NO752792L - - Google Patents

Description

Foreliggende opprinnelse gjelder fremgangsmåte for fremstilling av mikroorganismer. Det er kjent mange mikroorganismer som kan utnytte hydrokarboner som karbon- og/eller energikilde. Den tørkede biomasse som kan oppnås ved dyrking av slike mikroorganismer, ofte referert til som enkeltcelleprotein,

er rik på protein og kan brukes som mulig næringsmiddel eller nærings-supplement for mennesker og dyr.

En fremgangsmåte for dyrking av hydrokarbon-forbrukende mikroorganismer omfatter vanligvis vekst av slike organismer under aerobe betingelser i et flytende vekstmedium som omfatter, i tillegg til karbonkilden, assimilerbare kilder for nitrogen som f.eks. nitrogengass , nitrationer, ammoniumioner eller urea. Selv om nitrogengass er billig i anskaffelse er bruken av den som nitrogengasskilde ufordelaktig, idet det kreves mye energi for å metabolisere den, hvilket gjør at mikroorganismen forbruker mye av karbonkilden. Nitrationer krever også mye av karbonkilden siden de må reduseres til ammoniumioner for å kunne metaboliseres av mikroorganismene. Ammoniumioner er både billige og lett tilgjengelige og forbruker ikke mye av karbonkilden, men har den ulempe at de virker hindrende på veksten av mange organismer, spesielt på visse metanol- og metanforbrukende bakterier, når de finnes i det flytende vekstmediet i for stor konsentrasjon. Endelig kan urea, som er billig og lett tilgjengelig og ikke krevende når det gjelder karbonkilden, bare utnyttes av et begrenset antall bakteriearter.

Det er et formål med foreliggende oppfinnelse å skaffe en forbedret fremgangsmåte for dyrking av hydrokarbon-forbrukende mikroorganismer hvor de ulemper som er forbundet med bruken av visse nitrogenkilder er overvunnet.

Oppfinnelsen skaffer således en fremgangsmåte

for fremstilling av mikroorganismer hvori en eller flere hydrokarbon-forbrukende mikroorganismer dyrkes under aerobe betingelser i et flytende vekstmedium omfattende urea og essensielle mineralsalter i nærvær av en eller flere ikke-hydrokarbonforbrukende ureasepositive mikroorganismer som kan metabolisere organiske substanser fremstilt av de voksende hydrokarbon-forbrukende mikroorganismene.

Uttrykket "hydrokarbon" slik det anvendes her menes å omfatte ikke bare hydrokarboner, men også oksygenerte derivater av dem.

Uttrykket "mikroorganisme" anvendes her i bred betydning og omfatter ikke bare bakterier men også gjær, tråd-aktige sopper, aktinomyceter og protozoer.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen spalter ureasepositive mikroorganismer gradvis urea og danner derved ammoniumioner i det flytende vekstmediet, hvilke ioner så blir tilgjengelige for de hydrokarbon-forbrukende mikroorganismene, mens konsentrasjonen derav reguleres av de ikke-karbonforbrukende ureasepositive mikroorganismene som således hindrer dannelse av inhiberende konsentrasjoner av ammoniumioner i det flytende vekstmediet.

Når de hydrokarbon-forbrukende mikroorganismene vokser raskt, er produksjonen av ekstracellulære produkter høy

og som følge derav er veksthastigheten høy for de ikke-hydrokarbon-forbrukende ureasepositive mikroorganismene som metaboliseres disse ekstracellulære produktene. De sistnevnte mikroorganismene kan derfor spalte det tilførte urea i ammoniumioner med høy hastighet og ammoniumioner er således tilgjengelige for hydrokarbon-utnyttende mikroorganismene med stor hastighet slik at det passer til deres raske vekst.

Når de hydrokarbonforbrukende organismene vokser langsomt er produksjonshastigheten for ekstracellulære produkter lav og som følge derav er veksten av de ikke-hydrokarbon-forbrukende, ureasepositive mikroorganismene lav. De sistnevnte mikroorganismene er derfor ikke i stand til å spalte tilført urea i ammoniumioner med stor hastighet. Denne lave hastighet for produksjon av ammoniumioner passer også til den langsomme vekst av de hydrokarbon-forbrukende mikroorganismene.

Ammoniumioner er således tilgjengelig for de hydrokarbon-forbrukende mikroorganismene i en mengde som er proporsjonal med veksthastigheten for de hydrokarbon-forbrukende mikroorganismene. Derfor forblir ammoniumionkonsentrasjonen i det flytende vekstmediet relativt konstant og i praksis vil den virkelig aldri overstige det nivå der det opptrer inhiberende virkning på veksten.

I sin enkleste form omfatter den kultur av mikroorganismer som anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen en hydrokarbon-forbrukende. mikroorganisme som ikke kan nyttiggjøre seg urea men kan bruke ammoniumioner som nitrogenkilde sammen med"en eller flere ureasepositive, ikke-karbonforbrukende arter som kan spalte urea og frigjøre ammoniumioner i mediet.

Den hydrokarbon-forbrukende mikroorganisme er fortrinnsvis en metan-forbrukende bakterie som vokser i nærvær av metan eller en metanol-forbrukende bakterie som vokser i nærvær av metanol. Gode resultater oppnås dersom kulturen inne-holder både en metan- og en metanolforbrukende bakterie som dyrkes i nærvær av metan.

Andre mikroorganismer kan imidlertid også være

til stede i kulturen, som f.eks. en eller flere ikke-hydrokarbon-forbrukende ureasenegative mikroorganismer som kan metabolisere organiske substanser som er fremstilt av de voksende hydrokarbon-forbrukende mikroorganismene, og også ytterligere andre hydrokarbon-forbrukende mikroorganismer kan være til stede.

Metanforbrukende mikroorganismer som passende

akn anvendes ved fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen er eksempelvis Methylococcus capsulatus, Methylococcus minimus, Methylobacter vinelandii, Methylosinus trichosporium, Methylocystis parnis og organismen SM., (NCIB 11084) som i detalj er beskrevet i britisk patentsøknad 678/74. Passende metanol-forbrukende mikroorganismer er eksempelvis Hyphomicrobium sp. (NCIB nr. 11040), Pseudomonas extorquens, Pseudomonas methylotropha (NCIB nr. 10508-10515 og 10592-10596) og organismen OML (NCIB 11112) som er fullstendig beskrevet i britisk patentsøknad nr. 678/74. Enhver ikke-hydrokarbon-forbrukende bakterie som kan utnytte urea og kan vokse i blandkultur med hydrokarbon-forbrukende bakterier kan brukes, eksempelvis organismene M]L (NCIB 11062), M2(NCIB 11061)

og M1 (NCIB 11065) som alle er fullstendig beskrevet i britisk

patentsøknad nr. 678/74. En foretrukket blandet kultur for anvendelse ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen i nærvær av metan er kulturen betegnet T3 (NCIB 11085) som omfatter den metan-forbrukende mikroorganismen SM3 (NCIB 11084), den metanol-forbrukende mikroorganismen OML (NCIB 11112) og fire ikke-metylotrope mikroorganismer M^, M,,, M^og M^(NCIB 11063). M^er en urease-negativ mikroorganisme. Kulturen T3 og dens bestanddeler er fullstendig beskrevet i britisk patentsøknad 678/74.

Urea er passende til stede i det flytende vekstmediet i en konsentrasjon på fra 3 til 50 g/l. Det er selvsagt at det ikke skal tilføres vesentlige mengder ammoniumioner til det flytende mediet bortsett fra ved spaltning av urea.

Andre elementer som vanligvis finnes i mediet

er fosfor, svovel, magnesium og jern. Fosforkilden er fortrinnsvis et eller flere fosfater som f.eks. K2HP04, KH2P04 eller Na2HP04eller fosforsyre, fortrinnsvis i en konsentrasjon av fra 3-20 g/l. Svovelkilden kan være svovelsyre eller et sulfat, passende i en konsentrasjon av fra 0,5-5,0 g/l. De to metallene tilføres som ett av deres salter som f.eks. MgS04.7H20 i en konsentrasjon av fra 0,2-2,0 g/l og FeCl.j.6H20 i en konsentrasjon av fra 0,01 til 0,1 g/l.

Mediet kan også inneholde spormengder av andre elementer i form av passende salter som f.eks. kalsium-, sink-, kobolt-, molybden- og borsalter. Et eksempel på et passende medium er angitt i eksemplet.

Fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen kan foregå sats-vis, halv-kontinuerlig, men fortrinnsvis i kontinuerlig strømmende kultur. For å oppnå vekst inokuleres mikroorganismene i mediet som bringes i kontakt med oksygen. For kontinuerlig strømmende kultur kan mikroorganismene dyrkes i ethvert egnet fermenteringskar som f.eks. et omrørt gjæringskar med plater eller et tårngjæringskar med spreder, som er utstyrt enten med indre kjøling eller en ytre resyklert kjølekappe. Friskt medium pumpes kontinuerlig inn i kulturen med mengder som er ekvivalente med 0,02 til 1,00 kulturvolumer pr. time og kulturen tas ut med en slik hastighet at kulturvolumet forblir konstant. Oksygen og eventuelt karbondioksyd bringes i kontakt med mediet fortrinnsvis ved å boble det kontinuerlig gjennom en dyse ved bunnen av karet. Oksygenkilden for kulturen kan være luft, oksygen eller oksygenanriket luft. Brukt gass kan resykleres enten gjennom en ytre sløyfe eller innvendig ved hjelp av en gassinnføringsom-rører.

Temperaturen i kulturen holdes vanligvis mellom 30 og 50°C og fortrinnsvis fra 38 til 45°C. Kulturens pH reguleres vanligvis til mellom 6,0 og 8,0 og fortrinnsvis mellom 6,4 og 7,4 ved passnde tilsetning av alkali, f.eks. NaOH, KOH og/ eller en syre, f.eks. H2S04eller H^PO^.

Mikroorganismecellene kan høstes fra vekstmediet ved hjelp av hvilken som helst standardteknikk som vanligvis brukes, f.eks. flokkulering, sedimentering og/eller utfeining, fulgt av sentrifugering og/eller filtrering. Biomassen tørkes så, f.eks. ved fryse- eller spraytørking og kan anvendes i denne form som næringsmiddel eller næringstilskudd for mennesker eller dyr. Oppfinnelsen illustreres ytterligere i følgende eksempel. Eksempel.

Et "Biotec" fermenteringskar med et arbeids-volum på 2,5 1 ble tilsatt medium og inokulert med 100 ml av kultur T3 (omfattende bakteriene SM3, OML, M.^, M2, M3og. M4) . Denne kultur ble fremstilt som beskrevet i britisk søknad 678/74. Mediet inneholdt følgende ingredienser:

Temperaturen i gjæringskaret ble holdt ved 42 C og pH ved 7,0. En blanding av metan (25%) og luft (75%) ble boblet inn i gjæringskaret ved bunnen av dette i en mengde av 600 ml/min. Gjæringskaret ble omrørt ved hjelp av en enkelt 6-bladet omrører med 1200 omdr. pr. min.

Vekst inntrådte innen 24 timer og når det opp-løste oksygentrykket nådde null, ble kulturen dyrket kontinuerlig ved å anvende det ovennevnte medium. Fortynningsgraden ble øket med intervaller på ca. 2 timer ved trinn på ca. 0,02h-''" inntil det var nådd en fortynningsgrad på 0,175 h ^.

Det ble så overholdt følgende betingelser i fermenteringskaret:

Under disse betingelser ble det oppnådd en metan-begrenset, stabil tilstand.

Analyse på urea og ammoniumioner (uttrykt som NH3) gå følgende resultater.

Det kan således sees at urea blir forbrukt. Ammoniumioner frigjøres til mediet og er tilgjengelige for de metanforbrukende bakterier som nitrogenkilde. Mengden ammoniumioner i kulturmediet er lav (51 mg/l) og den tillater god vekst av metan-forbrukeren uten inhibering. Den totale mengde restnitrogenkilde i kulturen, dersom den forelå i form av ammoniumioner, ville være tilstrekkelig til å hindre vekst og forårsake at kulturen ble ødelagt.

i

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av mikroorganismer, karakterisert ved at en eller flere hydrokarbon-forbrukende mikroorganismer dyrkes under aerobe betingelser i et flytende vekstmedium omfattende urea og essensielle mineralsalter i nærvær av et hydrokarbon og i nærvær av en eller flere ikke-hydrokarbonforbrukende, ureasepositive mikroorganismer som kan metabolisere organiske substanser produsert av den (de) voksende hydrokarbon-forbrukende mikroorganisme(ne).

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den hydrokarbon-forbrukende mikroorganisme som anvendes er en metan-forbrukende bakterie og hydrokarbonet er metan.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som hydrokarbon-forbrukende mikroorganisme anvendes en metanol-forbrukende bakterie og som hydrokarbon anvendes metanol.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det i tillegg til den metan-fprbrukende bakterie anvendes en metanol-forbrukende bakterie.

5.. Fremgangsmåte ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at det som ikke-hydrokarbon-forbrukende, ureasepositiv mikroorganisme anvendes en ikke-hydrokarbon-forbrukende, ureasepositiv bakterie.

6. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-5, karakterisert ved at det i tillegg til de hydrokarbon-forbrukende mikroorganismene og de ikke-hydrokarbon-forbrukende, ureaspositive mikroorganismene anvendes en eller flere ikke-hydrokarbon-forbrukende, ureasenegative mikroorganismer som kan metabolisere organiske substanser som er fremstillet av de voksende hydrokarbon-forbrukende mikroorganismene.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den blandede kultur betegnet med T3 og med NCIB-tiltredelse nr. 11085 dyrkes i nærvær av metan.

8. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-7, karakterisert ved at temperaturen holdes i området 30-50°C.

9. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-8, karakterisert ved at pH justeres til området 6,0-8,0.