NO792820L - Fremgangsmaate for reduksjon av spredningslys ved fotometriske maalinger, saerlig ved fotometrisk maaling av hemoglobin, samt reagens for bruk ved fremgangsmaaten - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører fotometri og omfatter en fremgangsmåte for reduksjon av lysspredningen ved en fotometrisk måling, særlig ved simultanbestemmelse av hemoglobinkonsentrasjonen i henhold til en fotometrisk metode og leukozyttallet vedjen elektronisk telling i en ved hemolyse forberedt og ved hjelp av en stabilisator stabilisert cellesuspensjon.

Telling av de røde og hvite blodlegemer, ofte kombi-nert med bestemmelsen av hemoglobinkonsentrasjonen, blir alle-rede i mange år gjennomført med delautomatiske og opp til hel-automatiske systemer. Fullblodet som er gjort ukoagulert ved hjelp av koaguleringshemmende midler består av celleformede bestanddeler som erythrozytter, .:.leukozytter, Lthrombpzytter.;.såmt plasmaet med de deri oppløste bestanddeler. For telling og eventuell samtidig størrelsesbestemmelse av de celleformede bestanddeler må disse tilberedes hensiktsmessig for en slik analyse. Således foreligger f. eks. leukozyttene og erythrozyttene i typiske mengdeforhold mellom en og tusen. En telling av leukozyttene vil altså bli betydelig forstyrret av de tallmessig sterkt overveiende erythrozytter, og en slik telling kan til og med gjøres umulig. Man avhjelper seg med metoder som bevir-ker en vidtgående eliminasjon av erythrozyttene uten derved å forandre mengden av leukozytter. En kjent metode er hemolysen, som ødelegger erythrozyttene i deres form, dvs. spalter opp i., små bruddeler uten derved å forandre leukozyttallet. Ved telling f. eks. etter den elektriske motstandsmetode kan erythrozyttfragmentene erkjennes som artefakta og adskilles fra antall leukozytter. Det ved oppspaltingen av erythrozyttene frigjorte hemoglobin kan ved siden av, etter tilsetning av ytterligere reagenser også bestemmes fotometrisk.

Den simultane bestemmelse av leukozyttene og hemoglobinkonsentrasjonen ved på denne måte forberedte prøver er tids-messig begrenset, idet slike prøver vanligvis forblir stabile i 2 0 minutter, og analysen må gjennomføres i løpet av dette tidsrom.

Det :er et typisk trekk ved den hemolytiske metode at det på grunn av den store mengde av de i oppløsningen foreliggende fragmenter av erythrozytter, men imidlertid også på grunn av de intakt forblivende leukozytter som skal telles,.-opptrer uspesifikke tilsløringer som virker forstyrrende inn på den fotometriske måling av hemoglobinet. Man vet fra nephelome-trien at; den fra den spredende løsning utsendte lysintensitet er proporsjonal til antall kolloidpartikler samt deres volum i kvadratet (RAYLEIGH). Den ved hemolysen bevirkede celleoppløs-ning i fragmenter med forskjellig størrelse og antall tilveie-bringer således et ukontrollerbart transmisjonstap for den gjennomstrålede suspensjon. Den gjennom dispersjonen reduserte . andél av lyset i det blå spektralområde er ikke tungtveiende ved hemoglobinmålingen. Forandrer, de dannede cellefragmenter og også de morfologisk forandrede leukozytter etter hemolysen sitt volum ytterligere, så er dette transmisjonstap dessuten tidsavhengig. Den målte ekstinksjon er altså beheftet med en ikke systematisk og tidsavhengig feil i form av en ekstra pseudo-ekstinksjon og. kan ved justeringsprosesser ikke kompenseres tilfredsstillende. Denne feil kan være opp til 3 - 7 % av hemo-. globinverdien.

Den oppgave som ligger til grunn for foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en metode for tilberedelse av suspensjoner for fotometrisk analyse, særlig for suspensjoner for bestemmelse av hemoglobinkonsentrasjonen, ved hvilken de beskrevne uspesifikke tilsløringer elimineres eller i hvert fall kan reduseres.

Denne oppgave blir løst ved en fremgangsmåte som er angitt i krav 1. En for løsning av denne oppgave foretrukket anvendbar reagens er angitt i krav 3.

For den simultane. beat.emm.else. av. hempglpbinkgngentra-sjbnen og leukozyttallet blir 1) tilveiebragt en oppløsning av erythrozyttene i minst mulige cellefragmenter, under samtidig morfologisk fiksering av leukozyttene og 2) brytningsindeksen for suspensjonsmidlet tilpasses brytningsindeksen for erythrozyttfragmentene samt til brytningsindeksen for de stabiliserte leukozytter.

For gjennomføring av oppfinnelsen blir det benyttet en reagens med f. eks. følgende sammensetning: 5 - 10 g trimetyltetradecylammoniumbromid (lyseringsmiddel) 20 - 35 g oktylfenoldekaetylenglykoleter (hemolyserende emulgator) 24 0. - 350 ml formaldehyd 37 % i vann

(leukozyttstabilisator)

ad 1000 ml isotonisk koksaltoppløsning

Lyseringsmidlet har som kvarternær ammoniumforbind-J...^. else en på erythrozytten spesifikk celleoppløsende virkning, mens leukozyttene riktignok blir morfologisk forandret, men forblir opprettholdt tallmessig.

Emulgatoren modifiserer brytningsindeksen for sus-pens jonsmidlet på en slik måte at ved en bestemt konsentrasjon har 'emulgator/suspensjonsmiddeloppløsningen en lignende brytningsindeks som cellematerialet, og spredningen av lyset i cellesuspensjonen reduseres under en tolererbar feilgrense. Denne modifiserte brytningsindeks kan også tilveiebringes med en annen substans som har en tilstrekkelig stor brytningsindeks og den nødvendige oppløsbarhet. En emulgator som virker spesi-fikt hemolyserende på erythrositter understøtter den hemolytiske virkning for lyseringsmidlet. En praktisk kvantitativ og rask hemolyse kan derfor oppnås.

Stabilisatoren har på grunn av sin aldehydgruppe en-konserverende virkning på leukozyttene, dvs. cellene blir morfologisk fiksert. Antall av de i suspénsjonen tilstedeværende leukozytter blir derved stabilisert og kan bestemmes med elek-troniske midler.

For å oppnå en optimal effekt, altså en hurtig og selektiv hemolyse av erythrozyttene, en vidtgående eliminasjon av tilsløringer og en tilstrekkelig stabilitet for leukozytt-tallet, må de tre reagenskomponenter foreligge i avveiet kombi-nasjon i suspensjonen. Denne effekt oppnår man innenfor de i

-eksemplet angitte konsentrasjonsintervaller. Blir den således fremstilte reagens tilført i forholdet 1 del reagens til 99 de-ler av en for måling forberedt blodprøve, så fremkommer en hur-

tig hemolyse, hemoglobinet blir befridd i sine i erythrozytter foreliggende derivater og konsentrasjonsbestemmelsen kan umid-delbart gjennomføres med de egnede metoder. Den hemolyserte og stabiliserte cellesuspensjon for bestemmelse av hemoglobin og leukozytter forblir stabil i 3 0 - 60 minutter.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte for reduksjon av forstyrrelser av en fotometrisk måling på grunn av lysspredning i en suspensjon som skal måles, med hver gang en brytningsindeks som tilhører en fase, karakterisert ved tilblandingen av en tilsetning med en brytningsindeks utenfor området som inneslut-tes av brytningsindeksen for suspensjonsmidlet og den midlere brytningsindeks for de suspenderte faser, hvorved tilblandingen. foretas i en mengde som reduserer dette område.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, med en suspensjon av hemolyserte erythrosytter og stabiliserte leukozytter i isotonisk ; koksaltoppløsning , karakterisert vedat til-setningen er en hemolyserende emulgator.

3. Reagens for reduksjon av forstyrrelsen av en fotometrisk måling på grunn av lysspredning i en suspensjon av blodlegemer i et isotonisk suspensj onsmiddel, k a r a k t .e-^ risert ved at det inneholder a) et lyseringsmiddel, b) et middel for modifisering av brytningsindeksen, c) et middel for stabilisering^ av leukozyttene, d) et oppløsningsmiddel.

4. Reagens ifølge krav 3, karakterisert ved at den inneholder

5. - .10 g trimetyltetradecylammoniumbromid 20 - 35 g oktylfenoldekaetylenglykoleter 240 - 350 ml formaldehyd 37 % i vann ad 1000 ml isotonisk koksaltoppløsning.