NO800330L - Fremgangsmaate for fremstilling av enkeltcelleprotein - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrører en forbedret fremgangsmåte for fremstilling av enkeltcelleprotein (SCP) .

Proteinholdige materialer er. viktige dietiske komponenter for mange dyr. En stor rekke av slike materialer er i bruk, innbefattet f.eks. fiskemel, soyabønnemel og materialer som stammer fra rapsfrø og solsikkefrø. I de siste 20 år har det vært utført mye forskning vedrørende fremstilling av gjær og bakterielle proteiner for .inkludering i dyre-dietter. Slike proteiner som stammer fra mikroorganismer, refereres vanligvis til som enkeltcelleproteiner eller SCP.

Inkludering av store mengder av visse meget anvendte proteinholdige materialer i diettene kan for visse arter ha uguns-tige virkninger. Dette blir ofte tilskrevet "toksiske" bestanddeler. Virkningen av disse bestanddeler er nylig blitt gjennom-gått (Toxic Constituents of Plant Foodstuffs, utgitt av I.E. Liener, Academic Press, New York). Liener (1969, s.4-6) refere-rer til toksiske bestanddeler som substanser som frembringer skadelige virkninger når de gis til mennesker eller dyr. Han skil-ler mellom kjemiske bestanddeler som er dødelige og slike som frembringer en ugunstig fysiologisk respons. Bearbeidning eller "andre foranstaltninger har vist seg å være effektive til

å ødelegge mange toksiske bestanddeler".. Det skal også refereres til Altshul A.M., (1967, Science, 158, 221) hvor det.heter at dersom det "ikke var for det faktum at slike oljefrø som soyabønnefrø og bomullsfrø kan bearbeides slik at deres toksiske bestanddeler inaktiveres, ville disse rike kilder for plante-protein ikke innta en slik betydelig stilling som de nå innebar når det gjelder foring av husdyr".

Det er kjent at foring av enkeltcelleprotein som stammer

fra prokaryotiske mikroorganismer, hvilke inkluderer bakterier og blågrønne alger, til enkelte dyrearter, spesielt hus-fugler, med høye dietiske inkluderinger forårsaker redusert f6r-opptak, redusert oppnådd livsvekt (LWG) og dårlige for-omdannelsesforhold (FCR). I ekstreme tilfeller frembringer dette leverskade med organforstørrelse, og fokal nekrose med fogocytisk og inflamma-torisk celle-infiltrering kan iakttas ved histopatologisk under-søkelse. Denne virkning er blitt frembrakt med prokaryotisk enkeltcelleprotein som stammer fra forskjellige mikroorganismer,

dyrket på forskjellige næringsmedier og ved forskjellige fremgangsmåter, og er omtalt av (i) D.E. Owen og S.M.A. Doak (Fd. Cosmet. Toxicol, 16_, 633, 1978), (ii) L. Farstad (Acta Agric. Scand., 27, 129, 1977) og (iii) C.T.Whittemore, D.W.Gilchrist - Shirlaw, D.B.McDonald<p>g A.G. Taylor: (British Poultry Science, 19 , 283, 1978) .

Fra forsøk hvorved enkeltcelleprotein dannet ved fremgangsmåten beskrevet i søkerens britiske patentskrift 1 370 892 var inkludert som et proteinholdig materiale i normale kommersielle diett-for til husfugler, har vi funnet progressiv, reduksjon i LWG og progressiv reduksjon i foropptak. I samsvar med dette er det en økning i tilfellene med observerbare leverskader et-tersom den prosentvise inkludering av prokaryotisk enkeltcelleprotein i diettene øker. Forsøkene ble utført med dietter inneholdende 0, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25 og 30 % av prokaryotisk enkeltcelleprotein dannet ved fremgangsmåten i henhold til bri-tisk patent nr. 1 370 892. Med lav inkludering av SCP (f.eks. 2,5 %), skilte ikke tilfellene med leverskade seg betydelig fra tilfellene ved dietter som ikke inneholdt noe SCP. Med store inkluderinger av SCP ble det imidlertid observert betydelige for-skjeller i tilfeller av leverskade mellom SCP-holdige dietter og ikke-SCP-dietter. F.eks. med broiler-kylling-dietter som inneholdt ikke-stressfulle mengder av urenset protein, f.eks. 25 %, og også ikke-stressfulle mengder av vitaminer og mineraler, var tilfellene av leverskade mellom 10 og 40 %, vanligvis 10 Med verpende høner foret med stressfulle mengder (30 %) av råprotein, inneholdt i dietter med et 30 %ig SCP-innhold, var tilfellene av leverskade mellom 30 og 70 %, vanligvis 50 %. Vi har også funnet at virkningen på vekst-ytelsen for husfugler som kommer av inkludering av SCP i deres dietter, ikke påvirkes i betydelig grad ved å variere de mikrobielle kulturforhold eller ved å variere den fremgangsmåte hvorved mikroorganismene tørkes for å danne en dietisk ingrediens, dvs. fryse-, flash- og sprøytetør-kede produkter gav like effekter.

Effekten av å anvende prokaryotisk SCP som en dietisk ingrediens begrenser, ved visse arter de andeler hvorved SCP kan inkluderes i diettene for disse arter, og reduserer følgelig anvendbarheten av prokaryotisk SCP i forbindelse med disse arter.

I henhold til foreliggende oppfinnelse tilveiebringer vi en fremgangsmåte for fremstilling av enkeltcelleprotein, hvil ken omfatter å dyrke prokaryotiske mikroorganismer og deretter behandle de<*>dyrkede mikroorganismer for å fremstille et produkt som omfatter hele ikke-levedyktige celler og/eller spaltede celler, hvorved mikroorganismene behandles med et oksydasjonsmiddel eller utsettes for andre oksydasjons-innretninger, hvor oksyda- \ sjonsmidlet tilsettes eller de andre innretninger anvendes under dyrking og/eller under den etterfølgende behandling og/eller tilsettes til eller anvendes på produktet etter den etterfølgende behandling, idet oksydasjonsmidlet tilsettes i en mengde på mellom 3 og 300 mmol pr. liter av en faststoff-suspensjon inneholdende mikroorganismene når det tilsettes under dyrking eller under etterfølgende behandling, eller, når det tilsettes til produktet, tilsettes i en mengde mellom 3 og 300 mmol pr. liter av produktets fuktighetsinnhold. ;De prokaryotiske mikroorganismer som hittil vanligvis har vært anvendt ved fremgangsmåter for fremstilling av enkeltcelleprotein, er bakterier. Fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse er først og fremst av interesse i den utstrekning den vedrører bakterier, og vil heretter bli beskrevet som en fremgangsmåte for fremstilling av bakterielt SCP. Foreliggende oppfinnelse er anvendbar for hvilken som helst fremgangsmåte for fremstilling av bakterielt SCP. En slik fremgangsmåte er den som er beskrevet i vårt britiske patent nr. 1 370 892, hvorved de bakterier som anvendes er stammer av artene Pseudomonas methylotropha (nå kjent som Methylophilus methylotrophus), Pseudomonas rosea, Hyphomicrobium variabile og Microcyclus polymorphum. En rekke stammer av disse arter er deponert i de følgende kultur-samlinger: ;(a) National Collection of Industrial Bacteria (NCIB) ,;Torrey, Research Station, Aberdeen, Skottland; (b) US Department of Agriculture (NRRL), Peoria, Illinois, USA; (c) Fermentation Research Institute (FRI), Japan; ;og er tildelt de følgende tiltredelsesnummere:;NCIB nr. 10508 - 10515; 10592 - 10596; 10516; 10517; ;10597 - 10612. ;NRRL nr. B5352 -B.5359;B5360 - B5364 ; B5381; B5382; ;B5365 - B5380. ;FRI nr. 1215 - 1222; 1223 - 1227; 1228; 1229; 1230-1245.. ;Egenskapene til ovennevnte 4 arter og de spesielle stammer som er oppført, er angitt i vårt britiske patent nr. 1 370 892. Av de arter som spesifikt er nevnt ovenfor, er Pseudomonas methyloltropha (Methylophilus methylotrophus) spesielt foretrukket. Blant de spesifikke stammer som er oppført ovenfor, er disse arter representert ved stammene NCIB nr. 10508-10515 og 10592-10596. ;Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan være en sats-yis eller kontinuerlig fremgangsmåte, og den er fortrinnsvis en kontinuerlig fremgangsmåte. Ved en kontinuerlig fremgangsmåte blir en kultur av mikroorganismer dyrket i en fermentor, og en vandig suspensjon inneholdende mikrobielle celler blir kontinuerlig uttatt og utsatt for en serie med behandlingstrinn for å konsentrere suspensjonen før den første til en tørker. Ved en typisk fremgangsmåte-sekvens blir suspensjonen som forlater fermentoren utsatt for de følgende trinn før den føres til en tør-ker: (I) et flokkuleringstririn, som f.eks. involverer oppvarming og syrebéhandling så som beskrevet i vårt britiske patent 1 381 306, (II) ett eller flere separeringstrinn for å separere hovedmeng-den av væske fra de mikrobielle celler, hvor separert væske kan returneres til fermentoren mens•en konsentrert suspensjon som ofte kalles "tørker-matingskrem" føres til tørkeren. ;Cellene kan behandles med oksydasjonsmidlet ved hvilket som helst trinn ved fremgangsmåten i Ved valg av trinn for ut-føringen av behandlingen er imidlertid følgende faktorer rele-vante: 1. Det anvendte oksydasjonsmiddel kan være toksisk for leven-de mikroorganismer og således ha skadelige virkninger på ;en vekst-kultur.;2. Mange oksydasjonsmidler blir degradert og helt eller delvis deaktivert av enzymer, så som peroksydaser og katalase, som er til stede i de fleste bakterier. 3. Mengden av nødvendig oksydasjonsmiddel avhenger av volumet av væske forbundet med cellene, og oppfinnelsen anvendes således mer økonomisk ved tilsetning av oksydasjonsmidlene til konsentrerte suspensjoner eller til produktet. 4. Behandling med oksydasjonsmiddel utføres fortrinnsvis ved temperaturer mellom 10 og 140°C, spesielt mellom 50 og 80°C, ;og en temperatur på 60°C er spesielt foretrukket.;.5. Den pH hvorved behandlingen med oksydasjonsmiddel utføres,, er fortrinnsvis i området 7,0-9,0, spesielt i området 7,5-8,5, og pH-verdier på 8,0 til 8,5 er mest egnet. La-vere pH-verdier er akseptable, men oksydasjonsforholdene blir forandret. Likeledes er høyere pH-verdier akseptable, men i dette tilfellet er en viss spaltning av oksydasjonsmidler tilbøyelig til å føre til i øket utstrekning å gjø-re behandlingen mindre effektiv. Ytterligere lutede og ;flokkulerte celler reagerer under forhold med høy pH for å danne en sterkt viskøs væske som er vanskelig å blande. Ved å ta hensyn til disse betraktninger er tilsetning av oksydasjonsmidlet til en vekst-kultur ikke foretrukket på grunn av problemene som forårsakes ved virkningen av oksydasjonsmidlet på en voksende celle og dens degradering ved katalase/perok-sydase. Etter celle-luting og suspensjonskonsentrering er katalase-degraderingen minimal og konsentrasjonen av faststoff høy. Det er. således foretrukket å behandle celle-suspensjonen med oksydasjonsmidlet kort tid før suspensjonen føres til tør-keren, dvs. å behandle tørker-matingskremen. Alternativt kan produktet fra tørkeren behandles med oksydasjonsmidlet. Selv om1 dette produkt løselig kan bli referert til som "tørkede" celler, så er det i virkeligheten en målbar mengde med vann forbundet med de "tørkede" celler, typisk 10 % (vekt)vekt). Dersom således oksydasjonsmidlet tilsettes i en mengde på 3 til .. 300 mmol pr i liter av produktets fuktighetsinnhold, kan dette beregnes på følgende måte: ;Typisk "tørt" produkt inneholdende 10 % fuktighet;= 100 ml vann/kg.;Derfor tilsettes 3-300 mmol oksydasjonsmiddel pr.;10 kg produkt.;Når produktet behandles med visse oksydasjonsmidlet, kan det være nødvendig med ytterligere fremgangsmåtetrinn for å fjerne spor av oksydasjonsmidlene fra det endelige produkt. ;Oksydasjonsmidlet er passende ett som er rent, som ikke etterlater noen toksiske rester og som ikke gjør noen, eller minimal, skade på produktets næringsmessige kvalitet. Det foretrukne.oksydasjonsmiddel er hydrogenperoksyd. Andre egnede oksydasjonsmidler innbefatter organiske peroksyder, uorganiske peroksyder, ozon og permanganat. Andre egnede oksydas jonsmåter ■*.

kan innbefatte elektrolytiske prosesser.

Den foretrukne mengde av oksydasjonsmiddel som tilsettes, varierer i en viss utstrekning med den pH hvorved tilsetninger foregår. Et foretrukket mengdeområde som er effektivt ved forskjellige pH-verdier, er imidlertid fra 30 til 175 mmol, spesielt

■70 til 150 mmol, pr. liter av en faststoff-suspensjon eller pr. liter av produktets fuktighetsinnhold. Ved de undersøkelser vi har foretatt har vi funnet den største effekt med minimal oksyda-sjon når oksydasjonsmidlet tilsettes i en mengde på 86 mmol pr. liter.

Varigheten av behandlingen med oksydasjonsmidlet ligger passende innen området 1 til 300 minutter, og 10 til 40 minutter og spesielt 30 minutter er foretrukket.

Ved anvendelse av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen oppnås et produkt som har en rekke fordeler overfor kjente prokaryotiske SCP. Viktigst er at anvendelse av dette produkt let-ter vanskelighetene med redusert for-inntak, redusert oppnådd le-vende-vekt og dårlig f6r-omdannelsesgrad undersøkt for husfugler, og reduserer tilfellene av leverskader når produktet gis med høy diettisk inklusjon.- I tillegg har produktet forbedret farve og forbedrede dispergeringsegenskaper, hvilket er viktig når det be-nyttes til foring av unge dyr, f.eks. gjøkalver. Disse fordeler øker generelt anvendbarheten av prokaryotisk SCP.

Oppfinnelsen blir belyst av de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Ved en serie med forsøk i stor skala ble han- og hun-kyllinger og verpende høner foret med dietter inneholdende Methylophilus methylotrophus (Pseudomonas methylotropha) enkeltcelleprotein, i noen tilfeller ubehandlet og i andre tilfeller behandlet med hydrogenperoksyd'ved fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Under fremstillingen av det anvendte behandlede enkeltcelleprotein ble celle-lysat (dvs. tørker-matingskrem) med et fast-stoffinnhold på 18 % (vekt/volum) behandlet med slike mengder av konsentrert hydrogenperoksydløsning (12 % vekt/volum) at den opprinnelige konsentrasjon av hydrogenperoksyd i kremen var mellom 0. og 175 mM. Etter blanding av hydrogenperoksydet med kremen ble den behandlede krem holdt ved en temperatur på 60°C og ved pH 7,0 i 30 minutter før den ble tørket med en flash-tørker.

Typiske resultater for fordietter for fugler inneholdende behandlet og ubehandlet enkeltcelleprotein, og for for-dietter for fugler hvor enkeltcelleprotein var erstattet med altnerati-ve proteinholdige materialer, er angitt i tabell 1. Fig. 1 er en grafisk fremstilling av forekomsten av grov observerbar leverskade (prosent av test-antallet) mot konsentrasjonen (æM) av hydrogenperoksyd i tørker-matingskremen for verpende høner (kurve A), hun-kyllinger (kurve B) og han-kyllinger (kurve C). Kurvene A, B og C er lineære regresjonsanalyser av de. data som ble oppnådd for alle kyllinger og verpende høner i disse serier av forsøk. Tilfellene av skader var høyest for verpende høner og minst for han-kyllinger. Den grafiske fremstilling viser at den minimale konsentrasjon av hydrogenperoksyd som er nødvendig for å redusere lever-skader hos kyllinger og verpende høner effektivt til null-nivåer, er 114 mM. Ved våre tester med for-dietter for fugler inneholdende alternative proteinholdige materialer, fremviste en rekke fugler leverskade.

EKSEMPEL 2

Ved en ytterligere serie med forsøk i stor skala ble husfugler foret med dietter inneholdende Methylophilus methylotrophus (Pseudomonas methylotropha) SCP, i noen tilfeller ubehandlet og i andre tilfeller behandlet med hydrogenperoksyd i henhold til fremgangsmåten ved foreliggende oppfinnelse. SCP ble fremstilt i et stort forsøksanlegg ved anvendelse av fremgangsmåten i vårt britiske patent nr. 1 370 892. Ved fremgangsmåten ble bakterie-celler dyrket i et metanolholdig medium i en fermentor ifølge vårt britiske patent nr. 1 353 008. Celle-suspensjonen som forlater fermentoren ble behandlet ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge vårt britiske patent nr. 1 381 306 og ble konsentrert for å danne en tørker-matingskrem (DFC) som deretter ble ført til en tørker.

Ved disse forsøk ble prøver av DFC ved pH 4 og med et fast-stoffinnhold på 12-15 % tatt fra anlegget og utsatt for de føl-gende behandlingstrinn i et laboratorium for å danne hydrogenperoksyd-behandlet materiale (trinnene 2 og 4 ble utelatt for å danne et ikke-hydrogenperoksydbehandlet sammenligningsmateriale: 1. KOH/NaOH tilsettes (1,68:1,00 mol-forhold) for å gi den ■ ønskede pH,

2.H2^2t;"-lsettes, se bemerkningen nedenfor,

3.. temperaturen holdes ved 60°C i 30 minutter,

4. det re-nøytraliseres til pH 7 med f^SO^,

5. det sprøyte-tørkes, og

6. forprøven granuleres.

x Ved forsøk nr. APC021J ble dette trinn funnet nødvendig.

I trinn 3 ble en mengde på 12 % (40 vol.) hyrdrogenperok-syd satt tilDFC. Antall milliliter hydrogenperoksyd som set-tes til 100 g DFC betegnes heretter som "% tilsetning" av hydrogenperoksyd, dvs. at tilsetning av 2,5 ml til 100 g DFC gir en "2,5 %" hydrogenperoksyd-behandling - svarende til tilsetning av 86 mmol pr. liter hydrogenperoksyd.

Prøver av SCP oppnådd som beskrevet ovenfor ble inkludert i diettene til følgende fugler:

(a) For-dietter for broiler-kyllinger (Ross I) inneholdende

25 % av test-prøven fra tilnærmet 8 til 22 dager gamle.

(b) For-dietter for verpende høner (lette hvite hybrider over

40 uker gamle) inneholdende 30 % av test-prøven i 6 dager.

I hver av en serie på 6 forsøk ble SCP behandlet med "2,5%" hydrogenperoksyd med varierende pH-verdier, og ble inkludert i diettene til de ovennevnte fugler (4 forsøk med kyllinger og 2 med verpende høner). I hvert tilfelle ble det også anvendt en sammenligningsdiett inneholdende ubehandlet SCP. De biolo-giske data utviklet fra disse forsøk er oppsummert i den grafiske fremstilling vist i figur 2. I denne er ordinaten de prosentvise tilfeller av leverskade, i forhold til dem som forekommer med en sammenligningsdiett innbefattet ubehandlet SCP ved samme forsøk (tatt som 100 %), ved anvendelse av dietter inneholdende SCP behandlet med "2,5 %" hydrogenperoksyd. Abscissen er pH ved hydrogenperoksyd-behandling for det behandlede SCP.

De forskjellige symboler ved den grafiske fremstilling repre-senterer de forskjellige forsøk hvorfra de plottede verdier ble oppnådd. Den prosent fugler som fremviser leverskade blant dem som ble foret med en sammenligningsdiett inneholdende ubehandlet. SCP ved hvert forsøk, er angitt i tabell 2.

Prosentene gitt i tabell 2 ble tatt som 100 % verdiene for den grafiske fremstilling i figur 2 med hensyn til de individu-elle forsøk.

Disse data viser klart et pH-optimum for slik hydrogenper-plsksydbehandling i pH-området 8-8,5. De gjennomsnittlige prosentvise tilfeller av lverskade representert ved den stiplete linje i den grafiske fremstilling i figur 2, er:

Ved et ytterligere forsøk APC024J utført på den ovenfor beskrevne måte, ble både,mengden av hydrogenperoksyd-tilsetning og pH ved behandlingen med hydrogenperoksyd variert. De resulterende data for leverskade fra dette forsøk er oppsummert i den grafiske fremstilling i figur 3. Ved denne grafiske fremstilling er ordinaten de prosentvise tilfeller av leverskade,

i forhold til dem som forekommer når det anvendes en ubehandlet sammenligningsprøve (tatt som 100 %), ved anvendelse av for inneholdende SCP behandlet med varierende mengder hydrogenperoksyd ved varierende pH-verdier. Abscissen er pH ved hydrogenperoksyd-behandlingen. Disse data betyr at en optimal behandling ligger i området "2 %" H20 ved pH 8 og "2,5 %" H2°2 ved pH 8'5,

Claims (14)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av enkeltcelleprotein, omfattende å dyrke prokaryotiske mikroorganismer og déretter behandle de dyrkede mikroorganismer for å fremstille et produkt som omfatter hele ikke-levedyktige celler og/eller spaltede celler, hvorved mikroorganismene behandles med et oksydasjonsmiddel eller utsettes for andre oksydasjonsinnretninger, hvor oksydas jonsmidlet tilsettes eller de andre innretninger anvendes under dyrkingen og/eller under den etterfø lgende behandling og/eller tilsettes til eller anvendes på produktet etter den etter-følgende behandling, idet oksydasjonsmidlet tilsettes i en mengde på mellom 3 og 300 mmol pr. liter av en faststoff-suspensjon inneholdende mikroorganismene når det tilsettes under dyrking eller under etterfø lgende behandling, eller, når det tilsettes til produktet, tilsettes i en mengde på mellom 3 og 300 mmol pr. liter av produktets fuktighetsinnhold.

2. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, hvorved den prokaryotiske mikroorganisme er en bakterie.

3. Fremgangsmåte i henhold til krav 2, hvorved bakterien er en stamme av arten Methylophilus methylotrophus.

4. Fremgangsmåte i henhold til krav 3, hvorved bakterien er hvilken som helst av stammene NCIB nr. 10508-10515 eller 10592-10596.

5. Fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det under fremstillingen av enkeltcelleproteinet fremstilles en konsentrert' suspensjon før nevnte suspensjon utsettes for tørk-ing .

6. Fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at mikroorganismene behandles med oksydasjonsmidlet ved en. temperatur i området 10-140°C.

7. Fremgangsmåte i henhold til krav 6, karakterisert ved at behandlingen foregår ved en temperatur i området 50 til 80°C.

8. Fremgangsmåte i henhold til.hvilket som helst av de foregående krav, hvorved mikroorganismene behandles med oksydasjonsmidlet ved en pH i området 7,0-9,0.

9. Fremgangsmåte i henhold til krav 8, karakterisert ved at pH er i området 7,5-8,5.

10. Fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av de foregående, krav, karakterisert ved at oksydas jonsmidlet tilsettes i en mengde innen området 30-175 mmol pr. liter av faststoff-suspensjonen eller pr. liter av produktets fuktighetsinnhold.

11. Fremgangsmåte i henhold til krav 10, karakterisert ved at oksydasjonsmidlet tilsettes i en mengde innen området 70-150 mmol pr. liter.

12. Fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at varigheten av behandlingen med oksydasjonsmidlet er innen området 1-300 minutter.

13. Fremgangsmåte i henhold til krav 12, karakterisert ved at varigheten av behandlingen er innen området 10-40 minutter.

14. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at oksydasjonsmidlet er hydrogenperoksyd.