrogen som kan være lineær eller forgrenet, mettet eller umettet, aromatisk eller ikke-aromatisk eller begge, og cyklisk eller ikke-cyklisk.

I noen utførelsesformer ifølge oppfinnelsen kan hydrokarbonresten være substituert med en heteroatom-inneholdende substituent. Slike substituenter innbefatter -OR, -NR2, -SR, -COOR, -CONR2, -OOCR, -NRCOR, -SOR, -SO2R, -S03R, halogen, -CN og lignende, hvor R er H eller alkyl (1-6C). Cykliske aminer innbefatter pyridyl, pyrimidyl, tiazolyl, kvinolyl osv. De kan følgelig innbefatte enkeltring eller fusjonerte ringsystemer og kan inneholde ytterligere hetereoatomer.

Det er å bemerke at forbindelsene ifølge oppfinnelsen inneholder minst et chiralt senter og kan følgelig eksistere i forskjellige steroisomeriske former. Om ønskelig kan slike stereoisomerer, inkludert enantiomerer, bli separert ved anvendelse av teknikker som er standard innenfor fagområdet, men rasemiske blandinger eller blandinger inneholdende mer enn en diastereomer kan også bli anvendt. Forbindelser som vist i formlene 1-4, er derfor representative for individuelle optiske isomerer, enantiomerer eller diasteriomerer samt blandinger av disse individuelle chirale isomerene.

Om ønskelig kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen bli fremstilt i metalliserte former ved behandling av tetrapyrrol-type kjerner med et hensiktsmessig ion så som magnesiumion, sinkion, tinnion og lignende, for å oppnå et metallkompleks. Metallionet kan også bli radiomerket. Generelt blir metallionet skutt inn ved anvendelse av hensikts-messige salter under betingelser som er standard innenfor fagområdet. For eksempel kan sinkionet bli ført inn ved behandling av forbindelsen med sinkacetat i 1:1 metylenklorid: metanol.

Forbindelsene kan også inneholde markør, inkludert radioisotoper, kromoforer

og fluorescensmarkører. Radioisotopmerking er generelt nyttig når forbindelsene følges in vivo eller anvendes for å merke spesifikke grupper. Nyttige kationiske grupper som er radioisotoper, innbefatter technetium, gallium og indium. I tillegg kan radioisotoper av hetereoatomer, så som 13II eller <32>P, i selve molekylet eller inklusjon av ,<4>C bli anvendt for å merke molekylet.

Som ytterligere beskrevet i BPD-relaterte patenter angitt ovenfor, kan forbindelsen ifølge oppfinnelsen bli koblet, om ønskelig til et målsøkende middel som vil lede molekylet til et spesifikt vev eller organ. Slike målsøkende midler innbefatter antistoffer, reseptorer, reseptorliganer og lignende. Lenking av målmidlet til forbindelsen blir utført ved anvendelse av standard teknikker. Ifølge en "konjugert form" menes en forbindelse med formlene 1-4 koblet til et målsøkende middel, som beskrevet ovenfor.

Foretrukne utførelsesformer av forbindelsene med formel 1-4 innbefatter de hvor begge n er lik 2, eller de hvori begge R<1> er metyl og de hvori R<2> er vinyl. Spesielt foretrukket er forbindelser med formlene

Både A-EA6 og B-EA6 er blitt fremstilt. Begge er effektive fotosensibiliserende midler, og det ser ut som om A-EA6 er lettere å formulere.

De forskjellige formene av forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan som angitt bli anvendt i fotodynamiske terapiteknikker som generelt er kjent innenfor fagområdet. Som angitt ovenfor, kan fotodynamisk terapi bli utført ved anvendelse av en mengde protokoller og for forskjellige indikasjoner. I tillegg utviser forbindelsene av denne typen farmakolo-gisk aktivitet i fravær av lys i noen tilfeller. Standard farmasøytiske blandinger, inkludert liposomale blandinger, er foretrukket og anvendt som ønskelig i slike applikasjoner.

Følgende eksempler skal illustrere oppfinnelsen. Eksemplene illustrerer og demonstrerer overraskende farmakokinetiske egenskaper til to medlemmene av artene ifølge oppfinnelsen, A-EA6 og B-EA6, men det er ventet at de gjenværende forbindelsene beskrevet i formlene 1-4 vil ha lignende variasjoner i disse egenskapene. Den lille klassen av forbindelser innbefattet i foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig verdifulle tilføyelser til repertoaret av fotodynamiske midler som er nyttige for behandling av forskjellige tilstander hvortil denne terapien er blitt rettet.

Eksempel 1

Fremstilling av to former av EA6

A. For å fremstille B-EA6 er utgangsmaterialet BPD-DB som dimetylester, dvs. BPD-DB som vist i figur 1 hvor R<1> og R<2> begge er COOMe og R" er vinyl.

Til 2,0 g (2,7 mmM) BPD-DB i 50 ml etylenglykol og 100 ml diklormetan ble det tilsatt 1,0 ml svovelsyre. Reaksjonen ble omrørt i 181. ved romtemperatur. Deretter ble reaksjonen tilsatt til en omrørende blanding av 100 ml 5% vandig ammoniumacetat og 100 ml diklormetan. Det organiske laget ble isolert og deretter vasket to ganger med 50 ml vann. Oppløsningsmidlet ble fjernet ved roterende avdampning. Den mørkegrønne resten ble deretter kromatografert på 75 g aluminiumoksid (deaktivert md 5% vann) og eluert med en gradient på 0,5%-5,0% metanol i diklormetan. Oppløsningsmidlet fra fraksjonene inneholdende produktet ble deretter fjernet ved roterende avdampning. Resten ble tørket i vakuum over natt for å tilveiebringe 2,02 g (89%) av analytisk ren grønn tittelforbindelse.

B. å lignende måte som den som er angitt i paragraf A, men erstatning av BPD-DA

med BPD-DB ble den isomeriske formen A-EA6 fremstilt.

Eksempel 2

Sammenligning av opptak og frigjøring av B-EA6 og BPD-MA ved LI210 celler BPD-MA eller B-EA6 ble inkubert med 3 ug/ml i nærvær av 10% fetalt bovin serum med lOVml LI 210 celler, en murin leukemicellelignende. Det intracellulære innholdet av fotosensibiliserende midler ble målt ved fluorescens av cellelysater ved forskjellige tidspunkter. Maksimal konsentrasjon oppnådd var 145,9 ng/10<6> celler for B-EA6 og 149,5 ng/10<6> celler for BPD-MA. Tidsforløpet for opptak er vist i figur 2 som en prosentandel av celleinneholdet ved 60 min. på det tidspunktet hvor opptaket hadde nådd et maksimum i begge tilfeller. Som vist, blir B-EA6 tatt opp hurtigere og når 80% av dets maksimale konsentrasjon etter bare 5 min. og når maksimalt opptak i løpet av 15 min.

Kinetikken til frigjøring av disse medikamentene fra LI 210 cellene ble målt ved forbelastning av cellene ved 3ug/ml i 11. og deretter plassering av cellene i medikament-fritt medium inneholdende 10% fetalt bovin serum. Gjenværende intracellulært medika-mentinnhold ble målt ved forskjellige tidspunkter ved lysering av cellene og måling av fluorescens. Som vist i figur 3 (igjen som en prosentandel av utgangsintracellulært innhold), viste BPD-MA og B-EA6 forskjellig kinetikk for frigjøring. Opprinnelig frigjøring av B-EA6 er mye hurtigere, men frigjøringen var mer fullstendig når det gjelder

BPD-MA.

Det var uventet at in vitro farmakokinetikken til B-EA6 var mer hurtig enn de til BPD-MA. Idet høyere retensjon av B-EA6 kunne tilskrives dets økete størrelse sammenlignet med BPD-MA, var den hurtigere overføringen gjennom den cellulære membranen uventet.

Eksempel 3

Sammenligning av in vivo farmakokinetikk

Enten BPD-MA eller B-EA6 ble administrert ved intravenøs injekson inn i DBA/2 mus i en dose på 4 m/kg ved anvendelse av 3 mus pr. tidspunkt. Medikamentinnholdet i plasma, hud, lever og nyre ble bestemt ved fluorescensen i vevsekstraktene. Figur 4 viser resultater plottet som en prosentandel av konsentrasjonen i relevant vev 15 min. etter injeksjon. Som det fremgår av figur 4, akkumulerte verken BPD-MA eller B-EA6 i plasma, lever eller nyre; men BPD-MA akkumulerte i huden i løpet av de første 31., mens B-EA6 ikke gjorde dette.

Den mer hurtige akkumuleringen av B-EA6 sammenlignet med BPD-MA som her bekreftet in vivo ved hurtigere fjerning fra alle vev, utgjør en fordel. Behandling med lys kan bli utført rett etter injeksjon av fotosensibiliserende middel, og på grunn av hurtig fjerning vil det ikke fremkomme forlenget hud eller øye fotosensibilisering. Individene som er blitt behandlet, kan gjenoppta deres normale liv uten spesielle hensyn så som unngåelse av klart lys og bæring av mørke solbriller.

Halveringstiden til B-EA6 og BPD-MA i forskjellige vev ble deretter registrert i tidsrammen 15 min.-3t., og resultatene er vist i tabell 1:

Halveringstiden til BPD-MA i denne tidsrammen kunne ikke bli registrert i huden på grunn av at dets konsentrasjon økte i løpet av 3 t.-perioden. Som vist i tabell 1, har B-EA6 generelt en mye kortere halveringstid enn BPD-MA i de fleste vev. Mangel på akkumulasjon av B-EA6 i normal hud sammenlinet med BPD-MA var uventet, og indikerer en mer hurtig fjerning enn av BPD-MA. Som angitt ovenfor, er dette fordelaktig idet hudfotosensitiviteten er den eneste anerkjente bivirkningen ved fotodynamisk terapi ved anvendelse av fotosensibiliserende midler.

Farmakokinetikkene ble også bestemt ved anvendelse av en in vivo muse tumor-modell. Grupper av 10 BDA/2 mus inneholdende Ml rabdomyosarkom tumorer ble injisert intravenøst med en liposomal formulering av BPD-MA ved forskjellige doseringer av 0,75-1,5 mg/kg. Tumorene ble bestrålt med 690 nm Iaserlys ved 50 eller 150 J/cm<2> ved forskjellige tidspunkter etter injeksjon. Resultatene, som vist i tabell 2, ble bestemt med hensyn på prosentandel mus i hver gruppe som var tumorfri på dag 7 etter injeksjon.

Som vist i tabell 2, viste BPD-MA behandlete mus vesentlige overlevelsesrater når de faste injeksjonstidspunktene varierte fra 15-180 min. Derimot viste B-EA6 behandlete mus ingen respons etter 30 min. eller 180 min., mens signifikant respons ble oppnådd når bestrålningen ble tilført etter bare 15 min.

Disse data demonstrerer at BPD ved anvendelse av B-EA6 vil være effektiv med tidlig behandling med lys. Mangel på effekt etter senere tidspostinjeksjon indikerer igjen hurtig fjerning av B-EA6 som er fordelaktig som angitt ovenfor.

Eksempel 4

Bestemmelse av LD50 med og uten serum

Enten B-EA6 eller BPD-MA ble inkubert i 11. med LI210 cellene med en rekke konsentrasjoner og eksponert for 9 J/cm2 bredsprektret lys. Denne bestemmelsen ble utført i fravær av serum og i nærvær av 10% serum. Resultatene er vist i tabell 3.

Som vist har PBD-MA og B-EA6 sammenlignbare LD50 verdier i fravær av serum,

men i nærvær av serum viser B-EA6 en vesentlig bedre retensjon av effektivitet.

I de fleste tilfellene reduserte tilstedeværelse av serum betydelig fotoaktiviteten til midlene anvendt i PDT, så som BPD- MA. Det er overraskende at B-EA6 viser mer affinitet for cellemembranene enn for plasmakomponenter, og blir derfor meget lite påvirket av tilstedeværelse av serum i cellulært miljø. In vivo kan dets aktivitet følgelig være høyere enn den til BPD-MA og andre forbindelser på denne familien.

Eksempel 5

In vitro effektiviteten til B-EA6

Evnen som B-EA6 har til å omdanne en cytotoksisk effekt på L1210 cellene in vitro, ble ytterligere testet ved inkubering av cellene med B-EA6 ved forskjellige konsentrasjoner i 11. i fravær av serum. Etter at medikament i overskudd var fjernet, ble cellene eksponert for 9 J/cm bredspektret lys (380-750 nm), og celleoverlevelsen ble bestemt ifølge MTT analysen (Mosmann, T. et al JImmunol Meth (1983) 65:55-63). Prosentandel av drepte celler ble beregnet referert til overlevelse av celler kun eksponert for lys. Ved en konsentrasjon på omtrent 7 ng/ml ble 80% av cellene drept, og ved 15 ng/ml overlevde nesten 100% av cellene. Som angitt ovenfor, er LD50 for B-EA6 omtrent 4,7 ng/ml.

Den noe lavere effekten av B-EA6 sammenlignet med BPD-MA in vitro gjør at den forholdsmessig høyere aktiviteten til B-EA6 sammenlignet med BPD-MA in vivo i nærvær av serum som demonstrert i eksempel 4, enda mer uventet.

Eksempel 6

Selektiviteen til B-EA6 for tumorceller

Evnen som L1210 cellene har til å akkumulere B-EA6, ble sammenlignet med evnen til splenocytene. B-EA6 ved 3 ug/ml ble inkubert med hver celletype, og celle-innholdet til B-EA6 ble bestemt av fluorescensen i cellelysatene. Figur 5 viser en sammenligning av opptaket for to celletyper i ng/10<6> celler. Som vist, hadde L1210 cellene evne til oppta omtrent 140 ng/10<6> celler som har nådd denne verdien etter omtrent 20 min. Splenocyter akkumulerer derimot mindre enn 20 ng/10<6> celler etter en times inkubasjon.

DBA/2 mus som bærer Ml (rabdomysarkoma) tumor, dyrket subkutant i flankene, ble anvendt som en modell for å vise at B-EA6 demonstrerte selektivitet for tumorer. Musene ble administrert 0,75 mg/kg B-EA6 i en liposomal formulering intravenøst. Etter

15 min. ble et 1 cm område som innbefattet en 5 mm diameter tumor, eksponert for

50 J/cm 70 mW lys på 690 nm bølgelengde fra en argon-pumpe farvestofflaser. Eksponeringen eliminerte effektivt tumoren, men påvirket ikke omgivende normal hud. B-EA6 demonstrerer følgelig tumorspesifisitet.

Eksempel 7

Immunmodulering av B-EA6

Balb/C mus (5-8 mus pr. gruppe) ble testet ved anvendelse av forsinket hud-fotosensivitetsanalyse også betegnet kontakt hypersensivitet (CHS) analyse. Musene ble malt i flanken med sensibiliseringsmidlet dinitrofluorbenzen (DNFB) og 5 dager senere ble et øre eksponert for DNFB, mens det andre virket som en kontroll. Svellingen er en indikator på immunresponsen. Mus ble injisert intravenøst med 1 mg/kg liposomal B-EA6 og enten bestrålt med 15 J/cm<2> lys over hele kroppen eller eksponert for omgivende lys. Evnen som denne behandlingen har til å forhindre immunrespons som demonstrert med inhibisjon av øresvelling, ble besemt. Resultatene viste at administrering av B-EA6 kombinert med enten etterbestrålning med 15 J/cm<2> fullt kroppslys eller med omgivende lys, reduserte svellingen i testøret sammenlignet med ubehandlete mus. Svellingen var i begge tilfellene bare omtrent 60% av den som ble vist i mus uten behandling.

I en ytterligere analyse for å bestemme immunmodulering ble murine peritoneale makrofager isolert, renset og aktivert av rekombinant interferon-y (100 U/ml). Aktiverte celler ble inkubert i 11. ved 37°C med B-EA6 i et konsentrasjonsområde og deretter eksponert for 690 nm LED lys ved 5 J/cm . Ekspresjonsnivåer av MHC I, MHCII, CD54, CD80 og CD86 ble bestemt 241. senere ved anvendelse av FITC konjugerte antistoffer og en cellesorteringsinnretning. Resultatene er vist i tabell 4 for B-EA6 ved 0,5 ng/ml sammenlignet med lignende eksperimenter ved anvendelse av BPD-MA ved 2,5 ng/ml.

Resultatene i tabellen er gitt som en prosent av ekspresjon sammenlignet med celler behandlet kun med lys. Som vist, kunne BPD-MA og B-EA6 begge redusere ekspresjonen av MHC II, men ikke gjenværende overflatemarkører, Til tross for at B-EA6 har fordelaktig farmakokinetikk, har den beholdt den immunmodulatoriske aktiviteten til BPD-MA og andre forbindelser fra denne gruppen.

Eksempel 8

Effekt av B-EA6 i en artrittmodell

MRL-lpr mus utviklet spontant artritt, og dette ble forsterket ved intradermal injeksjon av Freund's Adjuvant. Forskjellige antall av MRL-lpr mus ble behandlet med PDT på dagene 0,10 og 20 etter injeksjon av adjuvant. PDT besto av 0,5 mg/kg liposomal B-EA6 injisert intravenøst etterfulgt av eksponering av den ventrale delen til musen for rødt (560-900 nm) lys ved 80 J/cm<2> i 11. etter B-EA6 injeksjon. Musene ble observert og symptomer registrert pr. 5. dag i 30 dager. Resultatene er vist i figur 6 sammenlignet med mus behandlet på lignende måte med BPD-MA og BPD-MB. Som vist i figur 6, var B-EA6 (vist som skraverte sirkler) enten målt ved forekomst av kliniske symptomer (dvs. prosentandel mus som utviser disse symptomene) eller ved forandring i bimaleolar ankelvidde i millimetere, effektiv når det gjelder å forhindre fortsettelsen av adjuvantinjeksjon.

Retensjonen av den immunmodulatoriske aktiviteten til B-EA6 er demonstrert.

Eksempel 9

Effekt av B-EA6 på mikrovaskulatoren

Mus kremaster muskel modellen ble anvendt. B-EA6 ble administrert intravenøst med 2 mg/kg og begynnende 5 og 15 min. etter injekson, kirurgisk eksponerte arterioler og venyler ble bestrålt med lys med en intensitet på 25 J/cm pr. 5 min. begynnende ved 5 min. og 15 min. etter injeksjon av B-EA6. Årene ble målt som rød blodkolonnediameter som en prosentandel av kontrollene.

Resultatene er vist i figur 7. Idet forbigående karrlukning kunne blei ppnådd når bestrålningen ble påbegynt ved 5 min., ble permanent lukking oppnådd når bestrålningen ble påbegynt etter 15 min.

Den forsterkete kapasiteten til B-EA6 når det gjelder å snøre eller lukke vaskula-turen, som demonstrert i dette eksemplet, i kombinasjon med hurtigere farmakokinetikk, gjør B-EA6 spesielt fordelaktig for behandling av neovaskulære sykdommer i øyet.

Eksempel 10

Absorpsjonsspekteret til B-EA6

BPD-MA og B-EA6 har lignende absorpsjonsspektere i plasma før og etter 41.

eksponering av fluorscens (380-750 nm) lys. En sammenligning av disse spektrene er vist i figur 8. Likheten av spekteret til B-EA6 med spekteret ti BPD-MA er fordelaktig på grunn av at anvendelse av BPD-MA som et terapeutisk middel nyttig i PDT, er godt dokumentert. Likheten i deres spektere indikerer at samme lyskilder kan bli anvendt for B-EA6 som er nyttige for behandling av BPD-MA.

Eksempel 11

In vitro cytotoksisiteten til A-EA6

På en lignende måte som den som er angitt i eksempel 5, ble cytotoksisiteten til A-EA6 in vitro på to forskjellige cellelinjer testet og sammenlignet med BPD-MA. Enten

L1210 cellene eller den dentritiske cellelinje D2SC/1 ble inkubert i en time ved 37°C med enten A-EA6 eller BPD-MA. Til fjerning av medikament i overskudd ble cellene eksponert for 690 nm lys ved 5 J/cm2 lys for dendritiske celler og ved 9°J/cm2 lys for L1210 cellene. Celleoverlevelse ble bestemt 18-24 timer senere ved anvendelse av MTT kolorimetrisk analyse beskrevet i eksempel 5. Prosent celler drept ble beregnet med referanse til celler eksponert kun for lys. Som vist i figur 9A, viste A-EA6 sammenlignbar cytotoksisitet som BPD-MA med hensyn på L1210 celler i fravær av serum, men var betydelig mer toksisk i nærvær av serum enn PBD-MA. De åpne sirklene representerer A-EA6 pluss serum. De lukkete sirklene representerer BPD-MA pluss serum; åpne kvadrater representerer A-EA6 i fravær av serum, og lukkete kvadrater representerer BPD-MA i fravær av serum.

Som vist i figur 9B, i dendritiske celler hvor BPD-MA har en LD50 på 6 ng/ml og A-EA6 har en LD50 på 2,7 ng/ml, var A-EA6 toksisk ved lavere konsentrasjoner enn BPD-MA i nærvær av 5% fetalt kalveserum. I figur 9B representerer lukkete sirkler BPD-M og åpne kvadrater av A-EA6.

I en lignende bestemmelse, men med måling av MHC I reseptorer istedenfor cytotoksisiteten, var A-EA6 effektiv når det gjelder å redusere ekspresjonen av disse reseptorene ved lavere konsentrasjoner. I denne bestemmelsen ble dendritiske celler inkubert i 1 time ved en medikamentkonsentrasjon som er mindre enn LD50; 2,5 ng/ml og 5 ng/ml for BPD-MA og 1 ng/ml og 2,5 g/ml for A-EA6. Cellene ble behandlet med 690 nm lys ved 5 J/cm2 og deretter merket med hensiktsmessig antistoff 3 timer etter behandling og vurdert ved flow cytometri. Resultatene ble målt som prosent av gjennomsnittlig kanal fluorescensintensitet for lys-behandlete kontroilceller. Disse reusltatene er vist i figur 10; BPD-MA ga en 18% og en 29% reduksjon ved 2,5 ng/ml og 5 ng/ml; A-EA6 reduserte kanalfluorescensen med omtrent 25% ved både 1 ng/ml go 2,5 ng/ml konsentrasjonene.

Eksempel 12

Effekt av A-EA6 på intracellulær signalisering

Betingelsene for studien angitt i eksempel 11 ble rapportert ved anvendelse av HL-60 celler som mål og sammenligning av effektene av A-EA6 og BPD-MA på cytotoksisiteten, på mitogenisk reaksjonsveikinase p70 S6K, og på stress reaksjonsveikinasene c-jun og HSP27. Resultatene er vist i figur 11. Ved subletale konsentrasjoner viste A-EA6 sterkere aktivering av stressreaksjonskinaser og sterkere inhibisjon av nitogene reaksj ons veikinaser.

Effekten på kaspaseaktivering i HL-60 cellene ble også målt. A-EA6 viste en sterkere akvitering av kaspaser enn BPD-MA. Denne effekten er ønskelig, idet den er assosiert med apoptose. Ved anvendelse av apoptose for å fjerne uønskete celler, forårsaker den minste effekten på omgivende normale celler og vev. Sammenligning av A-EA6 med BPD-MA er vist i figur 12.

Figur 13 viser en lignende sammenligning når prosent DNA fragmentering ble målt i HL-60 cellene. Igjen var A-EA6 effektiv ved lavere konsentrasjoner enn BPD-MA.

Eksempel 13

In vivo fotodynamisk terapi ved anvendelse av A-EA6

I en protokoll som ligner den som er angitt i eksempel 3, ble enten A-EA6 eller BPD-MA injisert intravenøst i mus med M 1 tumorer i en dose på 1 mg/kg. Dette ble etterfulgt av bestrålning av hele kroppen med 50 J/cm<2> 690 nm laserlys ved forskjellige tidspunkter etter administrering av medikamentet. Antall tumor-frie dyr på dag 7 ble bestemt, og resultatene er vist i tabell 5.

Disse resultatene viser at A-EA6 er minst like effektiv som BPD-MA i denne analysen.

Eksempel 14

Immunmodulatorisk aktivitet

Flanker av kontroll og testmus ble malt med antigen DMFB, og ørene ble eksponert 5 dager senere ved påføring av samme forbindelse. Testdyrene ble behandlet med full-kropps PDT ved anvendelse av BPD-MA eller A-EA6 ved injistering av det fotosensibiliserende midlet intravenøst og deretter eksponering av dyrene for rødt LED lys ved IS J/cm<2>. Prosent ekspresjon av øresvelling ble beregnet sammenlignet med kontrollene. Resultatene er vist i tabell 6 og indikerer at A-EA6 hadde en sterkere immunmodulatorisk effekt i denne analysen enn BPD-MA.

Claims (11)

1. Forbindelse, karakterisert ved at den har formelen og metalliserte og/eller merkete og/eller konjugerte former derav hvor hver R<1> uavhengig er alkyl (1-6C); hver n er uavhengig et tall fra 0 - 6; og R<2> er vinyl eller et derivat derav, som kan oppnås ved addisjon eller oksydasjon av vinylgruppen.

2. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert ved at R<2> er vinyl, -CHOR', -CHO, -COOR', -CH(OR')CH3, -CH(OR')CH20R', -CH(SR')CH3, -CH(NR')2CH3, -CH(CN)CH3, -CH(COOR')CH2, -CH(OOCR')CH3, -CH(NR'COR')CH3, -CH(CONR'2)CH3, -CH(halogen)CH3 eller -CH(halogen)-CH2(halogen) hvori R' er H eller en hydrokarbonrest (1-6C) eventuelt substituert med en heteroatomsubstituent eller hvor R<2> er en organisk gruppe med mindre enn 12C som er et resultat av direkte eller indirekte derivatisering av en vinylsubstituent, eller hvor R er en gruppe inneholdende 1-3 tetrapyrrol-type kjerner.

3. Forbindelse ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den er i en metallisert form, og/eller som er i konjugert form og/eller som er merket.

4. Forbindelse ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den ikke inneholder et metallion.

5. Forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at R er vinyl, og/eller hvori hver R<1> er metyl, og/eller hvori begge n er 2.

6. Forbindelse ifølge krav 5, karakterisert ved at R<2> er vinyl og begge R' er metyl.

7. Forbindelse ifølge krav 6, karakterisert ved at den har formelen og metalliserte og/eller merkete og/eller konjugerte former derav.

8. Forbindelse ifølge krav 7, karakterisert ved at den er i en metallsiert form, og/eller som er i konjugert form og/eller som er merket.

9. Forbindelse ifølge krav 7, karakterisert ved at den ikke inneholder et metallion.

10. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at den omfatter forbindelsen ifølge et hvilket som helst av kravene 1-9 blandet sammen med minst én farmasøytisk akseptabel eksipient.

11. Anvendelse av en forbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 -9, for fremstilling av et medikament for anvendelse ved fotodynamisk terapi eller diagnostikk.