NO800089L - Biologisk kar. - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrører et biologisk kar for cellekul- ;

i turer eller biologiske tester med en løsbar og væsketett med karets sidevegger forbundet bunn, hvor bunnen og sideveggene omgir i det minste et kammer, og hvor sideveggene danner et vegglegeme, eventuelt med en tildekning for kammeret eller kamrene .

Et slik kar er kjent fra DE-AS 2 157 160. Bunnen er forbundet med vannlegemet gjennom en klebedyktig tetning som er klebet på bunnen og opptas av noter i vannlegemet. Bunnen tje-ner her som et fast substrat til påhefting av levende celler tilhørende høyere organismer, som under sterile betingelser dyrkes i passende kulturmedier i en cellekultur. I cellebiolo-gien er det i mange tilfelle nødvendig å analysere de på en overflate fremvoksede celler utenfor kulturen, det være seg med mikroskop, med biokjemiske metoder eller med fremgangsmåter for bestemmelse av opptatt radioaktivitet. Ved avslutning av kulturen løses derfor ved dette kar vannlegemet manuelt fra bunnen. Den med bunnen forbundne tetning forblir dog til å begynne, med der og må da også fjernes ved avskraping, hvilket dog er temmelig omstendelig å utføre. Av denne grunn egner det seg til dette formål praktisk talt bare bunner av glass som imidlertid ikke representerer det substrat som er egnet til påhefting av alle typer celler. Bortsett fra dette er et sådant biologisk kar vanskelig å fremstille på grunn av den tetning som skal limes på og kan bare benyttes en eneste gang.

Hensikten med denne oppfinnelse er derfor å tilveiebringe et kar av den innledningsvis nevnte art som er enklere å fremstille og hvor det er mulig på en enkel måte å løse eller fri-gjøre bunnen for videre benyttelse sammen med de på bunnen beliggende cellekulturer uten at det må treffes noen spesielle forholdsregler.

Denne oppgave er løst ved at i det minste den del av vegglegemet som grenser til bunnen, består av et kautsjukkelastisk ikke zytotoksisk kunststoff som ved adhesjon hefter væsketett til bunnen.

Som følge av at vegglegemet er forbundet med bunnen ved adhesjonshefting, kan disse to deler uten vanskeligheter skil-les fra hverandre. Anbringelse av en tetning faller bort og det er bare nødvendig å bringe bunnen og vegglegemet i berøring med hverandre, eventuelt å trykke dem inntil hverandre for å frembringe adhesjonsheftingen. Bortsett fra dette kan så vegglegemet benyttes som helhet på ny, idet det etter bruk vaskes i en oppløsning av en ikke toksisk detergent, spyles med destil-lert vann og deretter steriliseres i autoklav.

Vegglegemet kan også utføres i to sjikt, hvor det sjikt som vender mot bunnen, består av kautsjukkelastisk, ikke zytotoksisk kunststoff som adhesjonshefter væsketett til bunnen. Tilsvarende gjelder for den mot bunnen vendende flate av vegglegemet, dog kan hele vegglegemet også bestå av kunststoff.. Ved kar med store flater med mange kammere kan vegglegemet dessuten inneholde en forsterkningsplate av stivt materiale som er innleiret i vegglegemet.

Vegglegemets hefteflate kan være plan og glatt, men også konkave hefteflater kan benyttes. Hefting er også mulig når hefteflaten av vegglegemet istedenfor speilblank er silkematt, dvs. ru i mikromålestokk. Videre kan hefteflaten være brutt med rilleaktige fordypninger for oppfangning av mindre differ-

i anser i termisk utvidelse av de to til hverandre heftende materialer.

Vegglegemet består fortrinnsvis av et hydrofobt kunststoff, særlig silikonkautsjukk.

Til andre formål for oppfinnelsen kan følgende kunststoffer være hensiktsmessige: 1. Polyvinylklorid med tilsetning av høymolekylære myknere, særlig etylenvinylacetatkopolymer. Vinylacetatgehalten kan gå opp til 90%, hvilket bringer med seg særlig myke forbindelser. Ved variasjon av etylenandelen kan hydrofobigraden varieres.

2. Polyuretanelastomere med forskjellige alkoholandeler.

3. Polyvinylidénklorid.

4. Metylkautsjukk hhv. kloridkautsjukk som begge dessuten er hydrofobe, hvor egenskapene av disse substanser kan varieres med tilsetning av fyllstoffer eller/og stabilisatorer, og hvor også tilsetning av silikonolje eller andre glidemidler er mulig. 5. Fluorkautsjukk, ikke perfluorisert, men kombinert med klor sikrer også kautsjukkelastiske, hydrofobe forbindelser.

6. Polyuretangeler.

Bunnen kan være en glassbunn, da også glass hefter til si-i likonkautsjukk, men en kunststoffbunn foretrekkes hvis materia-j le har tilsvarende hefteevne til vegglegemet, men som også ut-gjør en særlig hensiktsmessig bunn for cellekulturer. Det egner seg f.eks. til dette formål bøyelige plater særlig med en tyk-kelse i størrelsesområdet ca. 0,5 mm, . f.eks. av polyuretan, polystyrol eller lignende materiale. Et slikt materiale er cellevennlig og danner en hensiktsmessig bunn for cellekulturer.

I stedet kan også en filterbunn av f.eks. polykarbonat benyttes hvis porer tillater gjennomgang av molekyler, partikler eller cellefortsettelser.

Kamrene ha en lysvidde som avtar mot bunnen og høyden av vegglegemet hhv. kamrene kan være mellom 0,1 og 20 mm, særlig 2 til 10 mm.

Videre kan karet være forsynt med et løst sittende lokk, særlig med sarg, og lokket kan hefte med adhesjon til vegglegemet .

Oppfinnelsen skal forklares nærmere nedenfor ved hje,lp av

eksempler og under henvisning til tegningen, hvor:

Fig. la,2a og 3a viser tre forskjellige utførelser av et biologisk kar ifølge oppfinnelsen sett i perspektiv og fig. lb, 2b og 3b viser snitt til de foregående figurer.

Det på fig. la og lb viste biologiske kar består av et vegglegeme 1 med en forholdsvis stor flate og et stort antall sylindriske boringer som i en ønsket anordning strekker seg fra oversiden la til undersiden lb av vegglegemet 1 og er åpne til begge sider. Vegglegemet 1 hefter til en bunn 3, slik at borin-, gene er lukket væsketett på undersiden ved hjelp av bunnen 3, slik at det er dannet et stort antall kammere 2. På to motsatte sider rager bunnen 3 utenfor vegglegemet 1.

Ved den på fig. 2a og 2b viste utførelse består kamrene 2 av gjennomgående kvadratiske åpninger som avtar i tverrmål mot bunnen 3.

Ved utførelsen ifølge fig.. 3a og 3b er vegglegemet 1 og

dermed også kamrene 2 utført meget flate.

Bunnene 3 er spesielt bøyelige og kan bestå av polystyrol, polyetylen, polypropylen, polykarbonat og fluoriserte, polyme-riserte hydrokarboner. Imidlertid kan også glass benyttes som mikroskopiske objektbærere.

På den annen side har man den mulighet som bunn 3 å benyt-te dialyse- og filterfolier som avhengig av porestørrelse til- ■' later gjennomgang av molekyler, partikler eller cellefragmenter. Med dette for øyet anbringes karet i en passende væske som

gjennom porene kan kommunisere med kamrenes 2 indre.

Bunnene 3 kan før de bringes sammen med vegglegemet l,være forsynt med testsubstanser, f.eks. testreagenser, antisera,. viruspreparater o.l.Disse substanser gis anledning til å tørke ut på feltene av bunnen 3 som svarer til vegglegemets kammer-bunner. Derved blir den standardiserte testing av reagenser med deres virkning på cellene eller andre biologiske preparater gjort lettere, hvilket forøvrig også er prisgunstig, fordi lag-ring, emballering og anvendelse av slike bunner 3 er billigere og enklere enn anvendelse av hele tilsvarende preparerte celle-kulturkar.

Til anvendelse bringes vegglegemet 1 og bunnen 3 sammen og til dette formål kan eventuelt benyttes en ramme som sikrer nøyaktig utretning av vegglegemet 1 og bunnen 3. Deretter kan kamrene 2 fylles med suspensjonen av de celler som skal kultiveres. På cellene utføres eksperimentelle manipulasjoner på samme måte som ved normale kulturer. Kamrene 2 kan enten plas-seres i en steril petriskål og kultiveres under standardbetin-gelser med påsatt petriskållokk eller kan forsynes med et eget lokk. Lokket kan da enten sitte løst på og ha luftefremspring og en nedgående sarg eller det kan ved adhesjon hefte til vegglegemet 1 og dermed lukke kamrene 2 på lignende måte som med bunnen 3 på undersiden. I dette tilfelle kan kammeret 2 kulti-. veres som et lukket system. For biologiske tester kan karet benyttes til testing av ikke-cellulære reaksjoner,f.eks. agglutinasjonsreaksjoner med latekskuler eller med drepte celler.

På tidspunktet for avslutning av kultiveringen kan bunnen 3 uten videre fjernes fra vegglegemet 1, og cellene kan fikse-res før eller etter adskillelsen. Skulle ikke heftende celler, hhv. produkter av farve- eller agglutinasjonsreaksjoner, behol-des og arkiveres på bunnen 3, må de tørkes opp på forhånd med et hensiktsmessig fikseringsmiddel, f.eks. en konsentrert pro-teinløsning.

Ikke fikserte, påheftede celler kan dog kultiveres videre på bunnen 3 også etter atskillelsen av vegglegemet 1, idet bun-

nen 3 legges inn i en kulturskål med kulturmedium.

Bunnen 3 med cellekulturen kan danne en mikroskopisk objektbærer eller kan dessuten anbringes på en glassobjektbærer. En utnyttelse ved hjelp av histologisk farving, histokjemiske reaksjoner eller immunfluorescens er også mulig.

Etter forangående markering av de kultiverte celler kan det foretas en mikroskopisk autoradiografi hvor fotografiske sølvkorn dannes over stedet for innleiring av den radioaktive substans.

Radioaktivt markerte celler på bunnen 3, særlig på toluol-uømfintlige transparente materialer, kan undersøkes ved scintillasjonsmåling på sin radioaktivitet. Plastikkplater er spesielt egnet til dette, hvilke kan klippes opp i de enkelte kulturområder som måles atskilte.

Når plastikkplater benyttes.som-bunner 3 kan cellene inn-leires for elektronmikroskopi og kan skjæres ultratynt.

En utførelse av karet ifølge fig. la og lb egner seg særlig til håndtering av mikrotitersysternet med et stort tilhøren-de antall tilbehørapparater. Disse apparater gjør pipeteringen av store serier lettere og likeså oppsamlingen av kulturrester eller supenderte celler for videre utnyttelse av disse.

For undersøkelse med en scintillasjonsmåler kan bunnene 3 av toluolbestandig kunststoffmateriale klippes både med saks og også med en stanse til et tilsvarende antall felter som deretter faller ditekte ned i under.disse anbragte småglass med scintillatorvæske.

Etter avslutning av undersøkelsene kan den delte og tørke-de bunn 3 med de på den anbragte cellekultur arkiveres kompakt i folieform eller plateform.

Videre er det mulig å kultivere cellene i de enkelte kammere 2 og markere dem radioaktivt, og etter avslutning av kultiveringen å la bunnen 3 sitte på vegglegemet 1 og anbringe et ytterligere vegglegeme 1 på den andre side av bunnen 3 i riktig stilling i forhold til det førstnevnte vegglegeme. Bunnen 3 er da utformet som filterfolie. Denne kombinasjon som består av to vegglegemer 1 og en bunn 3, kan så ovenfra forsynes med vas-■ kevæske som samtidig avsuges nedenfra. Ved riktig valg av vas-kevæskene fastholdes de i og for seg suspenderte celler på bunnen 3 som virker ,som filter, i oppsluttet tilstand og ekstraheres når det er ønskelig, slik at til slutt bare det uløselige raa- , teriale blir igjen på bunnen 3. Deretter kan bunnen 3 tas av i og de enkelte prøver kan underkastes en scintillasjonsmåling.

Claims (10)

1. ' jBiologisk kar for cellekulturer eller biologiske tester med en løsbar og væsketett med karets sidevegger forbundet bunn, 'hvor bunnen og sideveggene omgir i det minste et kammer, og hvor sideveggene danner et vegglegeme, og forsynt eventuelt med en tildekning for kammeret, kamrene, karakterisert ved at i det minste den til bunnen (3) tilstøtende del av vegglegemet (1) og fortrinnsvis hele vegglegemet (1) består av kautsjukkelastisk, ikke zytotoksisk kunststoff som ved adhesjon væsketett hefter til bunnen (3).

2. Biokar ifølge krav 1, karakterisert ved .at vegglegemet (1) er som helhet anvendelig igjen.

3. Biokar ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at vegglegemets (1) flate som vender mot bunnen (3) består av kunststoff.

4. Biokar ifølge krav 1,2 eller 3, karakterisert ved at vegglegemets (1) hefteflate er plan og glatt.

5. Biokar ifølge et av kravene 1-4, karakterisert ved at vegglegemet (1) består av et hydrofobt kunststoff, fortrinnsvis en silikonkautsjukk.

6. Biokar ifølge et av kravene 1-5, karakterisert ved at bunnen (3) består av cellevennlig plastmateriale.

7. Biokar ifølge et av kravene 1-6, karakterisert ved at det omfatter en filterbunn (3) hvis porer tillater gjennomgang av molekyler, partikler eller cellefragmenter•(Zell-fortsatze).

8. Biokar ifølge et av kravene 1-7, karakterisert ved at det omfatter et lokk som sitter løst på vegglegemet, og fortrinnsvis et ved adhesjon heftende lokk, særlig med sarg' .

9.. Biokar ifølge et av kravene 1-8, karakte ri s'e r t ved at testsubstanser er anbragt på bunnen (3) overensstemmende med kammerrasteringen til vegglegemet (1).

10. Biokar ifølge et av kravene 1-9, karakterisert ved en ramme til innjustering av riktig overdekning mellom vegglegemet (1) og bunnen (3) under sammensetning..