NO771031L - Produkter og fremgangsm}te til fremstilling av forbindelser for behandling av schizofreni. - Google Patents

Abstract

Fremgangsmåte og produkt for behandling av schizofreni.

Description

Oppfinnelsen angår forbindelser og preparater som

er egnet for "behandling av schizofreni. Mer spesielt angår oppfinnelsen behandling av schizofreni ved bruk av polypep-

tider, omag-N-acylerte og/eller hydrokarbonholdige estere av polypeptider. Popypeptidene har fra 3 til ca. 8 alfa-aminosyregrupper og en karakteristisk struktur, særlig N-acylerte T-V-L-holdige polypeptider og deres tilsvarende amider som

f.eks. N-acyl-treonylvalylleucinamider.

Schizofreni er den alvorligste av alle mentale syk-

dommer som psykiateren har til behandling. Hyppigheten er om-

trent 1 pr. 1000 og prevalens omkring 1 pr. 100. Sykdommen er ansvarlig for 25 - 50% av alle innskrivninger på statens syke-

hus for mentalt syke og psykiatrisk behandling i vanlige sykehus (U.S.A.) (Kolb, Modern Clinical Psychiatry, side 311 -

312, 1973).

De fleste pasienter som utvikler sykdommen opplever

et forlop som er langsomt og snikende, selv om en mindre del av pasientene kan ha en akutt utvikling. Sykdommen karakteri-

seres ved forstyrrelse av de fblelsesmessige reaksjoner sammen med tåkete eller utilstrekkelige uttrykk; ved forstyrrelse av

tenkeevnenkarakterisert ved. manglende evne til å nå et mål, ved oppdeling av sammenhenger, ved forstyrret assosiasjons-evne, sperremekanismer, neologismer etc, ved tilbaketrekning fra omgivelsene og opptatthet av indre tanker, ved tap av evnen til å erfare glede, og oftest ved persepsjonsforstyrrelse som grovt'sett kommer til uttrykk ved hallusinasjoner og inn-bilninger.

Uheldigvis begynner schizofrenien oftest i den

sene ungdom eller tidlige voksne alder og til tross for bruk av antipsykotiske legemidler, vil schizofrenien oftest være en varig tilstand og udyktiggjbre personen mer eller mindre i hele hans levetid.

Det er nå mye som tyder på at sykdommen er genetisk bestemt, selv om miljbmessige faktorer, særlig tidlige livs-erfaringer uten tvil også er viktige. Det synes ikke å være noen tvil om at det foreligger en grunnleggende metabolisk forstyrrelse som i det fblgende skal beskrives mer detaljert.

Dessverre kan det ikke bevises absolutt at det finnes en dyremodell for schizofrenistudier siden man ikke kan sam-tale med dyrene for å finne ut om de er schizofrene. Macawue-apene ved Wisconsin Primate Laboratory som er morsmessig og sensorisk forstyrret (de er engstelige, aggressive og ikke istand til å funksjonere seksuelt) kommer nærmest i oppforsel til pasienter med schizofreni (Harlow, "The Development of Patterns of Affection", (utvikling av affeksjonsmonstere), Thomas William Salmon Lectures, New York Academy of Medicine, New York, desember 1960). De mest alvorlig fblelsesmessig forstyrrede aper er studert og viser en forandring av alfa-2-globulin,som senere beskrives, i blodet, i likhet med en forstyrrelse som karakteriserer slike menneskelige pasienter (Beckett, Frohman et al., "Schizophrenic-like Mechanisms in Monkeys" (schizofreni-lignende mekanismer hos aper), The American Journal of Psychatry, 119:835 - 842, 1943). Videre viste apene elektro-encefalografiske forstyrrelser, særlig i hjernens septum, i likhet med hva som tidligere er beskrevet som et karakteristisk trekk hos schizofrenipasienter (Heath: "Electroencephalographic Studies in Isolation-raised Monkeys wit Behavioral Impairments" (elektroecefalografiske undersøk-elser med oppforsels-forstyrrede aper oppdradd i isolasjon),

Diseases of the Nervous System, 33:157 - I63, 1972).

Bruken av dyr har hittil hovedsakelig vær å demon-strere tilstedeværelsen av unormale metaboliske stoffer i blodet til pasienter med schizofreni. Når unormalt blodprotein gis til rotter i en-situasjon med matbelønning og tau-klatr-ing, 'vil rottene redusere ytelsen og aktiviteten vesentlig (Bergen' og medarbeidere: "Further Experiments with Plasma Proteins from Schizophrenics" (ytterligere eksperimenter med plasmaproteiner fra schizofrenipasienter), i: Serological Fractions in Schizophrenia, av R.E. Heath, side 67, Paul B. Hoeber, Inc., Medical Book Department of Harper & Row, New York, 1963).

Det er visse ting som tyder på at ekstrakter fra det limbiske system i hjernen hos avdbde pasienter, innsprbytet i normale frivillige fremkalte en simulert schizofrenisk reaksjon (Garey: "Focal Electroencephalographic Changes Induced by Anti-septal Antibodies" (Fokale elektroencefalografiske forandringer fremkalt av anti-septale antistoffer), Biological Psychiatry, 8:75 - 88, 1974). De klareste undersøkelser omfatter innsprøyting av isolert alfa-2-globulin fra blodet hos schizofrenipasienter i mikroliter-mengder i ventrikkelen hos rotter som har implantert elektroder i midtre forhjernebunt. Rotter med slik implantering vil belbnne seg ved å presse ned en stang så ofte de kan på bekostning av all annen aktivitet. Når mikroskopiske mengder isolert alfa-2-globulin innsprbytes i ventrikkelen, finner det sted en reduksjon av aktiviteten ved stangpressingen som ikke forekommer når en lignende forbindelse fra en kontrollperson injiseres. Noen av rottene som innsprbytes blodprotein isolert fra schizofrenipasienter kan svinge over stangen som om de ville presse den ned, svinge omkring og være ute av stand til å fortsette, hvilket ligner en schizofrenisk forstyrret motorisk tilstand. Tydningen av den nedsatte.evne til å presse ned stangen er at dyret har tapt evnen til å erfare glede mye i likhet med et som karakteriserer schizofrenipasienter (Caldwell og medarbeidere: "The Effeet of the S-protein on Intracranial Self-Stimulation in-the Rat",(Virkningen av S-protein på intrekraniell selvstimulering hos rotte), Biological Psychiatry, 8:235 - 244, 1974).

SSkeren har i mange år vært engasjert i utstrakt forskning for å finne årsaken til schizofreni på biokjemisk grunnlag og for å finne psykofarmakologiske behandlingsmetoder. Under dette arbeidet fant man at et protein med hoy molvekt, man kom frem til en molvekt på ca. 263.000 og med ca. 80% fettstoffinnhold, er mer aktivt hos schizofrenipasienter enn normale personer, og jo hurtigere en schizofrenipasient brytes ned, desto mer aktivt er proteinet. Dette protein er klassi-fisert som et alfa-2-globulin og har fått betegnelsen S-protein: Frohman, CE. L.K. Latham, P.G.S. Beckett og J.S. Gottlieb: "Biochemical Studies of a Serum Factor in Schizophrenia"

(Biokjemiske studier over en serumfaktor ved schizofreni), Molecular Basis of Some Aspects of Mental Activity (Moleky-lært grunnlag for en del trekk ved mental aktivitet), bind 2, 0. Walaas, utgiver, side 24-1 - 255, Academic Press, New York

(1967) og CE. Frohman: "Studies on the Plasma Factors in Schizophrenia" (Studier om plasmafaktorer ved schizofreni), Mind as a Tissue, (Bevisstheten som vev), C. Rupp, uigiver, side 181 -'195, Hoeber Med. Div., Harper & Row, New York. S-protein vil når det gis til f.eks. rotter blokkere opplevel-sen av gledestimuleringer hos rotter, men synes ikke å forandre deres unnvikingsreaksjoner.

Forsok på å redusere aktiviteten for S-proteinet

hos schizofrenipasienter har bestått i ta ekstrakter fra hjerner som f.eks. kveghjerne, konglekjertler fra kjott, etc, under letingen etter forbindelser som regulerer aktiviteten for S-proteinet. Frohman og medarbeidere i: "Control of the Plasma Factor in Schizophreniz" (Regulering av plasmafaktoren ved schizofreni), Recent advances in Biological Pshychiatry, bind 7, side 45 - 51, 1964, beskriver at et isolert protein fra dyrisk vev motvirket aktiviteten hos S-protein. Dette protein er betegnet anti-S-protein og finnes hos både dyrisk og menneskelig vev. Hos schizofrenipasienter finnes S-protein med alfa-skrueformet konfigurasjon mens hos normale personer foreligger S-proteinet overveiende som en tilfeldig kjede eller med (3-skrueformet (p-helix) konfigurasjon. Fremstilling av terapeutiske mengder anti-S-protein byr på store vanskeligheter og store omkostninger og utvinning for generell medisinsk

bruk kan ikke gjennomføres i praksis. Produksjon av noen få

få milligram anti-S-protein fra kveg vil kreve slaktning av eksempelvis 100.000 kveg. Således er naturlig tilfbrsel av anti-S-protein på ingen måte tilstrekkelig for behandling av annet enn få enkeltpersoner og ville medfbre utenkelige omkostninger. Andre publikasjoner som angår disse grunnleggende undersøkelser er fblgende: CF. Frohman, R.E. Arthur, H.S. Yoon og J.S'. Gottlieb: "Distribution and Mechanism of Action of the Anti-S-Protein in Human Brain" (Fordeling og virke-måte for anti-S-protein i den menneskelige hjerne), Biological

Psychiatry, bind 7, nr. 1, side 53 - 61, 1973, og CR. Harmi-son and CE. Frohman: "Conformational Variation in a Human Plasma Lipoprotein" (Konfigurasjons-variasjoner hos lipopro-teinplasma fra mennesker), Biochemistry, bind 11, nr. 26, side 4485 - 4493, 1972.

Man har også notert ved.undersøkelser som sbkerne har deltatt i at ekstrahert anti-S-protein er et antigen. Mens schizofreni kan dempes dramatisk ved å gi anti-S-protein til en pasient, vil anti-S-proteinet hurtig inaktiveres ved dannelse av antistoffer og senere administrert anti-S-protein kan inaktiveres så raskt at den ikke har noen tydelige virkning av schizofreni. Søkeren har vært engasjert i forsbk på å nedbryte anti-S-proteinet i molekylfragmenter som kan ha en brukbar virkning ved behandling av schizofreni uten å være utsatt for den uønskede antigenaktivitet.

I henhold til foreliggende oppfinnelse vil behandling av anti-S-protein med f.eks. pepsin og typsin som reduserer proteinet til mindre peptider med molvekt under ca. 1.000, gi en tripeptid-holdig fraksjon som har vist seg å være aktiv ved

å redusere den uønskede aktivitet hos S-protein. Tripeptidet viser en aktivitet ved å forårsake omdannelse av alfa-helix-S-protein til den tilfeldige kjedekonfigurasjon. Tripeptidet erkarakterisertsom treonyl-valyl-leucin. Man har arbeidet med å syntetisere tripeptidet og en vesentlig ren, dvs. krystallinsk form av tripeptidet er fremstilt. Tripeptidet har virkning mot S-protein hos schizofrenipasienter, dvs. alfa-helix-konfigurasjonen hos S-proteinet overfores til den tilfeldige konfigurasjon. Når forbindelsen ved forsbk administreres for å motvirke virkningen av S-protein hos rotter,

er imidlertid den effektive virketid for pripeptidet liten og

derfor vil hyppige periodiske doser av tripeptidet være nbd-vendig ved effektiv behandling av schizofreni.

I henhold til foreliggende oppfinnelse er det også funnet at T-V-L-peptider og deres derivater kan brukes for å dempe eller undertrykke schizofrenisymptomer hos pattedyr som har slike'symptomer. Disse polypeptider inneholder rester av minst tre alfa-aminosyrer og har den angitte T-V-L-struktur. Polypeptet kan være en aminosyre, dvs. ha en endeplasert aminosyregruppe i syreform og den andre endeplaserte aminosyregruppe i alfa-amino-form (-NF^). Det foretrekkes imidlertid at de polypeptider som brukes for å undertrykke symptomer av schizofreni inneholder minst én av de endeplaserte aminosyregrupper i derivatform, spesielt at den endeplaserte alfa-aminogruppe er acyl-substituert eller den endeplaserte karboksylsyregruppe er i amid- eller ester-form. Fortrinnsvis er begge endegrup-per substituert på denne måten og særlig foretrekkes acylerte amider. Disse polypeptider kan også være ytterligere substituert og deres farmasbytisk ugiftige derivater som syre- eller basesalter eller derivatformer kan brukes for å dempe symptomer av schizofreni i henhold til foreliggende oppfinnelse.

T-V-L-holdige polypeptider i henhold til oppfinnelsen viser seg effektive ved behandling av schizofrenisymptomer ved å omstrukturere alfa-helix-konfigurasjonen hos S-protein som finnes i nervesystemet, f.eks. hjernen, hos schizofrenipasienter, til den tilfeldig orienterte form. Polypeptider eller acylerte polypeptider, estere eller amider har struk-

hvor Ra betegner en mettet alifatisk hydrokarbongruppe som alkylen med 1-20 C-atomer, fortrinnsvis lavalkylen med 1-4 C-atomer; R13 betegner -0(R<e>) hvor Re utgjor hydrogen eller

et mettet alifatisk hydrokarbon som alkyl med 1-20 C-atomer,

eller fortrinnsvis lavalkyl med 1-4 C-atomer, eller aryl eller aralkyl med 1-4 ringer, fortrinnsvis 6-24 C-atomer, eller R "betegner -NR R hvor R og R kan være like eller forskjellige og kan være hydrogen eller lavalkyl med f.eks. 1-6

c d

C-atomer, eller R og R kan være lavere alkylen og tilsamiiien danne en cyklisk struktur inklusive det nitrogenatom som de er bundet til;' A og B er begge en monoiminoacylgruppe, fortrinnsvis en oc-monoiminoacylgruppe som inneholder 2-10 C-atomer og B er hydrolyserbar fra (L)-komponenten i den essensielle T-V-L-• struktur slik at karboksylfunksjonen i (L)-komponenten blir

tilgjengelig hos verten; p er lik 0 eller 1; t er 0 til 5;

x er 0 til ca. 5; og t pluss x er fra 0 til 5. Når t er 2 eller mer så kan alle A-grupper være like eller forskjellige, f.eks. kan (A)^. være fenylalanylprolyl. Når x på lignende måte er 2 eller mer, kan alle B-grupper være like eller forskjellige. I en foretrukket stoffgruppe er - R° like -NR°R^ eller minst én av p, t eller x er forskjellig fra null. (T)-komponenten som vises i ovenstående strukturformel kan foreligge enten i diastereoisomerform f.eks. som treonyl eller allotreonyl hvos stereokjemien ved cc-karbonet. er omvendt. Fortrinnsvis er (T)-komponenten treonyl. (L)-komponenten i

•strukturformlene kan være

(vanligvis betegnet leucyl), som foretrekkes, eller innta en annen form som

Forbindelsenelfdlge oppfinnelsen omfatter stoffer hvor enhver stubstituent, f.eks. et monoiminoacylradikal som her betegnes med B, på karboksylgruppen i (L)-resten i den essensielle T-V-L-fblge er hydrolyserbar. For å oppnå den onskede aktivitet bor substituenten være hydrolyserbar under de forhold som hersker i det aktuelle miljo hos verten. Egnede hydrolyserbare substituenter er slike som hydrolyseres i nærvær av rode blodlegemer ved en inkuberingstemperatur på omkring vertens kroppstemperatur, dvs. ca. 35 - 40°C. En egnet metode for å bestemme om en substituent er hydrolyserbar eller ikke består i å inkubere en forbindelse som inneholder den essensielle T-V-L-struktur og en substituent på (lu-resten i et lever-medium ved ca. 37°C

Peptiderestene i forbindelser i henhold til foreliggende oppfinnelse omfatter peptidgrupper som har optisk

aktivitet. Forskjellige peptidgrupper kan ha konfigurasjoner med betegnelsen L- eller B-. Monoiminoacylgrupper med betydning A i formel II og den essensielle T-V-L-del av forbindelsene kan være i L- eller D-form eller blandinger av disse

som racemiske blandinger. På grunn av hyppige vanskeligheter med å hydrblysere D-peptider som er substituenter på karbok-sylfunksjoner i peptider under opprettholdelse av karboksylfunksjonen, vil monoiminoacylradikaler som inneholder gruppen B i formel II med fordel ikke ha optisk aktivitet eller, når de er optisk aktive, foreligge i L-konfigurasjon. Blant fore-.trukne forbindelser finner man slike hvor (L)-gruppen i den essensielle T-V-L-sekvens har D-konfigurasjon.

Tripeptidet treonyl-valyl-leucin eller dens derivater som beskrevet, f.eks. de tilsvarende amider, kan fremstilles i relativt stor renhetsgrad og kan være krystallinske, f.eks. være ca. 90 - 95% rene, og fortrinnsvis omkring 100% rene.

Forskjellige forbindelser med formel II kan være mellomprodukter for fremstilling av stoffer som er aktive ved behandling av schizofreni. Når f.eks. p er lik null og R*3 er hydrogen, kan forbindelsen være et mellomprodukt for fremstilling av en forbindelse hvor p er 1 og/eller R er forskjellig fra hydrogen. Forbindelser som er spesielt gunstige for behandling av schizofreni er polypeptider hvor p er lik 0 eller 1 og polypeptider som inneholder minst tre peptid- eller aminosyre-rester og t er lik 0 eller mer, i aminosyre- eller derivatform. Polypeptider hvor minst én av para-meterne p,. t eller x er forskjellige fra null kan oppvise lengre aktivitetsperiode enn når tripeptidet T-V-L er i amino-syreform.

Foretrukne acylerte polypeptider for bruk s,om aktive midler eller deres mellomprodukter har strukturen:

hvor gruppen 4NH-CH-C-) er et monoiminoacylradikal og R f.eks.

i

R<1>

hydrogen eller en lavere alkylgruppe som f.eks. har 1 - 4 C-

atomer eller en

2 ^5

gruppe hvor R og R-^ betegner hydrogen

eller lavere alkyl med f.eks. 1-4 C-atomer, eller betegner aryl eller aralkyl med 1-4 ringer og fortrinnsvis med 6 - 24 C-atomer. Slike grupper kan være substituert som f.eks. i

a b

tyrosyl. Symbolene R , R , p, t og x har samme betydning som i formel II.

I forbindelser med formel III utgjor R^ en del av en alfa-aminosyre- eller peptid-rest som f.eks. i treonyl eller allotreonyl hvor R^" betegner en alfa-hydroksyetylgruppe, leucyl hvor R"*" er en 2-metylpropylgruppe, valyl hvor R betegner en isopropylgruppe, seryl hvor R"'" betegner en hydroksymetyl-gruppe, isoleucyl hvor R"*" betegner 1-metylpropyl, glycyl hvor

R"<*>" betegner hydrogen, eller alfa-alanyl hvor R"*" betegner metyl,

arginyl hvor R"*" betegner

tyrosyl hvor R"*"

og. lignende. Når gruppen som inneholder R<1>

har en alfa-hydroksygruppe, kan den overfores til en lavere alkoksy- eller aryloksygruppe, fortrinnsvis benzyloksy eller t-butyloksy. Dette kan foretas under syntesen for å beskytte

hydroksylgruppen. Peptidrester som monoiminoacylradikaler som er bundet til den essensielle T-V-L-struktur kan også være prolyl, arginyl o.l. Videre kan disse grupper være en dikar-boksylsyrerest som f.eks. en glutamin- eller asparaginsyre-rest.

'R -gruppen i foreliggende forbindelser kan ha opptil 20 C-atomer, selv om alkylengruppen helst har inntil 4 C-atomer.

0

I!

Således kan N-acylgruppen H-(Ra<->C) f.eks. være acetyl propano-yl, butynoyl, pentanoyl, heksanoyl, heptanoyl, oktanoyl, nona-noyl, dekanoyl, undekanoyl, dodekanoyl, tridekanoyl, tetrade-kanoyl, pentadekanoyl, palmitoyl, heptadekanoyl, stearyl o.l. Estergruppen R kan være metyl, etyl, propyl, butyl, pentyl, heksyl, heptyl, oktyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tride-cyl, tetradecyl, pentadecyl, heptadecyl, oktadecyl, fenyl, benzyl, tertiært butoksykarbonyl, t-butyl, dihydro-epi-hydrok-sy-androsteronyl o.l. Fortrinnsvis er N-acylgruppen og estergruppen normal-grupper og har' altså rette C-C-kjeder. Forbindelsene med de aktuelle formler eller deres mellomprodukter kan ha substituenter som ikke innvirker på deres kjemiske eller farmakologiske aktivitet.

Mellomprodukter for fremstilling av aktive stoffer ifolge oppfinnelsen er forbindelser med formel

hvor r, x, A og B har den tidligere angitte betydning, D betegner H eller en a-amino-beskyttende gruppe, E er lik -0H, en endeplasert karboksylsyregruppe, et metallkompleks av f.eks. sink, kobber, nikkel, kobolt, jern,magnesium eller aluminium, og fortrinnsvis et metallhydroksydkompleks, eller et syre- eller base-addisjonssalt, R betegner H, alifatisk hydrokarbon, fortrinnsvis mettet, eksempelvis alkyl med 1-20 C-atomer som lavalkyl med 1-4 C-atomer eller en aralifatisk

eller arylgruppe med 1-4 ringer og fortrinnsvis 6 - 24 C-atomer, acyl inkl. alkanoyl eller aralkanoyl med 1-20 C-atomer, fortrinnsvis lavere acyklisk acyl med 1-4 C-atomer, tetrahydropyranyl, et enverdig metall som et alkalimetall av typen natrium o.l. Et metall som sink,. kobber, nikkel, kobolt, jern, magnesium'eller aluminium kan danne et kompleks med funk-sjoner av pblypeptidet som f.eks. en karbonylgruppe.

oc-aminobeskyttelsesgruppen kan være (1) av acyl-eller tioacyltypen, med fortrinnsvis 2-21 C-atomer, f.eks. lavere alifatisk acyl med 2-7 C-atomer, eksempelvis acetyl, etc; lavere aralifatisk acyl med 8-15 C-atomer som ftalyl, naftoyl, benzoyl etc; trifluoracetyl; kloracetyl; Y-klor-butyryl; toluensulfonyl; benzensulfonyl; nitrofenylsulfenyl; tritylsulfenyl; o-nitrofenoksyacetyl o.l., (2) en aromatisk uretan-gruppe illustrert ved benzyloksykarbonyl og substituert benzyloksykarbonyl som p-klorbenzyloksykarbonyl, p-nitroben-zyloksykarbonyl, p-brombenzyloksykarbonyl, p-metoksybenzyl-oksykarbonyl, (3) alifatisk -uretan som beskyttelsesgruppe illustrert ved tert-butyloksykarbonyl, diisopropylmetoksykar-bonyl, isopropyloksykarbonyl,. etoksykarbonyl, allyloksykar-bonyl, (4) cykloalkyl-uretan-grupper som beskyttelsesgrupper illustrert ved cyklopentyloksykarbonyl, cykloheksyloksykarbo-nyl, (5) tiouretan-beskyttelsesgrupper som fenyltiokarbonyl,

(6) alkyl- og aralkyl-beskyttelsesgrupper som illustrert ved trifenylmetyl (trityl) og benzyl, (7) trialkylsilangrupper som trimetylsilan. De endeplaserte karboksylsyregruppene kan være (.1) -OG hvor G f.eks. betegner en alifatisk gruppe med fortrinnsvis 1-20 C-atomer eller en aralifatisk gruppe med 1-4 ringer og fortrinnsvis 6-24 C-atomer, og inneholdende en ester avsluttet med et karbonholdig radikal eller acyl som lavere acyklisk acyl fortrinnsvis med 1-6 C-atomer, (2) en amid-holdig gruppe som f.eks. -NH^, aminoalifatisk eller amino-aralifatisk gruppe (eksempelvis monocyklisk aralifatisk) med 1 - 10 C-atomer, således kan aminet være primært, sekundært eller tertiært, eksempelvis -NR cR d hvor R c og R d har betydning som ovenfor, eller (3) et forankringsmiddel som

harpiks som bæremateriale; - 0 - CHp - CgH^- harpiks-bæremateriale, klormetylert harpiks, hydroksymetylharpiks, Merrifield-harpiks o.l. Fortrinnsvis er de nevnte alifatiske eller aralifatiske grupper hydrokarbyl.

Polypeptider ifdlge oppfinnelsen, f.eks. stoffer med formel II,, kan benyttes til å oppheve symptomer av schizofreni hos mennésker og pattedyr og man antar at dette skjer ved å redusere aktiviteten til S-protein, dvs. ved at de frembringer en reduksjon av graden av alfa-helix-konfigurasjon i S-proteinet i det varmblodige dyr. Disse aktive stoffer kan være effektive til å motvirke symptomer av schizofreni og deres uttrykks-former som nervose spenningstilstander, manisk-depressiv psykose etc, når de gis farmakologisk innvortes til et levende dyr. Når man gir en aktiv forbindelse i henhold til oppfinnelsen f.eks. blandet med et farmasøytisk bærestoff, gis prepa-ratet innvortes f.eks. i fordbyelseskanalen, og parenteral administrasjon foretrekkes. Den aktive forbindelse kan være i fast eller flytende form og. kan være sammenfoyd med.en farma-søytisk bærer som f.eks. er i fast form, opplosning, suspensjon, emulsjon eller annen form. Parenteral administrasjon kan skje f.eks. subkutant, intraperitonealt, intravenbst, intraarterielt, intramuskulært eller lignende. For oral administrasjon kan den aktive forbindelse og den farmasbytiske bærer f.eks. være en pille, drops, tablett, kapsel eller flytende suspensjon. Eksempler på bærestoffer er faste typer som laktose, magnesiumsterat, kalsiumstearat, stivelse, terra alba, dikalsiumfosfat, sukrose, talkum, stearinsyre, gelatin, agar, pektin eller akasiegummi og væsker som sesamolje, olivenolje, vann o.l. Et enterisk belegg som celluloseacetatftalat kan brukes. Forbindelsene ifblge oppfinnelsen kan også inneholde konserveringsmidler, stabiliseringsmidler, fuktemidler, emul-gatorer og buffere eller salter o.l. De aktive stoffer som benyttes i henhold til oppfinnelsen eller preparater som inneholder dem kan enten gis sammen med eller inneholde andre fysiologisk aktive stoffer eller medikamenter som f.eks. puffere, syreoppfangere, beroligende midler, analgetika, hormoner o.l.

Man kan bruke varierende doser av de aktive stoffer avhengig av den valgte forbindelse, tilstanden, administrasjons-vei, den bnskede virkning på verten, etc, pattedyrets art o.l. Således kan mengden aktivt stoff variere, men bor være tilstrekkelig til å oppheve schizofreni-symptomer hos pattedyret i signifikant grad. Dosene vil generelt variere mellom minst ca. 0,01 mg pr. kg pr. dag (milligram pr. kg kroppsvekt pr. dag) f.eks. på opp til 2 eller flere mg pr. kg pr. dag og helst mellom ca; 0,1 og 1 mg pr. kg pr. dag.- Behandlingen kan bestå av en enkelt daglig dose eller de ovenstående doser kan gis oppdelt over en periode, f.eks. 2-4 doser å ca. 0,05 - 0,2 mg pr. kg kan gis pr. dag. Den aktive, forbindelse kan inn-arbeides i langtidsvirkende preparater slik at disse mengder gjores tilgjengelige for kroppen over et lengre tidsrom. Ak-tivitetstiden kan forlenges ved å innarbeide polypeptidene i organiske og oftest polymere forbindelser som gelatin, poly-kloretinfosfat eller polyglutaminsyre.

Forbindelsene ifolge oppfinnelsen, inkl. slike som

er aktive ved behandling av schizofreni-symptomer eller deres forlopere eller mellomprodukter kan fremstilles syntetisk av individuelle aminosyrer eller■av polypeptider, under dannelse av den dnskede T-V-L-peptidsekvens. I henhold til en syn-tesevei, omsettes aminosyrekomponenter i onsket rekkefolge for fremstilling av peptidstrukturen, f.eks. kan amingruppen i en forste aminosyre kondenseres med karboksylsyregruppen i en andre aminosyre under dannelse av en dipeptidstruktur som kan omsettes videre til den onskede struktur med 3 - ca. 8 aminosyregrupper eller enheter. For å komme frem til den onskede kombinasjon av aminosyregrupper, er det vanligvis nød-vendig å blokkere eller beskytte de steder på aminosyremolekyl-et som kunne gi opphav til uonskede sidereaksjoner, f.eks. karboksylsyregruppen i en forste aminosyre som kunne reagere med amingruppen i en forste aminosyre eller en andre aminosyre. Slik blokkering kan skje på kjent måte. Særlig gunstige beskyttelsesgrupper for aminogruppen på aminosyrer er a-amino-beskyttelsesgrupper av typen ftalyl, karbobenzyloksy og t-butyloksykarbonyl, fordi de lett kan bindes til aminogruppen uten å forårsake racemisering av aminosyren, er relativt inert overfor reaksjonsbetingelsene og lett kan fjernes fra aminogruppen uten uheldig innvirkning på aminosyren. Beskyttelsesgruppene kahomsettes som syrehalogenid av typen klorid, ester eller syreanhydrid, f.eks. et blandet syreanhydrid med alkyl-

formiat, eksempelvis lavere alkylformiat. Reaksjonen kan gjen-nomføres ved romtemperatur i et inert organisk medium som benzen. Hoyere eller lavere temperaturer på mellom 0 og 50°C kan eventuelt brukes. Karboksylsyregruppen på aminosyren kan blokkeres ved reaksjon med aminogruppen i den forutgående aminosyre 'i peptidserien eller med en annen egnet blokkerings-gruppe når syren er den forste syre i serien.

For lettvint utvinning av aminosyresynteseproduktet etter hvert reaksjonstrirm kan det være en fordel å benytte den forste eller avsluttende aminosyregruppe som en harpiksester eller harpiksamid. Særlig gunstige harpikser er f.eks. benzhydrylamin-harpikser, klormetylerte harpikser, Merrifield-harpiks og hydroksymetylharpiks. Fremstilling av benz^hydryl- • aminharpiks beskrives av Rivallile og medarbeidere, Heiv. 54, 2772 (1971), og fremstilling av hydroksymetylharpiks beskrives av Bodanszky og medarbeidere, Chem. Ind. (London) 38, 1597-98 (1968).

Beskyttelsesgruppene må være stabile i omsetnings-mediet under reaksjonsforholdene som benyttes for fremstilling av peptidet. Beskyttelsesgrupper for endeplaserte karboksyl-syregrupper bor være stabile under de betingelser som brukes for å fjerne alfa-amino-beskyttelsesgruppen ved hvert syntese-trinn. Blokkeringsgruppen bor beholde de beskyttende egenskap-er, dvs. ikke avspaltes under syntesebetingelsene og når de fjernes etter avsluttet syntese, bor de anvendte reaksjons-betingelser ikke forandre peptidkjeden på uonsket måte. Blok-keringsgruppene kan fjernes på forskjellige kjente måter avhengig av den typen gruppe som brukes, f.eks. med trifluoreddiksyre, ved hydrogenolyse med, f.eks. hydrogen og en kata-lysator som platina, palladium eller.lignende eller med hydrogenbromid i iseddik eller trifluoreddiksyre eller med vannfri hydrogenfluorsyre. Hydrogenolysemedium er fortrinnsvis vann-fritt.

Reaksjonen mellom en foreliggende peptidenhet og en påfblgende aminosyre kan skje i fast fase. Ved fremstilling av harpiksestere eller -amider, kan harpiksbærematerialet og aminosyren blandes omhyggelig i et inert organisk medium som f.eks. tetrahydrofuran, dioksan, dimetylf.ormamid, benzen, etanol o.l. Reaksjonen forlbper ved romtemperatur selv om hoyere temperaturer på f.eks. mellom 0 og 80°C eventuelt kan brukes. Omsetningen fortsettes vanligvis til avslutning for å gjore utbyttet av peptidprodukt så stort som mulig. Bruk av vesentlig overskudd av aminosyrereaktant, f.eks. overskudd på minst 1,5 - 200 eller mer ganger den nodvendige stokiometriske mengde og lange reaksjonstider på minst 1 time og fortrinnsvis 5 500 timer eller mer gir oket utbytte. Om reaksjonen er avsluttet kan bestemmes ved Kaiser-fargereaksjon. En positiv Kaiser-fargereaksjon angir usubstituerte grupper på aminosyren. Dor-man-titrering kan også brukes for å fastslå om reaksjonen er avsluttet.

Egnede bindingsmetoder for fremstilling av polypeptidkjeden av forbindelser i.henhold til oppfinnelsen finnes beskrevet i litteraturen. Generelt blir aminosyren og/eller peptidfragmenter bundet til hverandre slik at f.eks. en aminosyre eller peptid inneholdende en beskyttet alfa-aminogruppe og en endeplasert karboksylgruppe omsettes med en aminosyre eller peptid som inneholder en fri alfa-aminogruppe og en beskyttet endeplasert karboksylgruppe, eller en aminosyre eller peptid som inneholder en aktiv alfa-aminogruppe og en beskyttet endeplasert karboksylsyregruppe omsettes med en aminosyre eller peptid som inneholder en fri endeplasert karboksylsyre og en beskyttet alfa-aminogruppe. Karboksylsyregruppen kan aktiveres f.eks. ved omdannelse til et syreazid, -anhydrid eller -imidazolid eller til en aktivert ester som cyanoetylester, tiofenylester, p-nitrotiofenylester, tiokresyl-, p-metansul-fonylfenyl-, p-nitrogenyl-, 2,4-dinitrofenyl-, 2,4,5- eller 2,4,6-triklorfenyl-, pentaklorfenyl-, N-hydroksysuccinimid-, N-hydroksyftalimid-, 8-hydroksykinolin-, N-hydroksypiperidin-ester, eller ved omsetning med et karbodiimid (eventuelt under tilsetning av N-hydroksysuccinimid) eller N,N'-karbonyldiimida-zol eller et isoksazoliniumsalt, f.eks. "Woodward"s reagens, og aminogruppen aktiveres f.eks. ved omsetning med et fosfitt. Hyppig anvendte metoder omfatter karbodiimidmetoden, Weygand-Wuensch-metoden (karbodiimid i nærvær av en N-hydroksysuccinimid), azidmetoden, metoden med aktiverte estere og anhydrid-metoden, og videre Merrifield-metoden og metoden med N-karbok-syanhydrider eller N-tiokarboksyanhydrider.

Med fordel kan karbodiimidmetoden brukes og karbodi- imidkoplingsmidlet kan f.eks. være N-etyl-N'-(~)f-dimetylamino-propyl-karbodiimid) eller et dihydrokarbyl-karbodiimid som f.eks. et dialkyl med 1-20 C-atomer, eksempelvis dicyklo-heksyl-carbodiimid. Karbodiimidet kan forelegges i et inert opplbsningsmiddel som f.eks. metylenklorid for å lette omsetningen. Ofte er molforholdet mellom karbodiimid og antall mol av den minst rikelige aminosyre ca. 0,):1 til 10:1. Bindings-reaksjonen kan foretas i et inert medium som diklormetan, i mengder som gir tilstrekkelig opplbsningsmiddel, f.eks. 1 - 100 ml eller mer pr. gram aminosyre. Reaksjonen forlbper ved romtemperatur, selv om man kan bruke hoyere eller lavere temperaturer på f.eks. mellom -30 og +50°C om bnsket.

Frigjøring eller avspalting av beskyttelsesgrupper fra en aminosyre eller et peptidfragment for ytterligere reaksjon kan foretas på enhver kjent måte. Med fordel kan blokker-ingsmidler på aminogrupper, f.eks. acyl-beskyttelsesgrupper fjernes i to trinn med et hydrogenhalogenid som f.eks. hydrogenklorid, i hvert trinn. Produktet er syreaddisjonssaltet som f.eks. hydrogenkloridet, som kan nøytraliseres med en base som trietylamin, pyridin, natrium- eller kaliumhydroksyd, natrium- eller kaliumkarbonat o.l. Hydrogenhaldgenidet kan fremstilles ved å boble hydrogenhalogenid gjennom et flytende medium som f.eks. dioksan eller metylenklorid. En harpiksester kan omdannes til et ubeskyttet peptid ved å boble gjennom hydrogenhalogenid som f.eks. hydromidgass i et medium som inneholder peptidharpiksester<p>g trifluoreddiksyre.

Som nevnt ovenfor er det hensikten å modifisere polypeptidkjeden som inneholder T-V-L-sekvensen til en forbindelse som viser lengre effektiv levetid ved behandling av schizofrene symptomer enn aminosyre-tripeptidet og således kan sistnevnte polypeptid omdannes til et omega-N-acylert polypeptid. Kjente acyleringsmetoder kan brukes selv om det vil være gunstigst å benytte en prosess som ikke forstyrrer amino-syregruppenes optiske aktivitet. Alfa-aminogruppen på polypeptidet kan acyleres ved omsetning med det tilsvarende syrehalogenid, eller syreanhydrid, etter kjente metoder. Endeplaserte karboksylsyre- eller estergrupper kan forestres eller omestres etter kjente metoder for fremstilling av et peptid som vil vise stbrre effektiv dose. Forestring kan skje ved omsetning av polypeptidet som har en fri endeplasert karboksylsyregruppe med den tilsvarende alkohol. Amider med karakteristisk T-V-L-sekvens i henhold til oppfinnelsen kan fremstilles på kjente måter. F.eks. kan den tilsvarende syre eller syrehalogenid, f.eks. -klorid av peptidet omsettes med ammoniakk eller et primært eller sekundært amin. Ammoniakk eller amid benyttes ofte i monst stdkiometrisk mengde for å oppnå fullstendig reaksjon med peptidet. Omsetningen kan foretas i et inert opplbsningsmiddel som tetrahydrofuran og ved en temperatur på omkring 10 til 50°C eller mer. Jo hoyere molvekten for acyl- og estergruppene er på peptidet, jo langsommere og av lengre varighet vil som regel virkningen være ved behandling av schizofrene symptomer.

De funksjonelle derivater av forbindelser og mellomprodukter ifblge oppfinnelsen omfatter farmasbytiske salter inkl. syre- og baseaddisjonssalter av polypeptidene. Syre-addisjonssaltene kan fremstilles ved å omsette polypeptidet med en organisk eller uorganisk syre som saltsyre, hydrogenbrom-syre, svovelsyre, fosforsyre, eddiksyre, maleinsyre, vinsyre, sitronsyre, eplesyre, askorbinsyre, benzosyre o.l. Forbindelser med T-V-L-sekvensen kan også finnes i form av metallkom-plekser som fremstilles ved å omsette polypeptidene med et tungtopplbselig salt, hydroksyd eller oksyd av metallet. Metaller som kan brukes omfatter kobolt, kobber, kalsium, jern, sink, magnesium, natrium, kalium og ammonium. Andre metaller som kan brukes er nikkel og aluminium. F.eks. kan man få et metallkompleks ved å tilsette polypeptidet og et tungtopplbselig metall salt, metallhydroksyd eller metalloksyd til et vandig medium eller ved å tilsette et alkalisk medium til en vandig oppløsning av polypeptidet og et vesentlig uoppløselig metallsalt under dannelse av et uoppløselig polypeptid-metallhydroksyd-kompleks. Et uoppløselig polypeptidmetallsaltkom-pleks kan også fremstilles in situ ved å sette polypeptidet og et metallsalt til et vandig alkalisk medium.

Oppfinnelsen skal i det fblgende beskrives ved eksempler. I eksemplene foreligger peptidgrupper med optisk aktivitet i L-konfigurasjon hvor intet annet er angitt.

Eksempel 1

Fremstilling av leucin- benzylester- p- toluensulfonat

På en 200 ml trehalskolbe forsynt med Dean og Stark-kjblefelle, tilbakelbpskjbler (med tbrreror) og mekanisk rbrer kokes 15 g ( 0,0789 mol) p-toluensulfonsyre^-monohydrat inntil én ekvivalent vann er avgitt. På dette punkt tilsettes 10 g (0,07634 mol) leucin og 17,0 g (0,15 mol)benzylalkohol. Blandingen kokes ved tilbakelbp i 4 timer og man lar det hele avkjbles til romtemperatur. Opplbsningsmidlene fjernes i vakuum og det fås en hvit, fast rest. Det hvite stoffet vaskes med vannfri eter og omkrystalliseres fra etanol/eter og gir etter tre krystallisasjonstrinn 28,2 g leucin-benzylester-p-toluensulfonat (94% utbytte) med sm.p. 157 - 158°C. (dekomp.).

Eksempel 2

Fremstilling av benzyl- N- q- t- butyloksykarbonylvalylleucinat

Ca. 13,2 g (0,0336 mol) benzyl-leucinat-p-toluensul-. fonat behandles med natriumbikarbonat for fremstilling av benzyl-leucinat, som utvinnes med metylenklor.idekstraks jon.

På en 200 ml trehalskolbe forsynt med nitrogeninnlbpsrbr og

-utlbp og magnetisk rbrer opplbses 6,25 g (0,34 mol) dicykloheksylkarbodiimid i 30 ml frisk-destillert torr CH2CI2og det opparbeidede benzyl-leucinat tilsettes. Blandingen holdes under nitrogenatmosfære og avkjbles til ca. -30°C med tbrris og karbontetraklorid. Til blandingen settes 7,45 g (0,0336 mol) N-a-t-butyloksykarbonylvalin opplost i 50 ml torr Ct^C^, dråpevis. Den dannede blanding lagres ved -10°C i 2 dager. Etter fjerning av den dannede hvite felling ved filtrering, vaskes metylenkloridsjiktet påfblgende med 25% vandig eddiksyre, vandig natriumbikarbonatopplbsning, vann, og mettet, vandig saltvann. Det organiske laget tbrkes over vannfri MgSO^og opplbsningsmidlet fjernes i vakuum. Inndampningsresten tas opp i etylacetat, filtreres og konsentreres på nytt i. vakuum. Det dannede faste stoff omkrystalliseres fra etanol/- heksan og gir etter "to kcystållisasjonstrinn 9,17 g benz yl-N-oc- t-butyloksykarbonylvalyl-leucinat (65% utbytte), sm.p. 90 - 91°C Eksempel 5

Fremstilling av benzyl-N-cc-t-butyloksykarbonyl-0-benzyltreonyl- valylleucinat

På en lOO ml trehalskolbe forsynt med gassinnlbp og utlop og magnetisk rbrer fylles 4,08 g (0,00972 mol) benzyl-N-a-t-butyloksykarbonylvalylleucinat opplost i 50 ml iseddik. Blandingen avkjøles til 5°C og man bobler hydrogenkloridgass gjennom blandingen i 30 minutter. Den inndampes så til tbrrhet i vakuum. ;Det dannede hvite pulver som er benzyl-valyl-leucinhydfoklorid vaskes flere ganger med vannfri eter. Pul-veret suspenderes i 30 ml torr Ct^C^, avkjbles til -30°C og behandles med 1,38 ml (0,010 mol) trietyla.min og rbres i 30 minutter til en opplbsning.

Den dannede trietylaminopplbsning settes til 1,94 g (0,010 mol) dicykloheksylkarbodiimid opplost i 30 ml frisk-destillert torr C^C^. Oppløsningen holdes under nitrogenatmosfære og 3,0 g (0,00972 mol) N-a-t-butyloksykarbonyl-O-benzyltreonin opplost i 30 ml torr ChL-jC^ tilsettes dråpevis. Reaksjonsblandingen holdes på -10°C i 2 dager. Den dannede hvite felling frafiltreres og metylenkloridlaget vaskes fort-løpende med vann, 25% vandig eddiksyre, vandig natriumbikarbonatopplbsning, vann og mettet vandig saltvann. Det organiske sjiktét tbrkes !på; vannfri MgSO^og opplbsningsmidlet fjernes i vakuum. Residuet tas opp i etylacetat, filtreres og konsentreres i vakuum og gir 3,56 g hvitt pulver som er

■benzyl-N-a-t-butyloksykarbonylrO-benzyltreonyl-valylleucinat (60% utbytte, sm.p. 115 - 119°C).

Eksempel 4

Fremstilling av benzyl-O-benzyltreonylvalylleucinat-hydroklorid

Hydrogenkloridgass bobles langsomt i 50 minutter gjennom en kald (5°C) og omrbrt opplbsning ar 4,1 g (6,71 mmol) benzyl-N-oc-t-butyloksykarbonyl-O-benzyl-treonylvalylleucinat i 50 ml iseddik. Opplbsningsmidlet fjernes i vakuum. Residuet vaskes med eter og omkrystalliseres fra etanol/eter til 3,14 g benzyl-O-benzyltreonylvalylleucinat-hydroklorid (86% utbytte med sm.p. 200 - 202,5°C).

Eksempel 5

Fremstilling av treonyl- valyl- leucin

1 g bénzyl-O-benzyltreonylvalylleucinat-hydroklorid nøytraliseres til benzyl-O-benzyltreonyl-valylleucinat. En hydrogenolyseblanding fremstilles inneholdende benzyl-O-benzyltreonylvalylleucinat, 0,5 g 10% palladium på trekull pr.

0,01 mol av forbindelsen som skal hydrogeneres, og absolutt etanol. Til blandingen settes 1,1 molekvivalenter eddiksyre basert på benzylesteren. Blandingen hydrogeneres i 4 timer. Kataly-satoren filtreres fra og opplbsningsmidlene fjernes i vakuum. Inndampningsresten vaskes med vannfri eter og omkrystalliseres fra etanol/eter til 544 mg av det frie peptid, treonylvalylleucin (85%' utbytte).

Eksempel 6

Fremstilling av benzyl- N- q- acetyl- O- benzyltreonylvalylleucinat

Benzyl-O-benzylthreonylvalylleucinat fremstilles fra

1 g benzyl-O-benzyltreonylvalylleucinat-hydroklorid som i eksempel 5 og opploses i eddiksyre, hvorpå 2 ekvivalenter eddiksyreanhydrid, basert på benzylesteren, tilsettes. Blandingen rores over natten. Opplosningsmidlene fjernes i vakuum og inndampningsresten omkrystalliseres fra metanol/eter til 806 mg benzyl-N-a-acetyl-O-benzyltreonylvalylleucinat (85% utbytte).

Eksempel 7

Fremstilling av N- cc- acetyltreonylvalylleucinamid

1 g benzyl-N-oc-acetyl-O-benzyltreonylvalylleucinat opploses i 95% etanol. Ammoniakk bobles gjennom oppløsningen

i 8 timer. Etter omroring ved romtemperatur i 48 timer fjernes opplosningsmidlet i vakuum. Inndampningsresten vaskes med eter til 795 mg (99%) N-a-acetyl-O-benzyltreonylvalylleucinamid. 1 g av dette amid gjennomgår hydrogenolyse i absolutt etanol og gir 705 mg (90% utbytte) N-cc-acetyltreonylvalylleucinamid.

Eksempel 8

Merrifield- syntese av treonyl- valyl- leucin

En opplosningav 5,3 g t-butyloksykarbonyl-L-leucin (21,2 mmol), 2,5 ml trietylamin (18 mmol) i 2-metyltetrahydrofuran som opplosningsmiddel fremstilles og 20 g Merrifield-harpiks, som er polystyren tyerrbundet med 2% divinylbenzen,

og som gir 21,2 mmol klor, tilsettes. Merrifield-harpiksen analyseres og viser et innhold på 1,06 mmol klor pr. gram harpiks, og for bruk vaskes harpiksen med metanol, destillert vann, med etanol,og metylenklorid og torkes derpå i vakuum ved 100°C. For bruk destilleres 2-metyltetrahydrofuran over natriumdispersjon og trietylaminet destilleres over fenylisocyanat og re-destilleres over natriumdispersjon. Blandingen kokes ved til-

bakelbp i omkring 70 timer for å gjennomføre forestring av de blokkerte aminosyrer til harpiksen. Etter forestringsreaksjonen vaskes harpiksen med tetrahydrofuran, etanol, iseddik, etanol, destillert vann, etanol og metylenklorid og tbrkes i vakuum ved 100°C i 3 timer. Ca. 21,5 - 22 g t-butyloksykarbonyl-L-leu-cinharpiksester-fremstilles.

t-butyloksykarbonyl-L-leucinharpiksesteren suspenderes

i 200 ml metylenklorid og rores ved å gjennomboble ren nitrogen, t-butyloksykarbonyl-beskyttelsesgruppen fjernes ved å tilsette 400 ml av en blanding av like deler trifluoreddiksyre og metylenklorid. Harpiksen vaskes og nøytraliseres med 400 ml 10% trietylamin i kloroform. Harpiksen vakses med kloroform og metylenklorid. Ca. 4,82 g t-butyloksykarbonyl-L-valin tilsettes til harpiksen fulgt av en ekvivalent mengde, dvs. ca.

4,57 g dicykliheksylkarbodiimid (24 mmol) og koplingsreaksjonen fortsettes i minst 16 timer. Den dannede t-butyloksykarbonyl-L-valyl-L-leucylharpiksester vaskes med metylenklorid, særlig vannfri etanol, iseddik, etanol og metylenklorid for å fjerne dicykloheksylurea-biproduktet. Avslutning av reaksjonen under-søkes ved Kaisér-fargereaksjon.

Man benytter samme fremgangsmåte som ovenfor for å fjerne t-butyloksykarbonyl (boc)-beskyttelsesgruppen. Til den frispaltede harpiksester settes 5,00 g t-boc-0-benzyl-L-treo-

nin og en ekvivalent mengde (3,6 g) dicykloheksylkarbodiimid (18,4 mmol) og koplingsreaksjonen forloper i 4 timer. Den dannede harpiksester vaskes på samme måten som tidligere og tbrkes over natt ved romtemperatur i vakuum over fosforpentoksyd. Omkring 22 - 23 g t-butyloksykarbonyl-O-benzyl-L-treonyl-L-valyl-L-leucylharpiksester fremstilles.

Avspalting av tripeptidet fra harpiksen skjer ved

å suspendere den tbrkede t-butyloksykarbonyl-O-benzyltrebnyl-valylleucinharpiksester i 100 ml 100% trifluoreddiksyre som vannfri hydrogenbromid bobles gjennom. Under denne prosess blir harpiksesterbindingen og samtidig O-benzyl-beskyttelsesgruppen på treoninet avspaltet og gir de oppløselige hydrobro-mid- og trifluoracetat-salter av treonylvalyleucin i trifluoreddiksyre.

Trifluoreddiksyreopplbsningen blir inndampet til tørr-het harpiksen opplost i 100 ml av et likt volum metanol-destil lert vann. Blandingen inndampes til tbrrhet under redusert trykk og inndampningsresten opploses i 100 ml etanol som igjen inndampes under nedsatt trykk. Det torre materiale opploses i 10 - 20 ml i så lite som mulig 30% iseddik og filtreres. Fast natriumkarbonat eller natriumbikarbonat tilsettes langsomt til felling fremtrer. Det ferdige tripeptidproduktet omkrystalliseres fra etanol/vann ved å opplbse produktet i et stort overskudd av destillert vann, konsentrere opplbsningen ved å av-destillere en del av vannet og foreta krystalldannelse i kjole-skap ved ca. 5°C. Man får ca. 657 mg L-treonyl-L-valyl-L-

leucin (75% utbytte) med sm.p.-område 240 - 242°C(dekomp.).

Eksempel 9

Fremstilling av L- treonyl- L- valy- D- leucin

Man gjentar fremgangsmåten fra eksempel 8, bortsett fra at det brukes D-leucin istedenfor L-leucin og det fremstilles L-treonyl-L-valyl-D-leucin. Produktet er en hvit krystallinsk blanding som finnes å ha- et dekomponeringspunkt på

ca. 240°C under forkullirig.

Eksempel 10

Fremstilling av N- q- acetyl- treonylvalylleucin

t-butyloksykarbonyl-O-benzyltreonylvalylleucin-•harpiksester fremstilles på samme måten som beskrevet i eksempel 8. t-butyloksykarbonyl-beskyttelsesgruppen fjernes på

samme måten som gruppene på leucyl-harpiksesteren og valyl-leucyl-harpiksesteren fjernes i eksempel 8 under dannelse av O-benzyltreonylvalylleucin-harpiksester. Ca. 5,0 g tbrket 0-benzyltreonylvalylleucinharpiksester acyleres ved forst å vaske harpiksesteren med dimetylformamid og derpå omsette harpiksen med acetyleringsreagens som består av 100 ml 44 volumdeler dimetylformamid, 5 volumdeler eddisyreanhydrid og 1 volumdel trietylamin i 20 - 50 minutter og harpiksen vaskes med dimetylformamid, og med metylenklorid, hvoretter den tbrkes i vakuum ved romtemperatur over natten.

N-acetyl-peptidet spaltes av fra harpiksen som beskrevet i eksempel 8. Trifluoreddiksyreopplosningen inndampes til tbrrhet under nedsatt trykk. Residuet vaskes med like deler metanol og vann, inndampes til tbrrhet under nedsatt trykk, vaskes med etanol og opparbeides ved igjen å inndampe. til tbrrhet under nedsatt trykk. Sluttproduktet krystalliseres fra etanol/eter og gir 400 mg N-a-acetyl-treonylvalylleucin (55% utbytte) med smeltepunkt 210 - 214° C (dekomp.).

Eksempel 11

Merrifield-syntese av hydrokloridsaltet av glycyltreonylvalyl-leucin •Ut fra 10 g O-benzyltreonylvalylleucin-harpiksester fremstilt som beskrevet i eksempel 10 ble koplingen av t-butyloksykarbonyl-glycin foretatt ved å suspendere harpiksesteren i 100 ml metylenklorid, tilsette 1,94 g t-butyloksykarbonyl-glycin (10 mmol), fulgt av en ekvimolar mengde, dvs. 2,06 g, dicykloheksylkarbodiimid (10 mmol) og la kondensasjonen fortsette i 4 timer. t-butyloksykarbonyl-glycyl-O-benzyl-treonylvalylleucin-harpiksesteren spaltes av fra harpiksen som beskrevet i eksempel 8 ovenfor. Etter egnet vask i metanol, destillert vann, etanol og tilsetning av natriumkarbonat for å holde pH på 4,5 inndampes produktet til tbrrhet under nedsatt trykk.

Glycyltreonylvalylleucinet overfores til hydrokloridsaltet ved opplbsning i 100 ml av en blanding av 3 volumdeler etanol og 1 volumdel eter og gjennombobling av vannfri hydrogenkloridgass gjennom opplbsningen i omtrent 10 minutter. Produktet filtreres og tbrkes over natt ved romtemperatur i vakuum-.tbrker og gir 600 mg hydrokloridsalt av glycyltreonylvalylleu-cin (60% utbytte) med smeltepunkt 225 - 226°C (dekomp.).

Eksempel 12

Merrifield- syntese av N- ct- acetyl- tyrosyl- treonylvalylleucin

O-benzyl-treonylvalylleucin-harpiksester (fremstilt som i eksempel 10) i en mengde på 7,4 g settes til en reak-sjonsbeholder og suspenderes i 75 ml metylenklorid. Til opplbsningen settes 3,735 g t-butyloksykarbonyl-O-benzyltyrosin (10 mmol) fulgt av en ekvivalent mengde dicykloheksylkarbodiimid (2,06 g = 10 mmol) og koplingsreaksjonen forlbper i 4 timer. Man omrbrer ved å boble ren nitrogen gjennom suspen-sjonen* Harpiksen vaskes med metylenklorid, etanol, eddiksyre, etanol og metylenklorid igjen for å fjerne dicykloheksylurea-biproduktet, og tbrkes over natt ved romtemperatur i vakuum over fosforpentoksyd. Det torr produktet O-benzyltyrosyl-0-benzyltreonylvalylleucin-harpiksester oker typisk i vekt til 7,50 - 7,55 g.

N-acetyleringen foretas på vesentlig samme måte som

i eksempel 10 for syntese av N-oc-acetyl-treonylvalylleucinet bortsett fra at det brukes 7,5 ml eddiksyreanhydrid, 2,5 ml trietylamin og 50 ml dimetylformamid. Etter N-acetyleringen vaskes harpiksen med dimetylformamid, derpå metylenklorid og tbrkes i vakuum ved romtemperatur over natt.

'Avspalting av peptidet fra Merrifield-harpiksen skjer på samme måten som beskrevet i eksempel 8, bortsett fra at man for å unngå eventuelt elektrofil aromatisk substitusjon på tyrosinringen med brom forst bobler hydrogenbromid gjennom en resorcinol-trifluoreddiksyreblanding i et forhold på 2 g resorcinol pr. 100 ml trifluoreddiksyre for å fjerne spor av Br Som en ytterligere forholdsregel mot elektrofil substitusjon tilsettes 20 ml anisol direkte til spaltingsbeholderen. Sluttproduktet, N-a-acetyl-tyrosyltreonylvalylleucin omkrystalliseres fra etanol-eter og gir 900 mg tetrapeptid (5)% utbytte)

med smeltepunktområde.234,5 - 235°C (dekomp.). Aminosyreanalyse av produktet gir 0,93 tyrosin, 1,00 treonin, 1,00 valih og 1,00 leucin.

Eksempel 13

Merrifield- syntese av treonylvalylisoleucin

En opplbsning av 5,3 g t-butyloksykarbonyl-L-isoleucin (21,2 mmol), 2,5 ml trietylamin (18 mmol) i 2-metyltetrahydrofuran som opplbsningsmiddel fremstilles og 20 g Merrifield-harpiks tilsettes. Fbr bruk vaskes harpiksen med metanol, destillert vann, etanol og metylenklorid og tbrkes i vakuum ved 100°C. For bruk destilleres 2-metyltetrahydrofuran over en natriumdispersjon og trietylaminet destilleres over fenylisocyanat og omdestilleres over natriumdispersjon. Blandingen kokes ved tilbakelbp i omkring 72 timer for å fjen-nomfbres forestring av de blokkerte aminosyrer til harpiksen. Etter forestringsreaksjonen vaskes harpiksen med tetrahydrofuran, etanol, iseddik, etanol, destillert vann, etanol og metylenklorid og tbrkes i vakuum ved 100°C i 3 timer. Ca. 21,5

- 22 g t-butyloksykarbonyl-L-isoleucin-harpiksester er utbyttet. Denne kopling av t-butyloksykarbonylvalin til t-butyloksy-karbonylisoleucin-harpiksester skjer på samme måten som koplingen av t-butyloksykarbonyl-L-valin til t-butyloksykarbonyl-L-leucin-harpiksesteren som beskrevet i eksempel 8. På grunn

av den ennå stbrre steriske hindring lar man imidlertid reak-

sjonen forlope i 24 timer. Harpiksen blir derpå vasket som van-lig for å fjerne biprodukter og man undersbker om reaksjonen er fullfort med Kaiser fargereaksjon. Addisjonsreaksjonen til t-butyloksykarbonyl-treonin for fremstilling av t-butyloksykarbonyl-treo nylvalylisoleucin-harpiksester, spalting av peptidet fra harpiksen under dannelse av t-butyloksykarbonyl-treonylvalylisoleucin og den følgende isolasjon og rensing skjer som beskrevet for fremstilling av treonylvalylleucin i eksempel 8. Man får tripeptidet, treonylvalylisoleucin i en mengde på ca. 600 mg (68% utbytte).

Eksempel 14

Merrifield- syntese av treonylvalyleucinylarginin

Man folger samme fremgangsmåten som"i eksempel 8 bortsett fra at det brukes 6,78 g t-butyloksykarbonyl-nitro-(guanidinyl)-L-arginin (21,2 mmol) som aminosyre forestret til 20 g Merrifield-harpiks. Forestringsreaksjonen utfores ved å koke blandingen ved tilbakelop i ca. 72 timer og harpiksesteren vaskes og tørkes som i eksempel 8 til ca. 22 eller 23 g t-butyloksykarbonyl-nitroarginin-harpiksester. Ca. 5 g ,t-butyloksykarbonyl-L-leucin (24 mmol) koples til nitroarginin-harpiksesteren ved tilsetning av en ekvivalent mengde dicykloheksylkarbodiimid (4,6 g = 24 mmol), og man lar reaksjonen forlope i 16 timer. Etter vasking av harpiksesteren gjennomføres koplingen av t-butyloksykarbonyl-L-valin og t-butyloksykarbonyl-O-benzyl-L-treonin til harpiksesteren på samme måten som beskrevet i eksempel 8. Man får omtrent 24 g t-butyloksykarbonyl-O-benzoyl-L-treonyl-L-valyl-L-leucyl-arginin-harpiksester.

På grunn av nitrogruppens stabilitet overfor hydrogenbromid spaltes den beskyttede peptidharpiksester med vannfri hydrogenfluorid for også å fjerne nitrogruppen. Etter passering gjennom en egnet ionevekslerharpiks konsentreres elueringsmidlet til en olje og utfelles isoelektrisk ved tilsetning av fast natriumkarbonat. Produktet L-treonyl-L-valyl-L-leucyl-L-arginin omkrystalliseres fra etanol-vann og gir ca. 900 mg av tetrapeptidet.

Peptider med karakteristisk T-V-L-sekvens kan også fremstilles i fast fase ved omsetning med klormetylert harpiks som er en polystyren tverrbundet med divinylbenzenharpiks og forhandles av Bio Rad Laboratories, Richmond, California, U.S.A., under merket "Bio Beads SX-1". For tilsetning av peptidrester blir f.eks. en t-butyloksykarbonylleucin-harpiksester suspen-dert i dioksan og beskyttelsesgruppene frigjort med 4N saltsyre. Det dannede hydroklorid nøytraliseres med trietylamin og vaskes. Koplingen av ytterligere aminosyrerester kan gjen-nomføres ved å bruke at koplingsmiddel som dicykloheksylkarbodiimid. 'Denne fremgangsmåten har ikke vist seg å være så billig som andre syntesemetoder som f.eks. Merrifield-syntesén. Eksempel 15 Treonylvalyleucin- metylester

,Rå treonylvalyleucin (0,066 g = 0,2 mmol) fylles på

en 5 ml reaksjonsampulle og tbrkes ved 100°C i vakuum over natt over fosforanhydrid. Det torre tripeptid opploses i 0,54 ml vannfri metanol. En på forhånd fremstilt blanding av dimetok-sypropan og ren hydrogenklorid i vektforhold 542:83 tilsettes i en mengde på 0,63 ml til reaksjonsblandingen. Reaksjonsam-pullen lukkes. Blandingen rystes grundig og hensettes over

natt for dannelse av treonylvalylleucin-metylesteren. Opplbs-ningsmidlehe avdampes under nitrogen og tbrkes i vakuum ved 100°C over forsforsyreanhydrid over natt.

Eksempel 16

N- O- diacetyl- treonylvalylleucin- metylester

Produktet fra eksempel 15 opploses i 0,38 ml pyridin. Eddiksyreanhydrid i en mengde på 0,1 ml (2 mmol) tilsettes som acyleringsmiddel og reaksjonsblandingen holdes ved 37°C i 20 minutter i lukket ampulle. Opplbsningsmidlet avdampes under nitrogen og det acylerte produktet tbrkes i vakuum ved 100°C

over fosforsyreanhydrid over natten.

Den acylerte tripeptidester N-O-diacetyl-treonylvalylleucin-metylester kan renses ved å opplbse råproduktet i metanol og fore prbven gjennom én hbytrykks-væskekromato-

graf. En modul-væskekromatograf av typen Waters utstyrt med en prepareringskolonne 3 m hby og 9 mm i diameter fylt med "Phenylporasil-B" benyttes med metanol som elueringsmiddel.

Man måler brytningsindeks og UV-absorbsjon ved 225 nm for eluatet og metanolens strbmningshastighet er 1 ml pr. minutt.

En absorberende fraksjon som utgjor omkring 100 ml eluatvolum oppsamles. Fraksjonens opplbsningsmiddel avdampes under en strbm av torr nitrogen og tbrkes i vakuum ved 100°C over fosfor-

syreanhydrid, over natten.

Det folgende eksempel illustrerer isolasjon og fremstilling av tripeptid-treonylvalylleucin fra dyr.

Eksempel 17

Ekstraksjon og isolasjon av treonylvalylleucin-holdig polypeptid fra kvegh. jerne

Hypotalamus fra flere kveghjerner dissekeres ut og homogeniseres i bufferopplbsning, idet folgende betegnet "tris-citratbuffer", som er fremstilt slik:

Tris- citratbuffer

0,498 molar vandig opplbsning av tris-citratbuffer fremstilles slik: Til 1 liter destillert vann tilsettes 9,58 g sitronsyre og 49,9 g tris(hydroksymetyl)-aminometan. pH for den dannede opplbsning innstilles på 8,65 ved tilsetning av 0,1 molar vandig natriumhydroksyd. Homogenisering av hypotalamus utfores i fire volumdeler (ml) tris-citratbuffer pr. vektdel (g) hypotalamus. Den homogeniserte blanding sentrifugeres ved 15.000 omdreininger pr. minutt i 20 minutter ved 4°C og den overflytende væske som inneholder ekstrahert anti-S-proteinfaktor og en rekke forurensninger oppsamles. 4 kg stivelseshydrolysat vaskes én gang med destillert vann og to ganger med tris-citratbufferen. Den fuktige stivelsen formes til en blokk som måler 123 x 60 cm x hbyden 5 cm.

De to ender av blokken holdes på plass med filtrerpapir for

at overskudd av buffer skal kunne renne ut. Etter en slik drenering har blokken en tykkelse på bare 1,5 cm.

Langs bredden av stivelsesblokken, i en avstand

43,5 cm fra dens ene ende, graver man ut en 2,5 cm bred renne i blokken. Blokkens temperatur innstilles på 4°C. Væsken fra den ovennevnte sentrifugering (ca. 35 - 40 ml) som inneholder anti-S-proteinfaktoren blandes med 10 dråper brom-fenolblått. Oppløsningen blandes med den utgravde stivelsen og denne blanding helles opp i den 2,5 cm brede rennen i blokken.

Blokken utsettes så for en elektroforetisk strbm på 750 volt og 50 milliampere, idet katoden forbindes med den enden av blokken som ligger 43,5 cm fra rennen, og anoden med den andre enden. Man forer strbmmen kontinuerlig gjennom blokken til den blå linjen over. blokkens bredde (som skyldes brom- fenolblått) beveger seg mot anoden en avstand lik 42 cm. Dette tar ca. 18 timer. I lbpet av dette tidsrom beveger en lyse-rbd linje seg (som kommer fra hemoglobinet i ekstraktet fra hypotalamus) mot katoden en avstand på 5 cm fra rennen.

Området mellom de blå og rode linjer etter elektro-foresen déles i 10 striper hvor hver stripe går over hele blokkens bredde og selv er ca. 5 cm brede. Hver strimmel blir separat og fullstendig gravet ut fra blokken og oppslemmet i 12 ml tris-citratbuffer i ca. 10 minutter. Oppslemmingen vakuum-filtreres gjennom en Buchner-trakt. De 10 fraksjoner gjennomgår en tropt.ofan-opptaksprove beskrevet i Biological Psychiatry, bind 7, nr. 1, side 53 (1973), som indikasjon på mengden anti-S-proteinfaktor. To eller tre av de aktive fraksjoner behol-des. Idet man nummererer båndene på stivelsesblokken fra 1 - 10 og starter med den blå linjen, finner man de fraksjoner som inneholder storste anti-S-protein-aktivitet vanligvis i bånd eller striper nr. 2, 9 og 10.

Ovenstående fremgangsmåte gjentas tilstrekkelig mange ganger til at man har 20 fraksjoner med relativt hby anti-S-proteinfaktor-aktivitet. Disse 20 fraksjoner slås sammen og avdampes gjennom dialyseror for reduksjon av volumet fra opp-rinnelig 100 - 160 ml til ca..40 - 60 ml.

Deretter prepareres en fylt kolonne for kromatografer-, ing av den konsentrerte opplbsning av rå anti-S-proteinfaktor som folger: DEAE- cellulosekolonne

800 g "Selectacel" som er en DEAS-type av cellulose (dietylaminoetylcellulose forhandlet av Brown Company i Berlin, New Hampshire, U.S.A.) vakses to ganger med 20 1 porsjoner 0,19N vandig natriumhydroksyd. Deretter vaskes fyllingsmaterialet med 20 1 porsjoner 0,19N saltsyre. Derpå vaskes materialet med 0,005 molar fosfatbuffer til skyllebufferen er kloridfri (vanligvis 25 ganger). Fyllmaterialet fylles derpå på en 110

cm hby glasskolonne med innerdiameter 2,5 cm.

Den konsentrerte rå opplbsning av anti-S proteinfaktor fylles på DEAE-kolonnen og den elueres deretter med et 2-kolbe-gradientsystem hvor kolbe A inneholder 1.000 ml 0,005 molar vandig kationfosfat-pufferopplbsning (pH 7,4) og kolben B inneholder 1.000 ml 0,04 M vandig kationfosfatpufferopplbs- ning (pH 4,3) som er tilsatt natriumklorid i et forhold på 405,5 g natriumklorid pr. 50 liter bufferopplosning. Eluatet oppsamles i 15 ml fraksjoner og man får ca. 120 fraksjoner ialt som nummereres. Hver fraksjon gjennomgår prove for bestemmel-se av anti-S-proteinfaktorens aktivitet ved trypt.ofan-opptaksmetoden, og de 10 fraksjoner med den største anti-S-faktor-aktivitet slås 'sammen og konsentreres ved frysetørking til ca. 10% av det opprinnelige volum.

Man gjentar denne fremgangsmåte tilstrekkelig mange ganger til at man har nok konsentrat inneholdende anti-S-pro-teinf aktor til å gi et samlet proteininnhold på ca. 200 mg i henhold til Lowry-metoden. Dette krever ca. 300 - 400 ml konsentrat som igjen krever ca. 400 - 1.000 g kveghypotalamus som igjen rna dissekeres fra omkring 160 kveghoder.

Konsentratet som inneholder omkring 200 mg protein dialyseres mot destillert vann i 24 timer. For hvert 17 ml konsentrat tilsettes 4,25 ml 0,1 molar trypsin og 2,1 ml 1 molar CaC^. Hele blandingens pH innstilles på 7,8 med 1 molar NaOH og inkuberes i 2 timer på vannbadryster ved 37°C Etter inkubering filtreres opplbsningen gjennom en "Diaflo<u>membran med molvekt 10.000 ("Amicon UM-10"). Etter filtrering tilsettes 4,25 ml 0,1 molar pepsinopplosningen pr. 17 ml filtrat-blanding. pH innstilles på 1,5 med 1 molar HC1 og blandingen inkuberes igjen i 2 timer ved 37°C. Etter inkubering heves pH til 7,8 med 1 molar NaOH og oppløsningen filtreres gjennom en Diaflo-membran ("Amicon UM-2"), med molvekt 1.000.

Filtratet flashavdampes for reduksjon av volumet til omkring 50 ml. Blandingen sentrifugeres og den overflytende væske oppsamles. Væskens pH innstilles på under 2,2 ved å tilsette konsentrert saltsyre. Den surnede væsken fortynnes med destillert vann til 75 ml. Oppløsningen som inneholder anti-S-proteinfaktor kolonnekromatograferes på folgende kolonne: Forste sulfonerte harpikskolonne

Fyllmaterialet er "Aminex 50-WX2" fra Bio Rad Company som er en hydrogenioneform av en "Dowex" kationeveksler-harpiks med partikkelstbrrelse 200 - 325 mesh. Harpiksen er en sulfonert polystyren med 2% nominell tverrbinding med divinylbenzen. Fyllmaterialet vaskes i Buchner-trakt med 0,1N saltsyre til vaskevæsken er fargeløs. Derpå vaskes materialet med destil lert vann til væsken har pH lik 5, hvorpå materialet vaskes med omkring 3 volumdeler 2,ON- vandig natriumhydroksyd. Fyllmaterialet vaskes igjen med destillert vann til væsken har pH lik 5. Deretter overfores det til begerglass og oppslemmes i 2 volumdeler IN vandig natriumhydroksyd ved 35°C i 2 - 3 timer. Derpå går'oppslemmingen gjennom en Buchner-trakt og filter-kaken vaskés med destillert vann til væsken har pH lik 5. Fyllmaterialet oppslemmes i 2 volumdeler 0,2 molar vandig opplbsning av natriumcitrat (pH 3>l) og oppslemmingen helles opp i en glasskolonne 150 cm hby og 2 cm i innerdiameter.

Den sure, vandige opplbsning av rå anti-S-proteinfaktor fylles på Aminex-kolonnen som derpå elueres med et 2-kolbe-elueringssystem hvor kolbe A inneholder 2.000 ml 0,2M vandig natriumcitratopplbsning (pH 3,1) og kolbe B inneholder 2.000 ml acetatcitratbuffer [pH 9,1) fremstilt ut fra 315 g sitronsyre og 402 g natriumacetat i 4 liter ionefritt vann. Kolonnen holdes under et trykk på 0,7 atm nitrogen. Eluatet oppsamles i 10 ml fraksjoner, som gir 120 fraksjoner ialt. Fraksjonene nummereres i levert rekkefolge fra kolonnen. Fraksjonene undersbkes ved tryptofan-opptaksmetoden for å finne anti-S-proteinfaktorens aktivitet. Det oppsettes en

kurve over antall fraksjoner langs x-aksen og fraksjonenes aktivitet langs y-aksen. Man finner minst én aktivitetstopp på den dannede kurven,.vanligvis i området mellom tyvende og tredevte fraksjon og ofte ser man andre topper, f.eks. én i

40-talls-fraksjonene, én i 70-talls-fraksjoner og én i 90-talls-fraksjoner og én topp i området mellom 110 og 120-talls-fraksjonene. De fraksjoner som danner hver topp, f.eks. 2 eller 3

fraksjoner i 20-talls-fraksjonene, slås sammen for viderebe-handling. Hver slik gruppe av fraksjonssekvenser behandles i det folgende separat som angitt nedenfor.

Fordelingskrornatografi

. Metode A

Gruppen av fraksjoner med hby anti-S-proteinfaktor-aktivitet flashavdampes på rotasjonsfordamper til ca. 5-10 ml volum. Konsentratet gjennomgår teppe-elektroforese med apparatur Beckman Spinco modell CP. 20 liter elektrolyttopp-lbsning lages ut fra 22,4 ml 0,5M vandig KH2PO^-opplbsning med 259,2 ml 0,5M vandig opplbsning av Na2HP0^og fortynning av blandingen til 20 1 med destillert vann og innstilling av blandingens pH til 8,0 med fosforsyre eller natriumhydroksyd etter behov. 50 milliampere 950 volt likestrom benyttes. Bare ca. 5 1 elektrolyttopplosning brukes til hvert forsbk. Den elektroforetisk fraksjonerte opplbsning av anti-S-proteinfaktor pluss forurensninger oppsamles fra elektroforeseapparaturen i 32 fraksjorier som hver har et volum, på ca. 15. ml. Hver av disse fraksjoner gjennomgår prove for anti-S-proteinfaktor-aktivitet ved tryptofan-opptaksmetoden. Fraksjonene med storst aktivitet holdes tilbake og slås sammen. Dette er ofte åttende til tolvte fraksjon som tas fra apparatet.

Den fraksjonsgruppe som har de mest aktive fraksjoner flashavdampes i en rotasjonsfordamper til et volum på ca.

1 - 5 ml. Den konsentrerte opplbsning som nå inneholder så

lite som ca. 5 mg polypeptidmateriale separeres i kolonner av molekylsikter fremstilt slik:

Molekylsiktkolonner

2 glasskolonner anordnes i serie hvor hver kolonne er 200 cm hby og 0,81 cm i innerdiameter. Begge kolonner fylles med "Sephadex G-15 fine" som er et molekylsiktmateri-ale levert av Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey,

U.S.A. Fyllmaterialet er partikkelformet dekstran med par-tikkelstbrrelsesområde 40 - 120 mikron.

Oppløsningen som inneholder anti-S-proteinfaktor fores gjennom de to "Sefadex"-kolonner med 0,02M eddiksyre som elueringsmiddel. Eluatet oppsamles i 2 ml fraksjoner som nummereres fra 1 - 120 ialt. Disse fraksjonene gjennomgår alle tryptofan-opptaksmetoden for å finne anti-S -proteinfaktor-aktivitet og undersbkes for totalt polypeptidinnhold ved UV-absorbsjon i bølgelengde 220 nanometer. Tilstrekkelig av de

mest aktive fraksjoner (med hensyn på aktivitet av anti-S-proteinfaktor) slås sammen og gir et samlet polypeptidinnhold i området ca. 60 mikrogram til 1,5 milligram. Oppløsningen flashinndampes på rotasjoninndamper for reduksjon av volumet til 1 - 3 ml.

Den konsentrerte opplbsning av anti-S-proteinfaktor pluss forurensninger renses ved ioneveksler-kromatografi på folgende kolonne:

Sulfonert harpikskolonne nr. 2

Glasskolonnen er 200 cm hby har innerdiameter 0,81 cm. Fyllmaterialet er "Aminex 50-WX2" som er en kationeveksler-harpiks beskrevet tidligere. Fyllmaterialet fylles på kolonnen og innstilles i likevekt med 0,2N natriumcitratbuffer (pH 3,0) og systemet oppvarmes til 35°C.

Oppløsningen som skal kromatograferes fylles på kolonnen som elueres med et 2-kolbers elueringssystem hvor kolbe A inneholder 1 liter 0,2N natriumcitratbufferopplbsning (pH 3,0) og kolbe B inneholder 250 ml bufferopplbsning prepa-rert slik: 14,6 g sitronsyre, 20,6 g natriumacetat, 3,1 ml iseddik og 800 ml destillert vann opploses, opplbsningens pH innstilles på 4,0 ved å tilsette konsentrert saltsyre og opplbsningens volum innstilles på 1 liter ved tilsetning av destillert vann.

Eluatet fra kolonnen oppsamles i 5 ml fraksjoner i

en hastighet på ca. 4-5 fraksjoner pr. time. Omkring 130 - 150 slike fraksjoner oppsamles ialt. Hver fraksjon proves for anti-S-protéinfaktorens aktivitet ved tryptofanopptaks-metoden. Den eller de fraksjoner som har hbyeste aktivitet utgjor opplbsninger av relativt ren anti-S-proteinfaktor, dvs. •materiale som er fritt for de fleste andre peptider, celle-rester etc. som var forbundet med faktoren når den ble ekstrahert fra kveghypotalamus i tris-citratbufferen. De fraksjoner som har hbyeste konsentrasjon av anti-S-proteinfaktor finnes ofte i fraksjonsnummere 80 - 86. Aminoanalyse av disse fraksjoner viser, at faktoren er et polypeptid som inneholder en kombinasjon av noen av folgende aminosyrer: glytaminsyre, treonin, valin, leucin, fenylalanin, tyrosin,asparaginsyre, serin og glycin. Statistisk bedbmmelse av tallene fra amino-syreanalysen sammenholdt med enzymstudier tyder på at anti-S-proteinfaktoren inneholder tripeptidet L-treonyl-L-valyl-L-leucin.

Metode B

Alternativt blir hver fraksjonsgruppe fra ovennevnte fraksjonering og tryptofan-opptaksprbve behandlet separat og renset ved omvendt fasefordelingskromatografi. Omvendt fasefordelingskromatografi gjennomfbres i en Waters Associates modell 660 Solvent Programmer og en Waters Associates modell 6000 Solvent Delivery System i forbindelse med en kolonne med lengde 1,8 eller 3 m x9 mm diameter fylt med "Phenyl Porasil B" fra Waters Associates. Kolonnen anbringes i et hus med konstant temperatur, laget av isoporblokker som omgir et bad med konstant temperatur av typen "Haake FE". Provene fylles på ko- ' lonnen gjénnom én Waters Associates modell" U6K Universal In-jector"(l mikroliter til 10 ml) og eluatet fra kolonnen oppsamles i en "Fraktion Collector 1205" fra Scientific Manufac-turlng Industries. Eluatet fra kolonnen folges med et ultra-fiolett spektrofotometer Beckman modell 25 utstyrt med mikro-celleenhet "LC-25" fra Waters Associates og differensial-refrak-trometer "R-401 fra Waters Associates.

For hver fraksjonsgruppe fra den sulfonerte harpikskolonne torres fraksjonen og opploses i 5 - 10 ml opplbsningsmiddel og innsprbytes på kolonnen. Elueringen folges med hensyn på brytningsindeks og absorbsjon ved 225 nanometer. Etter-hvert som aktivitetstopper elueres, stanses strbmmen fra kolonnen og prbven gjennomsbkes' for UV-absorbsjon fra 350 - 210 nanometer. Fraksjoner på hver 5 ml oppsamles og homogene topper slås sammen. Fraksjonen eller flere fraksjoner inndampes til tbrrhet og gjennomgår aminosyreanalyse for å finne trypto-pan-opptak og de topper som har inhiberingsvirkning.

Fraksjoner som inneholder L-treonyl-L-valyl-L-leucin kan N-acyleres og/eller forestres som beskrevet i eksempel 10, 15 eller 16.

Som angitt ovenfor har forskning angående schizofreni fort til isolasjon av a-5-globulin (alfa-helix-S-protein) fra plasma hos schizofrenipasienter, og som har andre aktiviteter enn lignende a-2-globulin (tilfeldig orientert S-protein) fra plasma hos normale personer. Se Frohman et al. Recent Advances in Biological Psychiatry nevnt tidligere. Alfa-helix-S-protein isolert fra schizofrenipasienter gir observerbare psykologiske reaksjoner når de f.eks. gis rotter. Caldwell og medarbeidere i ovennevnte Biological Psychiatry angir at administrasjon av alfa-helix-S-protein til rotter reduseres selvstimulering for gledereaksjoner hos rotter. Ved hjelp av fremgangsmåten opp-rettet av Caldwell og medarbeidere har man undersbkt forskjellige peptider i henhold til oppfinnelsen for å finne deres evne til å reversere eller undertrykke virkningen av alfa-helix-S- protein. På denne måten illustreres aktiviteten av bestand-deler i henhold til oppfinnelsen for dempning av schizofreni-symptomer hos mennesker. Man har også funnet.at peptider som motvirker aktiviteten hos alfa-helix-S-protein viser inhibering overfor tryptofan-opptak og, som nevnt i eksempel 17, kan tryptofan-opptaks-analyse brukes som hjelp ved isolering av peptidfraksjoner som er aktive mot alfa-helix-S-protein.

Eksempel 18

Fremgangsmåten for intrakraniell selvstimulering hos rotter beskrives på side 237 - 239 i Caldwell og medarbeidere: Biological Psychiatry, referert tidligere (som man herved viser til i sin helhet), og denne fremgangsmåten gjentas bortsett fra nedenstående forhold. Rottene har stimuleringselektroder plan-tert i midtre forhjernebunt og gjennomgår forsbk for å finne antall ganger man kan vente at stangen presses ned av et dyr innenfor et gitt tidsrom. Alfa-helix-S-protein administreres intercisternalt og man kan da iaktta at antall ganger stangen presses ned faller til ca. 77% av det opprinnelige antall. Forskjellige polypeptider gis intramuskulært til rotte i en mengde på 0,2 mg/kg kroppsvekt for å finne om polypeptidene motvirker effekten av alfa-helix-S-protein. Tryptofan-opptak gjennom-føres også for de aktuelle polypeptider. Inhiberingen av tryp-tof anopptaket bestemmes etter 10 minutter. Resultatene av for-sbkene fremgår av tabellen:

De folgende polypeptider gjennomgår forsbk for å finne inhibering av tryptofanopptaket. Inhiberingen av tryptofan-opptaket bestemmes etter 10 minutter.

De folgende polypeptider proves for inhibering av tryptofanopptaket etter 10, 15 og 30 minutter.

De nevnta data illustrerer bruk av aminosyregrupper

med D-konfigurasjon for inhibering av tryptofan-opptak. Som vist for D-alanyl-L-treonyl-L-valyl-L-leucin, kan inhibering av tryptofan-opptaket bli redusert etter en viss inhiberings-

tid. Når imidlertid det essensielle polypeptid med T-V-L-sekvensen hadde en lucin-rest med D-konfigurasjon, viste peptidet bket aktivetstid.

De folgende polypeptider gjennomgår forsbk for sam-menligningsformål. Inhiberingen av tryptofon-opptaket be-

stemmes etter 10 minutter.

Som det fremgår av de ovenstående tall etter prov-

ing av L-treonyl-L-valyl-L-leucyl-D-alanin, vil nærvær av substituenter som er relativt vanskelige å hydrolysere fra karboksylsyrefunksjonen på aminosyren på (L)-resten i den essensielle T-V-L-sekvens gjore at peptidet ikke får vesent-

lig aktivitet på tryptofan-opptaket.

På vesentlig samme måte som beskrevet ovenfor prover man N-acetyl-tyrosyltreonylvalylleucin, propyltreonylvalyl-leucylprolylglycin for å finne disse forbindelseres virkning på rotter som er gitt alfa-helix-S-protein. Man finner at begge disse polypeptidholdige forbindelser gjenoppretter stang-nedpressende aktivitet hos rotter. Andre polypeptider som demper eller undertrykker symptomer av schizofreni er treonyl-valylleucylarginin.

Claims (14)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid, karakterisert ved at omsetter aminosyrerester med struktur:

i sekvens ved omsetning av aminfunksjonen på den ene aminosyrerest og karboksylsyregruppen på en annen aminosyrerest hvorunder grupper på aminosyrerestene som gir uonskede sidereaksjoner beskyttes, for fremstilling av en polypeptidforbind-else med formel

hvor A betegner en oc-monoiminoacylgruppe med 2-10 C-atomer, B er en hydrolyserbar a-monoiminoacylgruppe med 2 - 10 C- atomer, d er -H,

eller en a-aminobeskyttende gruppe hvor P betegner alkylen med 1-20 C-atomer og p er lik 0 eller 1, E er lik R1"*, en endeplasert karboksylsyrebeskyttende gruppe, et metallhydroksydkompleks eller et syreaddisjonssalt, hvor betegner 0Re eller -NRCR^, hvor Re er hydrogen eller alkyl med 1-20 C-atomer, eller aryl eller aralkyl med 6-24 cd C-atomer, og R og R er like eller forskjellige og betegner hydrogen eller lavere alkyl eller betegner alkylen eller til-sammen danner en cyklisk struktur som omfatter det nitrogenatom de er bundet til; R er lik H, alkyl med 1-20 C-atomer, acyl med 1-20 C-atomer, tetrahydropyranyl eller énverdig metall, t er lik 0 - 5, x er lik 0-5, og slik at summen av t og x er 0 - 5, samt deres farmasoytiske salter.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakter i- sert ved at den fremstilte forbindelse har formelen

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at i den fremstilte forbindelse 0 er -NHCHC-gruppen treonyl og B har L-konfigurasjon hvis den I CHOH CH, 3 ér optisk aktiv.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, 2 eller 3, karakterisert ved at i den fremstilte forbindelse

gruppen leucyl.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, 2, 3 eller 4, karakterisert ved at i den fremstilte forbindelse betegner A og B like eller forskjellige peptidrester valgt blant prolyl, treonyl, allotreonyl, leucyl, isoleucyl, glycyl, seryl, arginyl, fenylalanyl, glutamyl, asparagyl og alanyl.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-5, karakterisert ved at i forbindelsen betegner 0 ii HR <a> C acetyl.

7. Fremgangsmåte som angitt i kravene 1-6, karakterisert ved at i peptidet betegner R metoksy.

8. Fremgangsmåte som angitt i kravene 1-6, karak terisert ved at i peptidet betegner R -NPL,.

9. Fremgangsmåte som angitt i kravene 1-6, karakterisert ved at i peptidet betegner R -0H.

10. Fremgangsmåte som angitt i kravene 1-9, karakterisert ved at i peptidforbindelsen betegner

gruppen D-leucyl.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at forbindelsen er L-treonyl-L-valyl-D-leucin.

12. Fremgangsmåte som angitt i kravene 1 eller 2, karakterisert ved at forbindelsen er fenylalanyl-prolyltreonylvalylleucylprolyl-fenylalanin.

13. Fremgangsmåte som angitt i kravene 1 eller 2, karakterisert ved at forbindelsen er N-acetyl-treo-nylvalylleucinamid.

14. Fremgangsmåte som angitt i kravene 1- 9, karakterisert ved at i peptidet er

resten L-treonyl-L-valyl-L-leucin.