NO774311L - Fremgangsmaate ved fremstilling av immunologiske materialer - Google Patents

Abstract

Fremgangsmåte ved fremstilling av immunologiske materialer.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av immunologiske materialer og spesielt vedrører den fremstilling av gamma-globuliner, immunologiske nukleinsyrer og immunologiske dialysater ved innføring og kultivering av cellelinjer in vitro.

En fundamental nødvendighet for at dyr skal overleve er evnen

til å motstå infeksjon forårsaket av parasittiske organismer såsom vira, bakterier, sopp og parasitter som konstant er tilstede i omgivelsene. Dyrenes immunitet mot slike organismer er tilveiebrakt av et antall forskjellige mekanismer innbefattende fagocytter,antilegemenes kjemiske aktivitet, samt produksjonen av interferoner som inhiberer virusformering.

Under de siste to tiår er betydelig forskning utført innen forskjellige immunologiske felter, innbefattende studier av immunologiske reaksjoner som innbefatter fremstilling av det materiale som spesifikt' vil bekjempe spesielle antigener innført i et dyr. Produksjonen av materialet som er i stand til å overføre disse spesifikke immune reaksjoner enten for å avimmunisére vertene ved in vivo-injeksjon eller til "naive" celler som er i stand til å undergå immunologiske reaksjoner når de inkuberes in vitro, er naturligvis av vik-tighet for medisin og veterinær forskning. Se f.eks.

H.S. Lawrence: "The transfer in humans of delayed skin sensitivity to streptococcal M substance and to tuberculin with disrupted leukocytes". J. Clin-Invest, (1955), 34,

219-30 eller "Transfer of immunological information in humans with dialysates of leukocyte extracts", Trans. As. Amer. Physicians, (1968), 7_6, 84-91. Tilstedeværelsen av levende celler er nødvendig for replisering. av slike immunologiske materialer.

i Lymfecellene til dyr som er immunisert mot et spesielt anti-• gen har sannsynligvis innarbeidet den immunologiske informasjon i deres nukleinsyrer til å gi såkalte "immune-nukleinsyrer" som sannsynligvis bærer den immunologiske hukommelse. Således vil immune nukleinsyrer være kjennetegnet ved deres egenskap til å overføre immun reaktivitet overfor spesielle antigener til "naive " lymfocytter når de injiseres in vivo eller når "naive" lymfocytter inkuberes med immune nukleinsyrer in vitro. Dyr med slike "aktiverte" (sensitized) lymfoide celler vil lett reagere ved et nytt møte med det tilsvarende antigen og eksempelvis motstå angrep fra bakterier eller vira som fører dette antigen.

Et antall in vitro-cellelinjer av menneske- eller dyreherkomst er etablert, men det er ikke fremkommet noe tilfredsstillende . kultiveringssystem for in vitro fremstilling av gamma-globuliner som er spesifikke for et gitt antigen. Lymfoblastoide celler i en kultur kan spontant fremstille antilegemer som er rettet mot ukjente antigener, og de kan således ikke anvendes for noen praktiske formål. I tillegg vil cellene i kulturen ofte forandre deres egenskaper når kultiveringen foregår over lengre tid og således miste noen av egenskapene for deres differensierte tilstand. Det ble derfor antatt som lite sannsynlig at det kunne finnes en cellelinje som kunne bringes til å- produsere spesifikke immunologiske nukleinsyrer, dvs. være i stand til å innarbeide i sine cellenukleinsyrer informasjonen erholdt i eksogene spesifikke immunologiske nukleinsyrer og ytterligere være i stand til å replisere slike spesifikke immunologiske nukleinsyrer. Produksjonen av spesifikke antilegemer (gamme-globuliner) under anvendelse av en- slik cellekultur ble også ansett som lite sannsynlig.

Imidlertid er det overraskende funnet at når en lymfoblas-toidcellelinje, kjent som LDV/7, ble inkubert med. spesifikke immune nukleinsyrer (i form av i-RNA og i-DNA) erholdt fra humansk eller animalsk donor, lymfoidceller som tidligere var aktivert mot et gitt antigen, ville cellene innarbeide denne immunologiske informasjon og dublisere de innførte molekyler. Ytterligere når de aktiverte (induced) LDV/7-celler ble brutt

i opp og deretter dialysert ble det funnet at dialysatet over-førte den spesifikke celle-innførte immunitet til andre celler både in vivo og in vitro. I virkeligheten kunne denne immunitet overføres til "naive" LDV/7-celler som derved ville fort-sette å dublisere de immunologiske nukleinsyrer som opprin-nelig ble anvendt. Et dialysat med disse egenskaper er i det etterfølgende betegnet som immun-dialysat. Det ble også funnet at inkubering av cellelinjen med immune nukleinsyrer og/ eller immune dialysater ville bringe cellene til å produsere gamme-globuliner spesifikke for det antigen som donoren opp-rinnelig ble immunisert mot. LDV/7-cellelinjen ble' utviklet fra periferalblodleukocytter erholdt fra en 7 5 år gammel, tilsynelatende frisk, mannlig frivillig.

Cellene kan dyrkes i suspensjonskultur, enten i statiske kulturer eller i spinnekulturer og de kan også kultiveres i agar. Denne egenskap er spesielt nyttig da det muliggjør at veletablerte bakteriologiske metoder kan anvendes for in vitro kontroll av menneskeceller. F.eks. er kloning mulig og det er også mulig å studere innvirkningen av forskjellige faktorer, såsom kolonistimulernede faktor på cellenes differensiering.

Cellelinjen ble initialt etablert ved den følgende prosedyre (prosentangivelsene i det følgende er volum-%): Mesteparten av erytrocyttene ble separert fra den opprinnelige blodprøve ved tilsetning av 20% plasmagel og kastet etter sedimentasjon i prøverør. Den gjenvunne suspensjon inneholdt erytrocytter/leukocytter i et forhold mindre enn 20:1. De således erholdte leukocytter ble suspendert i et "RPMI 1640"-medium inneholdende 20% kalvefosterserum, ved en konsentrasjon på 2 x 10 6 leukocytter/ml. 2/3 av dette medium ble erstattet med friskt medium to ganger i uken. Da celledød fant sted i løpet av de første uker ble kulturen konsentrert i den grad det var nødvendig for å holde cellekonsentrasjonen over 10 celler/ml.

i

I

Cellene ble kultivert i glass "Roux"-flasker. 6 uker etter påbegynt kultivering viste cellene i en av flaskene tegn på. vekst, nemlig de ble større og begynte å formere seg og

disse ble anvendt for påbegynnelsen av LDV/7-cellelinjen.

Denne cellelinje er siden dyrket i store mengder under anvendelse av den beskrevne dyrkningsmetode: LDV/7-cellelinjen kan bibeholdes i et antall forskjellige næringsmedia. Den kan- kultiveres i "RPMI 1640"-medium inneholdende 5 - 30% kalvefosterserum. Fortrinnsvis består næringsmediet av "RPMI"-medium inneholdende 10% kalvefosterserum. Ytterligere kan "McCoy's" og "Eagle<1>s Essential

Medium" anvendes ved subkultivering av cellelinjen.

Cellene vokser i suspensjonen ved 37°C og danner klumper som

kan dispergeres ved forsiktig omrøring av mediet. Cellene videre-føres (are passaged) minst 3 ganger om uken. Det aktuelle podningstall er 5 x 10 5 celler/ml og cellene får vokse i en statisk kultur inntil en -cellekonsentrasjon på 10 g celler/

ml nås. Deretter vil cellene vokse i en omrørt kultur hvori en roterende, steril magnetisk omrører holder cellene i suspensjon i næringsmediet. En høyere konsentrasjon på stør-relseorden 1,5 x 10 celler/ml kan derved erholdes. Prosentandelen av døde celler er ca. 5%, men varierer i henhold til kulturbetingelsene. Genereringstiden for cellene er ca.

24 timer, igjen avhengig av kulturbetingelsene.

Generelt er betingelsene slik at pH og temperatur under hvilke cellélinjenformeres i det vesentlige de samme som leukocytter

ville møte i et menneskelegeme.

Karyotype-analyse av cellene viser at LDV/7-cellelinjen er hypotetraploid. Antallet av kromosomer varierer mellom 80

og 93. En undersøkelse av cellenes morfologi ved hjelp av optiske mikroskop viste en heterogen cellestørrelse og at flesteparten av cellene hadde et oppblåst (blast-like) ut-seende. Ytterligere undersøkelse ved hjelp av et elektron-mikroskop bekreftet cellelinjens heterogenitet og viste runde,

monocellulare celler av varierende størrelse med cytoplasmisk differensiering og "rough" endoplasmisk reticulum og makrofage egenskaper. Det synes å være minst to cellepopulasjoner, hvorav den ene hadde celler med en diameter mindre enn 15 um og den andre med større celler med en diameter på 15 - 30 um. Tilsynelatende er de større celler avledet fra de små.

3 kloner har blitt erholdt med kromosomtall på 84 for den

første og 85 for den andre og tredje, og underbygger således kloningseffektiviteten.

De fagocytiske egenskaper for cellene ble også undersøkt ved hjelp av elektrOnmikroskopet. Det kunne klart sees at noen av cellene ble fagocyttisert av andre celler. Ingen vi-rale partikler ble oppdaget på elektronmikrofotografier erholdt enten fra prøver tatt under vanlige kulturbetingelser eller fra kulturvekst ved +40°C. Det er verdt å bemerke at cellelinjen er meget følsom overfor det adrenale kortikale steroidhormon-kortison, hvilket indikerer tilstedeværelsen av lymfoblastoidceller og/eller stamceller. Det er også viktig å bemerke at ingen EB-virus-antigener ble påvist ved immunofluorescens.

Ved vevtypebestemmelse av LDV/7-cellene for histokompatibili-tet viste HL-A-antigener tilstedeværelsen av de følgende særpreg (specificities) : HLA 2 og. HLA 32 for den første locus, og HLA "specificity" W 14 for den andre locus. Imidlertid ble svak reaktivitet med andre antisera og andre HLA-spesifisiteter også observert, mén dette ble betraktet som uspesifikt. LDV/7-cellene er deponert i Laboratoire d'Immunobiologie, Faculte de Medecine Broussais Hotel-Dieu, 15, rue de l'ecole de Medecine, Paris 75006, og er offentlig tilgjengelig på forespørsel.. LDV/7-cellelinjen og en fremgangsmåte for dens formering er beskrevet og krevet i norsk ansøkning nr. 77.4312.

Det er. ikke mulig i alle tilfeller å fremstille immuno-

logisk materiale fra andre etablerte cellelinjer, fordi ikke alle cellelinjer er induserbare på samme måte som beskrevet ovenfor i forbindelse med LDV/7-cellelinjen. Det ble spesielt funnet at 3 lymfoblastoide cellelinjer erholdt fra leukemi-pasienter, 2 fra Burkitt-lymfetumorer og 3 etablert fra perifere blodlymfocytter erholdt fra friske frivillige ikke kunne la seg indusere. Imidlertid ble vellykket induksjon oppnådd når lymfoblastoidcellelinjene BRI 8 og BEC 11 ble anvendt, dog ikke i samme grad som det ble oppnådd for LDV/7-cellelinjen.

Det er funnet at en betingelse som en cellelinje må tilfredsstille for at en vellykket induksjon kan oppnås på en enkelt måte og for at cellelinjen deretter skal produsere spesifikke gamma-globuliner, er at det anvendes en cellelinje som allerede produserer gamma-globuliner. Slike gamma-globuliner

vil naturligvis være rettet mot ukjente antigener, som tidligere nevnt. F.eks. vil cellelinjer av lymfoid opprinnelse (myeloma eller lymfoblastoid-cellelinjer) tilfredsstille dette kriterium og kan derfor induseres til å produsere spesifikke gamma-globuliner, nemlig i-RNA og i-DNA. Imidlertid skal man ikke utelukke den mulighet at cellelinjer som ikke spontant produserer gamme-globuliner kan bli induserte. Induksjon av cellelinjer som allerede produserer gamme-globuliner spontant, under anvendelse av den ovenfor beskrevne teknikk i forbindelse med LDV/7-cellelinjen vil således føré

til produksjon av gamma-globuliner med den samme spesifisi-

tet som det induserte materialet.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer derfor en fremgangsmåte for fremstilling av gamma-globuliner og immune nukleinsyrer (som tidligere definert),som begge er spesifikke for et gitt antigen, og som omfatter:

(i) kultivering in vitro av en induserbar cellelinje i nær-

vær av spesifikke immune nukleinsyrer eller spesifikke immune dialysater erholdt enten fra menneske- eller dyre-donor^-lymfoidceller som er aktiverte (sensitized'• med hensyn til det nevnte spesifikke antigen, eller fra celler fra en tidligere

indusert cellelinje aktivert med hensyn til det spesifikke antigen, eller i nærvær av en væskefase. av en kultur av en tidligere indusert cellelinje aktivert med hensyn til det spesifikke antigen, og (ii) ekstrahere gamma-globuliner fra væskefasen av den således induserte cellekultur og/eller ekstrahere immune nukleinsyrer fra de således dyrkede celler.

I henhold til et annet trekk ved oppfinnelsen tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av immune dialysater,

som ovenfor beskrevet og som omfatter:

(i) kultivering in vitro av en induserbar cellelinje i nærvær av spesifikke immune nukleinsyrer eller spesifikke immune dialysater erholdt enten fra menneske- eller dyre-donor-lymfoid-celler som er aktiverte (sensitized) med hensyn til det nevnte spesifkke antigen, eller fra celler fra en tidligere indusert cellelinje aktivert med hensyn til det spesifikke antigen, eller i nærvær av en væskefase av en kultur av en tidligere indusert cellelinje aktivert med hensyn til det spesifikke antigen, og (ii) gjenvinne det immune dialysat fra de således dyrkede celler.

For å tilveiebringe induksjon av visse cellelinjer kan de betingelser som anvendes i forbindelse med LDV/7-cellelinjen være tilstrekkelig. I andre tilfeller kan det være nødvendig med trivielle modifikasjoner av slike teknikker, såsom tiden for inkubasjon, eller mere subtile forandringer kan være nødvendig, såsom å forandre cellens overflate ved anvendelse av proteolytiske enzymer eller behandling med nukleinsyrer fra fostere (embryonic nucleic acids).

Cellelinjene som kan anvendes ved foreliggende fremgangsmåte innbefatter mutante cellelinjer avledet fra LDV/7-cellelinjen. En slik mutant cellelinje må naturligvis være stabil for å være av noen praktisk nytte. De arvelige forandringer som

1 frembringer mutant-cellelinjen kan være spontan eller kan være indusert ved forskjellige kjemiske eller fysikalske mid-• ler såsom røntgenstråler eller UV-lys.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for fremstilling av spesifikke gamma-globuliner er det foretrukket å anvende kulturcellelinjer av lymfe-opprinnelse (myeloma eller lymfoblastoide.cellelinjer) som spontant før induksjon produserer gamma-globuliner, eksempelvis mot ukjente antigener i deres kulturmedia. Mere spesielt er det foretrukket å anvende myeloma-cellelinjer. Hvis lymfoblastoide cellelinjer anvendes er det spesielt foretrukket at det anvendes en kultur av LDV/7-cellelinjen.

Både ved fremstilling av immune nukleinsyrer, særlig i-RNA,

og immune dialysater i henhold til foreliggende oppfinnelse kan anvendes induserbare cellelinjer av lymfoid herkomst,

som angitt ovenfor, som spontant produserer spesifikke gamma-globuliner før induksjon. Anvendelse av LDV/7-lymfoblastoidcellelinjen er foretrukket. Disse cellelinjer kan naturligvis anvendes ved fremstilling av immune dialysater ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåte.

Den immune nukleinsyre eller, ved'fremgangsmåten for fremstilling av spesifikke gamma-globuliner eller immune nukleinsyrer, det immune dialysat som initialt anvendes for å indusere cellelinjen erholdes fra et tidligere immunisert menneske eller dyr, eksempelvis sau, kanin, marsvin eller rotte. Når en dyredonoranvendes under anvendelse av spor-frie dyr immunisert mot ett antigen er fullstendig monospesi-fikk sehsitisering mulig. i-RNA kan ekstraheres fra donorens lymfoidceller ved den varme fenolmetode og i-DNA kan ekstraheres ved kald fenol-ekstraksjon under anvendelse av et sterkt cheleringsmiddel, eksempelvis natrium-4-aminosalicy-

lat og et fuktemiddel, eksempelvis natrium-triisopropyl-naftalensulfonat. Inkubering av disse immune nukleinsyrer eller immune dialysater med en induserbar cellelinje som er i stand til å dublisere de induserende molekyler, eksempelvis lymfoblastoidcellelinjene kjent som LDV/7 og BRI 8 fører

til produksjon av store mengder immune nukleinsyrer som er spesifikke med hensyn til et gitt antigen. Nydannelse av de induserende immune nukleinsyrer finner sted i cellekultursystemet samtidig med replisering av cellens egne nukleinsyrer under cellens normale.deling. Dette kan muligens tilskrives "derepression"av endogene nukleinsyrer, eksempelvis derepresjon av DNA som deretter produserer det tilsvarende i-RNA.

Det bør imidlertid forstås at det ikke synes å være noen type barriere som eksempelvis forhindrer indusering av lymfeblastoid-cellelinjen LDV/7, som stammer fra mennesker, av i-RNA erholdt fra lymfoidcellene fra sau.

Et immun-dialysat kan deretter fremstilles ved å bryte opp de induserte celler, eksempelvis ved gjentatt fryse-tine-teknikk eller ved hjelp av en homogenisator med en etterfølgende dia-lyse av homogenisatet. Dette immun-dialysat fra menneske.: eller dyre leukocytter, sensitisert med hensyn til et gitt angiten inneholder molekyler med en molekylvekt på mindre enn 10000. Dialysatet er i stand til å overføre immunologisk informasjon til cellene i kulturen. Disse celler ble etter inkubasjon med det induserende immun-dialysat funnet å produsere i-RAN og i-DNA med den samme spesifisitet som immun-dialysatet anvendt for induksjon. Aktiviteten av immun-dialysatet ble ikke ødelagt ved behandling med RNA-

ase eller DNAase, men ble ødelagt ved behandling med<p>ronase. Dette indikerer at informasjonen bæres av små proteiner med

en molekylvekt mindre enn 10000, og at denne informasjon kan "kopieres" inn i en nukleinsyre. Selv om mekanismen av .en slik kopiering er uklar, er resultatet, nemlig overføring av informasjon fra proteiner til nukleinsyrer fullstendig uven-tet i lys av den eksisterende kunnskap om molekylær biologi. Det er verdt å bemerke at nyere bevis indikerer at i-RNA

som er ansvarlig for overføring av immunitet mot et spesifikt antigen er "messenger" RNA: se P. Bibello, M. Fish-

man and G. Koch, Cell Immunol, 23_, 309-319 (1976).

Spesifikke antilegemer (gamma-globuliner) er funnet i væskefasen erholdt fra kulturer av celler indusert med i-RNA, i-DNA og/eller immun-dialysater. Det er overraskende funnet at disse spesifikke gamma-globuliner (i det vesentlige IgG) all-tid hadde menneskelig spesifisitet når den anvendte celle-. linje var av human herkomst, selv om den induserende immune nukleinsyre var av dyreherkomst (eksempelvis sau, kanin). Dette indikerer igjen derepresjon av vertcellegenom av dyre-nukleinsyren. Dette er underbygget av det følgende bevis. Induksjonsprosessen for cellelinjene forårsaker forandringer i celleoverflatene og spesielt tilsynekomst av spesifikke antigen-reseptorer som trolig er gamma-globuliner. Ytterligere forsøk under anvendelse av LDV/7-celler, sau i-RNA og kanin anti-sau gamma-globulin viser at ingen sau gamma-globuliner er påvisbare i de induserte kulturer, hvilket indikerer at de spesifikke gamma-globuliner produsert av LDV/7-cellene er human-allotyper. Ytterligere når de spesifikke . antilegemer ble ekstrahert på en immuno-adsorbent-kolonne for det tilsvarende antigen, og ble undersøkt etter eluering var kun human-allotyper tilstede.

Ytterligere inkubasjon av ikke-induserte celler med væskefasen fra en indusert kultur induserer i-DNA-og i-RNA-produksjonen i de "naive" cellene og svært ofte også produksjonen av spesifikke gamma-globuliner. Følgelig kan de induserende faktorer i vevkulturmediet så vel som antilegemene ekstraheres og renses. Gamma-globulinene kan ekstraheres under anvendelse av en spesifikk immuno-adsorbent-kolonne med det tilsvarende antigen eller xenogenisk anti-human-globulin-antilegeme på hvilket det spesifikke gamma-globulin som inneholdes i mediet vil bindes til. Gamma-globulinene kan deretter lett erholdes ved den etterfølgende eluering.

Selv om de etterfølgende eksempler primært vedrører anvendelse av "Key-hole limpet haemocyanin (KLH)" som det sensitiserende antigen så er dette fordi det er eksperimen-telt fordelaktig. Andre antigener såsom brucella-bacterier, coccidioidin eller histoplasmin kunne også med hell vært anvendt.

Anvendelse av de ovenfor beskrevne immunologiske materialer for å overføre celle "mediated"immunitet mot spesfikke antigener er av åpenbar betydning innen det medisinske felt. De induserende molekyler kan eksempelvis erholdes fra spore-frie dyr immunisert mot ett antigen, og derved oppnå i det vesentlige monospesifikke immune "overførere" (mediators). Kloning av cellekulturer etter induksjon vil også resultere i en kultur for fremstilling av monospesifikke gamma-globuliner.

Storproduksjon av slike "overførere" in vitro har mange an-vendelser. Anvendelse av immune dialysater utviser en fordel over immune nukleinsyrer da det er så vidt mulig å oppnå immune reaksjoner mot de immune dialysater, og ved dette vil unngås anafylaktiske reaksjoner. Ytterligere vi det ikke være noen virusrisiko ved anvendelse av celledialysater, mens en hypotetisk tilstedeværelse av en virusgenom i immune nukelih-syrer vil være vanskelig å utelukke. Følgelig vil et middel som kan administreres i enhetsdoser, omfattende minst én av de immune nukleinsyrer (i-RNA eller i-DNA) og/eller immune dialysater som er spesifikke for et gitt antigen og fremstilt ved den ovenfor beskrevne prosess også være innen foreliggende oppfinnelses område. Spesifikke human gamma-globuliner fremstilt in vitro bør ha et bredt anvendelses-område og kan anvendes som erstatninger for gamma-globuliner erholdt fra dyre- eller menneske-donorer og som for tiden anvendes i passiv immunoterapi eller , f or diagnostiske formål.

I henhold til oppfinnelsen er det også tilveiebrakt et middel som kan administreres i enhetsdoser og omfatter spesifikke gamma-globuliner fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Oppfinnelsen skal illustreres av de følgende eksempler:

Eksempel 1 (a) Generell metode for initial indusering av en cellelinje med immune nukleinsyrer erholdt fra en tidligere immunisert donor.

En RNA-oppløsning eller DNA-oppløsning erholdt fra lymfoidceller fra en donor som tidligere var. immunisert mot et spesifikt antigen ble henholdsvis behandlet med DANase og RNAase for å sikre at det ikke var henholdsvis DNA eller RNA

tilstede. 10 LDV/7-celler ble inkubert i 30 - 60 min. med

.0,5 - 1,00 mg RNA eller DNA i oppløsning.

Cellene ble suspendert ved en konsentrasjon på 5 x 10^ celler/ml i et RMPI 1640 medium supplementert med 10% kalvefosterserum. Kulturen ble dyrket inntil det ble oppnådd en cellekonsentrasjon på 10 6 celler/ml og ble deretter innført i.et friskt medium hvilket senket cellekonsentrasjonen til 5 x 10^ celler/ml. Cellene ble høstet når det totale utbytte av kulturen var av størrelsesorden 10"^ celler. Immune-RNA og immune dialysater ble erholdt fra disse celler og spesifikke gamma-globuliner ekstrahert fra vevkulturmediet. (b) Generell metode for indusering av cellelinje under anvendelse av et dialysat erholdt fra initialt induserte LDV/7-celler. Dialysater av celler fremstilt som angitt ovenfor ble erholdt etter fryse-tining av 10 9celler i 10 ml destil-lert vann og deretter dialysert gjennom en dialysepose under vakuum.

100 ml LDV/7 celler ved en konsentrasjon på 5 x 10^ celler/ml ble inkubert med dialysater erholdt fra 5 x 10 7 celler indusert som angitt ovenfor. Cellene ble forkultivert til et totalt utbytte på 2 x 10 9 celler og i-RNA, i-DNA og immune dialysater ble erholdt fra de sistnevnte.

Spesifisiteten av i-RNA erholdt fra kulturcellene etter indusering med i-RNA, i-DNA eller immun-dialysat for ondartede melanoma-antigener ble bestemt i et celle-"mediated" cytotok-sisitetssystem. Ondartede melanoma-cellelinjer var målceller. De cytotoksiske indekser viste at immune nukleinsyrer eller immune dialysater gjør "naive" inaktive perifere blodlymfocytter spesifikt cytotoksiske overfor målcellene etter inkubasjon.

Eksempel 2

I en annen forsøksserie ble det funnet at inkubasjon av LDV/7 eller BRI 8 celler med immune nukleinsyrer eller immune dialysater, slik som angitt i eksempel 1 induserte, tilsynekomst av spesifikke antigenreseptorsteder på celleoverflaten av lymfoblastoidceller. (a) Når LDV/7 celler ble inkubert med i-nukleinsyrer eller immune dialysater spesifikk for KLH ("Keyhole-limpet haemocyanin"), utviklet deretter LDV/7-cellene mottagersteder for dette antigen. Dette kan sees som en rosettdannelse på SRBC (røde blodceller fra sau) som tidligere var belagt med KLH. Under disse forsøk kunne det påvises dannelse av et spesifikt anti-KLH antilegeme i kulturmediet. (b) Lymfoblastoidcellelinjen BRI 8 ble indusert under anvendelse av teknikken beskrevet i eksempel 1, i nærvær av i-RNA og i et annet forsøk i nærvær av immune dialysater, som begge var spesifikké for KLH. Deretter ble rosettdannelse observert slik som angitt under (a).

Eksémpel 3

I-RNA anvendt i denne forsøksserie var ekstrahert fra lymfe-knuter og spleener av sau immunisert enten med melanom- eller colon carcinom-celler. Immun RNA fra sau blir i det etterføl-gende betegnet som Is-RNA. I-RNA fra sau immunisert med KLH (Keyhole Limpet Haemocyanin) ble anvendt som en kontroll.

Immunisering av sau og den varme fenolekstraksjonsmetoden for i-RNA er henholdsvis beskrevet i D.H. Kern, D. Fritze, CR. Drogemuller arid Y.H. Pilch, J. Nat. Cancer. Inst. 5_7, 97-103

(1976), and L.L. Veltman, D.H. Kern and Y.H. Pilch, Cell. Immunol. 131, 367-377 (1974). i-RNA preparatene ble undersøkt i med hensyn til deres innhold av protein, DNA og RNA.. Sukrose-densitetsgradientprofilene for i-RNA ble også bestemt da disse tillater bestemmelse av en degradering som ødelegger den biologiske aktivitet: se Y.H. Pilch, K.P. Ramming and P.J. Deckers. I H. Bush, Ed: Methods in Cancer Research, Vol 9, New York, Academic Press, 1973, 195-254.

Den biologiske aktivitet for de erholdte i-RNA-prøver ble bestemt ved en in vitro mikrocytotoksisitetstest: se RNA in the Immune Response, H. Friedman, Ed, Ann. N.Y. Acad. Sei., 207. (1973). Deres evne til å omdanne normale allogene men-nesképerifere blodlymfocytter til cytotoksiske"effekta<r>"-celler ble bestemt etter in vitro inkubasjon av lymfocytter med i-RNA, hvoretter den cytotoksiske aktivitet av de behandlede lymfocytter ble bestemt mot kultiverte human-tumorceller av den samme histologiske type som de anvendt for å immunisere den anvendte Is-RNA-donorsau.

Lymfoblastoidcellelinjen LDV/7 ble indusert med Is-RNA på følgende måte: 1 mg Is-RNA ble oppriløst i 0,5 ml RPMI 1640 medium og denne oppløsning gjøres opp til 0,35 M med hensyn til sukrose. 10 7-LDV/7 celler ble deretter suspendert i denne oppløsning og inkubert i minst 30 min. ved 37°C under kontinuerlig omrøring. Etter endt inkubasjon tilsettes nytt medium og det endelige volum justeres til 20 ml, hvilket bringer cellekonsentrasjonen til 5 x IO5 celler/ml. Da den midlere fordoblingstid av denne cellelinje;når den kultiveres under statiske betingelser, er av størrelsesorden 24 h ble et volum friskt medium

(RPMI 1640, supplementert med 10% kalvefosterserum) tilsvarende det eksisterende volum av kulturen tilsatt hver dag inntil det totale kulturvolum nådde 3 1 hvilket ga ca. 2 x 10 9 celler. En alikvot del på 10 7 celler fra denne kultur induseres for annen gang med den samme Is-RNA under anvendelse av den samme fremgangsmåte. Denne på ny induserte ali-kvote del tjener som utgangskultur for en andre kultur som igjen tilføres-friskt medium og får vokse inntil det ønskede celleantall er erholdt..Vanligvis får den andre cellekultur

vokse inntil det erholdes 4 x 10 celler. Cellene fra de to<9>celler. kulturer slåes sammen og lagres dypfryst ved -20°C. I-RNA ekstraheres fra disse frosne celler (Ic-RNA) og undersøkes

med hensyn til biologisk aktivitet, som ovenfor beskrevet.

Det erholdes totalt 0,7 - 1,5 mg RNA fra 10<9->celler. Alle satser av Ic-RNA ekstrahert på denne måte ga en ikke-degradert profil for sukrosedensitetsgradienter.

Ic-RNA ekstrahert fra de kultiverte LDV/7-celler ble undersøkt med hensyn til deres evne til å indusere "naive" human-lymfocytter for å gjøre disse cytotoksiske, in vitro, overfor tumor-målceller. Humanlymfocyttene ble isolert fra periferalblod fra en sunn donor på "Ficoll-isopaque"-gradienter. Deres aktivitet ble sammenlignet med de for de induserende Is-RNA-preparater. 8< ut av 10 forsøk viste at Ic-RNA-preparatene var i stand til å overføre betydelig cytotoksisitet for tumormålcellene til "naive" allogene lymfocytter. Tabell 1 viser resultatene fra to typisk vellykkede forsøk.

Allogene human-lymfocytter fra perifert blod av en sunn bloddonor ble anvendt som "effector"-celler. 5 x 10<7>celler ble inkubert med i-RNA ekstrahert fra (a) ikke-induserte LDV/7 celler (c-RNA), (b) en sau immunisert med KLH (Is-RNAk), (c) en sau immunisert med menneske-colon-carcinom-celler (Is-RNAc), (d) en sau immunisert med human-melanom-celler (Is-RNAm) og (e) tre satser LDV/7 celler (Ic-RNA), etter induksjon med

.hver av tre forskjellige typer Is-RNA (k, c og m). Lymfocytter inkubert med intet i-RNA ble anvendt som kontroll (Cl). Hvert resultat representerer middeltallet av 6 verdier. Signifikante forskjller (P< 0.005) ble funnet mellom aktiviteten for I-RNA erholdt enten fra sau immunisert med.tumorceller eller fra LDV/7 kulturer indusert med disse antitumor Is-RNA' er på den ene side og med kontrollene (lymfocytter inkubert med intet RNA, c-RNA, Is-RNAk eller Ic-RNAk) på .den annen "side. Ingen signifikante forskjeller kunne observeres mellom cytotoksisitetsindeksene erholdt med aktive Is-RNA-preparater og Ic-RNA'er fra LDV/7 celler indusert med disse Is-RNA'er. NT ikke undersøkt. "Allogene-lymfocytter" anvendes her under henvisning til pasienten e-ller donoren for tumorceller som. ble anvendt for immunisering av sau. De kultiverte tumorceller anvendt i cytotoksi-sitetsforsøkene var allogene med hensyn til tumorcelledonoren og var av samme histologiske type som de anvendt for immunisering av sau. Den samme bloddonor tilveiebrakte "effec.tor"-lymfocyttene anvendt i disse forsøk.

Det må imidlertid påpekes at disse resultater ikke antyder

at de observerte cytotoksisiteter bare kan tilskrives å

være tumorspesifikke da både Is-RNA og Ic-RNA-preparatene kan overføre inmin-reaktivitet mot Hl-A spesifikke typer (specificities) så vel som mot tumorassosierte antigener.

Hva som klart er^vist er at Ic-RNA overfører tilsvarende cyto-toksisitetsindekser til normale human-lymfocytter som de overført av Is-RNA anvendt for induksjonen.

Det bør også bemerkes at LDV/7 cellene er i stand til å produsere Ic-RNA som bærer den samme spesifisitet som Is-RNA

i minst 10 uker etter den initiale induksjon og Ic-RNA

viste den samme spesifikke aktivitet når den ble ekstrahert 3-10 uker etter induksjonen.

Eksempel 4

I-RNA ble ekstrahert fra lymfevev av sau immunisert enten

med KLH (Keyhole Limpet Haemocyanin) eller med humantumor-

vev (melanom, colon carcinom) , KLH og Freund 1 s Completé Adjuvant (FCA), eller med FCA alene. I-RNA fra ikke-immunisert

I

i sau ble ekstrahert under de samme betingelser. Varm-fenol-metoden anvendes for RNA-ekstraksjon. DNA, RNA og protein-konseritrasjonen for hvert preparat bestemmes og fravær av betydelig degradering bestemmes ved analyse av sukrose-densi-tetsgrådientprofiler. I-RNA-preparatene ble holdt lyofilisert inntil bruk.

LDV/7-lymfoblastoidcellelinjen ble anvendt for disse forsøk. Cellene fikk vokse i RPMI 1640 medium (Gibco), tilsatt 10% .kalvefosterserum (FCS) i en suspensjonskultur og deres gjen-nomsnittlige fordoblingstid under de anvendte forsøksbetingel-ser var ca. 24 timer.

For induksjon ble 10 7 LDV/7 celler inkubert i 60 min. il ml RPMI 1640 medium, uten FCS, inneholdende 1 mg I-RNA. Ved slutten av inkubasjonsperioden ble 19 ml medium 10% FCS tilsatt slik at cellekonsentrasjonen ble justert til 5 x 10^ celler/ml. Cellene fikk deretter vokse undér standard kulturbetingelser.

Bevis for dannelse av membranreseptorer, spesifikke for det gitte antigen, på overflaten av de induserte LDV/7 cellene, er som følger:'

(a) Immun cytoadhesjon

Røde blodceller fra sau (SRBC) blandes med et likt volum av

en 0,005%<1>ig tanninsyreoppløsning og inkuberes i 10 min.

ved 37°C. Etter vasking i en fosfatpufret saltoppløshing (PBS) ble cellene suspendert i PBS i et volumforhold 1:20. 1 ml av den erholdte suspensjon ble blandet med 5 ml PBS inneholdende 1 mg/ml KLH og inkubert i 10 min. ved 37°C i den hensikt å fiksere antigenet på SRBC-membranene. Etter vasking ble antigenbelagte SRBC resuspendert i 5 ml PBS. Vaskede LDV/7 celler ble blandet med antigenbelagt SRBC og inkubert i 2 timer ved 37°C. Prøver uttas ved slutten av inkubasjonsperioden og plasseres mellom glassplater og dekkglass og telles under mikroskop. LDV/7-celler til hvilke mere enn 3 SRBC er knyttet betraktes som "rosettdannende" celler.

I

LDV/7-celler indusert med I-RNA fra sau immunisert med KLH viste et signifikant høyere antall, rosettdannende celler når de inkuberes med KLH enn celler indusert med RNA erholdt

fra ikke-immuniserte dyr, eller méd I-RNA fra sau immunisert med et antigen forskjellig fra det som ble anvendt for å be-legge SRBC, eksempelvis FCA. Det midlere antall rosettdannende celler observert for en indusert kultur var av størrel-sesorden 10%.

(b) Immunofluorescens

KLH merket med tetrametylrhodaminisotiocyanat, isomer G (Sigma)

(RITC) ble anvendt for å lokalisere KLH-membranreseptorer ved direkte immunofluorescens. 200 ug/ml RITC merket KLH

5

inkuberes med 6 x 10 LDV/7 celler i 30 min..

Celler inkuberes under de samme betingelser med ikke-merket KLH. De. sistnevnte påvises på celleoverflaten ved kanin anti-KLH-antiserum konjugert til fluorescein-isotiocyanat, isomer I (Sigma) (FITC). Kanin anti-KLH-antisera fremstilles ved tre to ukelige injeksjoner av 1 mg KLH.

Et geit anti-kanin FITC-merket antiserum ble anvendt ved

den indirekte teknikk for å fremkalle u-merket kanin anti-KLH antilegemer fiksert på overflaten av LDV/7 celler inkubert med KLH.

LDV/7-celler indusert med sau i-RNA-KLH og inkubert med KLH viste fluorescent farging ved det direkte forsøk (under anvendelse av merket KLH) .eller ved den indirekte prøve (under anvendelse av fluorescerende kanin anti-KLH antiserum eller ikke-merket kanin anti-KLH antiserum og et fluorescerende geit anti-kanin antiserum) (se tabell 2). Celler indusert med sau i-RNA-FCA eller i-RNA fra ikke-immuni sert sau viser på deres overflate ingen antigen-reseptorer forKLHog forblir således ikke-fluorescerende. Spesifikk immunblokkering (IB) underbygget spesifisiteten av fargin-gen. Ca. 30% av cellene fra de induserte kulturer ble fun-nét å være fluorescerende.

Graden av fluorescent farging er uttrykt som prosentandelen av fluorescerende celler som følger: + > 30% ++ > 40%

+++ > 50%

FITC Fluorescein-isotiocyanat Isomer I

RITC Tetrametylrhodamin-isotiocyanat Isomer G.

(c) Peroksydase- diaminobenzidin ( PO- DAB): se Graham, R.C. and Karnovsky, M.J.: The early stages of absorption of in-jected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultrastructural cytochemistry by a new tech-nique. J. Histochem. Cytochem. , 1_4, 291 , 1966 .

10 6 LDV/7-celler inkubert med 1 ml av en oppløsning av KLH

(200 ug/ml) ble etter omhyggelig vasking fiksert med Karnovsky's fiksativ i 5 min. og deretter utsatt for kanin anti-KLH antiserum. Etter en ytterligere omhyggelig vasking ble cellene utsatt for geit anti-kanin antiserum konjugert med hestereddik-peroksydase (Institut Pasteur). Preparatet utsettes for en mettet oppløsning av 3-3<1>diamino-benzidin fri base (DAB)

(Sigma) i 15 min. ved 20°C og fikseres deretter med Karnovsky's fiksativ i 30 min.. Perlen ble deretter dehydratisert og inn-bakt i Epon 312. Tynne snitt ble erholdt under anvendelse av en Reichert mikrotom og undersøkt ufarget eller kontrastlagt med bly i et Philips 300 elektron-mikroskop.

i-RNA-KLH induserte celler, inkubert med KLH og farget med P0-DAB viste under elektron-mikroskop en tykk mørk linje på

den ytre overflate av deres membraner, tilsvarende peroksy-dasereaksjonen og viste således KLH-fiksering på membran-antigenreseptorene. Ca. 30% av KLH-I-RNA-cellene ble funnet å være peroksydasepositive.

Det er derfor konkludert at dette i-RNA (fra sau) overfører informasjon til xenogene lymfoblastoidceller i en kultur.

De sistnevnte celler er i stand til å uttrykke denne informasjon på nytt. Resultatene viser at xenogen I-RNA

ikke kun passivt innarbeides og repliseres av LDV/7 lymfo-blastoidcellene, men blir funksjonell ved at dets informa-

sjon kommer til uttrykk så snart disse innarbeides i en vertscelle. I virkeligheten så induseres celleoverflateforandrin-ger, nemlig tilsynekomst av spesifikke antigenreseptorer,

og ytterligere utskillelse av spesifikke Y-globuliner, selv bm det sistnevnte ikke er vist i dette eksempel.

Eksempel 5

I-RNA ekstraheres- på vanlig måte fra lymfevev fra kaniner immunisert med brucellabakterier. i-RNA-preparatene erholdt

på denne måte ble anvendt for å indusere LDV/7-cellelinjen under anvendelse av teknikken beskrevet i eksempel 3. Den supernatante væske erholdt fra kulturmediet ble analysert for tilstedeværelse av gamma-globuliner spesifikke for brucella-

bakterier under anvendélse av det opprinnelige sensitiserende antigen. Tilstedeværelsen av slike spesifikke gamma-globuliner ble indikert ved immunofluorescens-teknikker og ved agglutinering når prøvene av den supernatante væske ble kom-binert med brucella-bakterier.

Eksempel 6

Ved å følge fremgangsmåten ifølge eksempel 5 ble gamma-globuliner spesifikke for coccidioidin "produsert" under anvendelse av LDV/7-cellelinjen. i-RNA anvendt for.å indusere cellekultursystemet var erholdt fra lymfevev av kaniner som tidligere var sensitisert for coccidioidinet.

Claims (17)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av gamma-globuliner og immune nukleinsyrer, som begge er spesfikke for et gitt antigen, karakterisert ved at:

(i) en induserbar cellelinje kultiveres in vitro i nærvær av spesifikke immune nukleinsyrer eller spesifikke immune dialysater erholdt enten fra human-eller animal-donor-lymfeceller sensitisert for det spesifikke antigen eller fra celler fra en tidligere indusert cellelinj.e sensitisert for det nevnte spesifikke antigen,, eller i nærvær av væskefasen av en kultur av en tidligere indusert cellelinje sensitisert for det spesifikke antigen, og (ii) gamma-globuliner ekstraheres fra væskefasen av den således induserte cellekultur og/eller de immune nukleinsyrer ekstraheres fra de således kultiverte celler.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at i trinn (i) anvendes i-RNA erholdt fra lymfeceller fra en sensitisert dyredonor. I I

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den sensitiserte dyredonor er sau, kanin, marsvin eller rotte.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at i trinn (i) anvendes i-RNA eller i-DNA erholdt fra celler fra. tidligere induserte LDV/7-celler.

5. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-4, karakterisert ved at i trinn (i) anvendes donorlymfeceller eller en tidligere indusert cellelinje sensitisert for "Keyhole-limpet haemocyanin" , co.ccidioidin, histoplasmin, brucella-bakterier eller melanona eller colon carcinom-celler.

6. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 - 5", karakterisert ved at i trinn (i) kultiveres en cellelinje av lymfeherkomst, som før induksjon spontant produserer gamma-globuliner.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det anvendes en myelom-cellelinje.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det anvendes en BRI 8 eller BEC 11 cellelinje.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det anvendes en LDV/7-cellelinje.

10. Fremgangsmåte ved fremstilling av immune dialysater spesifikke til et gitt antigen, karakterisert v e d at: (i) en induserbar cellelinje kultivers in vitro i nærvær av spesifikke immune,nukleinsyrer erholdt enten fra human- eller animal-donor-lymfeceller sensitisert for det spesifikke antigen eller fra celler fra én tidligere indusert cellelinje sensitisert for j det nevnte spesifikke antigen, eller i nærvær av væskefasen I av en kultur av en tidligere indusert cellelinje sensitisert for det spesifikke antigen, og (ii) at det immune dialysat erholdes fra den således kultiverte cellelinje.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at i trinn (i) anvendes i-RNA erholdt fra lymfeceller fra en sensitisert dyredonor.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at den sensitiserte dyredonor er sau, kanin, - marsvin eller rotte.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at i trinn (i) anvendes i-RNA eller i-DNA erholdt fra celler fra tidligere induserte LDV/7-celler.

14. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 10-13, karakterisert ved at i trinn (i) anvendes donorlymfeceller eller en tidligere indusert cellelinje ' sensitisert for "Keyhole-limpet haemocyanin", coccidioidin, histbplasmin, brucella-bakterier eller melanona eller colon carcinomceller.

15. ' Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 10 - 14, karakterisert ved at i trinn (i) kultiveres en cellelinje av lymfeherkomst, som før induksjon spontant produserer gamma-globuliner.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at det anvendes en BRI 8 eller BEC 11 cellelinje.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at det anvendes en LDV/7-cellelinje.