NO333579B1 - Anvendelse av kopolymer 1 for fremstilling av en farmasoytisk sammensetning for behandling av inflammatoriske tarmsykdommer. - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelsen av Kopolymer I (glatiramer acetat), et Kopolymer I -relatert polypeptid, eller et Kopolymer I -relatert peptid, for behandling av inflammatoriske tannsykdommer, slik som Crohns sykdom og ulcerativ kolitt.

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse farmasøytiske sammensetninger for behandling av inflammatoriske tarmsykdommer (IBD), spesielt Crohns sykdom og ulcerøs kolitt.

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Inflammatoriske tarmsykdommer (IBD) er navnet på en gruppe relaterte sykdommer som rammer fordøyelseskanalen, hovedsakelig Crohns sykdom og ulcerøs kolitt, to alvorlige gastrointestinale forstyrrelser med høy hyppighet (mer enn én av 500 amerikanere har en type av inflammatorisk tarmsykdom) og invalidiserer mange pasienter, og er en betydelig belastning for helsevesenet. Pasienter kan ha diaré, kvalme, oppkast, abdominale kramper og smerter kan være vanskelig å kontrollere. IBD karakteriseres ved kronisk overdreven destruksjon av kolon (i ulcerøs kolitt), eller den lille eller store tarmen (i Crohns sykdom) pga. infiltrering av tarmveggen ved inflammatorisk infiltrering.

Patogenese av IBD involverer interaksjoner blant lokale mikroorganismer i omgivelsene, genetisk mottakelighet og immunsystemet. Flere mikroorgansimer, bakterier og virus impliseres som etiologiske midler av IBD, ingen bevis for en bestemt rolle for et infeksiøst middel er imidlertid tilveiebrakt. Nyere data antyder noen mottakelige gener, men fortsatt kreves utstrakte studier for å identifisere de spesifikke genene som er ansvarlige for infeksjon av slike sykdommer. Mens egenskapen til begge mulige infeksiøse midler og genetiske endringer forblir uklare, er det oppnådd stor fremgang i forståelse av immunmekanismene som er ansvarlige for IBD-patogenese, spesielt Crohns sykdom.

CD4+Thl -celler er identifiserte som sentrale formidlere i Crohns sykdomspatogenese. Disse viser begrenset, men variabel TCR-repertoar. INF-y frigjort ved disse TH1-cellene aktiverer lokale makrofager til å produsere proinflammatoriske cytokiner og toksiske metabolitter, nærmere bestemt TFN-a og nitrogenoksid (NO), som forårsaker skade på tarmepitelet og opprettholder transmural inflammasjon. Denne kronisk unormale Th 1-respons opprettholdes ved opphevelse av toleranse for komponenter av tarmfloraen eller dens produkter, som resulterer i en autoimmunliknende prosess. Fordi et spesifikt vertsantigen ikke er identifisert, er IBD ikke genuine, autoimmune sykdommer. Pga. av dens immune egenskap kan IBD imidlertid sees på som sådan. Kopolymer 1 (Copl, glatirameracetat eller GA) er en ikkepatogen, syntetisk tilfeldig kopolymer bestående av de fire aminosyrene: L-Glu, L-Lys, L-Ala og L-Tyr (heretter betegnet "Copl" eller "GA"), er nå et godkjent medikament for behandling av multippel sklerose under navnet "Copaxone" (Sela og Teitelbaum, 2001). Det er et meget godt tolerert middel med kun få ugunstige reaksjoner og med høy sikkerhetsprofil. Behandling med Copl ved inntak eller inhalering er angitt i U.S. 6 214 791.

Nylig ble det funnet at i Copl gir en fordelaktig effekt i dyremodeller mot flere forstyrrelser. Copl undertrykker således den åpenbare immunawisningen av implantat kontra vertssykdom (GVHD) i tilfelle benmargstransplantasjon (Schlegel et al., 1996; US 5 858 964), så vel som implantatawisning i tilfelle av organtransplantasjon (Aharonie/ al, 2001).

WO 01/52878 og WO 01/93893 beskriver at Copl, Copl-relaterte peptider og polypeptider og T-celler som aktiveres dermed beskytter CNS-celler fra glutamattoksisitet og forhindrer/hemmer neuronal degenerering eller hjelper nerveregenerering i CNS og det perifere nervesystemet. Copl er således for eksempel under vurdering som en terapeutisk vaksine for neurodegenererende sykdommer, som optiske neuropatier og glaukom (Kipnis og Schwartz, 2002).

Copl og relaterte kopolymerer og peptider er beskrevet i WO 00/05250 (Aharoni et al, 2000), og anses som del av denne beskrivelsen for behandling av autoimmune sykdommer. Selv om kolitt er nevnt blant de autoimmune sykdommer er ingen protokoll eller noen eksempler angitt for testing av kolitt i den nevnte søknad.

Tilgjengelige medisinske behandlinger for IBD er nokså utilfredsstillende. En skadelig immunrespons mot lokale mikroorganismer, som hovedsakelig involverer CD4+ Thl-celler, og ubalanse mellom henholdsvis pro- og anti-inflammatorisk reaktivitet spiller en rolle i patogenesen av IBD, spesielt i Crohns sykdom (CD) (MacDonald et al., 2000; Shanahan, 2001). Nåværende medisinske behandlinger for IBD avhenger av anvendelse av uspesifikke, antiinflammatoriske medikamenter som kortikosteroider, så vel som immunundertrykkende medikamenter (Shanahan, 2001). Disse behandlingene bare lindrer symptomene og modifiserer imidlertid ikke sykdomsforløpet, mens de induserer kraftige bivirkninger som begrenser disses anvendelse. Videre er betydelig prosentandel av pasientene steroidresistente. Det er derfor et virkelig behov for nye, godt tolererbare terapier som effektivt induserer bedring og endrer sykdommens naturlig forløp. Basert på CD's immunpatologiske karakter, forsøker nye immunmodulatoriske strategier å avlede de CD4+ patogene T-celler fra Th 1-inflammatorisk til Th2-antiinflammatorisk fenotype (Shanahan, 2001; Sandborn og Targan, 2002; van Deventer, 2000).

SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN

I samsvar med foreliggende oppfinnelse er det nå funnet at behandling av 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre (TNBS)-induserte kolittmus med Copl kan beskytte musene fra sykdommen.

Foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av Kopolymer 1, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av en inflammatorisk tarm sykdom.

Det er imidlertid mulig å skaffe tilveie en fremgangsmåte for behandling av en pasient som lider av en inflammatorisk tarmsykdom (IBD), som omfatter tilførsel til nevnte pasient av en effektiv mengde aktivt middel, valgt fra gruppen bestående av Copl, et Copl-relatert polypeptid og et Copl-relatert peptid. Blant effektene som oppnås ved denne behandling inkluderes for eksempel reduksjon av sykdomsprogresjon, lindring av sykdomssymptomer, undertrykkelse av den inflammatoriske prosess og/eller hindring av videre sykdomsforverring.

Den inflammatoriske tarmsykdom (IBD) som behandles, er enhver sykdom der ugunstig immunreaktivitet åpenbares i tarmen, spesielt Crohns sykdom og ulcerøs kolitt.

Det er også mulig å tilveiebringe en farmasøytisk sammensetning for behandling av en inflammatorisk tarmsykdom (IBD), spesielt Crohns sykdom og ulcerøs kolitt, omfattende et aktivt middel valgt fira gruppen bestående av Copl, et Copl-relatert polypeptid og et Copl-relatert peptid, og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer.

I tillegg til anvendelse i følge foreliggende oppfinnelse som beskrevet over, er det også mulig å anvende et aktivt middel valgt fra gruppen bestående av, et Copl-relatert polypeptid og et Copl-relatert peptid, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av en inflammatorisk tarmsykdom (IBD), spesielt Crohns sykdom og ulcerøs kolitt.

En artikkel for fremstilling er også mulig å frenskaffe, som omfatter emballasje og en farmasøytisk sammensetning oppbevart i emballasjen, der den farmasøytiske sammensetning omfatter et middel som kan velges fra gruppen bestående av Kopolymer 1, et Kopolymer 1-relatert polypeptid og et Kopolymer 1-relatert peptid; der nevnte emballasje inkluderer en påskrift som indikerer at nevnte middel er terapeutisk effektivt for behandling av inflammatorisk tarmsykdom.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figurene 1A-1C viser effekten av oral behandling ved Copl (glatirameracetat, GA) på TNBS-indusert kolitt hos BALB/c-mus. Figur IA er et fotografi som viser makroskopiske funn: brutto tilsynekomst av representative tarmer, 7 dager etter TNBS-inokkulering, som viser: normal tarm, tarm fra TNBS-indusert kolitt fra ubehandlete mus (med sårdannelse på to steder, større adhesjoner, diaré og tarmhevelse, grad 8); tarm fra to mus behandlet oralt med Copl (0,25 mg/mus, 8 foringer) med kun fokal hyperemi (grad 1). Figur IB er en graf som viser endringer i vekt, og figur 1C viser overlevelsesforhold av BALB/c-mus med TNBS-indusert kolitt og oral behandling med GA, som sammenliknet med ubehandlete kolittmus og med normale mus eller mus som ble inokkulert med 50 % etanol alene. Vekten av GA-behandlete mus var betydelig høyere enn hos ubehandlete mus (p<0,05). Mus som døde i løpet av de to første dagene ble betraktet som behandlingsofre, og ble ikke tatt med i vurderingen. Hver gruppe besto av 5-7 mus som overlevde etter 2 dager. Resultater representerer ett eller tre liknende eksperimenter. Figurene 2A-2F er fotografier av histologiske prøver som viser effekten av GA-behandling på de mikroskopiske funn av TNBS-indusert kolitt. Histologiske kjennetegn av representative tarmsnitt fra BALB/c-mus 7 dager etter tilførsel av TNBS vises. Normal tarm - 2A (opprinnelig forstørrelse x 40) og 2B (x 100); TNBS-indusert kontrolltarm viser fullstendig sårdannelse av slimhinne, intens transmural betennelse, utstrakt sårdannelse og ødeleggelse av den normale tarmarkitekturen - 2C (x 40) og 2D (x 100); tarm fra TNBF-induserte mus behandlet oralt med GA viser nesten normale snitt, bevarte slimhinner, normal kjertelstruktur med bare mononukleære celleinfiltrasjoner i submukosa og krypter - 2E (x 40) og 2F (x 100). Figurene 3A-3F viser effekten av ulike GA-behandlinger på TNBS-indusert kolitt i ulike musestammer. Vektforandringer (figurene 3A, 3B); overlevelsesforhold (figurene 3C og 3D); histologisk bedømmelse (figurene 3E og 3F). Sykdom ble indusert ved rektal inndrypping av TNBS i 50 % alkohol i (SJL/JxBALB/c) Fl-mus (figurene 3 A, 3C, 3E) eller SJL/J-mus (figurene 3B, 3D, 3F). Kolitt-ubehandlete mus er sammenliknet med GA-behandlete mus ved enten oral behandling (250 ug/foring ved vekslende dager, som starter 7 dager før sykdomsinduksjon) eller ved daglige injeksjoner (2,5 mg/mus subkutant (SC) i PBS, som starter enten 7 eller 14 dager før induksjon). Vekten av GA- injiserte mus fra begge stammer var betydelig høyere enn hos ubehandlete mus (p<0,05).<*>indikerer statistisk betydelighet i histologiske manifestasjoner (p<0,05). Hver gruppe består av 7-11 mus som overlevde to dager etter sykdomsinduksjon. Figurene 4A-4F viser effekten av GA på lymfocyttproliferasjon i ulike musestammer. Responsene fra normale mus, kolittinduserte mus og kolittinduserte mus behandlet med GA oralt eller parenteralt daglig, er sammenliknet i BALB/c (figurene 4A og 4B), (SJL/JxBALB/c)Fl (figurene 4C, 4D), og SJL/J (figurene 4E, 4F) stammer. Miltceller (figurene 4A, 4C, 4E) og mesentriale lymfeknuter (MLN) (figurene 4B, 4D, 4F) ble dyrket, 7 dager etter sykdomsinduksjon uten antigen, kolonekstrakt (CE, 200 ug/ml) eller GA (50 ug/ml). Resultater fra tymidininkorporering er uttrykt som middelverdi cpm ± 1 SD av seks dyrkingsbrønner og representerer ett av to liknende eksperimenter ved anvendelse av samlete celler fra 3-5 mus i hver gruppe. # indikerer betydelig responsøkning til CE ved kolittmus.<*>indikerer betydelig reduksjon i CE-respons indusert ved GA-behandling. Figurene 5A-5C viser GA-effekten på TNF-a sekresjon i ulike musestammer. Responsen hos normale mus, kolittinduserte mus og kolittinduserte mus behandlet med GA oralt eller parenteralt daglig er sammenliknet i BALB/c (figur 5 A), (SJL/JxBALB/c)Fl (figur 5B), og SJL/J (figur 5C) stammene. Miltceller og mesentriale lymfeknuter (MLN) ble dyrket 7 dager etter sykdomsinduksjon, med immobilisert anti-CD3 (5 ug/ml). Etter 24 timer ble supernatanter fra seks dyrkingsbrønner samlet og TNF-a ble målt ved ELISA i duplikater. Resultater er uttrykt som TNF-a konsentrasjon (pg/ml ± 1SD) og representerer ett av to liknende eksperimenter ved å benytte samlete celler fra 3-5 mus i hver gruppe. # indikerer betydelig økning i TNF-a i kolittmus i sammenlikning med normale mus.<*>indikerer betydelig reduksjon i TNF-a indusert ved GA-behandling i sammenlikning med ubehandlete kolittinduserte mus. Figurene 6A-6B viser effekten av GA-behandling på sekresjon av TGF-p ved lymfocytter fra TNBS-induserte BALB/c-mus. Miltceller eller mesentrial-lymfeknuter (MLN) fra normale mus, kolittinduserte mus og kolittinduserte mus behandlet med GA ble dyrket enten med GA (50 ug/ml) (figur 6A) eller immobilisert anti-CD3 (5 ug/ml)

(figur 6B). Etter 72 timer ble supernatanter fra seks dyrkingsbrønner samlet og TGF-p ble målt ved ELISA i duplikater. Resultater er uttrykt som TGF-P konsentrasjon (pg/ml ± 1 SD) og representerer ett av to liknende eksperimenter ved å benytte samlete celler fra 3-5 mus i hver gruppe. # indikerer betydelig reduksjon i TGF-P i kolittmus ved

sammenlikning med normale mus.<*>indikerer betydelig økning i TGF-P indusert ved GA-behandling ved sammenlikning med ubehandlete kolittinduserte mus.

Figur 7 viser effekten av GA-behandling på vektforandring ved dekstransulfatnatrium (DSS)-indusert kolitt i C57BL/6-mus. GA ble tilført subkutant ved daglige injeksjoner - 2,5 mg/dag i PBS, som startet enten 7 dager før eller på samme dag som DSS-foring.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

I de senere årene er det rapportert flere studier som beskriver forklaring av mekanismen for hvordan Kopolymer 1 utøver sin fordelaktige effekt. Det ble således demonstrert at kopolymer 1 binder flere og med høy affinitet til forskjellige klasse II MHC-molekyler fra mus og mennesker, og kan også fortrenge antigener fra den MHC antigenbindende fordypning (Fridkis-Hareli et al., 1994). På denne måten nedreguleres andre antigener, og som en konsekvens også utholdenhet av inflammatorisk prosess. I tillegg viser Copl å være en potent induser for regulatoriske T-celler av Th2 typen (Aharoni et al., 1997). Videre fører det til endring av immunreaktiviteten fra Th 1- til Th2-profil i dyr så vel som i mennesker (Aharoni et al., 1998; Neuhaus et al., 2000). I lys av disse immunmodulerende aktiviteter av Copl og den Th 1-relaterte immunpatologiske egenskapen til Crohns sykdom var det av interesse å teste hvorvidt Copl også kan være effektivt i undertrykking av inflammatoriske tarmsykdommer. I henhold til dette ble effekten av Copl testet på den eksperimentelle dyremodellen, nemlig den TNBS-induserte murine kolittmodell, som likner human Crohns sykdom ved dens histopatologiske kjennetegn og cytokinreaktivitet (Wirtz og Neurath, 2000).

Det er vist her at Copl, administrert enten oralt eller parenteralt ved daglige injeksjoner, virkelig forbedrer de ulike patologiske funn av TNBS-indusert kolitt i tre musestammer, som indikerer at Copl kan være nyttig i behandling av inflammatoriske tarmsykdommer.

Betegnelsene benyttet her, "Kopolymer 1", "Copl" og "Cop-1", "glatirameracetat" og "GA" anvendes om hverandre.

"Copl eller et Copl-relatert peptid eller polypeptid" er ment å inkludere ethvert peptid eller polypeptid, inkludert et tilfeldig kopolymer som kryssreagerer funksjonelt med myelinbasisk protein (MBP), og som er i stand til å konkurrere med MBP i MHC-klasse II i antigenpresentasjonen.

En kopolymer som et aktivt middel kan være en tilfeldig kopolymer som omfatter en passende mengde av en positivt ladet aminosyre, slik som lysin (K) eller arginin (R), i kombinasjon med en negativt ladet aminosyre (fortrinnsvis i en mindre mengde) slik som glutaminsyre (E) eller asparginsyre (D), eventuelt i kombinasjon med en uladet, nøytral aminosyre slik som alanin (A) eller glysin (G), som fungerer som fyllmasse, eventuelt med en aminosyre tilpasset til kopolymerens immunogene egenskaper, slik som en aromatisk aminosyre som tyrosin (Y) eller tryptofan (W).

Kopolymerene som kan anvendes i den foreliggende oppfinnelse kan bestå av L- eller D-aminosyrer eller blandinger derav. Som kjent av dem med dyktighet i fagfeltet forekommer L-aminosyrer i de fleste naturlige proteiner. D-aminosyrer er imidlertid kommersielt tilgjengelige og kan erstattes av noen eller alle aminosyrene som anvendes for konstruksjon av kopolymerene som anvendes i den foreliggende oppfinnelse. Foreliggende oppfinnelse vurderer anvendelsen av kopolymerene inneholdende både D-og L-aminosyrer, så vel som kopolymerer bestående essensielt av enten L- eller D-aminosyrer.

Det aktive middel for anvendelse i den foreliggende oppfinnelse kan omfatte minst én tilfeldig tre- eller fire-aminosyrekopolymer omfattende én aminosyre valgt fra hver av de fire følgende grupper: (a) lysin (K) og arginin (R); (b) glutaminsyre (E) og asparginsyre (D);

(c) alanin (A) og glysin (G); og

(d) tyrosin (Y) og tryptofan (W).

Kopolymeren kan videre omfatte en kombinasjon av aminosyrene tyrosin, glutaminsyre, alanin og lysin, heretter betegnet poly-YEAK, av netto positiv elektrisk ladning, og er mest foretrukket Kopolymer-1, av det følgende, molare forhold av aminosyrer: omkring 0,14 glutaminsyre, omkring 0,43 alanin, omkring 0,10 tyrosin og omkring 0,34 lysin. Det kan være en lav eller høy molekylmasse kopolymer som er et polypeptid fra omkring 15 til omkring 100, fortrinnsvis fra omkring 40 til omkring 80 aminosyrer i lengde. Kopolymeren har en gjennomsnittlig molekylmasse på omkring 2000-4000 Da, fortrinnsvis ca. 2000-13000 Da, mer foretrukket ca. 4700-13000 Da, mest foretrukket ca. 5000-9000 Da, og aller mest foretrukket ca. 6000-8000 Da. Denne foretrukne kopolymer, Copl, er mest foretrukket i form av dets acetatsalt, kjent under det generiske navn glatirameracetat eller GA. Foretrukket molekylær masse varierer og prosesser for å lage en foretrukket form av Copl er beskrevet i U.S. patent nr.

5 800 808, og hele innholdet anses som del av denne beskrivelse.

Det er gitt bare ved eksempel, og at et aktivt middel kan variere både med hensyn til bestanddelene og deres relative proporsjoner, som således oppnår poly-YEAK kopolymerer som er ulike fra Copl.

Det aktive middelet kan være et Copl-relatert polypeptid som er en tilfeldig kopolymer inneholdende fire ulike aminosyrer, hver fra en ulik av gruppene (a) til (d), men som ekskluderer Copl. Aktiviteten som utvises ved Copl er forventet å vedvare dersom én eller flere av de følgende erstatninger er foretatt i kopolymerens aminosyresammen-setningen: Asparginsyre (D) i stedet for glutaminsyre (E), glysin (G) i stedet for alanin

(A), arginin (R) i stedet for lysin (K) og tryptofan (W) i stedet for tyrosin (Y).

Det Copl-relaterte polypeptidet kan inkludere enhver av de kopolymerene angitt i WO

00/05250, og andre syntetiske aminosyrekopolymerer, slik som de tilfeldige fire aminosyrekopolymerer beskrevet av Fridkis-Hareli et al., 2002, som kandidater for behandling av multippel sklerose, nemlig kopolymerene (14-, 35- og 50-merer) inneholdende aminosyrene fenylalanin, glutaminsyre, alanin og lysin (poly-FEAK), eller tyrosin, fenylalanin, alanin og lysin (poly-YFAK), og enhver annen liknende kopolymer som oppdages å kunne vurderes som et universalantigen liknende som Copl.

I en alternativ utførelsesform inneholder det Copl-relaterte polypeptid ifølge oppfinnelsen en kopolymer inneholdende en kombinasjon av tre ulike aminosyrer, hver fra en ulik én av de tre gruppene (a) til (d). Disse kopolymerene refereres til heri som terpolymerer. I en utførelsesform kan den molare fraksjon av aminosyrer av terpolymerene være omtrent hva som foretrekkes for Copl.

I en utførelsesform inneholder terpolymerene for anvendelse ifølge oppfinnelsen tyrosin (Y), alanin (A) og lysin (K), heretter betegnet poly-YAK. Gjennomsnittlig molar fraksjon av aminosyrene i disse terpolymerene kan variere. For eksempel kan tyrosin være til stede i en molar fraksjon på ca. 0,005-0,250; alanin kan være til stede i en molar fraksjon på ca. 0,3-0,6; og lysin kan være til stede i en molar fraksjon på ca. 0,1-0,5, men fortrinnsvis er de molare forhold av tyrosin, alanin og glysin ca. 0,10:0,54:0,53. Gjennomsnittlig molekylmasse av poly-YAK er ca. 2.000-40.000 Da, fortrinnsvis ca. 3.000-35.000 Da, mer foretrukket ca. 5.000-25.000 Da. Det er mulig å erstatte arginin (R) for lysin (K), glysin (G) for alanin (A), og/eller tryptofan (W) for tyrosin (Y).

I en alternativ utførelsesform inneholder terpolymerene for anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse tyrosin (Y), glutaminsyre (E), og lysin (K), heretter betegnet poly-YEK. Gjennomsnittlig molfraksjon av aminosyrene i disse terpolymerene kan variere: Glutaminsyre kan være til stede i en molfraksjon på ca. 0,005-0,300, tyrosin kan være til stede i en molfraksjon på ca. 0,005-0,250, og lysin kan være til stede i en molfraksjon på ca. 0,3-0,7, mens foretrukne molare forhold av glutaminsyre, tyrosin og lysin er ca. 0,26:0,16:0,58. Gjennomsnittlig molekylmasse av poly-YEK er ca. 2.000-40.000 Da, fortrinnsvis ca. 3.000-35.000 Da, mer foretrukket ca. 5.000-25.000 Da. Det er mulig å erstatte arginin (R) for lysin (K), asparginsyre (D) for glutaminsyre (E), og/eller tryptofan (W) for tyrosin (Y).

I en mulig utførelsesform inneholder terpolymerene for anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse lysin (K), glutaminsyre (E) og alanin (A), heretter betegnet poly-KEA. Gjennomsnittlig molfraksjon av aminosyrene i disse polypeptidene kan også variere. For eksempel kan glutaminsyre være til stede i en molfraksjon på ca. 0,005-0,300, alanin i en molfraksjon på ca. 0,005-0,600, og lysin kan være til stede i en molfraksjon på ca. 0,2-0,7, mens foretrukne molare forhold av glutaminsyre, alanin og lysin er ca. 0,15:0,48:0,36. Gjennomsnittlig molekylmasse av YEK er ca. 2.000-40.000 Da, fortrinnsvis ca. 3.000-35.000 Da, mer foretrukket ca. 5.000-25.000 Da. Det er mulig å erstatte arginin (R) for lysin (K), asparginsyre (D) for glutaminsyre (E), og/eller glysin

(G) for alanin (A).

I en mulig ytterligere utførelsesform inneholder terpolymerene for anvendelse ifølge

foreliggende oppfinnelse tyrosin (Y), glutaminsyre (E) og alanin (A), heretter betegnet poly-YEA. Gjennomsnittlig molfraksjon av aminosyrene i disse polypeptidene kan variere. For eksempel kan tyrosin være til stede i en molfraksjon på ca. 0,005-0,250, glutaminsyre i en molfraksjon på ca. 0,005-0,300, og alanin kan være til stede i en molfraksjon på ca. 0,005-0,800, mens foretrukne molare forhold av glutaminsyre, alanin og tyrosin er ca. 0,21:0,65:0,14. Gjennomsnittlig molekylmasse av poly-YEA er ca. 2.000-40.000 Da, fortrinnsvis ca. 3.000-35.000 Da, mer foretrukket ca. 5.000-25.000 Da. Det er mulig å erstatte tryptofan (W) for tyrosin (Y), asparginsyre (D) for glutaminsyre (E), og/eller glysin (G) for alanin (A).

Terpolymerene kan lages ved enhver fremgangsmåte tilgjengelig av en med som kjenner fagfeltet, for eksempel som beskrevet i de ovennevnte publikasjoner WO 01/52878 og WO 01/93893.

Ettersom bindingsmotivene til Copl til MS-assosierte HLA-DR molekyler er kjent, kan polypeptider med bestemt sekvens enkelt fremstilles og testes for binding til den peptidbindende kløft hos HLA-DR-molekylene, som beskrevet av Fridkis-Hareli et al., 1999. eksempler på slike peptider er dem beskrevet i WO 005249, og anses som del av denne beskrivelsen. Trettito av peptidene spesifikt angitt i nevnte søknad er reprodusert i tabell I nedenfor (SEQ ID NO: 1 til 32). Disse er 15-mer peptider som omfatter de fire aminosyrene alanin, glutaminsyre, lysin og tyrosin (peptider 2, 3, 5-32) eller bare de tre aminosyrene alanin, lysin og tyrosin (peptider 1,4). Slike peptider og andre liknende peptider forventes å ha liknende aktivitet som Copl, og er omsluttet innenfor definisjonen av Copl-relaterte peptider eller polypeptider.

I samsvar med foreliggende oppfinnelse er det kandidataktive middel testet i en egnet dyremodell for inflammatorisk tarmsykdom slik som den TNBS-induserte murine kolittmodell, som har vært veldig anvendelig for studien av mange viktige aspekter av inflammatorisk tarmsykdom. Siden denne modellen i seg selv ikke representerer kompleksiteten av de humane sykdommene, har mer enn tjue nye dyremodeller for tarminflammasjon blitt utviklet i de senere år (Bregenholt, 2000; MacDonald et al., 2000; Wirtz og Neurath, 2000). De kan inndeles i fire kategorier: (i)spontane modeller, slik som kolitt i C3H/HeJBir-mus, en ny understamme av C3H/HeJ-mus med høy forekomst av spontan kolitt; (ii) induserbare modeller i mus med et normalt immunsystem, som dekstransulfatnatrium (DSS) kolitt; (iii) adoptiv overføringsmodeller i immunkompromittert vert, som CD45RB CD62L+ cellene inn i SCID-mus; og (iv) genetisk konstruerte modeller, som IL-10 knockout mus. Selv om de fleste modeller har veldig heterogen opprinnelse, resulterer de fleste av dem i en felles fenotype: slimhinneinflammasjon formidlet ved Thl T-celler aktivert ved bakterielle antigener i slimhinnen, som viser stor likhet til human Crohns sykdom. Alle disse modellene kan anvendes i samsvar med oppfinnelsen.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er den foretrukne kopolymer for anvendelse som aktivt middel ifølge oppfinnelsen Copl, mest foretrukket i form av dets acetatsalt, kjent under det generiske navnet glatirameracetat. Doseringen av Copl som skal tilføres, bestemmes av legen i henhold til pasientens alder, sykdommens nivå, og velges fra et område fra 0,1 til 1000 mg, selv om enhver annen egnet dosering er omsluttet av oppfinnelsen. Tilførselen kan gjøres daglig i en eller flere doser, fortrinnsvis fra én til tre daglige doser, for eksempel totalt på 0,1 til 1000 mg, eller på vekslende dager, tre ganger/uke, eller én gang/uke, men ethvert annet intervall mellom tilførslene er betraktet av oppfinnelsen i henhold til alvorligheten av sykdommen og pasientens tilstand.

Oppfinnelsens sammensetning kan tilføres ved enhver egnet tilførselsmåte, inkludert oral, inhalasjon, intramuskulær, subkutan eller intradermal.

Oral tilførsel kan være en foretrukket tilførselsform, fordi det foretrekkes av pasienter og fordi, i IBD har denne ruten fordeler av spesifikk tilførsel til det syke organet, og følgelig aktivering av lokale, fordelaktige mekanismer, som MHC-blokkering i tillegg til den systemiske aktivitet.

I en foretrukket utførelsesform tilføres sammensetningen oralt. I dette tilfelle kan Copl blandes med andre matformer, og konsumeres i fast form, halvfast form, som suspensjon eller emulsjon, og kan blandes me farmasøytisk akseptable bærere, inkludert vann, oppløsende midler, emulgerende midler, smaksforsterkere og liknende, eller den kan være i væskeform, aerosol, inhaleringspulver eller i fast form, fortrinnsvis enterisk belagt form, alle som beskrevet i WO 98/30227 og korresponderende U.S. 6 214 791.

I en annen foretrukket utførelsesform tilføres Copl parenteralt, fortrinnsvis subkutant.

De følgende eksempler illustrerer enkelte momenter av den foreliggende oppfinnelse, men er ikke ment å begrense rekkevidden av den foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPLER

Materialer og fremgangsmåter

Dyr.

BALB/c-, SJL/J-, (SJL/JXBALB/c)Fl- og C57BL/6-mus ble innkjøpt fra Harlan (Jerusalem, Israel). 8 til 12 uker gamle hunnmus med vekt 18-21 g, ble benyttet i alle eksperimenter.

Materialer.

Glatirameracetat (GA, Copaxone", Kopolymer 1) fra parti 242990599 med en gjennomsnittlig molekylvekt på 7300 kDa ble oppnådd fra Teva Pharmaceutical Industries Ltd. (Petach Tikva, Israel). 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre (TNBS) var fra Sigma. Immobilisert anti-CD3-antistoff var fra Serotec.

Induksjon av kolitt i mus.

TNBF-kolitt ble indusert i anestetiserte mus (100 ul/mus) ved rektal inndrypping av 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre 5 % (vekt/vol.), blandet med et likt volum etanol. Hver gruppe inkluderte 6-12 mus. Mus som døde før dag 4 ble betraktet som behandlingsofre og ble ikke tatt i betraktning.

Bedømmelse av kolitt.

Vekstendringer og overlevelse ble daglig overvåket. Fem til åtte dager etter TNBS-inndrypping ble mus avlivet, og makroskopisk så vel som mikroskopisk tykktarmskade ble evaluert.

Makroskopisk tykktarmsbedømmelse.

Total skade på tykktarm ble gradert i henhold til Reuter et al., 1996, ved anvendelse av kombinerte verdier for de fire standard makroskopiske parametre: gradert sårdannelse i tykktarm (skala fra 0 - fullstendig normal, til 10 - mest alvorlig); intestinale og peritoneale adhesjoner (0 til 2); diaré (0 til 1); og tykkelse (0 til 1). Totalvurderingen er den aritmetiske sum av de fire bedømmelsene. Vurderingen ble utført ved en blindprosedyre.

Mikroskopisk bedømmelse.

Nære (proximal), midtre og fjerne (distal) deler av kolon ble fiksert i 10 % fosfatbufret formalin. Parafin innesluttete snitt ble farget med hematoksylin og eosin. Grad av histologisk skade og inflammasjon ble gradert i henhold til Elson et al., 1996, ved anvendelse av de kombinerte verdier for de fire mikroskopiske parametre: omfang, skala fra (0 - fullstendig normal, til 2 - involverer mer enn ett segment); inflammasjon (0 - intet, til 3 - kraftig); skade (0 til 3 - kraftig transmural); og regenerering (0 - fullstendig nydannelse av epitel, til 3 - intet).

Totalvurderingen er den aritmetiske sum av de fire bedømmelsene. Vurderingen ble utført ved en blindprosedyre.

Histologisk undersøkelse.

Tykktarmer som ble fjernet som beskrevet ovenfor ble fiksert i formalin, og histologisk vurdering ble utført på de fikserte tykktarmsprøvene farget med hematoksylin-eosin. Prøvene ble undersøkt av en patolog og rangert av grad av inflammatorisk infiltrat, sårdannelse eller vevsdød, og omfanget av dybde- og overflateskade.

GA - behandling.

GA ble tilført ved én av de følgende prosedyrer:

Oral behandling - 250 ug/dag i PBS, ved gastrisk intubasjon med en 18 gauge rustfritt stål foringsnål. Med mindre annet er beskrevet, ble foring utført på dagene -7,

-5, -3, -1, 0, 2, 4 og 6, i forhold til dagen for TNBS-inndrypping.

Parenteral behandling med daglige injeksjoner - 2,5 mg/dag, tilført subkutant i PBS, som startet 14 dager før sykdomsinduksjon.

Enkelt injeksjon - A depotdose av 10 mg/mus injisert subkutant i Freund's ufullstendige adjuvans (ICFA), 14 dager før sykdomsinduksjon.

Tykktarmsekstrakt.

Tykktarm fra syngeniske, normale mus ble kuttet i små remser og homogenisert. Homogenatet ble fortynnet i PBS og passért igjennom glassull. Proteinmengde ble målt ved anvendelse av et proteinanalysesett (BioRad, Richmond, CA).

Reaktiv analyse

Milt og mesentriske lymfeknute (MLN) celler (0,5 x IO<6>celler/brønn) ble dyrket med enten GA (50 ug/ml), tarmekstrakt (200 ug/ml), immobilisert anti-CD3 (5 ug/ml), eller PBS kontroll i et sluttvolum på 250 (il/brønn (6 brønner for hvert antigen). For proliferasjonsanalyse ble celler dyrket i RPMI1640 med 10 % FCS, pulset med 1 uCi av [<3>H] tymidin etter 48 timer inkubasjon, og høstet 12 timer senere. For cytokin (TNF-a og TGF-P)-analyse ble celler dyrket i serumfritt medium (DCCM-1), supernatanter ble samlet etter 72 timer og testet for cytokiner med ELISA ved bruk av mAb par (R & D systemer, Minneapolis; MN), i henhold til produsentens instruksjoner.

Statistisk analyse

Makroskopisk og mikroskopisk bedømmelse, så vel som vektforskj eller mellom GA-behandlete og ubehandlete grupper, ble analysert ved bruk av to-halet Mann-Whitney U-test- Statistikk og overlevelseskurver ble utført ved Kaplan-Meier test. Forskjeller i proliferasjonsresponser, TNF-a- og TGF-P-sekresjon ble sammenliknet ved anvendelse av den to-halete, uavhengige analysen. Alle de statistiske analysene ble utført ved SPSS 10.0 programmet. Signifikansnivået ble for alle testene satt til <0,05.

Eksempel 1.

Effekt av oral behandling av Copl på TNBS-indusert kolitt i BALB/c-mus

Kolitt ble indusert med TNBS i 50 % etanol. GA ble tilført oralt (250 ug/mus/foring) annenhver dag, med start enten syv eller tre dager før sykdomsinduksjon, på dagen for sykdomsinduksjon, så vel som to dager etter induksjonen, og som fortsatte som vist i venstre kolonne i tabell 2B nedenfor. Tykktarmbedømmelse ble utført 7 eller 8 dager etter sykdomsinduksjon. Mus som døde i løpet av de to første dagene (vanligvis omkring 20 % i alle grupper) ble betraktet som behandlingsofre, og er således ikke presentert; hver gruppe besto av 4-7 mus som overlevde etter dag 2.

Eksperimentets første sett testet evnen av oralt administrert GA (250 ug/mus, ved vekslende dager, med start 7 dager før sykdomsinduksjon, 8 foringer) for å bedre eksperimentelt TNBS-indusert kolitt i BALB/c-mus. Makroskopisk evaluering av tykktarm fra GA-foret mus, kontra de fra kontrollmusgruppen, i tre ulike eksperimenter, viste at GA-behandling førte til drastisk reduksjon av skade av tarmen som er karakteristisk for sykdommen, som oppsummert i tabell 2A. De ulike makroskopiske, patologiske funn, dvs. kraftig sårdannelse og/eller inflammasjon, adhesjon til nærliggende organer, diaré og hevelse i tarmvegg var alle således betydelig redusert (gjennomsnittlig 3,5 til 4,0 ganger i de tre eksperimentene) ved GA-behandling. Den totale makroskopiske skade, oppnådd ved den aritmetiske sum av bedømmelse for alle fire patologiske funn, ble redusert fra 10,2 i kontrollen til 2,7 i de GA-behandlete gruppene, nemlig 3,8 ganger.

Representative tykktarmer fra normale mus så vel som en mus med TNBS-indusert kolitt gradert til 8 (sårdannelse/inflammasjon på to steder, større adhesjoner, diaré og tarmfortykkelse), kontra tykktarmer fra to TNBS-induserte mus behandlet oralt med GA, og gradert til 1 (kun fokal hyperemi) er vist i figur IA. Som vist førte Ga-behandling til en markert reduksjon av makroskopisk skade på tykktarm indusert med

TNBS.

GA var spesielt effektivt når foring startet 7 dager før TNBS-inokkulasjon og fortsatte etter sykdomsinduksjon) totalt 8 foringer annenhver dag). Under disse forhold ble 5,2 gangers reduksjon i sykdommens styrke oppnådd (tabell 2B). En betydelig effekt ble imidlertid også observert når GA-behandling startet bare tre dager før induksjon (2,75 gangers reduksjon), eller på dagen for TNBS-inokkulering, og til og med to dager etter sykdomsinduksjon (2,2 gangers reduksjon).

Karakteristisk for kolitt er vekttap. BALB/c-mus med TNBS-indusert kolitt oppviste betydelig vekttap (10 % av sin kroppsvekt på dag 3 etter TNBS-inokkulasjon), med start for å innhente seg fra dag 7, men som ikke fikk tilbake sin opprinnelige vekt, som vist i figur IB. Mus som ble foret med GA hadde bare moderat vekttap (max 5 % av sin kroppsvekt på dag 3), og gjenvant følgelig sin opprinnelige vekt fullstendig ved dag 5. GA-behandlete mus oppviste således betydelig høyere vekt enn de ubehandlete mus, og 5-8 dager etter sykdomsinduksjon var deres vektkurve nær den normale for mus, som ikke hadde blitt sykdomsindusert.

I alle grupper døde ca. 20 % i løpet av de to første dagene etter TNBS-inndrypping. De ble betraktet som behandlingsofre og ble ekskludert fra alle beregninger eller presentasjoner. Sykdomsdødeligheten overskred 55 % hos ubehandlete mus 8 dager etter induksjon, mens bare 20 % dødelighet ble observert ho GA-behandlete mus pga. sykdomsprosessen, (fig 1C). Oral behandling av BALB/c-mus med GA resulterte således i forbedret overlevelsesgrad, i tillegg til de reduserte funn av TNBS-indusert kolitt.

Histologisk bedømmelse av tykktarmsprøver fra mus med TNBS-indusert kolitt ikke GA-behandlet, viste kraftig slimhinneskade, fokal inflammasjonsurvidelse ledsaget av transmural inflammasjon, utstrakt sårdannelse og kraftig ødeleggelse av den normale arkitekturen (figur 2C, 2D). I motsetning viste tykktarm fra TNBS-induserte, GA-behandlete mus mer konservert slimhinne (figur 2E), og kun få mononukleære celler infiltrert i submukosa og krypter (figur 2F). Tarmarkitekturen hos GA-behandlete mus var mye mindre skadet og den kjertelstrukturen var godt konservert (figur 2E, 2F), tilsvarende til dem hos normale mus (figur 2A, 2B). Den gjennomsnittlige histologiske bedømmelsen av mus som overlevde til dag 7, da de histologiske prøvene ble innsamlet, var 7,8 i kolittgruppen og 2,8 i GA-behandlet gruppe (fra en maksimal bedømmelse på 12,0), som viser 2,8 gangers reduksjon (p = 0,007). GA-behandling uten TNBS-induksjon resulterte ikke noen histologisk eller makroskopisk skade.

Eksempel 2.

Effekt av forskjellige GA-behandlingsmåter for TNBS-indusert kolitt i ulike musestammer

For undersøkelse av hvorvidt den fordelaktige effekten av GA på TNBS-indusert kolitt er begrenset til oral tilførsel i BALB/c-stammen, eller representerer en mer generell effekt, ble GAs evne til å inhibere TNBS-indusert kolitt ved tilførsel ved forskjellige ruter og doseringer, undersøkt i to ytterligere musestammer. Effektene av oral behandling (250 ug/foring ved vekslende dager, med start 7 dager før sykdomsinduksjon); en enkelt injeksjon av en depotdose (5 mg/mus subkutant (SC) i ICFA, 14 dager før induksjon); eller daglige injeksjoner (2,5 mg/mus SC i PBS, med start enten 7 eller 14 dager før induksjon), ble derfor testet i SJL/J-stammen og i den Fl-hybride stamme av SJL/J og BALB/c-(SJL/JxBALB/c)Fl.

Makroskopisk evaluering av tykktarmene, som oppsummert i tabell 3, viste at i likhet med BALB/c-stammen er begge stammer sterkt mottakelige for TNBS-kolitt (100 % forekomst av sykdom i de ubehandlete kontrollgruppene). Spesielt følsomme var SJL/J- mus der en bedømmelse på 12,4 ble funnet fra maksimal total bedømmelse på 14. den aggressive sykdommen i SJL/J-stammen ble ledsaget ved funnet av spesielt små milt og eksepsjonelt forstørret MLN. Oral behandling med GA reduserte den makroskopiske ødeleggelsen indusert av sykdommen i begge stammer, (men i mindre grad enn i BALB/c, tabell 1). Således ble det funnet 1,8 og 1,7 gangers økning i den totale, makroskopiske skaden i (SJL/JxBALB/c)Fl-mus foret med GA, sammenliknet med ubehandlete mus, observert henholdsvis 5 og 11 dager etter TNBS-inokkulering. I SJL/J-mus, som fremviste den mest kraftige sykdom, ble bare liten effekt av den orale behandling med GA oppnådd (en reduksjon på 1,7 poeng i den totale bedømmelse). På den annen side var GA-behandling administrert ved daglige injeksjoner mer effektive enn oral behandling, og reduserte drastisk tykktarmskaden, som er karakteristisk for sykdommen. Fem dager etter sykdomsinduksjon ble det således oppnådd en reduksjon på 3,5 og 4,6 ganger i den totalt makroskopiske bedømmelse i (SJL/JxBALB/c)Fl-mus injisert fra henholdsvis dag -7 og dag -14, sammenliknet med ubehandlete mus. En enda mer tydelig effekt ble oppnådd 11 dager etter sykdomsinduksjon når mus som daglig ble injisert med GA oppviste nesten fullstendig helbredelse (bare én av syv mus viste fokal hyperemi i hver gruppe, som resulterte i en total bedømmelse på 0,1), mens de fleste ubehandlete kontrollmus fremdeles var syke (total bedømmelse -5,3). Betydelig reduksjon i makroskopisk bedømmelse ved daglige injeksjoner av GA ble oppnådd, også i SJL/J-mus, som oppviste den mest kraftige sykdom (2,7 gangers reduksjon sammenliknet med ubehandlet kontroll ved injeksjoner fra dag -7), fulgt av normalt utseende av milt og MLN. En enkelt GA-injeksjon som en depotdose i ICFA ble ikke tilstrekkelig til effektivt å forhindre den makroskopiske skade indusert av TNBS-inokkulering. Selv om de makroskopiske bedømmelsene som ble oppnådd ved denne behandling var lavere enn de av ubehandlete kontroller, var denne effekten liten og statistisk ubetydelig.

Som vist i figur 3A-3B, resulterte TNBS-indusert kolitt i begge stammer i betydelig vekttap. To dager etter induksjon ble det derfor observert 12 % og 15 % vektreduksjon i (SJL/JxBALB/c)Fl (A)- og SJL/J (B)-mus som ikke mottok noen behandling. Mens Fl-mus viste påfølgende vekstgjenvinning (gjenvant 95 % av deres opprinnelige vekt på dag 6), fortsatte SJL/J-mus å tape vekt til dag 4, og deres gjennomsnittlige vekt på dag 5 var bare 80 % av deres opprinnelige vekt. GA-behandlinger inhiberte delvis omfanget av vekttap forårsaket av TNBS-kolitt i begge stammer. Dette ble funnet ved en beskjeden statistisk ubetydelig inhibering av vekttap i de oralt behandlete mus, og i en større betydelig inhibering av vekttap hos de daglige injiserte musene.

(SJL/JxBALB/c)Fl-mus injisert daglig (fira dag -7) tapte for eksempel bare 4 % av deres

opprinnelige vekt 1 dag etter induksjon, og gjenopprettet deretter vekten fullstendig på dag 6.1 begge stammer som uttrykker mildere sykdom, så vel som i SJL/J som uttrykker den mest kraftige sykdommen, var kroppsvekt av mus som daglig ble injisert med GA betydelig høyere enn hos ubehandlete mus (p < 0,01).

Sykdomsdødeligheten overskred 40 % hos de ubehandlete mus i begge grupper (på dag 8 i (SJL/JxBALB/c)Fl- og på dag 5 i SJL/J-mus), mens dødelighetsforhold på henholdsvis bare 30 % og 18 % ble observert etter oral behandling med GA i disse to gruppene (figur 3C, 3D). Daglig injeksjon av GA (som startet både 7 og 14 dager før sykdomsinduksjon) hindret videre fullstendig dødelighet i (SJL/JxBALB/c)Fl- og bare 8 % døde i SJL/J-gruppen ((p<0,05 for begge stammer), som indikerer at GA vesentlig hindrer dødelighet pga. sykdomsprosessen, som forbedrer overlevelsesforhold betydelig.

GA var også effektiv å hindre den mikroskopiske skade på tykktarmen indusert ved TNBS-kolitt, som vist i figurene 3E, 3F. (SJL/JxBALB/c)Fl-mus hadde således en reduksjon på 1,8 ganger i den histologiske bedømmelsen oppnådd ved oral behandling, og 6,6 ganger ved daglige injeksjoner (med start enten 7 eller 14 dager før sykdomsinduksjon). (SJL/JxBALB/c)Fl-mus som viste den kraftigste sykdom, ble bare mindre statistisk ubetydelig effekt av GA-behandling oppnådd (en reduksjon på 0,5 og 1,8 poeng i den totale bedømmelse ved henholdsvis foring og injeksjon).

Eksempel 3.

Effekten av GA på lymfocyttreaktivitet av TNBS-indusert kolitt

For å undersøke effekten av GA-behandling på T-cellereaktivitet i TNBS-kolitt, ble celleproliferasjonsresponsen studert, og sekresjon av cytokinene TNF-a og TGF-P i de kolittinduserte mus behandlet med GA ble sammenliknet med de ubehandlete mus. Reaktiviteten av miltceller - systemisk respons, så vel som reaktivitet av de lokale mesentriske lymfeknuter (MLN), nærliggende til det syke organet ble analysert i de tre musestammene. Proliferasjon i respons til tykktarmsekstrakt oppnådd fra normale syngeniske mus (CE) og til GA, er vist i figurene 4A-4F. En fremtredende proliferasjonsrespons til tykktarmekstrakt ble vist ved MLN-celler, dvs. 8,9,2,0 og 3,3 ganger i kolittinduserte mus over responsen fra normal MLN i henholdsvis BALB/c (figur 4B), (SJL/JxBALB/c)Fl (figur 4D) og SJL/J (figur 4F), (p<0,05). Denne reaktivitet var begrenset til lokal MLN da ingen betydelig proliferasjon til CE over responsen fra de samme celler uten antigen ble observert systemisk (figurene 4A, 4C, 4E). Denne lokale respons til tykktarmekstrakt var betraktelig forhindret ved GA- behandling, som vist ved 66 % inhibering i MLN fra BALB/c. Videre responderte MLN fra (SJL/JxBALB/c)Fl- og SJL/J-mus behandlet enten oralt eller parenteralt med GA til Ce på liknende måte som til MLN fra normale mus, som indikerer fullstendig inhibering av respons til tykktarmekstrakt ved GA-behandling. Lymfocytter fra GA-behandlete mus, både fra milt og MLN, prolifererte i respons til behandlingsmiddelet GA, der den systemiske respons er betraktelig høyere enn responsen hos MLN-cellene.

TNBS-induserte kolittmuseceller utskilte store mengder TNF-a, som påvist ved respons mot den brede anti-CD3-stimulansen. Som vist i figurene 5A, 5B, var denne økning i både BALB/c- og (SJL/JxBALB/c)Fl-mus mer uttalt i både splenocytter enn i MLN-celler. I motsetning viste ikke SJL/J-mus slik systemisk økning (figur 5C); TNF-a sekresjon fra deres MLN-celler hadde imidlertid sterk økning. GA-behandling i alle stammer resulterte i vesentlig reduksjon i TNF-a, i både milt og MLN, slik at sekresjonsnivåene i kolittinduserte mus behandlet med GA, var til og med lavere enn i normale mus. Denne reduksjon i TNF-a ble funnet i alle tilfellene, med unntak i MLN fra SJL/J-mus behandlet oralt med GA, som heller ikke viste betydelig reduksjon i de patologiske tilkjennegivelser. SJL/J-mus daglig behandlet parenteralt med GA, viste drastisk reduksjon i TNF-a-nivåer, så vel som redusert sykdomsvurdering. In vitro stimulering med enten GA eller CE resulterte ikke i sekresjon av TNF-a.

Sekresjon av TGF-P i respons på GA-behandling så vel som til en bred stimuli med anti-CD3, ble også vurdert. Resultatene oppnådd i BALB/c-mus vises i figurene 6A, 6B. Miltceller og i en mindre utstrekning MLN-celler, utskilte TGF-P i respons til GA. Denne respons var mer lydelig i mus behandlet med GA (figur 6A). Anti-CD3 stimulering resulterte i sekresjon av overskytende mengder av TGF-p ved miltceller fra normale mus, så vel som fra dem med kolitt (figur 6B). Sekresjon av TGF-P i MLN var interessant nok redusert i kolittinduserte mus (6,5 gangers reduksjon sammenliknet med MLN fra normale mus), men GA-behandling genererte fremtredende økning av TGF-P-sekresjon i MLN (2,2 ganger høyere enn sekresjon fra normale mus). Liknende resultater ble oppnådd i (SJL/JxBALB/c)Fl-mus, men ikke i SJL/J-mus som viste de mest aggressive sykdomsmanifestasjoner (resultater ikke vist).

Eksempel 4

Effekt av Copl på dekstransulfatnatrium (DSS)-indusert kolitt i mus Foring av mus i flere dager med dekstransulfatnatrium (DSS) polymerer i drikkevann induserer en akutt kolitt med blodig diaré, histologisk skade og inflammasjon (Wirtz og Neurath, 2000). 7 uker gamle C57BL/6-hunnmus ble foret med 2,5 % DSS-løsning i drikkevannet i 7 dager. GA ble tilført subkutant ved daglige injeksjoner - 2,5 mg/dag, i PBS, med start enten 7 dager før eller på samme dag som DSS-foring.

Resultatene av et innledende eksperiment ved å benytte denne modellen vises i figur 7. det ble funnet at DSS-forete, ubehandlete mus led av betraktelig vekttap fra dag 5, og mistet 17 % kroppsvekt ved dag 7 etter DSS-foring. Mus som ble behandlet med GA led bare av moderat vekttap (maksimalt 7 % hos mus injisert fra dag -7, og 4 % i mus injisert fra dag 0, ved dag 7). Disse resultatene indikerer at GA også kan ha en fordelaktig effekt i DSS-indusert kolitt.

Tabell 2.

Effekten av oral GA- behandling på de makroskopiske manifestasjoner av TNBS-indusert kolitt i BALB/ c- mus

A. GA-behandling med start 7 dager før sykdomsinduksjon

B. Effekt ved tidsbestemmelse av GA-behandling med hensyn til sykdomsinduksjon

Kolitt ble indusert i BALB/c-mus med TNBS i 50 % etanol. GA ble tilført oralt

(250 ug/mus) annenhver dag med start fra den indikerte dag relativt til sykdomsinduksjon. Tykktarmsbedømmelse ble utført 7 eller 8 dager etter sykdomsinduksjon. Mus som døde i løpet av de to første dagene (vanligvis ca. 20 % i alle grupper) ble betraktet som behandlingsofre og presenteres derfor ikke; hver gruppe besto av 4-7 mus som overlevde etter dag 2.<*>indikerer betydelig reduksjon i makroskopisk manifestasjon i GA-behandlete kontra ubehandlete mus (p<0,05).

Kolitt ble indusert med TNBS i 50 % etanol. GA ble tilført på en av de følgende måter: oralt (0,25 mg), 8 foringer med start 7 dager før sykdomsinduksjon; ved én injeksjon (5 mg/mus) SC i ICFA, 14 dager før sykdomsinduksjon; ved daglige injeksjoner (2,5 mg/mus) SC med start enten 14 eller 7 dager før sykdomsinduksjon. Mus som døde i løpet av de to første dagene (vanligvis ca. 20 % i alle grupper) ble betraktet som behandlingsofre og presenteres derfor ikke.<*>indikerer betydelig reduksjon i makroskopisk manifestasjon i GA-behandlete kontra ubehandlete mus (p<0,05).

REFERANSER

Aharoni R, Teitelbaum D, Sela M, et al. Copolymer 1 induces T cells of the T helper type 2 that crossreact with myelin basic protein and suppress experimental autoimmune encephalomyelitis. Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 94:10821-6 (1997).

Aharoni R, Teitelbaum D, Sela M, Arnon R. Bystander suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis by T cell lines and clones of the Th2 type induced by Copolymer l. J. Neuroimmunol. 91:135-46 (1998).

Aharoni R., Teitelbaum D., Arnon R., Sela M. Copolymer 1 inhibits

manifestations of graft rejection. Transplantation 27:598-605 (2001).

Bregenholt S. Cells and cytokines in the pathogenesis of inflammatory bowel disease: New insights from mouse T-cell transfer models.

Exp. Clin. Immunogenet. 17:115-29 (2000).

Elson CO, Beagley KW, Sharmanov AT, Fujihashi K, Kiyono H, Tennyson GS, Cong Y, Black CA, Ridwan BW, McGhee JR. Hapten-induced model of murine inflammatory bowel disease mucosa immune responses and protection by tolerance.

J. Immunol. 157:2174-2185 (1996).

Fridkis-Hareli M, Teitelbaum D, Gurevich E, et al. Direct binding of myelin basic protein and synthetic copolymer 1 to class II major histocompatibility complex molecules on living antigen-presenting cells - specificity and promiscuity.

Proe. Nati. Acad. Sei., USA 91:4872-6 (1994).

Fridkis-Hareli M, Neveu JM, Robinson RA, Lane WS, Gauthier L, Wucherpfennig KW, Sela M, Strominger JL. Binding motifs of copolymer 1 to multiple sclerosis- and rheumatoid arthritis-associated HLA-DR molecules.

J. Immunol. 162:4697-4704 (1999).

Fridkis-Hareli M, Santambrogio L, Stern JN, Fugger L, Brosnan C, Strominger JL. Novel synthetic amino acid copolymers that inhibit autoantigenspecific T cell responses and suppress experimental autoimmune encephalomyelitis.

J. Clin. Invest. 109:1635-1643 (2002).

Johnson KP, BR Brooks, JA Cohen, CC Ford, J Goldstein, RP Lisak, LW Myers, HS Panitch, JW Rose og RB Schiffer. Copolymer 1 reduces relapse rate and improves disability in relapsing-remitting multiple sclerosis: Results of a phase III multicenter, double-blind placebo-controlled trial. The Copolymer 1 Multiple Sclerosis Study Group. Neurology 45:1268-1276 (1995).

Kipnis, J. og Schwartz, M. Dual Action of Glatiramer Acetate (Cop-1) as a Treatment for Autoimmune Diseases and a Vaccine for Protective Autoimmunity after CNS Injury. Trends Mol. Med. 8:319-323 (2002).

MacDonald TT, Monteleone G, Pender SLF Recent developments in the immunology of inflammatory bowel disease. Scand. J. Immunol. 51:2-9 (2000).

Neuhaus O, Farina C, Yassouridis A, Wiendl H, Then Bergh F, Dose T, Wekerle H, Hohlfeld R. Multiple sclerosis: Comparison of Copolymer-1 reactive T cell lines from treated and untreated subjects reveals cytokine shift from T helper T

helper 2 cells. Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 97:7452-7 (2000).

Reuter BK, Asfaha S, Buret A, Sharkey KA, Wallace JL. Exacerbation of inflammation-associated colonic injury in rat through inhibition of cyclooxygenase-2.

J. Clin. Invest. 98:2076-85 (1996).

Sandborn WJ, Targan SR Biologic therapy of inflammatory bowel disease. Gastroenterol. 122:1592-608 (2002).

Schlegel PG, Aharoni R, Chen Y, Chen J, Teitelbaum D, Arnon R, Sela M, Chao NJ. A synthetic random copolymer with promiscuous binding to class IIMHC molecules inhibits T-cell proliferative response to major and minor histocompatibility antigens in vitro and confers the capacity to prevent murine graft-versus-host disease in vivo. Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 93:5061-6 (1996).

Sela M, Teitelbaum D. Glatiramer acetate in the treatment of multiple sclerosis. Expert Opin. Pharmacother. 2:1149-65 (2001).

Shanahan F. Inflammatory bowel disease: Immunodiagnostics, immunotherapeutics, and ectotherapeutics. Gastroenterol. 120:622-35 (2001).

Van Deventer SJH Immunotherapy of Crohn's disease.

Scand. J. Immunol. 51:18-22 (2000).

Wirtz S., Neurath M. Animal models of intestinal inflammation: New insights into the molecular pathogenesis and immunotherapy of inflammatory bowel disease.

Int. J. Colorectal Dis. 15:144-160 (2000).

Claims (6)

1. Anvendelse av Kopolymer 1, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av en inflammatorisk tarm sykdom.

2. Anvendelse i følge krav 1, der nevnte inflammatoriske tarmsykdom er Crohns sykdom.

3. Anvendelse ifølge krav 1, der nevnte inflammatoriske tarmsykdom er ulkerøst kolitt.

4. Anvendelse i følge et hvilket som helst av kravene 1-3, der nevnte farmasøytisk sammensetning er for oral administrering.

5. Anvendelse i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, der nevnte farmasøytiske sammensetning er for administrering intramuskulært, subkutant, intradermalt eller ved inhalering.

6. Anvendelse i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, der nevnte farmasøytiske sammensetning er for injeksjon.