NO760914L - - Google Patents

Description

Serum-albumin-preparater.

Oppfinnelsen angår nye serum-albumin-sammensetninger, deres fremstilling og anvendelse, samt nye polymer-komponenter i slike sammensetninger.

Innen blod-serologi er det av stor betydning å kjenne spesielle antistoffer. Ved blodoverføringer er kjenn-skapet til visse antistoffer helt avgjørende. Nærvær av ukjente antistoffer kan føre til en motstandsreaksjon som kan være dødelig. Når således en antistoffkonsentrasjon er så lav at den absorberes av cellene i stedet for å bli agglutinert, blir dette ofte mistolket som blod-forenlighet når innsprøytningen i virkeligheten var sensitiverende. -Når en annen blodoverføring gis en uke til 10 dager senere, kan en dødelig reaksjon inntre. Selv om reaksjonen ikke er dødelig, kan den redusere den nor-male levetid for de overførte og uforenlige celler og kreve flere blodoverføringer. Slike problemer kan unngås ved på forhånd å kjenne til alle eller de fleste antistoffer ved å til-veiebringe mer følsomme påvisningsmetoder for antistoffer.

Serum- eller plasma-albumin har vært benyttet til blodgruppe-serologi i ca. 3° år som hjelpemiddel for påvisning av enkelte antistoffer i blodserum som ikke opptages når blodserumet som prøves føres i kontakt med saltvanns- eller isotonisk oppløsning av røde blodlegemer. Agglutinering av røde blodlegemer på grunn av antistoffer er klassifisert som (1) forekommer i media med lavt proteininnhold eller med lav dielektrisk konstant, eksempelvis isotoniske saltoppløsninger og (2) forekommer i media med høyt proteininnhold eller høy dielektrisk konstant. De antistoffer som reagerer under førstnevnte betingelser er identifisert til å tilhøre IgM-klassen av immun-globuliner, mens antistoffer som reagerer under sistnevnte betingelser er identifisert til å tilhøre IgG-klassen.

Den teoretiske forklaring som er fremsatt angående evnen hos proteinet til å inngå spesifikk agglutinering er at det øker mediets dielektriske konstant og derved reduserer zeta-potensialet for cellene og forkorter den midlere inter-cellulære avstand til mindre enn den avstand som er nødvendig for at IgG-antistoffmolekylene skal kunne spenne over eller bygge bro over og agglutinere. Proteinet som benyttes som påvisningsmedium er serum-albumin fra pattedyr, særlig fra kveg på grunn av at det er enkelt å skaffe store mengder kweg-blod. Imidlertid har oppløsninger av tilgjengelig kvegserum-albumin variert sterkt med hensyn på evnen til å øke vannets dielektriske konstant og derfor også i evnen til å gi den nødvendige agglutinering for påvisning av antistoffer. Denne variabilitet har ikke nødvendigvis vært unngått ved å bruke høyere konsentrasjoner av albumin. Dessuten har tilgjengelige oppløsninger av kvegserum-albumin ikke tilstrekkelig potenserende evne til at man kan være sikker på ikke å overse visse antistoffer.

Det har tidligere vært gjort forsøk på å forbedre den potenserende virkning hos disse oppløsninger ved å modifisere albumin-preparatene. Imidlertid har slike modifi-serte preparater ikke alltid vært bedre. Således har Jones

og medarbeidere (Nature, 224. 519 (1969)) behandlet albumin med etanol for fremstilling av aggregater som syntes å ha flere ganger større molekylstørrelse enn naturlig albumin-molekyl. Det alkoholbehandlede albumin ble angitt å ha høyere potenserende evne, men sannsynligvis på grunn av den reversible natur hea aggregatene, som ga vanskelig reproduserbare re.sultater, har albumin-preparater inneholdende etanolproduserte albumin-aggregater ikke oppnådd bruk som potenserende medium. (Selv om nevnte større molekyler ble kalt "polymere" av Jones og enkelte ganger kalles polymere av andre for enkelthets-skyld, er det generelt akseptert at molekylene er aggregater og ikke sanne polymere, fordi de lett gjendannes til monomere med mercaptø-etanol, urea-oppløsninger eller ekstreme pH-verdier). Jones behandlet også serum-albumin med N,N'-p-fenylen-bis-maleimid som reagerer ved sulfhydrylgruppen og danner disulfid-dimere, men den således behandlede sammensetning viste seg ikke vesent-

lig å forbedre albuminets potenserende kapasitet. Andre til-satte polymer-forbindelser som dextran, polysucrose, polyvinyl-pyrrolidin etc, , men slike modifikasjoner er fremdeles ikke særlig tilfredsstillende. Det er således behov for et serologisk preparat som har en høyere og reproduserbar potenserende evne, er stabil under frakt og lagring, og kan behandles uten vanskelighet.

I henhold til foreliggende oppfinnelse har man oppdaget nye forbedrede serologiske albumin-preparater som har høyere potenserende evne for påvisning av antistoffer enn serum-albuminpreparater som vanligvis er i bruk og som kan gis varig og sikker potenseringsevne. Den nye forbedrede serum-albumin-preparater inneholder som essensiell bestanddel nye serum-albumin-polymere som i seg selv danner en side av oppfinnelsen. Beteg-nelsen "albumin" i forbindelse med en monomer eller polymer refererer seg til serum-albumin fra pattedyr. De nye polymer-bestanddeler i serum-albumin-preparatene er polymere med kovalent binding, hvor hver monomerenhet er bundet til den neste med en peptid- eller amidbinding, -NHC0-. Peptidbindingen er dannet mellom en aminogruppe tilhørende et albumin-molekyl og en karboksylgruppe i et annet albumin-molekyl og kan etter at bindingen er dannet ikke skilles fra andre peptidbindinger som finnes i molekylet. De polymere som foreslås anvendt i nye serum-albumin-sammensetninger ifølge oppfinnelsen kan inneholde opptil 15 albumin-enheter eller mere, men inneholder generelt fra mellom 2 og 8 monomer-enheter. Aminogruppens og karboksyl-gruppens plassering i albumin-molekylet som deltar i dannelsen av peptidbindingen er ubegrenset. Man antar.således at både tverrbindinger og lineærbindinger forekommer. Dimere og trimere og lineært forbundne høyere polymere kan gjengis ved formelen: hvor n betegner et tall (0 og 1 for dimer og trimer respektivt og større enn 1 for høyere polymere.) . "Alb" som inngår i ovenstående og følgende formler betegner en rest av et serum-albumin-molekyl som kan gjengis påfølgende måte:

De nye serum-albumin-preparater ifølge oppfinnelsen har overlegen potenseringsevne i forhold til nåværende preparater ved agglutineringsreaksjoner innen IgG-klassen av immune globuliner. Preparatene utgjør derfor meget følsomme media for påvisning av antistoffer, hvormed man kan påvise nærvær av antistoffer som hittil ikke har vært mulig med nåværende agglutineringspreparater. Preparatene er også egnet som fortynningsmidler ved fremstilling av forbedrede antisera-preparater for bruk som blodgrupperende og blodtype-påvisende reagenser og som fortynningsmedium for suspensjon av røde blodlegemer i serum/albumin- og/eller albumin/albumin-titrering for påvisning av antistoffer.

Forbedrede serologiske albumin-preparater i henhold til foreliggende oppfinnelse består av en albumin-polymer som ovenfor nevnt i blanding med fysiologisk eller isotonisk oppløsning. En enkelt polymer eller blanding av polymere eller en blanding av monomere og polymere kan utgjøre albumin-bestanddelen i preparater ifølge oppfinnelsen. Gode serologiske reaksjoner oppnås ved som albumin-bestanddel å benytte en blanding av monomere og polymere som fås ved polymerisering av monomer-albumin. Sammensetninger som inneholder en blanding av monomere og polymere etter polymerisasjon be-tegnes "polymerisert albumin"-oppløsning. Serologiske preparater som inneholder slike blandinger i fysiologisk oppløsning danner foretrukne utgaver av foreliggende oppfinnelse.

Generelt vil det totale albumin-innhold i preparater egnet for diagnose formål være 10 til 35 vektprosent. Foretrukne sammensetninger inneholder fra ca. 16 til 26 % total albumin. Med "total albumin" menes vektprosenten albumin uten hensyn til monomer eller polymer oppbygning. Bæremediet for albuminet er fysiologisk saltvann eller isotonisk oppløs-ning som er kjent på området.

Ved den foretrukne utførelse som benytter en blanding av monomere og polymere foreligger de nye polymere eller polymerblandinger i en mengde på minst 20 vektprosent av preparatets totale albumin-innhold. Bedre preparater kan inneholde fra ca. 46 til 70 1° polymer, selv om meget gunstige preparater kan inneholde fra ca. 28 til 45 f° polymer. Et eksempel på sistnevnte er en blanding hvor de omtrentlige forhold mellom monomer og polymer er som følger: Monomer 55-72 %, dimer 15-23 %, trimer 5-8 %, tetramer 1-4 fo, pentamer og høyere 5-15 fo. Generelt er vektforholdet mellom monomer og polymer fra ca. 7:3'til 1:9. Selv om man kan fremstille polymere hvor en vesentlig del er høyere enn oktamer, får man meget gunstige serologiske preparater som inneholder en vesentlig del trimere og tetramere.

De serologiske albumin-preparater ifølge oppfinnelsen er klare, fargede oppløsninger med pH mellom 6,5 og 8,0. Viskositet, dielektrisitetskonstant og andre egenskaper varierer avhengig av om en enkelt polymer, en blanding av polymere eller en blanding av monomere og polymere danner albumin-innholdet, samt av arten av de spesielle polymere. Generelt er den relative viskositet (vann som standard) større enn ca. 2 og lavere enn ca. 25, ledningsevnen for oppløsningene fortynnet 1:10 i.destillert vann ved 0°C ligger mellom ca. 5 x 10"^ mho/cm<2>til ca. 7 x 10~<4>mho/cm<2>.

De polymere er virkelige polymere hvor albumin-monomerenhetene er sammenføyd med kovalente peptid- eller amid-bindinger til forskjell fra albumin-aggregater som ofte dannes ved behandling av albumin med kald alkohol eller ved aldring og som er reversible til uavhengige monomer-enheter. I litteraturen benyttes begge uttrykkene "polymere" og "aggregat" i forbindelse med makromolekyler som dannes ved behandling av albumin med kald alkohol eller aldring og som ved fysiske be-stemmelser som f.eks. elektroforese viser tilsynelatende mole-kylvekter som er multipla av det opprinnelige albumin. Imidlertid er aggregatene dannet ved sekundærbindinger som f.eks. hydrogenbindinger og dannelsen er reversibel hvilket lett kan påvises ved metoder beskrevet i litteraturen (Dunker et al.,

J. Biol. Chem. 224, 5074 (1969), Fairbanks et al., Biochem 10, 2606 (1971))«Ved slike metoder Vål. behandling av albumin-opp-løsninger med 2-mercaptoetanol overføre ikke-kovalent bundne "polymere" eller aggregater til monomere. Elektroforese av natriumdodecylsulfat-komplekser av mercaptoetanol-behandlede oppløsninger på polyacrylamid-kolonne viser den monomere eller polymere natur for bestanddelene. I tillegg kan denne teknikk

(SDS-polyacrylamid gel-eléktroforese) benyttes for å anslå mole-kylvekten til de forskjellige bestanddeler. Dette skjer ved å sette opp mobiliteten:

for kjente proteiner mot molvekten, og derpå anslå molvekten for eksperimentelle polymere ved ekstrapolering fra denne kurve. Polymeriserte albumin-oppløsninger i henhold til oppfinnelsen fremstilt i henhold til den ovenfor beskrevne metode viser seg ved denne teknikk å inneholde sanne polymere som ikke kan gjendannes til monomere ved 2-mercaptoetanol, urea etc. Polymere ifølge oppfinnelsen viser egenskaper som er egne for den spesielle polymer.

Polymere ifølge oppfinnelsen må også holdes adskilt fra dimere som kan fremstilles ved å behandle albuminet med et reagens som N,N'-p-fenylen-bis-malemid som reagerer ved albuminets sulfhydrylgruppe.

De forbedrede serologiske serum-albumin-preparater som inneholder de nye polymere kan fremstilles ved først å polymerisere serum-albumin med et reagens som danner peptid-binding for fremstilling av en polymer eller polymerblanding,

og opparbeide den polymerholdige bestanddel enten som en enkelt polymer, en blanding av polymere eller fortrinnsvis en blanding av polymere og monomere, og bruke nevnte polymerholdige komponent til å fremstille den ønskede serologiske sammensetning ved opp-løsning i fysiologisk oppløsning. Når de forbedrede serologiske preparater inneholder en blanding av polymere med upolymerisert albumin kan egnede preparater fremstilles på enkel måte ved å polymerisere albumin som beskrevet senere, stoppe reaksjonen ved ønsket polymerisasjonsgrad, fraksjonere reaksjonsblandingen for utfelling av albumin-monomer/polymer-blandingen og preparere den som fysiologisk saltoppløsning som beskrevet nøyere i det følgende.

Polymerisasjon og fremstilling av de nye polymere kan skje ved å føre serum-albumin i intim kontakt med et peptid-danningsreagens slik at det inntrer en reaksjon mellom et albu min-molekyl og reagenset under dannelse av et mellomprodukt, hvorpå mellomproduktet omsettes med et annet albumin-molekyl og danner et albumin-dimer som deretter gjennomgår videre lignende reaksjoner under dannelse av trimér, tetramer og høyere polymere av albumin. De innledende reaksjoner som danner dimere (n i formel I er 0) kan gjengis ved følgende ligning (hvor "reagens" betegner peptidbindingsdannende reagens): Den dimere (IV) kan så reagere med et molekyl-reagens til et mellomprodukt som derpå reagerer med et annet molekylalbumin til en trimer (n i formel I er 1) og prosessen gjentas for høyere polymere. I tillegg til polymere dannes et biprodukt avledet av reagenset ved hvert trinn, og biproduktets oppbygning avhenger av dette reagens, imidlertid vil biproduktet inneholde grunnstoffene i vann.

To grupper av reagenser som tidligere har vært brukt i amidsyntese er særlig nyttige for fremstilling av polymerisert albumin. Disse amiddannende reagenser er: (1) 3-H isoxazoliumsalter beskrevet av Woodward eog medarbeidere i J. Am. Chem. Soc. 8^, 1010 (I96D og (2) karbodiimider beskrevet av Sheehan og medarbeidere i J. Am. Chem. Soc, 77»IO67(<1>955), U.S. patent 2.938.892 og 3.O98.693. Andre peptid-bindingsdannende reagenser kan også brukes. Selv om forbindel-sene ikke er begrenset til dette, vil foretrukne peptidbindingsdannende reagenser velges blant de nedenfor beskrevne, som kan fremstilles ved fremgangsmåter som er beskrevet i de angitte referanser. Selv om andre peptiddanningsreagenser og/eller metoder kan brukes for fremstilling av polymere ifølge oppfinnelsen, vil de ovenstående reagenser være særlig egnet for fremstilling av serologiske preparater.

Når den peptid-dannende reagens er et 3-H isoxazoliumsalt, vil kationet kunne gjengis ved formelen:

hvor fortrinnsvis betegner et aromatisk radikal som fenyl eller substituert fenyl, Q 2 betegner hydrogen eller lavalkyl og Qobetegner lavalkyl. Med "3-H-isoxazolium" menes at i substituenten i 3-stilling er hydrogen. Anionet kan være et uavhengig ion eller en indre anionisk gruppe. Eksempler fpå uavhengige anioner er fluorborater, sulfonater, lavalkylfosfo-nater, metosulfater, etosulfater etc. Når anionet er en indre anionisk gruppe, kan den tilveiebringes av en sulfonatsubstitu-ert fenylgruppe ved Q^. Med "lavalkyl" menes et alkylradikal med fra 1 til 6 C-atomer, eksempelvis metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, amyl, hexyl etc. Egnede isoxazoliumsalter omfatter N-etyl-5-fenylisoxazolium-3,-sulfonat, N-metyl-5-fenyl-isoxazolium-3,-sulfonat, N-etyl-5-fenylisoxazolium-fluorborat, N-metyl-5-fenylisoxazolium-fluorborat, N-(n-propyl)-5-fenyl-isoxazolium-3'-sulfonat, N-(n-propyl)-5-fenylisoxazolium-fluor-borat etc.

Ved en reaksjon som benytter 3-H-isoxazoliumsalt som peptid-danningsmiddel vil "reagens"-delen i mellomproduktet som eksemplifisert i formel III og VI være følgende grupper:

Således kan mellomproduktet med formel III gjengis ved formelen:

Biproduktet som dannes er et P-aroylamid med formel:

Når det peptid-bindingsdannende middel er et karbodiimid, er formelen:

I denne og følgende formler er minst en av gruppene R og R' et radikal hvor karbonatomet som er bundet til nitrogenet er et alifatisk karbonatom. Egnede rgrupper R og R' omfatter alkyl med 2 til 12 og fortrinnsvis 2 til 6 C-atomer, cyklohexyl, benzyl, fenetyl, lavalkylmorfolinyl, dilavalkylaminoalkyl, hydroksy-lavalkyl, lavalkylpiperidyl, fenyl, morfolino; og syre-addisjonssalter og kvaternære ammoniumsalter. De beste karbodiimider er vannoppløselige. Karbodimmider som inneholder ter-tiære aminogrupper kan gjøres vannoppløselige ved å danne et syreaddisjonssalt med mineralsyrer som hydrogenhalogenidsyrer, svovelsyre,, salpetersyre, fosforsyre og lavåaLkyl-sulf onsyrer og -fosfonsyrer, de kan også gjøres vannoppløselige ved kvaterni-sering med et egnet kvaterniseringsmiddel som lavere alkyl-tosylater, -halogenider og -sulfater, f.eks. metyltosylat, metylbromid, metyljodid, etyltosylat, metylsulfat, etylsulfat, benzylbromid og lignende.

Eksempler på foretrukne reagenser er: l-etyl-3-(3-dimetyl-aminopropyl)-karbodiimidhydroklorid, 1-cyklohexyl-3-(2-morfolinoetyl)-karbodiimid-meto-p-toluensulfonat, i-cyklohexyl-3-(4-dietylaminocyklohexyl)karbodiimi'd-meto-p-toluensulf o-nat, l-cyklohexyl-3-(P-dietylamino-etyl)-karbodiimid, l-etyl-3-

(2-morfolinoetyl)-karbodiimidhydroklorid, l-etyl-3-(2-morfolino-etyl)-karbodiimidsulfat.

Ved en omsetning som benytter et karbodiimid som peptid-bindingsdannende reagens er "reagens"-delen i mellomproduktet med formel III og IV følgende gruppe:

Således vil mellomproduktet med formel III kunne gjengis ved formelen:

Biproduktet som -dannes ved reaksjonen er en ureaforbindelse med formel:

Polymerisasjonen kan foretas ved å føre en vandig albmmin-oppløsning, fortrinnsvis en fortynnet vandig opp-løsning, i intim kontakt med et peptid-bindingsdannende reagens ved en pH mellom 4>5°S 6,0 og en temperatur på ca. 2-60°C, hvorpå en omsetning finner sted med dannelse av polymerisert albumin, generelt en blanding som inneholder polymere produkter. Når den ønskede polymeriseringsgrad er oppnådd, tilsettes en basisk hytrogenforbindelse ved temperaturer mellom 0 og ^, 0°C for å ødelegge overskudd av reagens og stoppe polymerisasjonsreaksjonen. De fremstilte polymerprodukter kan utvinnes ved vanlige metoder og deretter benyttes som en blanding, separeres for opparbeidelse av separate polymere eller kan behandles som beskrevet senere for fremstilling av serologiske albumin-preparater ifølge oppfinnelsen.

For gjennomføring av polymerisasjonstrinnet kan molarforholdet mellom peptid-bindingsdannende middel og albumin variere mellom ca. 1:1 og 60:1 avhengig delvis av om reagenset er et isoxazoliumsalt eller et karbodiimid. Forholdet mellom reagens og albumin når man benytter isoxazoliumsalt er fortrinnsvis ca. 30:1 til ca. 60:1, mens forholdet når man benytter karbodiimid fortrinnsvis er mellom 1:1 og 30:1.

Den nøyaktige konsentrasjon av albumin i den vandige albuminoppløsning som utgangsstoff er ikke avgjørende og kan ligge mellom 1,5 til 20 %,

Man opererer fortrinnsvis med en fortynnet opp-løsning som inneholder ca. 1,5 til 4 %• Den peptid-bindingsdannende reagens benyttes fortrinnsvis i vandig oppløsning.

Den nøyaktige konsentrasjon er ikke avgjørende og generelt benyttes bare tilstrekkelig vann til at reagenset går i oppløs-ning.

Serum-albumin-oppløsningen som benyttes under polymerisasjonen kan fremstilles fra krystallinsk albumin, imidlertid er det mer hensiktsmessig å fremstille oppløsningen fra høyere konsentrerte albiimin-oppløsninger som kan fås fra forhandlere eller som fremstilles spesielt. Selv om preparatet -ikke er begrenset til dette, vil serum-albuminet vanligvis være , kveg-serum-albumin, fordi kvegblod er lett å få tak i.

Ved en foretrukket fremgangsmåte for utførelse

av polymerisasjonen tilsettes en vandig, konsentrert oppløsning av et peptid-bindingsdannende reagens under røring, mens temperaturen holdes på ca. 2-40°C, til en fortynnet albumin-oppløs-ning som på forhånd er innstilt til en pH mellom ca. 5>2 og 5,6 med fortynnet mineralsyre som saltsyre, svovelsyre, fosforsyre etc. Blandingen røres etter tilsetningen i tilstrekkelig lang tid til at det dannes den ønskede mengde polymer. Graden av polymerdannelse kan bestemmes ved å ta ut prøver av reaksjonsblandingen og la disse gjennomgå polyacrylamid-elektroforese.

Polyacrylamid-skiveelektroforese (B.J. Davis, Annals N.Y. Acad. Sei. 121, 404 (1964)) benytter det faktum at porestørrelsen i geler ligger opp til molekylær-dimensjonene for proteinene og separasjon kan skje ved hjelp av dimensjons-forskjeller eller ladningsforskjeller. Ved denne metoden for separasjon - pg analyse blir prøvene adskilt elektroferetisk i polyacrylamidgel-kolonner som anordnes vertikalt mellom en elektrodeholdig øvre beholder og en nedre bufferbeholder. Gel- kolonnene har en øvre del hvor den elektroforetiske konsentrering av prøve-ionene finner sted og en nedre del hvor" separasjon finner sted. Etter elektroforetisk separasjon kan protein-bestanddelene som påvises som separate skiver etter egnet farging, bestemmes kvantitativt.

Når den ønskede polymeriseringsgrad er hådd,

kan de polymere opparbeides og/eller separeres påkkjent måte. Når man imidlertid vil bruke det polymeriserte albumin for fremstilling av serologiske preparater for diagnoseformål, stanses reaksjonen med en basisk nitrogenforbindelse. Denne reaksjons-avbryting er avgjørende hvis de polymere skal brukes for påvising av antistoffer siden preparatet som er fremstilt uten reaksjons-avbrudd har tendens til å gi uspesifikk agglutinering hvilket nedsetter brukbarheten for påvisning av spesifikke antistoffer.

Egnede basiske nitrogenforbindelser for reaksjons-avbrytelsen er glycin og andre aminosyrederivater som alanin, valin, isoleucin, £-aminocaproamid, etc. eller ammoniumklorid. Selv om andre basiske nitrogenforbindelser som alkylaminer, eksempelvis etylamin, propylamin, etc, eller aromatiske eller heterocykliske aminer kan brukes for "å avbryte reaksjonen, er det gunstig for fremstilling av polymere for bruk i serologiske preparater å unngå innføring av fremmede grupper eller struk-turer. Generelt tilsettes en mengde basisk nitrogen som er ekvivalent til mengden peptid-bindingsdannende middel som er tilsatt til å begynne med. På denne måten oppnås ikke bare å stoppe polymerisasjonen, men også ødeleggelse av overskudd av reagens.

Albumin-polymere og monomere kan opparbeides fra den polymeriserte og stoppede reaksjonsblanding ved utfelling og opparbeidelse av albuminene. Albuminene kan separeres i komponenter om ønsket og derpå oppløses i vann eller i fysiologisk saltvann.

De serologiske albumin-preparater i henhold til foreliggende oppfinnelse, egnet som diagnosemedia, kan fremstilles ved å utfelle albuminene, opparbeide dem fra reaksjonsblandingen og oppløse dem i fysiologisk oppløsning. Operasjonen gjennomføres vanligvis ved først å innstille pH i den polymeriserte albumin-reaksjonsblanding til mellom 4>5°g 7>0 med mineralsyre og, mens temperaturen holdes på mellom ca. 0 og-20°C, tilsette en alkohol slik at det ønskede polymeriserte albumin-produkt som inneholder en blanding av polymere sammen med en del upolymerisert albumin felles ut. Utfellingen vil starte når alkoholkonsentrasjonen er ca. 25 % og er i alt vesentlig avsluttet ved ca. 4-0 Egnede alkoholer for gjennomføring av fellingen er metanol, etanol, isopropanol og andre vannbland-bare alkoholer. Den foretrukne fremgangsmåten består i å tilsette tilstrekkelig alkohol ved en pH på ca. 5>0 til å omdanne reaksjonsblandingen til en ca. 4-0 prosentig alkoholisk oppløs-ningsmens temperaturen holdes innenfor -5 til -10°C. Fellingen skilles fra og opparbeides fra reaksjonsblandingen på kjent måte, fortrinnsvis ved sentrifugering, og kan oppløses i saltvann til en 10 til 35 prosentig isotonisk oppløsning. Det dannede serologiske albumin-preparat er en klar, farget oppløsning med de tidligere nevnte egenskaper.

Alternativt kan fellingen separeres i enkelt-bestanddeler etter vanlige metoder som f.eks. gelfiltrering.

Når en serologisk albumin-sammensetning skal fremstilles inneholdende en enkelt polymer, kan en blanding av 1 til 20 % vandig albumin føres gjennom en kolonne av "SEPHADEX G-200" (tverrbundet dextran, Pharmacia Co., Uppsala, Sverige)og de polymere separeres. De ønskede polymere kan derpå opparbeides ved å opp-løse dem i fysiologisk saltvann og konsentrering til 20-30 % isotonisk oppløsning ved ultrafiltrering for analyse og serologisk prøving.

De fremstilte preparater er egnet for bruk ved forskjellige serologiske prøver hvor ikke-polymeriserte albumin-oppløsninger tidligere har vært brukt, og gir diagnosemedia med mye større følsomhet og påvisningsevne enn man hittil har trodd mulig. Preparatene er ikke bare uvanlig følsomme ved høye for-tynningsgrader for forsøksmediet, men viser seg å redusere "prozoning"-fenomenet. Prozoning, dvs. manglende evne hos et antistoff med høyt agglutinin-innhold til å agglutinere antigen er åpenbart uønsket og påvisningsmedia som reduserer dette er ettersøkt. Således vil preparatene være egnede potenserings-midler i kliniske antistoffsystemer. I tillegg til anvendbar-heten som potenseringsmedia og media for påvisning av antistoffer er preparatene egnet når man ønsker fortynningsmiddel for serum eller røde blodlegemer. Videre er preparatene stabile ved lagring og transport.

De nevnte preparater kan brukes til spesifikke diagnoseprøver som benytter immunologiske prinsipper.

Således kan preparatet brukes til å øke antistoff påvisningen med røde blodlegemer i hemagglutineringsreaksjoner. Ved representative typiske forsøk fremstilles 2 prosentige suspensjoner av røde blodlegemer inneholdende antigen i polymerholdige albumin-preparater ifølge oppfinnelsen, og brukes til å titrere forsøkssera ved å tilsette en dråpe suspensjon av røde blodlegemer til et reagensglass som inneholder to dråper forsøksserum eller serum i egnet fortynning, inkubering av blandingen en time i vannbad ved yj°C, sentrifugering ved (vanligvis 1000 omdr./minutt i ett minutt) og undersøkelse for å finne agglutinering.

Preparatet kan også brukes for påvisning av antistoff -sensitiverte erytrocytter. Ved representative typiske forsøk blir to dråper polymerholdig albuminpreparat blandet med en dråpe 4-6 $ suspensjon av røde blodlegemer som på forhånd er sensitivert med antistoffer. Blandingen sentrifugeres og under-søkes derpå for å finne agglutineringsgraden.

De følgende eksempler skal illustrere oppfinnelsen, men skal ikke oppfattes begrensende.

EKSEMPEL I

14 ml 0,1 N saltsyre tilsettes til 500 ml 2 % vandig kveg-albumin-oppløsning (med albumin-innhold lik eller større enn 98 % og inneholdende $ 0 % monomer og 10 % dimert aggregat). pH etter tilsetningen er 5>4«Til den resulterende oppløsning settes under røring ved romtemperatur 5 ml 0,588 M l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid-hydrokloridoppløsning (forhold karbodiimid/albumin lik 20:1) og man fortsetter røringen i ca. 60 minutter for fremstilling av et polymerisert kveg-serum-albumin-produkt i reaksjonsblandingen. På dette tidspunkt tilsettes 5 ml 0,588 M glycin under røring til reaksjonsblandingen ved romtemperatur og røringen fortsettes i ca. 15 minutter for å stoppe polymerisasjonen. 50 ml 0,1N HC1 tilsettes for justering av pH til ca. 5>0«Derpå tilsettes 3^2 ml metanol (forhåndsav-kjølt til 0°C) under røring i løpet av ca. ^ 0 minutter, mens temperaturen i reaksjonsblandingen holdes på mellom -2 og -5°C, og røring fortsettes i ca. 15 minutter etter avsluttet tilsetning, hvorpå det polymeriserte albumin-produkt utfelles. Fellingen opparbeides ved sentrifugering ved 9000 omdr./min. i 30 minutter i en Sorvall-sentrifuge modell RC og utgjør 20,4 gram polymerisert kveg-serum-albumin. Sistnevnte tilsettes en minimal mengde destillert vann og danner en 30>3prosentig oppløsning av polymerisert kveg-serum-albumin.

Man blander 0,7 ml av denne 30>3prosentige polymeriserte kveg-serum-albumin-oppl]zfening med 0,3 ml 0,9 % natriumkloridoppløsning til en 22 fo oppløsning av polymerisert serologisk kveg-albumin. Analyse med polyacrylamid-skiveelektroforese (7 f° gel ved pH 7>2) av denne oppløsning viser følgende konsentrasjoner av monomere og polymere i vektprosent: 71 % monomer, 21,2 % dimer, 4,8 f> trimer, 1, 1 % tetramer og 1,9 % høyere polymere.

Serum-albumin-titrering av Rho~positive celler med anti Rho-serum i nærvær av 22 % polymerisert serologisk kveg-albumin viser agglutinering i en fortynning på I/2O48 av anti Rh0-serum.

EKSEMPEL II

På lignende måte som beskrevet i eksempel I, settes 3 ml 1>0N HC1 ved romtemperatur'til 25O ml 16,9 f> vandig kveg-serum-albumin-oppløsning for innstilling av pH til 5>4«Derpå tilsettes 20 ml 0,248 M l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid-hydrokloridoppløsning (forhold karbodiimid/albumin lik 8:1) under røring, og røringen fortsettes i 60 minutter til et polymerisert kveg-serum-albuminprodukt. 20 ml 0,248 M glycin tilsette for å stoppe polymerisasjonen. Derpå tilsettes 5 ml 1,0N HC1 for innstilling av pH til 5>0>blandingen avkjøles og 197 ml forhåndsavkjølt metanol tilsettes mens temperaturen holdes mellom -2 og -5°C, hvorpå polymerisert kveg-serum-albumin utfelles. Dette opparbeides som beskrevet tidligere og oppløses i destillert vann til 96 ml 24,1 % polymerisert kveg-serum-albumin-oppløsning med pH 7>5«Polyacrylamidanalyse av en prøve av opp-løsningen viste følgende sammensetning: ^ 2, 6 % monomer, 18,6 fo dimer, 12,6 fo trimer, 9>7f° tetramer og 26,5 f° høyere polymere.

En 22 fo serologisk polymerisert albumin-oppløsning fremstilt ved å blande ovenstående med natriumkloridoppløsning som beskrevet i eksempel I, brukes for gjennomføring av serum-albumin-titrering D av Rh o -p r ositive celler med anti Rh o-serum i blandingen. Man får agglutinering ved en fortynning av anti Rho-serum på større enn I/2048, mens maksimal fortynning for agglutinering i nærvær av 22 fo ikke-polymerisert- albumin som kontroll er 1/512.

eksempel III

På lignende måte settes 0,1 N HC1 til 10 ml 1,5 fo vandig kveg-serum-albumin-oppløsning for innstilling av pH fra 5,6 til 5,4. Til oppløsningen settes 0,6 ml 0,23 M N-etyl-5-fenylisoxazolium-3'-sulfonat (forhold isoxazoliumsulfonat/albumin lik 60:1) og den dannede blanding røres ved romtemperatur i ca. 60 minutter for fremstilling av et produkt av polymerisert kveg-serum-albumin..Glycin i en mengde svarende til isoxazolium-sulfonatet tilsettes og røres for å stoppe reaksjonen. Den polymeriserte albuminblanding gjennomgår polyacrylamid-gelelektroforese som viser følgende sammensetning: 77 f° monomer, 15,5 fo dimer, 5,2 fo trimer og 1,8 fo tetramer og høyere polymere.

. EKSEMPEL IV

Dette eksempel illustrerer polymerisert kveg-albumin-preparater med varierende monomer- og polymer-innhold og (1) inhibering av prozoningreaksjonen og (2) forbedret påvisning av antistoffer for antigenholdige røde blodlegemer ved høye serum-fortynninger, ved bruk av polymerisert serologisk albumin-preparat som potenseringsmiddel ved hemagglutineringsreaksjoner.

Preparater av polymerisert kveg-serum-albumin fremstilles som beskrevet i eksempel I. Disse preparater har monomer- og polymerinnhold som fremgår av tabell I.

Serologiske preparater med 22 fo totalt albumin

med ovenstående monomer- og polymerinnhold fremstilles i fysiologisk saltvann som tidligere beskrevet. Preparatene brukes ved serum-albumin-titreringer av anti-D (anti-RhQ). For slike titreringer lages 2 prosentige suspensjoner av røde blodlegemer inneholdende D(+)-antigen i de forskjellige 22 fo polymeriserte kveg-serum-albumin-oppløsninger med ovenstående monomer-polymer innhold. Som kontrollprøver fremstilles suspensjoner av røde blodlegemer inneholdende D( + ) antigen i 22 fo upolymerisert kveg-serum-albumin svarende til albuminet .som benyttes ved fremstilling av de polymeriserte preparater. De samme antigenholdige sammensetninger brukes for å titrere forhåndsfremstilte fortynninger av anti-D serum i normalt AB-serum. Titreringene skjer ved å anbringe to dråper serum i et reagensglass og tilsette en dråpe D(+) antigenholdig preparat, inkubere blandingen i en time i vannbad ved 37°C, sentrifugering ved 1000 omdr./minutt i ett minutt og unders<*>økelse for å finne eventuell agglutinering. Resultater ved lav fortynning viser inhibering av prozonings-reaksjon når jpolymerisert serum-albumin-preparater benyttes til titreringene, hvilket fremgår av tabell II.

Resultater som viser forbedret påvisning ved høye fortynninger når preparater av polymerisert serum albumin benyttes til titreringene fremgår av tabell III.

EKSEMPEL V

Eksemplet illustrerer øket evne til påvisning av antistoff-sensitiverte erytrocytter ved å bruke polymerisert serologisk albumin-preparat til hemagglutineringsreaksjonene.

For slik påvisning benyttes polymerisert albumin som oppløsning med monomer/polymer-fordeling i henhold til preparat C, D og E i eksempel IV, for fremstilling av preparater i fysiologisk saltvann med en albuminkonsentrasjon på 20 til 30 vektprosent. Som kontrollprøver ble to separate upolymeriserte kveg-serum-albumin-oppløsninger benyttet (upolymerisert nr. 1 og nr. 2), i samme konsentrasjonsområde. For å bestemme potenseringsvirkningen blandes to dråper albumin-oppløsning og en dråpe Coombs kontrollreagens (røde blodlegemer belagt med anti-stof f globulin) og sentrifugeres i 15 sekunder ved 34-00 omdr./min. og undersøkes derpå for å finne agglutineringsgraden. Resultatene fremgår av tabellen.

EKSEMPEL VI ,

Separasjon av polymerisert kveg-albumin-preparat med monomer/polymer-fordeling som preparat D i eksempel IV i de enkelte bestanddeler skjer på følgende måte.

4,5 ml 2$,6 % polymerisert albumin-preparat blandes med 10,5 ml buffer (0,1 M trishydroksymetylamgmmmetan-hydroklorid med 1,0 M natriumklorid og "Thimerosal" (1:10.000) ved pH 8,0. 10 ml av denne blanding fylles på en kolonne (2,5 x 93 cm = 456 ml) av "SEPHADEX G-200" (tverrbundet dextran,

Pharmacia Co.). Blandingen elueres med en blanding av 0,1 M trishydroksymetylaminometanhydroklorid og 1,0 M natriumklorid ved pH 8,0 med strømningshastighet l8 ml pr. time ved 5°C f°r opparbeidelse av monomere og polymere bestanddeler.

Komponentenes molekylvekt bestemmes ved hjelp av SDS-polyacrylamid-gelelektroforese som gir mobiliteten som opp-settes på en kurve som benytter kjente polymere med kjente mol-vekter som standard. Resultatene fremgår av tabell V:

EKSEMPEL VII

Dette eksempel viser forbedret antistoff-påvisning hos albumin-preparater som fremstilles fra forskjellige albumin-polymer-bestanddeler som er dannet ved fraksjonering av en polymerisert blanding som beskrevet i eksempel VI. Opera-sjonene utføres ved 10 fo totalt albumin-innhold, som ligger mye lavere enn foretrukne konsentrasjoner og viser den økede potenseringsevne for polymer-bestanddelene.

Serologiske preparater av 10% albumin i isotonisk oppløsning fremstilles fra hver av bestanddelene og fra ikke-fraksjonert polymerisert og ikke-polymerisert albumin som kon-trolloppløsning. Røde blodlegemer inneholder D(+) antigen tilsettes til hver av albumin-oppløsningene og danner preparater som inneholder 2f> suspensjon av røde blodlegemer. Disse benyttes til serum-albumin-titreringer som utføres som beskrevet i eksempel IV for å bestemme potenseringsvirkningen på anti Rh0-RhQ(anti-D-D) agglutinering.

Manoobserverer agglutineringer i fortynninger opptil 1/32 når albumin-bestanddelen er en dimer eller trimer og i fortynninger opptil 1/512 når albumin-bestanddelen er tetramer pluss høyere polymere. Man observerer agglutinering ved fortynninger på 1:128 når albuminet er en ikke-fraksjonert polymerisert blanding. Når albuminet er en monomer fremstilt ved fraksjonering av en polymerisert blanding eller en ikke-polymerisert albumin, observeres ingen agglutinering selv når anti-D serumet er ufortynnet.

EKSEMPEL VIII

På lignende måte som beskrevet i eksempel I og II blir en 0,248 M vandig oppløsning av l-cyklohexyl-3-(2-morfolino-etyl)karbodiimid-meto-p-toluensulfonat tilsatt under røring til 25OO ml l6,9 % oppløsning av vandig kveg-serum-albumin forhånds-innstilt til pH lik 5>4»Etter avsluttet tilsetning fortsetter

manåå røre i to timer for dannelse av polymerisert kveg-albumin. 200 ml glycin tilsettes for å avbryte polymerisasjonen, pH inn-stilles på 5,0 med fortynnet saltsyre og blandingen avkjøles.

Derpå tilsettes kald metanol for å utfelle det polymeriserte albumin. De faste stoffer fraskilles ved ultrasentrifugering og oppløses i fysiologisk saltvann. Det dannede preparat kan

med fordel brukes som potenseringsmiddel ved hemagglutineringsreaksjoner.

EKSEMPEL IX

Ved polymerisasjonsreaksjoner som utføres på lignende måte som beskrevet i eksempel I, II og III kan følgende polymerisert albumin-preparater fremstilles: En polymerisert albumin-blanding inneholder ca. 25 vektprosent monomer og ca. 75 vektprosent av en blanding av i alt vesentlig dimer, trimer, tetramer, pentamer, hexamer,

heptamer og oktamer ved omsetning av en vandig 12 prosentig kveg-serum-albumin og l-cyklohexyl-3-(4-dietylaminocyklohexyl)-karbodiimid-meto-p-toluensulfonat.

En polymerisert albumin-blanding som inneholder ca. 17 vektprosent monomer og ca. 83 vektprosent av en blanding av polymere med fra 2 til 15 albumin-enheter, ved omsetning med vandig 10 prosentig kveg-serum-albumin og l-cyklohexyl-3-( (3-dietylaminoetyl)-karbodiimid-hydroklorid.

En polymerisert albumin-blanding inneholdende ca. 10 vektprosent monomer og ca. JO vektprosent av en blanding av polymere med fra 2 til 8 albumin-enheter, ved omsetning av vandig 4 prosentig kveg-serum-albumin og l-etyl-3-(3-dimetyl-aminopropyl)karbodiimid-hydroklorid.

En polymerisert albumin-blanding som inneholder ca. 50 vektprosent monomere og ca. 50 vektprosent av en gblanding av polymere, hovedsakelig fra 2 til 6 albumin-enheter, ved omsetning av 4 prosentig kveg-serum-albumin og N-prppyl-5-fenyl-isoxazolium-D'-sulfonat.

En polymerisert albumin-blanding som inneholder ca. 45 vektprosent monomer og ca. 55 vektprosent av en pcfymer-blanding som inneholder relativt høye mengder trimere og tetramere ved omsetning av vandig 3 prosentig kveg-serum-albumin og N-etyl-5-fenylisoxazolium-fluorborat.

Ved andre operasjoner som utføres på lignende måte som beskrevet i eksempel I og II kan polymer-blandingene behandles med alkohol (etter først å innstille pH) for utfelling av albuminene, de utfelte albuminer kan fraskilles og opparbeides og derpå oppløses i fysiologisk saltvann for fremstilling av serologiske preparater som inneholder 15, 25 og 35 % totalt albumin.

EKSEMPEL X

Enkelt-polymere kan fremstilles fra en oppløsning av polymerisert kveg-albumin på lignende måte som beskrevet i eksempel VI. Hver polymer dispergeres separat i fysiologisk saltvann for fremstilling av en diagnosereagens med 24 % polymer. Preparatene kan brukes for potensering av hemagglutineringsreaksjoner.

Claims (15)

1. Serologisk albumin-preparat som inneholder minst en polymer av serum-albumin hvor hver albumin-enhet er forbundet med den neste med kovalente peptid-bindinger.

2. Preparat som angitt i krav 1, karakter i- sert ved at den polymere inneholder fra to til åtte albumin-enheter.

3» Preparat som angitt i krav 1, karakterisert ved at preparatets totale albumin-innhold er fra ca. 10 til 35 vektprosent.

4» Preparat av polymerisert serum-albumin inneholdende en monomer og polymere av serum albumin, hvilke polymere inneholder fra 2 til 8 albumin-enheter og monomere albumin-enheter i albumin-polymere er forbundet med kovalente peptid-bindinger.

5« Preparat som angitt i krav 4»karakterisert ved at det totale albumin-innhold er fra ca. 10 til 35 vektprosent.

6. Preparat som angitt i krav 5, karakterisert ved at monomer/polymer-forholdet er 7:3 til ca. 1:9.

7. Preparat som angitt i krav 5, karakterisert ved at albuminets polymerinnhold er fra ca. 46 til 70 fo.

8. Preparat som angitt i krav 5» karakt e- . risert ved at albuminets polymerinnhold utgjør fra ca. 28 til 45 fo.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av et serologisk albumin-preparat som inneholder en blanding av serum-albumin-monomer og -polymere, hvor preparatets polymerinnhold er minst 20 vektprosent av det to&ale albumin-innhold og hvor albumin-enhetene i de polymere er forbundet gjennom kovalente peptid-bindinger, -NHC0-, ved at man: (1) ved en temperatur mellom ca. 2 og 60°C og pH mellom ca. 4»5° S 6,0 fører en vandig albumin-oppløsning i kontakt med et peptidbindingsdannende middel for polymerisering av albuminet, hvilket peptidbindingsdannende middel består av et 3-H-isoxazoliumsalt eller et karbodiimidreagens, (2) tilsetter en basisk nitrogenforbindelse ved ca. 0 til 30°C for å avbryte polymerisasjonsreaksjonen, (3) tilsetter tilstrekkelig syre til å innstille pH mellom 4,5 °S 7> 0, (4) Tilsetter alkohol for utfelling av den poly meriserte albumin-blanding og (5) opparbeider blandingen av utfelt polymerisert albumin og oppløser fellingen i fysiologisk oppløsning.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 9>karakterisert ved(a) 3-H-isoxazoli"amsal"t""k:ationet nar formelen

hvor Q-j^ betegner f enyl eller sulf onatsubstituert f enyl, Q2 betegner hydrogen eller lavalkyl og betegner lavålkyl og (b) karbodiimidreagensen har formelen R-N=C=N-R <*> hvor minst en av gruppene R og R' betegner et radikal hvor karbonatomet forbundet med nitrogenatomet er et alifatisk C-atom og hvor R og R' betegner lavalkyl med fra 2 til 6 C-atomer, cyklohexyl, cyklopentyl, hydroksy-lavalkyl, fenyl, benzyl, fenetyl, lavååkylmorfolinyl, dilavålkylaminoalkyl, piperidyl, morfolino samt mineralsyre-, lavalkylsulfonsyre- og lavalkylfosfon-syre-addisjonssalter av disse eller lavalkyl-tosylater, -halogenider eller sulfat-kvaternære salter av lavalkylmorfolinyl, dilavålkylaminoalkyl, piperidyl og morfolino.;

11. Fremgangsmåte for påvisning av antistoff-sensitiverte erytrocytter karakterisert ved at man omhyggelig blander med en suspensjon av røde blodlegemer, et serologisk albumin-preparat som inneholder minst en polymer av serum-albumin hvor hver albumin-enhet er forbundet med neste med kovalente peptid-bindinger.;

12. Fremgangsmåte for påvisning av antistoffer karakterisert ved at man (1) omhyggelig blander en erytrocytt-suspensjon og et serologisk albumin-preparat som inneholder minst en polymer av serum albumin hvor albumin-enhetene er forbundet med kovalente peptid-bindinger og (2) omhyggelig blander denne blanding med anti-stoffholdig serum.;

13. Serum-albumin-polymer inneholder fra 2 til 8 monomer-albumin-enheter som er forbundet med kovalente peptid-bindinger, -NHC0-.;

14. Polymere som angitt i krav 13, karakterisert ved at antall monomere albumin-enheter er 3*

15. Polymere som angitt i krav 13, karakterisert ved at antall monomere albumin-enheter er 4