NO320944B1 - Sammensetning, fremgangsmate og anvendelse av thymosinpolypeptider for behandling av infertilitet og forokning av fertiliseringskapasiteten til menn. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører sammensetning og fremgangsmåte for behandling av infertilitet i mannlige pattedyr. Oppfinnelsen vedrører spesielt visse thymosin polypeptider og antistoffer og anvendelse av disse for å behandle infertilitet hos menn.

Thymus er involvert i immunologisk og endokrinologisk homeostase i kroppen. Se Besedovsky, et al. Nature 249:356-361 (1974). Viktigheten av thymuskjertelen ved utvikling og tiltagende immunologisk kompetanse i pattedyr er nå generelt akseptert. Forskjellige faktorer i thymuskjertelen er anerkjent for å modulere nivåene av kjønnssteroidene som igjen kan forårsake spontane og eksperimentelt induserte autoimmune sykdommer og endre immunresponsen i løpet av graviditet. Se Oates, et al., Trends Pharmacol. Sei. 5:347 (1984). Flere humorale faktorer med hormonlignende aktivitet er blitt isolert og karakterisert fra thymus eller ekstraktene derav. Se for eksempel Goldstein, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 74:725-729 (1977). Faktorer som er blitt isolert innbefatter prothymosin-a(ProTa), thymosin-aj (oq) og thymosin-fl4 (TB4). Tai og Tfi4 er blitt sekvensert og syntetisert. Sekvensen til Toq er for eksempel vist i US-PS 4.079.127 (Goldstein et al.). Sekvensen til T64 er gitt i US-PS 4-297-276 (Goldstein, et al.).

Tilstedeværelse av Ta \ i human sædvæske og follikkelvæske er blitt rapportert. Se Naz et al., Int. J. Fertil. 32:375 (1987), inkorporert heri som referanse. Naz et al. rapporterte at det var en korrelasjon mellom mengden av Ta\ i sædvæske og spermtellinger og sædvolumet og at nivåene var betraktelig lavere i menn med defekt spermiefunksjon.

Fertilisering er en omfattende prosess som krever at spermatozoer gjennomgår en kaskade av hendelser før de fusjonerer med eggplasmamembranen. Denne kjeden av hendelser innbefatter kapasitasjon av spermien som bindes til zona pellucida, akrosomreaksjon og penetrering gjennom zona pellucoda som alle er beskrevet i Naz et al., Current Opin. Immunol. 2:748-751 (1990). Kapasitasjon er en fysiologisk prosess som en pattedyrspermcelle må gjennomgå før den kan fertilisere en oocyt.

Infertilitet er fortsatt et problem for en vesentlig del av populasjonen. Kumulative data indikerer at så mange som en av fire gifte par i de forente stater som ønsker å ha barn har vanskeligheter med å oppnå dette. Et antall teknikker, så som kunstig inseminasjon, mikromanipulasjon av gameter og in vitro fertilisering er blitt utviklet i de senere årene for å løse noen av årsakene til problemet. Mange av disse teknikkene er meget dyre og grad av vellykkethet har vært lav. Det eksisterer derfor et vesentlig behov for sammensetninger og in vitro fremgangsmåter nyttige for behandling av infertilitet.

Det er en hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe sammensetninger og in vitro fremgangsmåter for behandling av infertilitet i menn. Det er en spesiell hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe sammensetninger som kan behandle infertilitet hos menn forårsaket av defekt spermiefunksjon.

Foreliggende oppfinnelse angår således en sammensetning for anvendelse ved fremstilling av et medikament for å øke penetrering av hannpattedyrspermier gjennom hunnpattedyregg, kjennetegnet ved at den omfatter en effektiv mengde av et penetreringsfremmende thymosinpeptid eller et penetreringsfremmende anti-thymosin antistoff, der thymosinpeptidet er forskjellig fra thymosin ai (T ai).

En foretmkken utførelsesform angår en sammensetning ifølge oppfinnelsen, kjennetegnet ved at det penetreringsfremmende thymosinpeptid eller anti-thymosin antistoff omfatter et polyklonalt eller monoklonalt anti- Tai-antistoff eller anti-TpV antistoff.

Videre angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for å øke penetrering av hannpattedyrspermier gjennom hunnpattedyregg, kjennetegnet ved at den omfatter det å bringe spermiene til et infertilt hannpattedyr i kontakt med en penetreringsfremmende mengde av et penetreringsfremmende thymosinpeptid eller penetreringsfremmende anti-thymosin antistoff in vitro.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan omfatte:

a) samle spermier fra sæd til et infertilt hannpattedyr; og

b) inkubere sæden in vitro med en penetreringsfremmende mengde av et penetreringsfremmende thymosinpeptid eller et penetreringsfremmende anti-thymosin antistoff i en tidsperiode tilstrekkelig for å øke penetreringen av spermiene gjennom egget.

Oppfinnelsen angår også anvendelse av et penetreringsfremmende thymosinpeptid eller et penetreringsfremmende anti-thymosin antistoff for fremstilling av en sammensetning for å øke penetrering av spermier fra hannpattedyr gjennom hunnpattedyregg.

Som anvendt heri betyr et "penetreringsfremmende thymosinpeptid" et thymosinpeptid som forsterker evnen som spermiene har til å befrukte et egg. Evnen som spermien har til å befrukte et egg kan for eksempel bli forbedret ved å fremme spermiens kapasitet eller ved å forsterke den akrosomale reaksjonen til spermien og kan sees ved en økning i spermien som penetrerer eggene. Thymosin polypeptidet kan bli naturlig isolert, produsert rekombinant eller syntetisk.

Behandling med thymosinmolekyler kan bli utført enten in vitro eller in vivo. For in vitro behandling blir thymosinpeptider tilsatt spermier samlet fra sæden til et infertilt hannpattedyr og inkubert i en tidsperiode som er tilstrekkelig for å øke fertiliserings-kapasiteten til spermien, vanligvis fra omtrent 5 til 10 timer. Etter inkubasjon kan spermieprøven bli vasket og inkubert med isolert egg. Inkubasjonen kan være in vitro eller in vivo ifølge kjente teknikker.

Alternativt kan thymosinpeptidet også bli administrert in vivo.

I en annen utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse, som diskutert nedenfor, blir penetreringsfremmende anti-thymosin antistoffer administrert in vitro for å behandle infertilitet hos i menn. Som anvendt heri angir "penetreringsfremmende anti-thymosin antistoffer" polyklonale eller monoklonale antistoffer mot et thymosinpeptid som øker den penetreringsevnen til spermien. Thymosinpeptidet kan være naturlig, rekombinant eller syntetisk og innbefatter full lengde peptid og biologiske aktive analoger eller fragmenter derav. Penetreringsfremmende antistoffer innbefatter anti-TPj-antistoffer og anti-TB4-antistoffer.

Som angitt ovenfor i en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse blir spermie fra sæd fra en infertil hann samlet og behandlet med penetreringsfremmende thymosinpeptider eller penetreringsfremmende anti-thymosin antistoffer før inkubasjon med egg.

I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir spermiene samlet i en suspensjon ved en konsentrasjon på 5-10 x IO<6> motile spermier per ml, og konsentrasjonen av thymosinpeptidet er innenfor området 0,05 til 10ng per 100 ul spermiesuspensjon, eller konsentrasjonen av anti-thymosin antistoffet er innenfor området fra 5 til 25 ul antiserum per 100 ul spermiesuspensjon.

Fremgangsmåter for samling av sæd er kjent for fagfolk innenfor dette området og oppfinnelsen er ikke rettet mot slike fremgangsmåter. Sæden vil fortrinnsvis bli gjort flytende og "swim-up" spermiepopulasjonen blir samlet. Flytendegjøringen vil fortrinnsvis oppstå ved oppvarming i 15-30 minutter ved 37°C. En slik fremgangsmåte er beskrevet i Naz et al., J. Cell Sei., 99:157-165 (1991). Oppsamlede spermieceller fra "swim-up" danner en spermiesuspensjon som blir vasket. Egnet medium for suspendering og vaskeprosedyrene innbefatter Biggers, Witten og Wittingham ("BWW") medium og Hams F-10 medium (oppnådd fra Gibco, N.Y.). Det er foretrukket å tilsette mediet bovint serumalbumin ("BSA"). En 1% tilsetning er tilstrekkelig til tross for at andre tilsetninger kan bli anvendt. Spermiekonsentrasjonen til prøven blir justert etter behov. Egnede konsentrasjoner hører inn under området på fra omtrent 5 til omtrent 10 x 10*> motile spermier pr. milliliter medium. Spermien blir deretter inkubert med penetreringsfremmende thymosinpeptider. Inkubasjonen blir fortrinnsvis utført ved omtrent 37°C under en karbondioksid forsterket atmosfære. En foretrukket atmosfære er blitt bestemt til å omfatte 95% luft og 5% karbondioksid. Inkubasjonstiden kan variere. Vanligvis varierer inkubasjonstiden fra omtrent 5 til omtrent 10 timer, fortrinnsvis fra omtrent 5 til 8 timer, er tilstrekkelig for å muliggjøre at kapasitasjon oppstår.

Mengden av thymosin som blir tilsatt til den spermieinneholdende prøven kan også variere. Effektive konsentrasjoner kan bli bestemt av fagfolk innenfor dette området ut fra det som blir beskrevet i foreliggende oppfinnelse. Vanligvis er konsentrasjonen innenfor området på omtrent 0,05 til omtrent 10 mikrogram pr. 100 mikroliter av spermiesuspensjonen. Konsentrasjonen av thymosin er fortrinnsvis innenfor området på omtrent 0.05 til omtrent 0.5 mikrogram pr 100 mikroliter av spermiesuspensjonen. Bestemmelse av en egnet mengde kan bli utført av personer innenfor dette fagområdet basert på tidsmengden som er nødvendig for at spermien kapasiterer. Tilstrekkelig thymosin blir tilsatt for å muliggjøre at spermien kapasiterer innenfor omtrent 5 til 10 timer.

Etter inkubasjonsperioden blir spermien vasket med medium som igjen fortrinnsvis er supplementer! med 1% BSA. Ved denne grensen er spermien klar for å bli inkubert med oocyter. Kontakten kan være enten in vitro eller ved kunstig inseminasjon eller in vivo. Egg kan dermed bli isolert fra kvinner og befruktet med den behandlede spermien før ^implantering. Alternativt kan thymosin-behandlet spermie bli inkubert med egg in vivo. Teknikker for applikasjon i begge tilfeller er kjent for fagfolk innenfor dette området.

Som et alternativ til behandling av spermie cellene med en effektiv mengde av en penetreringsfremmende thymosin kan spermie cellene bli behandlet med en effektiv mengde av et penetreringsfremmende anti-thymosin antistoff. Egnede antistoffer innbefatter anti-thymosin antistoffer som er effektive når det gjelder å stimulere spermie

penetreringsgraden som ved øking av spermiekapasitasjonen.

I foretrukne utførelsesformer ifølge oppfinnelsen blir antistoffer valgt fra antistoffer mot Tcq og T64. Slike antistoffer kan omfatte polyklonale antisera eller monoklonale antistoffer. Monoklonale antistoffer kan for eksempel omfatte muse eller humane monoklonale antistoffer. Generelt er teknikker for dannelse av monoklonale antistoffer kjent Se for eksempel Naz et al., Science, 225:342-344 (1984) og Naz et al., PNAS USA, 83:5713-5717 (1986). Dersom polyklonale antistoffer blir anvendt kan de omfatte polyklonalt antiserum fra pattedyr så som kaniner, mus eller rotter. For å oppnå foretrukket antiserum kan Toq eller T64 bli koblet til et egnet bærerprotein. Slike bærerproteiner er kjent for fagfolk innenfor dette området og innbefatter for eksempel heyhole limpet hemocyanin (KLH), difteri toksoid; tetanus toksoid, thyroglobulin, humant serum albumin osv. Koblingen blir utført ved anvendelse av teknikker kjent innenfor fagområdet Kjente koblingsmidler kan bli anvendt. Et foretrukket koblingsmiddel er glutaraldehyd.

Når egnede immunogener er oppnådd blir valgte dyr immunisert. Egnede immumseringsteknikker er kjent innenfor dette området. Vanligvis blir kanin eller annet dyr injisert intramuskulært og subkutant med immunogenet emulgert i Freuds fullstendige adjuvans. I det booster skjemaene kan variere blir foretrukne boostre administrert ukentlig etter to uker. Boostring kan fortsette etter behov. Det er blitt oppdaget at tre uker med boostring er tilstrekkelig, for eksempel når kaniner anvendes. Ved forskjellige tidspunkter i løpet av immuniseringsprosessen kan blod bli tappet fra dyret og titret for tilstedeværelse av ønsket antistoff. Vanligvis vil dyrene en uke etter siste booster bli blodtappet og antiseraet titret. Om ønskelig kan antistoffene deretter bli afff nitetsrenset ved anvendelse av en protein-A sepharose kolonne. Det eksisterer forskjellige teknikker for blodtapping av dyr. Som kjent for fagfolk innenfor dette området omfatter boosteradministreringer av immunogene vanligvis immunogenet emulgert med Freuds ufullstendige adjuvans.

Når antistoffet blir anvendt i en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen blir de inkubert med en spermiesuspensjon som tidligere beskrevet for inkubasjon med thymosinpeptider. Vanligvis kan antistoffkonsentrasjonen variere fra omtrent 5 til omtrent 25 mikroliter av antiserum pr. 100 mikroliter spermiesuspensjon; Som en eksempelvis illustrasjon, som ikke skal virke begrensende, utgjør et foretrukket konsentrasjonsområde for både T_i og TB4 antisera fra omtrent 10 til omtrent 20 mikroliter antiserum pr. 100 mikroliter spermiesuspensjon, eller omtrent 2 ug til omtrent 10 ug spesifikt IgG pr 100 ul. Etter endt inkubasjonsperiode blir spermiecellene vasket. I dette tilfellet fjerner vaskingen ureagert antistoff. De vaskede spermiecellene kan deretter bli inkubert med egg som angitt ovenfor.

Sammensetninger ifølge oppfinnelsen omfatter en farmasøytisk doseenhet for injeksjon eller en farmasøytisk doseenhet for innføring i den hunnlige vagina, der doseenheten for injeksjon inkluderer en farmasøytisk akseptabel bærer og thymosinpeptidet ved 900 til 1200 ug/m<2> pattedyrkroppsoverflateareal i den farmasøytisk akseptable flytende bæreren, der doseenheten for hunnlig vaginainnføring omfatter en langsom frigivelseskapsel som inkluderer 4-6 mg thymosinpeptid. Lyofiliserte preparater av thymosinpeptidet som inneholder mannitol og fosfatbuffer blir løst opp i fortynningsmiddel før dispergering. Det er hensiktsmessig å dispergere thymosin i 1 ml dosebeholdere.

Oppfinnelsen omfatter sammensetningen for anvendelse til å øke prosentandelen av akrosomreagert spermie, kjennetegnet ved at den omfatter en farmasøytisk doseenhet som inkluderer en akrosomreaksjons-induserende mengde av nevnte penetreringsfremmende thymosinpeptid eller nevnte penetreringsfremmende anti-thymosin antistoff.

I mennesker utgjør et administreirngsregime to ganger ukentlige injeksjoner på omtrent 1500 til omtrent 1700 ug. Doseringer og lengder på behandling kan være fleksibelt og kan bli bestemt ut fra pasientens kliniske respons overfor thymosin.

Thymosinpeptidet kan bli formulert til kapsler med biokompatibel sakte frigivelse som blir implantert inn i vaginal kanalen til et hunnpattedyr. Kapselen vil sakte frigi thymosinet over tid inn i vagina hvor det kan reagere med spermie fra den infertile hannen for å øke spermiens fertiliserende kapasitet. Fremgangsmåter for fremstilling av biologiske kompatible kapsler med sakte frigivelse er velkjente innenfor fagområdet. Et eksempel på en egnet kapsel er beskrevet i Radomsky, et al., Biol. of Reproduction, 47:133-140 (1992). En kapsel for implantering i en kvinne kan inneholde omtrent 4 til omtrent 6 mg thymosinpeptid.

Uten å være bundet til noen teori antas at spermieceller fra pattedyr behandlet med penetreringsfremmende thymosinpeptid eller anti-thymosin-antistoffhar forsterket kapasitasjon og akrosomreaksjon som kan danne grunnlaget for deres forsterkende fertiliseringskapasitet. Spermieceller behandlet som tidligere beskrevet er blitt vist å frigi høye mengder av akrosin i supernatanten sammenlignet med ikke-behandlede spermieceller. En utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfatter følgelig en fremgangsmåte for å øke spermiekapasitasjonen, en fysiologisk hendelse hvorved spermiecellene gjennomgår forskjellige fysiologiske og biokjemiske forandringer som muliggjør at de penetrerer eggcellemembranene, som omfatter det å bringe spermien i kontakt med en kapasitasjonsøkende mengde av et penetreringsfremmende thymosinpeptid eller anti-thymosin antistoff. Mengder nødvendig for slik virkning er blitt beskrevet ovenfor.

Eksempel 1 - Fremstilling av polvklonalt antisera

Tcci og TB4 ble kEgglent koblet til keyhole limpet hemocyanin (KLH) ved anvendelse av like mengder antistoff og KLH i nærvær av glutaraldehyd. Unge voksne New Zealand kaniner ble injisert ved intramuskulære og subkutane seter med Ta j -KLH eller T64-KLH emulgert med Freuds fullstendige adjuvans. Etter to uker ble kaninene immunisert med de respektive antigenpreparatene ukentlig i tre uker. Booster i løpet av disse tre ukene ble emulgert med ufullstendig Freuds adjuvans. En uke etter siste injeksjon ble dyrene blodtappet ved retroorbital punktering og antisera ble titret ved anvendelse av en radioimmunoanalyse.

For å tilveiebringe kontrollantisera ble samme prosedyre fulgt med unntagelse av at kaninene ble injisert med samme mengde KLH uten koblet thymosinpeptider eller med KLH konjugert til et kontroll 30 aminosyre langt peptid betegnet HGP-30. Dette peptidet er beskrevet i Achour, A., et al., PNAS USA 87:7045 (1990). Alle antisera ble varmeinaktivert ved en temperatur på 56°C i 30 minutter og lagret ved -20°C frem til bruk.

Eksempel 2 - Analyse av antistoffbinding med humane spermier

Antistoffer preparert i eksempel 1 ble analysert for deres binding med metanol-fiksert human spermie i en indirekte, immunofluorescensteknikk (IFT) som beskrevet av Naz et al. Proe. Acad. Sei., 81:857-861 (1984). Sædprøvene oppnådd fra fertile menn ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i Naz et al., J. Cell Sei. 99:157-165 (1991), ble vasket i PBS. En "oppsvømnings" populasjon av sterkt motile spermier ble samlet og på ny vasket i PBS og deretter lufttørket på ét bbjektglass og fiksert med metanol i 30 minutter ved romtemperatur. Deretter ble objektglasset luft-tørket og behandlet med antisera ved en 1:50 fortynning med fosfatbuffret saltvann (PBS) ved romtemperatur i 1 1/2 time i et fuktkammer. Antistoffbindingen ble lokalisert ved inkubering med fluorescein-merket geite anti-kanin antistoffer (1:50 fortynning), (Cappel Labs., Malvourne, PA.). Objektglassene ble vasket med PBS tre ganger, applisert i 90% glycerol i PBS inneholdende natriumazid (0.1%) og 1,4-diazabicyklo (2,2,2) oktan (10 milligram pr. milliliter) for å redusere fotoblekingen i løpet av observasjonen. Prøvene ble oppbevart ved 4°C i et fuktekammer helt til de ble undersøkt.

Anti-Toq antistoff demonstrerte binding hovedsakelig med akrosomale regioner til metanol-fikserte humane spermieceller i IFT. Anti-TB4 antistof freagerte også sterkt med akrosomale regioner og reagerte svakt med haleregionene til metanol-fikserte spermieceller. Absorpsjonen av disse antistoffene med Toq eller TB4 (20 ul av antistoff og 20 ug Toq eller TB4) absorberte signifikant ut immunreaktiviteten til antistoffene med spermieceller. Normalt kaninserum eller anti-KLH konjugat antistoffer reagerte ikke med metanol-fikserte spermieceller.

Eksempel 3 - Spermie penetrerinesanalvse

Human spermie penetreringsanalyse til zona-fritt-hamster oocyter (SPA) ble utført som beskrevet i Naz et al., J. Cell. Sei., 102:487-494 (1992). Superovulasjon ble indusert i voksne hunn golden hamstere ved intraperetoneale injeksjoner av 30IU eCG (gravid mare serumgonadotropin) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) på dag 1 av syklusen. Etter 55-72 timer ble 20 IU hCG (humant chorionisk gonadotropin) (Sigma) administrert intraperetonealt. 15-17 timer senere ble dyrene ofret og modent ufertilisert egg ble samlet fra oviduktene. egg ble separert fra omgivende kumulus celler ved inkubasjon med 0.2% hyaluronidase i Biggers, Witten og Wiitngham (BWW) medium og fra zona pellucida ved behandling med 0.1% bukspyttkjerteltrypsin i BWW. Zona-fritt egg ble to ganger vasket i BWW og plassert i midten av en vevskulturskål.

Sæd fra en fertil mann ble gjort flytende i 15-30 minutter ved 37°C og "oppsvømnings" spermiepopulasjonen ble samlet. Samlingsteknikkene er beskrevet i Naz et al., J. Cell. Sei., 99:157-165 (1991). Spermiecellene fra "oppsvømningen" ble vasket med BWW tilsatt med 1% BSA (Sigma Chemical Co.) justert til 5-10 x 10^ motile spermier pr. milliliter og deretter inkubert i 5-6 timer ved 37°C (i 5% CH2 og 95% luftblanding) med Toq eller TB4 (0.1-10 mikrogram pr. 100 milliliter av spermiesuspensjonen) eller polyklonalt antisera utløst i respons til irnmunogenene (10-20 mikroliter av antiserum/100 mikroliter spermiesuspensjon) eller samme mengde av kontrollantistoffer (normalt kaninserum, anti-KLH antistoffer eller anti-HGP-30 antistoffer) eller ekvivalent volum av PBS inneholdende 0.5% BSA (PBS/BSA). Etter inkubasjon ble spermiene vasket for å fjerne ureagert thymosin eller anti-thymosin-antistoff og koinkubert med zona-strippede hamster oocyter (30-50 egg/behandling i hver analyse) i tre til fire timer. Oocytene ble fjernet, grundig vasket, fiksert med 3% glyceraldehyd og farget med acetocarmin oppløsning. Spermiepenetreringen ble bestemt ved tilstedeværelse av et oppsvellet spermiehode med en tydelig hale i cytoplasma til ovum. Motiliteten til spermien før og etter inkubasjon med egg ble registrert. Analysene ble gjentatt minst 3-8 ganger ved anvendelse av forskjellige fertile donorer og hver prøve ble testet med minst 82-480 oocyter.

Prosentandel egg som ble penetrert ble beregnet ifølge følgende formel:

Ved anvendelse av denne analysen ble det bestemt at omtrent 93-108% av egg ble penetrert med spermie fra fertile menn i det et gjennomsnitt på en spermie penetrerte pr. oocyt. Resultatene av analysen er vist i tabell 1.

Som det fremgår fra tabell 1 øker Tcq betraktelig (P < .001) (opp til 2.6 ganger) prosentandelen av egg penetrert sammenlignet med PBS-BSA-behandlede kontrollspermier, testet i en konsentrasjon på 0.05 til 0.5 ug Toq/100 ul spermiesuspensjon.

Som vist i tabell 2 økte antistoffer mot både Toti og TB4 betraktelig (P<.001) (opptil 4.7 ganger) penetreringsratene på en konsentrasjonsavhengig måte. Antistoffer til KLH bærer, til HGP-30/KLH konjugat eller normalt kaninserum testet ved samme konsentrasjon (20 ul/100 ul) påvirket ikke penetreringsratene sammenlignet med PB S/B SA behandlet kontrollspermie. Immunoabsorpsjon av anti-Tcq og anti-T64-antistoffer med respektive peptider forårsaket en signifikant (P< .001) reduksjon i penetreringsfremmende aktiviteten til antistoffet.

SPA ble også utført på infertile (n=18) og fertile menn (n=5), som vist i tabell 3 ifølge fremgangsmåten til Syms et al., Fertil. Steril. 43:766 (1985). I denne analysen ble flytendegjort sæd kombinert med et likt volum forvarmet (37°C) testen forsøkseggeplommebuffer (beskrevet for eksempel i Naz et al., J. Cell Sei., 99:157

(1991)) og kapasitert i 24 timer ved 4°C. Spermien ble deretter vasket, tilsatt til zona-frie hamster oocyter og antall spermier penetrert pr. ovum ble bestemt ved fremgangsmåten beskrevet ovenfor. 100% egg ble penetrert med spermie fra fertile menn, med et gjennomsnitt på 26.2-34.9 spermie penetrert pr. oocyt (tabell 3). Dersom spermiefunksjonen var unormal var det en reduksjon i antall spermier som ble penetrert pr. oocyt og også en reduksjon i prosent egg som ble penetrert dersom avvikene til spermiene var alvorlige. Ta nivåene var betydelige (P= 002) lavere i sædvæske til infertile menn sammenlignet med de til fertile menn (gjennomsnitt ± S.D., infertile menn, 1321.89 ± 516.63; fertile menn 2962.20 ± 1811.25). Nivåene av Tai korrelerte betydelig (R=0.566, P var < 0.01) innenfor antall spermie pr. ovum ifølge SPA (tabell 3).

Eksempel 4 - Vurdering av akrosomreaksion

Virkningen til thymosinpeptider og deres antistoffer ble undersøkt ifølge human spermie akrosomreaksjon. Virkningen på akrosomreaksjonen ble vurdert ved å bestemme akrosomal status til spermien etter inkubasjon med antistoffer eller peptider samt ved studering av akrosin fordelingen etter akrosomreaksjonen.

a. Vurdering av akrosomalstatus

Motile spermier ble samlet fra fertile menn ved "oppsvømnings"-prosedyren som beskrevet i Naz et al., angitt ovenfor. Spermieprøver med god kvalitet, dvs. (5x10^ motile spermier pr. milliliter), høyere enn 75% dødelighet, +3 til +4 foroverprogresjon på en skala fra 0 til +5 ble inkubert med Ta\ eller T64 eller anti-Taj antistoffer eller anti-T04 antistoffer. Kontrollene ble behandlet med samme mengde normal kanin serum, anti-KLH antistoffer, anti-HGP 30 antistoffer eller PBS-BSA som tidligere beskrevet. Etter inkubasjon ble spermatozoene sentrifugert, vasket i PBS og delt inn i to alikvoter. En alikvot ble indusert til akrosom reagert med kalsium ionofor (Calcium ionophore A23187 (Sigma)) 0g inkubert med spermiesuspensjon i 1 time. Den andre alikvoten ble latt spontant akrosomreagere uten behandling med kalsiumionofor. Kalsiumionoforbehandling ble utført for å indusere akrosomreaksjonen til kapasitert spermie. Akrosomal statusen ble vurdert ved anvendelse av trippelfarveprosedyren beskrevet av Jager et al., Arch. Androl., 12:53-58 (1984). Spermien ble vasket to ganger 1 PBS og deretter inkubert ved 37°C i 15 minutter med 2% trypan blå (Sigma 1:1 v/v) i

PBS. Etter inkubasjon ble spermien vasket to ganger, fiksert i 3% glutaraldehyd, 0.1 M cacodylat buffer i 60 minutter og deretter vasket to ganger på ny i PBS. En dråpe av

denne suspensjonen ble plassert på et objektglass og lufttørket over natt. Det tørkede objektglasset ble farget med 0.8% Bismark Brown (Sigma) i deionisert vann (pH 1.8 med 2N HC1), skylt i deionisert vann og farget i 45 minutter ved romtemperatur i 0.8% Rose Bengal (Sigma) i 0.1M cacodylat buffer ved pH 6.0. Objektglassene ble på ny vasket i deionisert vann, dehydrert i en alkoholserie, klaret i xylen og applisert med

permount og et objektglass. Totalt 200-500 spermier pr. prøve ble vurdert og registrert som enten levende eller døde. Levende spermier ble ytterligere vurdert som akrosom-intakte eller akrosom-ikke-intakte (reagert) spermier. Eksperimentene ble gjentatt 3-5 ganger ved anvendelse av spermier med minst tre forskjellige fertile donoer.

Taj når testet ved en konsentrasjon på 0.5 mikrogram/mikroliter (dose hvorved Ta\ betraktelig øker penetreringsratene) øker betraktelig kapasitasjonen og akrosomreaksjonen til humane spermieceller (tabell 4). Ved inkubasjon med Tcq i 5-6 timer demonstrerte prøven betraktelig høyere prosentandeler av akrosom-reagert spermie sammenlignet med spermieprøver behandlet med PBS-BSA (tabell 4). Spermieprøvene behandlet med Tcq viste en høyere prosentandel av akrosom-reaktive spermier dersom de ble testet for spontan akrosom reaksjon (uten ionoforbehandling) eller undersøkt etter ionofor-indusert akrosomreaksjon. Virkningene var mer uthalte etter ionoforbehandling. TB4 utviste ikke en signifikant effekt.

Antistoffene mot både Tcq og TB4 forårsaket en signifikant økning i prosentandel av akrosom-reagert spermie (tabell 4). Virkningene var på ny tidlige enten de ble undersøkt for spontan akrosomreaksjon eller undersøkt etter ionofor-indusert akrosom reaksjon av antistoff-behandlet spermie, til tross for at virkningene var mer uthalte etter ionofor-behandlingen. Ingen signifikant virkning på prosentandelen av akrosom-reagert spermie ble observert ved behandling med antistoffer mot KLH eller antistoffer mot HGP-30 peptid/KLH konjugat sammenlignet med PBS-BSA kontroll.

B. Vurdering av akrosin fordelingen

Etter inkubasjon med thymosin peptidene eller anti-thymosin antistoffer eller kontrollantistoffer eller PBS-BSA og med eller uten behandling med kalsiumionofor A23187 i 1 time som beskrevet ovenfor ble spermiecellene sentrifugert og akrosinaktiviteten bestemt i supernatanten og cellene ifølge fremgangsmåten til Kennedy et al., J. Androl., 10:21-27 (1989). 90 mikroliter av supernatanten eller pelleterte spermieceller suspendert i 90 mikroliter PBS ble blandet med en milliliter av reaksjonsblandingen. Reaksjonsblandingen omfatter et milligram pr. milliliter av N-benzoyl-dl-arginin-P-nitranilin (BAPNA) hydroklorid i 0.055M HEPES buffer, 0.055 M NaCl, 10% v/v (dimetylsulfoksid), 0.1% v/v (triton-x-100). Oppløsningen ble deretter inkubert 13 timer ved romtemperatur. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 100 mikroliter 0.5M benzamidin og absorbansen ble målt ved 405 nanometer ved anvendelse av et Beckman spektrofotometer. Akrosinaktiviteten ble uttrykt som mikro IU/I0<6> spermatozoer. Den daglige variabiliteten til analysen ble normalisert ved anvendelse av et kryokonservert delvis-renset humant akrosinekstrakt. Preparering av slike ekstrakter er beskrevet av Naz et al., J. Cell. Sei., 102:487-494 (1992).

Inkubasjon med Ta\ (0.5 mikrogram/100 mikroliter), anti-Ta^ antistoff (20 mikroliter/100 mikroliter) eller anti-Tfi4 antistoff (20 mikroliter/100 mikroliter) demonstrerte en betydelig høyere mengde av akrosinkonsentrasjon frigjort i supernatanten og en lavere mengde akrosin konsentrasjon i spermieceller sammenlignet med PBS-BSA behandlet spermie (tabell 4) (P=0.004 til mindre enn 0.001). Virkningene var tydelige ved investigering med eller uten ionoforbehandling til tross for at virkningene var betydeligere etter ionoforbehandling. Ingen av kontroll antistoffene demonstrerte noen virkning på akrosinfordelingen av spermiecellene. TB4 utviste ingen signifikant virkning.

C. Spermie beve<g>elsesanalvser

Etter inkubasjon med thymosin peptider eller antistoffene derav i 5 til 6 timer som beskrevet ovenfor ble en alikvot (7 mikroliter) av spermiesuspensjonen plassert i en Makier beholder (Sefi Medical Instruments, Israel) og karaktertrekkene ved spermiebevegelsen ble målt ved anvendelse av en datastyrt sædanalysator (Cell Soft Cryo Resources, New York). Parameter innstillingene var 30 rammer analysert ved en billeddannende frekvens på 30 Hz, 3 rammer (frames) minimale prøver for motilitet, 15 rammer-minimale prøver for både hastighet og amplitude til lateral hodebevegelse ("ALH") målinger, 10 mikrometer pr. sekund terskelhastighet, minimal liniaritet på 2.5 for ALH målinger og et cellestørrelsesområdet på 4-40 pixeles med en forstørrelseskalibrering på 0.688 mikrometer pr. pixel.

Ingen virkning på prosentandel av motile spermieceller i prøven ble oppdaget ved behandling med enten Toq, TB4 (0.5 mikrogram pr. 100 mikroliter) eller deres respektive antistoffer (20 mikroliter pr. 100 mikroliter). Tcci, antistoffer mot TBi og antistoffer TB4 påvirket betydelig hastigheten, ALH og "slå" frekvensen til spermiecellene. Virkningene var tidligere på økningen i ALH og "slå" frekvensen. Verken TB4 peptidet eller kontrollantistoffene påvirket motilitetskaraktertrekkene til spermiecellene sammenlignet med PBS-BSA behandlet kontroll (tabell 5).

Claims (11)

1. Sammensetning for anvendelse ved fremstilling av et medikament for å øke penetrering av hannpattedyrspermier gjennom hunnpattedyregg, karakterisert ved at den omfatter en effektiv mengde av et penetreringsfremmende thymosinpeptid eller et penetreringsfremmende anti-thymosin antistoff, der thymosinpeptidet er forskjellig fra thymosin aj (T ai).

2. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert ved at det penetreringsfremmende thymosinpeptid eller anti-thymosin antistoff omfatter et polyklonalt eller monoklonalt anti-Tai-antistoff eller anti-TpVantistoff.

3. Sammensetning ifølge krav 2 for økning av penetreringen av hannpattedyrspermier gjennom hunnpattedyregg in vitro ved å bringe en spermiesuspensjon i kontakt med et egg, karakter isert ved at sammensetningen omfatter en farmasøytisk doseenhet som omfatter thymosinpeptidet i et område fra 0,05 til 10 ug per 100 ul spermiesuspensjon, eller anti-thymosin antistoffet ved en konsentrasjon fra 5 til 25 ul antiserum per 100 ul spermiesuspensjon.

4. Sammensetning ifølge krav 2, karakterisert ved at sammensetningen omfatter en farmasøytisk doseenhet for injeksjon eller en farmasøytisk doseenhet for innføring i den hunnlige vagina, der doseenheten for injeksjon inkluderer en farmasøytisk akseptabel bærer og thymosinpeptidet ved 900 til 1200 ug/m<2> pattedyrkroppsoverflateareal i den farmasøytisk akseptable flytende bæreren, der doseenheten for hunnlig vaginainnføring omfatter en langsom frigivelseskapsel som inkluderer 4-6 mg thymosinpeptid.

5. Sammensetning ifølge krav 2 for anvendelse til å øke prosentandelen av akrosornreagert spermie, karakterisert ved at den omfatter en farmasøytisk doseenhet som inkluderer en akrosomreaksjons-induserende mengde av nevnte penetreringsfremmende thymosinpeptid eller nevnte penetreringsfremmende anti-thymosin antistoff.

6. Fremgangsmåte for å øke penetrering av hannpattedyrspermier gjennom hunnpattedyregg, kar akterisert ved at den omfatter det å bringe spermiene til et infertilt hannpattedyr i kontakt med en penetreringsfremmende mengde av et penetreringsfremmende thymosinpeptid eller penetreringsfremmende anti-thymosin antistoff m vitro.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at den omfatter: c) samle spermier fra sæd til et infertilt hannpattedyr; og d) inkubere sæden in vitro med en penetreringsfremmende mengde av et penetreringsfremmende thymosinpeptid eller et penetreringsfremmende anti-thymosin antistoff i en tidsperiode tilstrekkelig for å øke penetreringen av spermiene gjennom egget.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at spermiene blir samlet i en suspensjon ved en konsentrasjon på 5-10 x IO6 motile spermier per ml, og konsentrasjonen av thymosinpeptidet er innenfor området 0,05 til lOjig per 100 ul spermiesuspensjon, eller konsentrasjonen av anti-thymosin antistoffet er innenfor området fra 5 til 25 ul antiserum per 100 ul spermiesuspensjon.

9. Anvendelse av et penetreringsfremmende thymosinpeptid eller et penetreringsfremmende anti-thymosin antistoff for fremstilling av en sammensetning for å øke penetrering av spermier fra hannpattedyr gjennom hunnpattedyregg.

10. Anvendelse ifølge krav 9, der det penetreringsfremmende thymosin peptid eller anti-thymosin antistoff omfatter thymosin ai (Toti), et biologisk aktivt analog eller fragment av Toti, polyklonalt eller monoklonalt anti- Toti-antistoff eller anti-TpYantistoff.

11. Anvendelse ifølge krav 9, der sammensetningen er en farmasøytisk doseenhet som omfatter thymosinpeptidet i området 0,05 -10 ug per 100 ul spermiesuspensjon, eller anti-thymosin antistoff i en konsentrasjon i området fra 5 - 25 ul antiserum per 100 ul spermiesuspensjon.