NO751877L - - Google Patents

Description

"Fremgangsmåte for serumundersøkelse

av hypdthyroidisme"

Sirkulerende Tg og T^er bundet til mange bestanddeler i blodet av hvilke den thyroksinbindende globulin(TBG)-fraksjon inneholder hovedbindestillingene i et bestemt antall. Bindingen av Tg og til TBG-molekylet er en konkurrerende proteinbinding, dvs. at ubundet vil erstatte Tg og T4som allerede finnes i molekylet.

Idet det bare er 1-2 mg TBG/100 ml normalserum, mettes bindestillingene som er ekvivalente med ca. 20 mikrogram

pr. 100 ml normalserum, lett ved en liten økning av T^-konsentrasjonen.

i'

I hyperthyroidisme er bindestillingene i TBG-molekylet nesten mettet med Tg og T^. I hypothyroidisme er bindestillingene meget umettede, noe som resulterer i en øket evne hos TBG-molekylet i serum til å oppta Tg.

Triosorb-bestemmelsen og andre lignende tester på Tg-opptak arbeider efter prinsippet med konkurrerende proteinbinding. Serum-Tg og -T^er primært bundet til bindestillingene i TBG-molekylet. Antallet ubesttte bindestillinger bestemmes ved tilsetning av radioaktivt Tg (Tg+) til serum i nærvær av et adsorpsjonsmiddel. Når Tg+ tilsettes til serum, vil ethvert over-skudd som ikke bindes til bindestillingene i TBG-molekylet i serumet, adsorberes til adsorpsjonsmidlet. Harpikssvamper er adsorpsjonsmidlet for Triosorbtesten. I hyperthyroidisme er eksempelvis de fleste av TBG-bindestillingene opptatt av Tg og T4og således vil det tilsatte Tg+ ikke bli opptatt av de endogene TBG-molekylene, men vil opptas av testadsorpsjonsmidlet. I hypothyroidisme er det omvendte tilfelle. Således vil mengden av radioaktivt Tg som bindes av adsorpsjonsmidlet direkte angi thyroidtilstanden hos pasienten.

Tetrasorbforsøket på T4 er også basert på prinsippet med konkurrerende proteinbinding. For å bestemme T^-konsentrasjonen ekstraheres T4fra serumet og frigjør det fra dets bindende protein, TBG. Serumekstrakten tilsettes så til en løsning inne-holdende en begrenset mengde eksogent TBG som det er bundet radioaktivt T4 (T4+) til. En forflytningsreaksjon foregår hvori

T^i ekstrakten fortrenger T4+ fra det eksogene TBG. Dette for-trengte T^+ adsorberes så på harpikssvampen som brukes som

adsorberingsmiddel. Når mere T4 tilsettes fortrenges mere T^+ fra TBG. Den mengde T4+ som fortrenges fra TBG er derfor direkte proporsjonal med mengden T4som er tilstede i serumekstrakten.

I hyperthyroidisme er det mere T4tilgjengelig i serumekstrakten til å fortrenge T4+ fra eksogent TBG enn.i euthyroidisme eller hypothyroidisme.

Når det er normale mengder TBG i serum påviser disse typer av thyroidfunksjonstester den aktuelle tilstand hos pasienten. Når TBG- og T4-nivåene er forhøyede, som i svangerskap eller som følge avøstrogen innføring i form av prale svangerskaps-hindrende midler, angit Tg-opptakstester at pasienten er hypothyroid. Tester som måler totalt T4angir imidlertid en euthyroid eller noen ganger en hyperthyroid tilstand. På en enkel måte kan det sies at svangerskap eller østrogentilsetning resulterer i en økning av antallet TBG-molekyler som forårsaker en økning av hormonbindende stillinger med en samtidig opptredende økning i thyroidhormon-nivåer. Thyroidfunksjonstester utført på disse sera på denne tiden viser et øket Tg-opptak, indikerende en hypothyroid funksjon og et øket T4~nivå, indikerende en hyperthyroid funksjon. Det er formålet med denne oppfinnelse å beskrive et kontrollserum fremstilt fra disse typer sera og normalserum som vil tjene som et hypthyroid kontrollserum for T4~tester.såvel som Tg-opptakstester. Med normalserum mener søkerne serum med normale Tg- og T4-verdier og som kan være menneske-, okse-, saue-, geite- eller annet syreserum. Bare hesteserum har vist seg ikke å kunne anvendes.

Et serum er hyperthyroid ifølge tetrasorb- og triosorb-testene dersom prosent Tg-opptak er større enn 35, og T4~konsentrasjonen er over 14,5 mikrogram pr. 100 ml serum. Et serum er euthyroid dersom prosent Tg-opptak er 25 til 35 og T4~konsentrasjonen er 5,3-14,5 mkg pr. 100 ml serum. Hypothyroid serum har et Tg-opptak på under 25 prosent og mindre enn 5 mljg T4

pr. 100 ml serum.

Fjerning av Tg og T^fra normalserum eller serum inne-holdende forhøyede TBG-nivåer, som ifølge de nedenfor angitte metoder, resulterer i et serum som bedømmes å være hypothyroid både ved metoder som måler T^-konsentrasjon og Tg-opptak.

Eksempel 1

Metode

1. Artikkel 2 tilsettes til 2400 ml av artikkel 1 i en 4 liters

Erlenmeyer-kolbbe (ca. 20% kullyekt til volum av serum) .

2. Det rystes forsiktig "ved romtemperatur inntil kullpartiklene er dispergert i væsken. 3. Blandingen plasseres ved 4°C. Det omrøres forsiktig i ca.

24 timer.

4. Ved slutten av 24 timer sentrifugeres blandingen med høy hastighet i en nedkjølt sentrifuge (34.800 x g). 5. Overstående væske avdekanteres og den sentrifugeres igjen som i trinn 4. 6. Efter den andre sentrifugeringen skal igjen den overstående væske avdekanteres og derpå filtreres ved vakuum gjennom et milliporefilter. 7. Filtratet (1200 ml) helles i et passende glasskår egnet for lyofilisering og lyofiiiseres. 8. Det lyofiliserte materiale overføres til en to liters Erienmeyerkolbe og artikkel 3 tilsettes. 9. La blandingen stå i 30 minutter og oppløsningspresessen hjelpes så ved forsiktig rysting. 10. 300 ml av artikkel 1 tilsettes så til serumblandingen som oppnås

i trinn 9.

11.2,14 ml overføres til et medisinglass som kan inneholde 2 ml og lyofiiiseres derpå.

Medisinglass rekonstitueres med 2,0 ml avionisert, destillert vann. Dette serum anvendes som en hypothyroid kontroll i forbindelse med alle thyroidfunksjonstester, dvs. den resulterende serumkontroll skal ha et Tg-opptaksnivå på mindre enn 25% ifølge Triosorbmetoden og en T^-konsentrasjon på mindre enn 5,3 mikrogram/ml ifølge Tetrasorb-metoden.

Modifikasjoner er naturligvis mulig i eksempel 1. Sentrifugering (trinnene 4 og 5) kan elimineres. Millipore-filteret (trinn 6) kan naturligvis være et Ertel-apparat. Serumet kan være menneske- eller dyreserum. Kravet om å overføre blandingen (trinn 11) kan naturligvis modifiseres eller unngås helt. Blandetiden (trinn 3) kan innkortes eller forlenges innen området 3-30 timer. Prosent karbon som tilsettes kan variere fra 5-20 prosent, idet et område på fra ca. 10 til ca. 20 prosent er foretrukket.

Denne fremgangsmåte fjerner over 99% av Tg og T^fra startserumet, og det produseres effektivt et Tg- og T^-fritt serum, mens den totale protienkonsentrasjon, pH eller T^-bindingsevneri for serumet ikke påvirkes nevneverdig.

Det følgende eksempel klargjør metoden som brukes for å fjerne Tg og T4fra serum som inneholder forhøyede TBG-nivåer. Modifikasjoner i dette eksempel lik de som er angitt for

eksempel 1 er mulige og omfattes av oppfinnelsen.

Eksempel 2

Metode

1. Artikkel 2 tilsettes til artikkel 1 i en 2 liters Erlenmeyer-kolbe (ca. 20% karbonvekt til volum av serum). 2. Det omrystes forsiktig ved romtemperatur i et minutt slik at karbonpartiklene dispergeres i væsken. 3. Blandingen plasseres ved 4°C og omrøres meget forsiktig i ca. 24 timer. 4. Efter 24 timers forløp sentrifugeres blandingen ved høy hastighet i en nedkjølt sentrifuge (34.800 x g).

5. Overstående væske dekanteres og den sentrifugeres igjen som

1 trinn 4.

6. Efter annen sentrifugering avdekanteres igjen overstående væske og den filtreres i vakuum gjennom et sintret glassfilter. 7. Det tilsettes 300 ml av artikkel 3 til 600 ml serum oppnådd fra trinn 6. Det omrystes forsiktig for å blande ingrediensene.

8. Det overføres 2,14 ml til et medisinglass som kan inneholde

2 ml og det lyofiiiseres.

Medisinglassene rekonstitueres med 2,0 ml avionisert, destillert vann. Dette serum anvendes som hypothyroid kontrollserum i forbindelse med alle throidfunksjonstester. Fyllingsløsningen vil efter rekonstitusjon inneholde ca. 7 prosent protein. Den resulterende serumkontroll skal ha et Tg-opptaksnivå på mindre enn 25% ifølge Triosorb-metoden og en T^-konsentrasjon på mindre enn 5,3 ug ifølge Tetrasorb-metoden. Serum som anvendes i dette eksempel kan eksempelvis fåes fra svangre kvinner eller fra kvinner på østrogenterapi.

En serie på fire adskilte forsøk ble utført for å vise effekten på sera når de ble behandlet som i eksemplene 1 og 2.

De resulterende sera ble prøvet ved å følge de vel kjente Triosorb- og Tetrasorb-protokoller. Resultatene av disse forsøk (tabell 1) viser at serum behandlet ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan anvendes som et hypothyroid kontrollserum for tester som utføres i kliniske laboratorier.

Resultatene fra forsøk I viser at det samlede normalserum var euthyroid ifølge begge tester. Efter behandlingen var serumet hypothyroid for både Tg-opptak og T^-konsentrasjon.

Resultatene fra forsøk II viser at hypothyroidverdiene

kan endres oppover når sera fra før behandlingen og sera efter behandlingen blandes sammen, som i dette forsøk i et forhold på

2 til 1.

Forsøk III ble utført med oksesera som representative

for dyresera som har vist seg nyttige. Som resultatene viser opp-viser samlet normalt okseserum Tg-opptak og T^-konsentrasjon i eutyroidområdet. Efter behandling oppfører disse sera seg på

samme måten som menneskesera og er i hypthyroidområdet både for Tg-opptak og T^-konsentrasjon. Som med menneskeserum kan Tg- og T4-verdiene økes ved å blande forskjellige forhold av normalt okseserum og det fremstilte hypthyroide okseserum.

Forsøk IV viser det ventede hypothyroide Tg-opptak og euthyroide T4-konsentrasjon for samlet serum oppnådd fra svangre kvinner. Efter den behandling som er angitt i eksempel 2, blir imidlertid serumet hypothyroid for både Tg-opptak og T4-konsentrasjon.

Claims (11)

1. Fremgangsmåte for oppnåelse av en hypothyroid serumkontroll, karakterisert ved følgende trinn: A. tilsetning av nøytralt avfarvningskull til blodserum i en mengde av ca. 5-20 prosent basert på vekt av kull til volum av serum, B. sammenblanding av den ovenstående blanding i ca. 24 timer ved en temperatur av ca. 4°C, C. to gangers sentrifugering av den resulterende oppslemming ved 34.800 x g og ved en temperatur av ca. 4°C, D. filtrering, av den resulterende overstående væske og E. lyofilisering av den således oppnådde overstående væske.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved tilsetning av ubehandlet normalserum i en mengde av ca. 10 til ca. 35 prosent av serumvolumet i trinn A til den filtrerte overstående væske i trinn D.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som serum anvendes dyre-blodserum.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som serum anvendes menneske-blodserum.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som serum anvendes okse-blodserum.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det anvendes serum som er T^-euthryoid, -hypothyroid eller -hyperthyroid og Tg-euthyroid eller -hypothyroid.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det anvendes serum som er Tg-hypothyroid.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det anvendes serum som er T4-euthyroid og Tg-euthyroid.

9. Kontrollserum som bedømmes som hypothyroid ifølge metoder som måler T^ -konsentrasjon og Tg-opptak, karakterisert ved at det omfatter blodserum som har blitt behandlet ved metoden ifølge krav 1.

10. Klinisk fremgangsmåte foir å måle en persons serum-trijodthyroninopptaksniyå og -thyroksinkonsentrasjon, karakterisert ved at den omfatter anvendelsen av en enkelt kontrollserumstandard som et hypothyroid reféransekontroll-serum for både trijodthyroninopptak- og thyroksinkonsentrasjons-tester.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, • karakterisert ved at fremstillingen av referanse-kontrollserumet omfatter følgende trinns A. tilsetning av nøytralt avfarvningskull til blodserum i en mengde av ca. 5-20 prosent basert på vekt av karbon til volum av serum, B. sammenblanding av den ovenstående blanding ved en temperatur av ca. 4°C, C. to gangers sentrifugering av den resulterende .oppslemming ved 34.800 x g og ved en temperatur av ca. 4°Cf D. filtrering av den resulterende overstående væske og E. lyofilisering av den således oppnådde overstående væske.