NO333671B1 - Fremgangsmate for fremstilling av ferutinin fra Ferula genusplanter og kosmetisk behandling av rynker. - Google Patents

Abstract

2005-10-06 S a m m e n d r a g Det er beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av ferutinin (Ia) fra Ferula spp ekstrakter omfattende basisk hydrolyse av ekstraktet og behandling med p-pivaloyloksybenzosyre. Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av ekstraktene og ferutinin innen det kosmetiske og det dermatologiske området.

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse vedrører vegetabilske ekstrakter fra Ferula spp og en fremgangsmåte for å isolere ferutinin fra disse ekstraktene. Nærmere bestemt vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av ferutinin fra Ferula genusplanter samt kosmetisk behandling av rynker.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Mange Ferula genusplanter inneholder terpener med østrogenaktivitet, også kjent som fytoøstrogener, det vil si substanser som regulerer hormonfunksjoner og som tilsyne-latende er et egnet alternativ for anvendelsen av synte-tiske hormoner i behandlingen av premenstruelt syndrom og forstyrrelser relatert til menopause og aldring. Ekstrakter av noen typer Ferula ble tidligere anvendt som preven-sjon og i behandlingen av impotens og menopauseforstyrrel-ser. I det siste har alkoholekstrakter fra Ferula asafoe-tida L blitt beskrevet (WO 0230438) som anticancermidler.

De mest rike forbindelsene i Ferula genusplanter er jaeschkenadiol(II)-derivater:

Spesielt daucanestere med den generelle formelen (I)

Daucanestere er kjente forbindelser og de er for eksempel beskrevet i Phytochemistry, volum 37, nr 3, s. 597-623, 1994. I formel (I) er R et rett eller forgrenet, mettet eller umettet alifatisk acylresiduum, eller et eventuelt substituert aromatisk acylresiduum. Eksempler på R-grupper er iso-valeroyl, angeloyl, benzoyl, p-hydroksybenzyl, ve-ratroyl eller cinnammoyl.

Daucanestere fra Ferula spp er østrogenmodulatorer lignen-de SERMer (selektive østrogenreseptormodulatorer), blant disse viser ferutinin (Ia) tydelig østrogenaktivitet, mens de andre har en heller begrenset aktivitet.

Spesielt er ferutinin en østrogenreseptor-alfaagonist (ERa) og en østrogenresptor-betaagonist/-antagonist (ER(3) . Det har også blitt vist at ferutinin har høyere binding til østrogenreseptorer enn tamoksifen.

Det er derfor et behov for å oppnå rerutininanrikede ekstrakter eller å optimere ekstråksjonen av ferutinin i ren form fra plantematerialer inneholdende dens forløpere.

En fremgangsmåte omfattende hydrolyse av en daucaneesters hele ekstrakt for å gi rå jaeschkenadiol og deretter re-forestring av jeschkenadiol med passende beskyttet p- hydroksybenzosyre, for eksempel med p-acetoksybenzosyre, er kjent fra litteraturen (J. Org. Chem. USSR (eng. overs.), EN, 28, 10, 1992, 1666-1673). Denne fremgangsmå-ten gir likevel heller lite utbytte (omkring 45 %), hoved-sakelig på grunn av kompetetive transforestringsreaksjo-ner.

Videre er det fra teknikkens stand kjent at CH 672251 ang-år anvendelsen av ferutinin som et legemiddel for behandlingen av ovarialinsuffisiens som verken angir eller foreslår en kosmetisk anvendelse av ferutinin; GB 1604225 som beskriver den anti-inflammatoriske og anti-koagulerende aktiviteten av aktive prinsipper ekstrahert fra den knoll-bærende delen av en plante av ambeliferae-familien, slik som Ferula Communis, og særlig beskriver dette dokumentet deres anvendelse for behandlingen av reumatisme eller gikt men som ikke foreslår en kosmetisk anvendelse; og Tamemoto Kimiko et al., Phytochemistry, vol. 58, no. 5, 2001, s. 763-767 som angir den antibakterielle anvendelsen av ferutinin i populærmedisin for behandlingen av hudsykdom-mer og sår, men uten noen henvisning til den kosmetiske anvendelsen.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Det har nå blitt funnet at anvendelsen av p-pivaloyloksybenzosyre som forestringsmiddel gjør det mulig å unngå konkurrerende reaksjoner ansvarlige for lave konversjons-utbytter.

Målet med foreliggende oppfinnelse er derfor en fremgangsmåte for fremstilling av ferutinin (Ia)

som omfatter følgende trinn:

a) ekstraksjon av daucanestere fra Ferula spp,

b) basisk hydrolyse av daucanestere for å gi jaeschkena diol (II) c) forestring av jaeschkenadiol (II) med p- pivaloyloksybenzosyre (III) for å gi p-pivaloylferutinin (IV) d) hydrolyse av p-pivaloylferutinin (IV) til ferutinin.

"Daucaneestere" betyr forbindelser med den generelle formelen (I) som definert over, esterene kan oppnås ved eks-trahering av rhizomer eller deler av Ferula spp som er over bakken, foretrukket Ferula communis og Ferula hermonis, med konvensjonelle metoder, for eksempel ved ekstra-hering med lavere alkoholer. Med utgangspunkt i Ferula hermonis rhizomer inneholdende ferutinin og jaeschkena-diolbenzoester (ikke enkelt separerbar ved kromatografi) i l:l-forhold, kan ren ferutinin isoleres ved å ekstrahere røttene med metanol, behandle ekstraktet med 5 % KOH og tilbakeekstrahere det forsåpede ekstraktet med alifatiske hydrokarboner, etere, estere eller klorerte løsemidler.

Alternativt kan daucanestere oppnås ved ekstraksjon med overkritisk C02ved temperaturer i området fra 35 til 65°C, foretrukket ved 45°C, og trykk i området fra 200 til 260 bar, foretrukket ved 245 bar. I separatoren (eller i separatorene) er temperaturen i området fra 25 til 45 °C og trykket er på omkring 50 bar. Under disse eksperimentelle betingelsene er gummimaterialer, som gjør gjenvinningen av de ønskede forbindelsene vanskelig, ikke ekstrahert. Residuet kan direkte utsettes for forsåping i henhold til det som fremkommer i eksemplene.

Jaeschkenadiol forestres med p-pivaloyloksybenzosyre og behandles i det samme reaksjonsløsemiddelet med en base, foretrukket et primært amin, mer foretrukket etylendiamin, for å gi ren ferutinin. Ifølge en foretrukket utførelses-form av oppfinnelsen utføres trinnene c) og d) passende i sekvens uten gjenvinning av intermediær p-pivaloylferutinin.

Et ytterligere mål med foreliggende oppfinnelse er den kosmetiske behandlingen av rynker omfattende administreringen av Ferula spp ekstrakter, den kosmetiske behandlingen av rynker omfattende administreringen av ferutinin samt den kosmetiske behandlingen av rynker omfattende administreringen av p-pivaloyloksyferutinin.

Ved påføring på huden viste ferutinin og Ferula spp-ekstrakter seg overraskende å øke kollagenbiosyntese og å gi en tonisk, trofisk og fuktgivende virkning, og derved gi fasthet og elastisitet. Videre reduserer de sebumsekre-sjon og har en spesiell rolle i kontroll av hirsutisme og ansiktsvirilisering. Sammensetninger inneholdende ferutinin eller Ferula spp-ekstrakter kan derfor anvendes innen kosmetikken eller dermatologien ved behandling av overfladiske eller dype rynker eller andre uestetiske tilstan-der samt ved behandlingen av ulike akner og seborréformer.

Ferutinin og Ferula spp-ekstrakter kan formuleres som kre-mer, geler og losjoner sammen med konvensjonelle tilset-ninger, for eksempel de beskrevet i Remington's Pharmaceu-tical Sciences Handbook, XVII utgave, Mack Pub., N.Y., U.S.A., foretrukket i nærvær av soyalecitin eller fosfoli-pider, slik som lauroylfosfatidylkolin og myristoyl-fosfatidilokolin, som kan inkorporeres i vann/olje- og ol-je/vann-emulsjoner eller i transdermale plaster.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen mer detaljert.

EKSEMPLER

Eksempel 1 - Isolering av jaeschkenadiol fra Ferrula her - monis - røt ter

250 g finmalte Ferula hermonis-røtter (partikkelstørrel-sesdistribusjon: 2 mm) ekstraheres ved perkolering med 1 1 MeOH. Etter knaing i to dager og perkolering av løse-middelet repeteres operasjonen (4x11) for å gi 112,2 g metanolekstrakt (45 %) . Legemiddeltømming overvåkes av TLC (petroleumseter/EtOAc 8/2, ferutinin Rf: 0,14).

Metanolekstraktet kokes under tilbakeløp med 513 ml av en 10 % KOH metanolløsning. Etter 1 time viser TLC-analyse (petroleumseter-EtOAc 8/2, ferutinin Rf: 0,14; Rf jaeschkenadiol: 0,31) at reaksjonen er fullstendig. Etter av-kjøling fortynnes reaksjonsblandingen med vann (500 ml) og ekstraheres med petroleumseter (4 x 500 ml). De kombinerte petroleumseterfåsene vaskes med saltlake, tørkes og fordampes. Det resulterende semikrystallinske residuum vaskes med kald petroleumseter (kjøleskapstemperatur) for å gi 7,5 g krystallinsk jaeschkenadiol. Moderluten renses ved kromatografi (50 g silikagel, petroleumseter-EtOAc 95:5) for å oppnå a-bisabolol (870 mg), en blanding av a-bisabolol og jaeschkenadiol og ren jaeschkenadiol (3,4 g etter krystallisering). Blandingen av jaeschkenadiol og a-bisabolol slås sammen med moderluten og kromatograferes (50 g silikagel, petroleumseter-EtOAc 95:5) for å gi 1,95 g krystallinsk jaeschkenadiol (totalt utbytte: 12,85 g, 5,1 %) .

Forbindelsen har følgende kjemisk-fysiske og spektroskopiske egenskaper: IR-spektrum (KBr, cm"1) : 3339, 2965, 2905, 2875, 1470, 1375, 1047, 968, 858

Massespektrum (CI.)

M<+>+l-H20=221; M++1-2H20=2 03

<X>H NMR-spektrum (300 MHZ, CDC13) 6: H9 5, 43 m, H2 3.9 m, H14 1,78 s, H15 1,00 s, H12 0,95 d J 4,98, H13 0,91 d J 5,13.

Eksempel 2 - Isolering av jaeschkenadiol fra Ferula commu - nis - røtter

250 g finmalt Ferula communis- røtter (partikkelstørrelses-distribusjon: 2 mm) ekstraheres ved perkolering ved anvendelse av 1 1 MeOH. Etter knaing i to dager og perkolering av løsemiddelet repeteres operasjonen (4x11), metanol-ekstraktene konsentreres til et volum likt vekten av de malte røttene, og ekstraktet tilsettes med 10 % KOH (10 ml). Den alkaliske løsningen kokes under tilbakeløp i 2 timer, avkjøles deretter og tilbakeekstraheres tre ganger med 200 ml n-heksan. Utarming av legemiddel overvåkes med TLC (petroleumseter/EtOAc 8/2).

De kombinerte heksanfasene vaskes med saltlake, tørkes og fordampes. Det resulterende semikrystallinske residuet vaskes med kald petroleumseter (kjøleskapstemperatur) for å gi 3,5 g krystallinsk jaeschkenadiol. Moderluten renses i henhold til eksempel 1. Utbytte: 0,8 g jaeschkenadiol med de samme kjemisk-fysiske egenskapene som i eksempel 1.

Eksempel 3 - Isolering av jaeschkenadiol fra Ferula commu - na- deler som vokser over bakken

1 kg finmalte Ferula communis- deler som vokser over bakken ekstraheres med karbondioksid ved 45°C og 245 bar i et eks-traksjonsapparat med superkritiske gasser. Temperaturen i

separatoren (eller i separatorene) er i området fra 25 til 45°C og trykket er på omkring 50 bar. Under disse betingelsene ekstraheres ikke gummimaterialer som gjør det vanskelig å gjenvinne de ønskede forbindelsene. Residuet som ba-re inneholder lipofile forbindelser og vann, tas opp med

metanol og behandles med baser for å hydrolysere jae-schkenadiolestere som beskrevet i eksempel 1 og 2. Etter rensing oppnås 5,1 g ren forbindelse med de samme karakte-ristikkene som produktet i eksempel 1.

Eksempel 4 - Syntese av p- pivaloyloksybenzosyre

4-hydroksybenzosyre (114,5 g, 829 mmol) oppløses under om-røring i pyridin (1,15 1), avkjøling til T<5°C i et isbad. Den resulterende løsningen tilsettes med 4-dimetyl-aminopyridin (DMAP, 0,3 ekvivalenter, 248,8 mmol, 30,4 g) og pivaloylklorid (3 ekvivalenter, 2,487 mol, 300 g, 293,6 ml). Løsningen tillates å varmes til romtemperatur og forblir under omrøring i 2 timer, deretter tilsettes vann (2,29 1) (eksotermisk reaksjon: avkjøle løsningen i et isbad) og forblir under omrøring i ytterligere 3 timer.

Løsningen helles i en separatortrakt og ekstraheres med CH2C12(3 x 750 ml). De kombinerte metylenkloridfåsene vaskes med 2 M H2S04(4 x 750 ml) og en mettet NaCl-løsning (1 x 1150 ml) og tørkes deretter over Na2S04(60 g).

Løsningen filtreres gjennom papirfilter og løsemiddelet fordampes av under vakuum for å oppnå et residu som finma-les med petroleumseter ved 30°-50° (3 x 400 ml), filtreres ved suging og tørkes under vakuum i en statisk tørker ved 45°C i 15 timer. 130,5 g produkt med følgende spektroskopiske karakteristikker oppnås.

IR-spektrum (KBr, cm"1) : 3680, 2978, 2361, 1753, 1686, 1603, 1427, 1289, 1204, 1163, 1103.

Massespektrum (C.I.): M<+>+l=223

<X>H NMR-spektrum (300 MHZ, D-DMSO) 5 H3=7 8,00 d J=8,48, H4=6 7,23 d J=8,55, CH3 1,34 s.

Eksempel 5 - Syntese av ferutinin fra jaeschkenadiol

Jaeschkenadiol (100 g, 419,5 mmol) oppløses ved omrøring ved romtemperatur i CH2C12(600 ml). Den resulterende løs-ningen tilsettes med p-pivaloyloksybenzosyre (1,4 ekvivalenter, 587,3 mmol, 130,5 g) og DMAP (0,3 ekvivalenter, 125,9 mmol, 15,4 g). Løsningen forblir under omrøring i 10 minutter for å komplettere reagensoppløsning, deretter tilsettes N,N'disykloheksylkarbodiimid (DCC, 1,8 ekvivalenter, 755,1 mmol, 155,8 g). Reaksjonen er fullstendig etter 2 timer.

Løsningen konsentreres til 2 volumer (200 ml) og fortynnes med 5 volumer CH3CN (500 ml), deretter filtreres disyklo-heksylureapresipitatet av og vaskes med 5 ytterligere volumer CH3CN (2 x 250 ml). De kombinerte organiske fasene helles i en separatortrakt, ekstraheres med 10 % vekt/volum Na2C03(2 x 250 ml) og med en NaCl-mettet løs-ning (1 x 250 ml) , tørkes deretter over Na2S04(100 g) . Na2S04filtreres av og løsemiddelet fordampes under vakuum for å gi 360 g av forbindelse (IV) med følgende spektroskopiske karakteristikker:<X>H NMR (300 MHZ, CDC13) : 5 8, 09 (d, j = 9,0 Hz, H3'-H5'), 7,20 (d, J=8,7 Hz, H2'-H6'), 5,60 (brt, J=4,7 Hz, H9), 5,35 (td, J=10,4-2,9 Hz, H6), 2,58 (dd, J=13,l-10,9 Hz, H7b), 2,34 (dd, J=14,l-2,3 Hz, H7a), 2,07 (m, H10), 2,04 (d, J=2,7 Hz, H5), 1,97 (d, J=9,7 Hz, H2a), 1,89 (m, Hil), 1,86 (s, H14), 1,63 (m, H2b), 1,57 (m, H3a), 1,41 (s, C(CH3)3), 1,30 (m, H3b) , 1,14 (s, H15) , 0,99 (d, J=6,9 Hz, H12), 0,89 (d, J=6,7 Hz, H13).

Forbindelse (IV) oppløses under omrøring ved romtemperatur i 2 1 CH2C12. Den resulterende løsningen tilsettes etylendiamin (10 ekvivalenter, 280 ml). Etter 3 timer er reaksjonen fullstendig. Løsningen avkjøles til 0°C, helles i en separatortrakt, vaskes deretter med 3M H2S04ved 0°C (2 x 750 ml, eksoterm reaksjon) en mettet NaCl-løsning (1 x 500 ml). Den organiske fasen tørkes over Na2S04(100 g), filtreres og fordampes til tørrhet. Residuet (230 g) settes på en silikagelkolonne (2,5 kg) ekvilibrert med 5,8 1 av en heksan:AcOEt=9:1-blanding og eluert med 70 1 av den samme blandingen. De produktinneholdende fraksjonene slås sammen, løsemiddelet fordampes av under vakuum og produktet tørkes i en statisk tørker ved 45°C i 24 timer.

139 g (92,4 %) produkt med følgende spektroskopiske karakteristikker oppnås: IR-spektrum (KBr, cm"1) : 3410, 1686, 1655, 1608, 1593, 1560, 1279, 1165, 1099, 771.

Massespektrum (C.I.): M<+->l-H20=341

<X>H NMR-spektrum (200 MHZ, CDC13) : 5 H3'=7'7,94 d J=8,4'=6' 6,88 d J=8, H9 5,56 m, H2 5,23 dt J=ll, H14 1,80 brs, H15 1,10 s, H13 0,94 d J=6,5, H12 0,82 d J=6,5.

Eksempel 6 - Fremstilling av et Ferula hermonis - ekstrakt

1 kg Ferula hermonis hel plante ekstraheres tre ganger med 5 volum aceton. De kombinerte acetonekstraktene konsentreres til 0,5 deler sammenlignet med vekten av utgangs-biomassen og fortynnes med 2 deler vann. Den vandige løs-ningen justeres til pH 7,8 med fortynnet KOH i nærvær av heksan under kraftig omrøring. Heksanfasen kastes, den vandige surgjøres til pH 5 og tilbakeekstraheres med n-heksan. Heksanfasen som inneholder ferutinin, konsentreres til tørrhet for å gi 52 g ekstrakt inneholdende omkring 35 % ferutinin.

Eksempel 7 - Formulering inneholdende ferutinin for behandling av overfladiske rynker

Ferutinin inkorporeres i en krem med følgende sammen-setning: Eksempel 8 - Formulering inneholdende en Ferula hermonis ren ekstrakt med et ferutinininnhold på 30 % og et jae-schkenadiolbenzoesterinnhold på 20 % Eksempel 9 - Gelinneholdende ferutinin Eksempel 10 - Kosmetikkformulerinq inneholdende Ferula spp- ekstrakt

FORSØK

Produkteffektivhet

Effektivheten til kremen ifølge eksempel 7 ble bestemt i en dobbel blindstudie med 40 frivillige kvinner på mellom 39 og 56 år som evaluerte effektene på hudelastisitet og fasthet og på rugometri. Studiet ble innledet med en syv dagers kondisjoneringsperiode, der objektet måtte avstå fra anvendelse av fuktighetsprodukter, solkremer og fly-tende make-up og unngå solbehandlinger og overdreven eks-ponering for UV-stråler.

Personene ble tillatt å anvende passende øye- og leppe-pleieprodukter, ansiktspuddere og ikke-fuktighetsgivende såper.

Personene ble tilfeldig delt i to grupper, en ble behandlet med en placebokrem og en ble behandlet med kremen ifølge eksempel 7. Kremene ble påført på ansiktet i stan-dardisert mengde (0,5 g, dvs. 0,5 cm krem fra tuben) to ganger daglig, om morgenen og om kvelden. Før og etter fem uker behandling ble følgende målinger utført.

Før hver målingssesjon oppholdt alle personene seg i 30 minutter i et klimatisk rom ved 23°C og 50 % relativ fuktighet. Hver sesjon omfattet tre målinger med corneometer, tre målinger med cutometer, og et silikonavtrykk av det periorbitale området på hudområdene indikerte følgende.

Alle 40 personer fullførte studiet.

Cutometri

Cutometer er en kommersielt tilgjengelig anordning (Cutometer SEM 575, Courage&Khazaka, Tyskland) for å måle hudmekaniske egenskaper på en ikke-angripende måte. Mer detaljert måler det den vertikale deformasjonen av hud-overflaten når den er underkastet et negativt trykk på 500 mm Hg gjennom en 2 mm åpning av en prøve. Prøvens hudpene-treringslengde måles optisk med 0,01 mm presisjon. Prøven er bundet til en datamaskin som registrerer huddeformasjon over tid. Fra den resulterende kurven kan mange variabler ekstrapoleres for å evaluere hudelastisitet, viskoelasti-sitet og viskøs oppførsel.

Følgende parametere ble registrert:

umiddelbar utvidelse (Ue), målt ved 0,1 sekund,

forsinket utvidelse (Uv),

endelig utvidelse (Uf), målt ved 10 sekunder og umiddelbar sammentrekning (Ur).

Testen ble utført ved anvendelse av cutometeret på begge kinn.

Signifikante variasjoner ble ikke observert i placebogruppen. Forsinket utvidelse (Uv) i den behandlede gruppen minsket vesentlig (16 %, p<0,05) etter 5 uker behandling. Denne parameteren reflekterer hudviskoelastisitetsegen-skaper og dermisoppførsel. Etter 5 uker ble en vesentlig endring også observert (-12 %, p<0,05) i Ue), som hoved-sakelig er påvirket av hydrering og mekaniske egenskaper i corneum-laget. Reduksjonen i Uv og Ue sammen med Ur-stabilitet viser økt fasthet i huden.

Corneometri

Mykt og glatt hudutseende er for det meste avhengig av nærværet av en passende mengde vann i corneous-laget.

Corneometer er en kommersielt tilgjengelig anordning (Corneometer CM 825 Combi 3, Courage&Khazaka, Tyskland) som måler kapasitetsendringer resulterende fra endringer i hudens fuktighet.

Testen ble utført ved anvendelse av corneometeret på begge kinn.

Etter 5 uker ble en vesentlig endring i den behandlede gruppen observert, spesielt økte hudens fuktighet med 17,5 % mens den ble redusert med 3 % i placebogruppen.

Rugometri

Silikonavtrykk ble utført på personer i sittende posisjon. Avtrykkene (2x5 cm) ble oppnådd ved begynnelsen og etter 5 uker ved anvendelse av "Siflo silikonavtrykksmateriale"

(tilgjengelig fra Flexico, Storbritannia).

Avtrykkene ble deretter analysert med Hudbildeanalysator-systemet ved anvendelse av Qantirides - Monaderm-program-vare, som atskiller kutant mikrorelieff fra mediane rynker og dype rynker og kalkulerer deres antall og dybde, endelig oppnås verdien for totalt rynkeområde.

Etter 5 uker ble vesentlige endringer observert i den behandlede gruppen. Spesielt ble en 21,3 % (p<0,05) reduksjon i rynkeområdet observert, mens reduksjonen i placebogruppen var 0,4 %.

Statistisk har vesentlig reduksjon blitt observert hoved-sakelig i antallet og dybden av mediane og dype rynker.

Konklusj on

Studiet konkluderte med at kremen i eksempel 7 har god kosmetisk aktivitet ved behandling av hud med krono- og fotoaldrende tegn, siden det øker hudens fasthet og fuktighet og reduserer gjennomsnittlig rynkeområde, spesielt dyp mikro- og makroruhet. Huden fremsto synlig fastere og mykere.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av ferutinin (Ia)

som omfatter følgende trinn: a) ekstraksjon av daucanestere fra Ferula spp, b) basisk hydrolyse av daucanestere for å gi jaeschkena diol (II) c) forestring av jaeschkenadiol (II) med p- pivaloyloksybenzosyre (III) for å gi p-pivaloylferutinin (IV) d) hydrolyse av p-pivaloylferutinin (IV) til ferutinin.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori daucanestere blir ekstrahert fra Ferula communis.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, hvori daucanestere blir ekstrahert fra Ferula hermonis.

4. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, hvori daucanestere blir ekstrahert med overkritisk karbondioksid ved temperaturer i området fra 35 til 65°C og trykk i området fra 200 til 260 bar.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, hvori temperaturen er 4 5°C.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4 eller 5, hvori separasjonen utføres ved temperaturer i området fra 25 til 45°C og trykk i området fra 45 til 55 bar.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, hvori trinn c) og d) utføres i serie uten gjenvinn-ingsforbindelse (IV).

8. Kosmetisk behandling av rynker omfattende administreringen av Ferula spp ekstrakter.

9. Kosmetisk behandling av rynker omfattende administreringen av ferutinin.

10. Kosmetisk behandling av rynker omfattende administreringen av p-pivaloyloksyferutinin.