NO800744L - Diagnosefremgangsmaate og utrustning til gjennomfoering av denne. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en diagnosefremgangs-måte, spesielt en.fremgangsmåte til diagnose av atherosklerose, og en innretning til dennes gjennomføring.

I lengere tid har det blitt antatt at athero-sklerose begynner med en beskadigelse av det arterielle endothel. Ved beskadigelser i endothelet utsettes subendotheliale bindevev for innvirkninger av kompo-

nenter av det sirkulerende blod. Blodplatene kleber til den frilagte overflate•av bindevevet, aggregerer og

frigjør ved siden av andre stoffer en vekstfaktor som,

slik det kunne påvises, stimulerer proliferasjon av

glatte muskelceller in vitro. Under normale betingelser regenererer éndotelet seg ved en kombinasjon av celle-migrering og celleproliferasjon og underbinder i. løpet av få dager blodets kontakt med et underliggende vev.

Den kumulerende effekt av korte proliferasjonsfaser av

de glatte muskelceller er å se som måtelig fortykning av karintima ved økende alder. Det antas at atherosklerotiske lesjoner, dvs. fokale, overmåls intima-fortykninger, utvikler seg på steder for gjentatt beskadigelse av éndotelet.

Fremadskredende karlesjoner inneholder overmåte meget lipide indre deler, som dekket av fibrøse deler med tett kollagen og hyperplastiske, glatte muskelceller.. I henhold til forskjellige litteratur-angivelser akselererer også høye konsentrasjoner av serumlipider dannelsen av atherosklerotiske lesjoner.

Diagnosefremgangsmåten ifølge opp-

finnelsen beror nu på den hittil ikke kjente fastslåing at migrering av endothelceller eller celler med endotheliale egenskaper in vitro i nærvær av serum av forsøksdyr, spesielt sv.in, så får en atherogendiett, som også i nærvær av serum av atherosklerose-pasienter er mindre enn i nærvær av serum av normalt forede forsøks-

dyr, resp. sunne personer. En nedsatt migrasjon in vivo kunne bevirke en økning av erstatningen av tapte celler og av lukning av små hull i endotellet og dermed begunstige

dannelsen av atherosklerotiske lesjoner. Den nedsatte migrasjon ville således på ingen måte stå i motsetning til de videre ovenfor sammenfattede kjente funn med hensyn til dannelse av atherosklerotiske lesjoner.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen til diagnose av atherosklerose erkarakterisert vedat man■sammenligner migreringen av endothelceller eller celler av endothellignende morfologi in vitro i nærvær av serum av personen som skal undersøkes med migreringen av tilsvarende celler i nærvær av serum av sunne kontrollpersoner eller andre standardsera og iakttar en nedsatt migrering i nærvær av serum av personen som skal undersøkes som henvisning til mulig nærvær av atherosklerose av denne person. Endothelceller som er anvendbare ifølge fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er eksempelvis slike fra svine-aorta (sammenlign D.De Bono, Nature 252, 83-84 (1974) og J.D. Pearson et al., Biochem. Soc. Transactions 5, 1181-1183

(1977)), og videre celler med endothellignende morfologi

er spesielt Balb/c 3T3-A31-celler, en muse-cellestamme, som tilskrives endotheliale egenskaper (sammenlign K.R. Porter G.J Todaro og V.A. Fonte J.Cell.Biol. 59, 633-642

(1973)). Viktig er ethvert tilfelle at de anvendte endothellignende celler danner en enskikts-cellekultur.

Målingen av cellemigreringen foregår fortrinns-vis på enskikts-cellekulturer (monolayers), hvori en del av celleskiktet fjernes, dvs. ble anbragt et eller flere sår. For å påvise deltagelsen såvel av replikasjon som migrasjon ved gjenopprettelse av beskadiget endothel ved in vitro forsøk, måler M.M. Sholley, M.A.. Gimbrone og R.S. Cotran, (Laboratory Investigation 36, 18-25 (1977)) graden av gjenkolonisering av i encelleskikt (monolayers) av endothelceller av menneskelig navlesnorvener anbragte typer av 0,4-0,5 mm bredde, idet ved siden av celletettheten ble det også målt graden av DNA-syntesen på grunn av opptak av<3>H-thymidin og for fastslåelse av delen av migrasjon ble replikasjonen utkoblet ved en del av prøvene ved bestråling, hvilket samtidig ganske betydelig nedsatte innbygning av<3>H-thymidin. For den kvantitative vurdering av migrasjonen alene er imidlertid vesentlig mere egnet og enklere enn av R.R. Biirk omtalt arbeidsmåte for en annen målsetning, måling av stimuling av migrasjon av Balb/c 3T3-celler ved hjelp av en fra tumorigen cellestamme SV 28 frigjort migrasjonsfaktor i serum-fritt medium, sammenlignet med forhold av normal Balb/c 3T3-celler i fravær og i nærvær av serum i Proe.Nat.Acad.Sei. USA 70 369-372 (1973).

I henhold til denne arbeidsmåte dyrkes enskikts-cellekulturer av Balb+c 3T3-A31-celler i . Petriskåler av kunststoff på den i følgende eksempel 1 nærmere omtalte og lett tilpassede måte under anvendelse av en egnet næringsoppløsning, som Dulbecco's Medium

(Gibco H21 HG) inneholdende 10% føtalt kalveserum (Gibco) samt penicillin og streptomycin og deretter anbringes et stivt barberblad eller.barberbladhalvdel, alt etter stør-relsen av skålen, et på en side skarpt begrenset, ca. 1 cm

brett, sår som strekker seg inn i kunststoffbuhnen. Deretter gjennomføres måling av migreringen under tilsetning av friskt medium med et innhold av f.eks. 4% eller 8% av det pasientserum som skal undersøkes resp. det normalserum som tjener til sammenligning. Anbringelsen av et sår av den angitte størrelse på den angitte måte er også meget hensiktsmessig ved anvendelsen av andre enskikts-cellekulturer.

Som målestokk for migreringen tjener f.eks. antall av de celler som pr. mm av den skarpe grenselinje migrerte over denne inn i til å begynne med cellefrie sår. Dette antall betegnes i eksemplene som migrasjonsenhet.. Mens' celledelingen først starter etter 30 timer, begrenses forsøksvarigheten til mindre enn 30 timer, f.eks. til 22 timer, hvorved det overflødiggjøres forholdsregler for å hindre replikasjon. I steden for Balb/c-3T3-A31-celler, kan det eksempelvis også anvendes endotelceller fra svine-aorta.

Foråt man bedre kan vurdere betydningen av den på en bestemt enskiktscellekultur fastlagt nedsatt migrasjonsaktivitet.av pasientserum, er det hensiktsmessig, samtidig på tilsvarende tilberedte enskikt-cellekulturer ikke bare å anvende migrasjonsaktiviteten av normalserum, men også den av serum med kjent, sterkt nedsatt migrasjonsaktivitet, dvs. i steden for bare en å anvende to standard sera. Slike standardsera kan,

i steden for fra utvalgte personer eller persongrupper, f.eks. også stamme fra spesielt, dvs. ikke-etherogen resp. atherogent forede svin. Også i dette tilfelle er imidlertid migrasjonsaktiviteten av sera av normale personer den utslagsgivende sammenligningsstørrelse hvormed svinesera sammenlignes og standardiseres og deretter anvendes som ekvivalent av humanstandard.

Som det spesielt fremgår av følgende eksempel 4 egner fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen seg også godt til kontroll av resultater av terapeutisk og/ eller dietetiske forholdsregler ved bestående eller antatt atherosklerose.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eksempler.

Eksempel 1:

Bestemmelse av migrasjonsenhetene(tallet

av migrerte celler pr. mm grenselinje) av sera av med en atherogen diett forede og av normalt forede dvergsvin.

a) Forsøksdyr: Som sådanne tjente tilsammen 25 hann-dvergsvin. Av disse fikk 12 normalt svinefor. 11 svin

fikk en atherogendiett, som i tillegg til det normale svinefor inneholdt smult, cholesterol og jordnøttolje,. i 4 uker før serumuttak, og 2 svin fikk samme atherogene diett bare i. 2 uker før serumuttak.

b) Metode: Balb/c 3T3-A31- celler, i det følgende betegnet som 3T3-B-celler, ble underholdt ved videredyrkning i

forhold 1 til 5 ganger pr. uke hver gang før konfluens i Dulbecco's medium (Gibco H21 HG) med et innhold av penicillin og streptomycin samt 10% føtalt kalveserum (Gibco), som var blitt innaktivert ved oppvarmning ved 56°C 5

i 30 minutter. Hver gang 1x10 3T3-B-celler ble innbragt

i 2,5 ral medium i kuhststoff-petriskåler (til vev-kulturen) av 35 mm diameter. Etter 5 dagers inkubasjon ved 3 7°C ble det i hver skål ahbragt et sår ved lett inntrykning av halvparten av et stivt barberblad (f.eks. personna Gem,) gjennom celleskiktet i kunststoffbunnen til markering av en grenselinje, og bevegelse av kniven med svakt trykk.loddrett til denne linje inntil ca. 10 mm avstand herifra. Nu ble mediet frasuget sammen med de avskrapede celler. Deretter ble det tilføyet 2,4 ml friskt medium, bestående av Dulbecco's Medium (Gibco H21 HG) med penicillin og Streptomycin, fulgt av lOO^ul av serumet som skal' undersøkes, tilsvarende 4%. Etter 22 timer ble mediet frasuget og celleskiktet fiksert og samtidig farvet ved hjelp av Leishman's farvestoffer i metanol (1,5 g farvestoff pr. liter metanol, 1,5 ml oppløsning pr. skål). Etter 10 minutter ble det tilsatt 3,5 ml vann og etter ytterligere 45 minutter ble skålene spylt grundig med rennende vann og tørket. For vurdering ble f.eks. cellene (kjernene) talt på 3 strimler av hver 1,2 mm bredde loddrett til grenselinjen. c) Resultater: På fig. 1 er det oppstillet resultatene av migreringsbestemmelsene etter avstigende migrasjonsenheter (=antall celler pr. mm grenselinje, angitt på ordinataksen). Skraverte områder betyr migrasjonsenheter av sera av normalt forede svin og ikke markerte områder betyr migrasjonsverdier av sera av med atherogen diett forede svin, idet verdien av begge bare 2 uker atherogent forede svin erkarakterisertmed en stjerne. Oppdeler man sera ifølge deres migreringenheter i to halvdeler så befinner seraene av alle normalt forede svin seg i halvparten med høyere migrasjonsenheter på gjennomsnittlig 42.3 + 2,1, og alle sera av atherogent forede svin i halvdelen med lavere migrasjonsenheter på gjennomsnittlig 17.4 + 1,9.

Eksempel 2: Bestemmelse av migrasjonsenheter av sera av atherosklerotisk og normale personer. a) Opprinnelse av de undersøkte humansera. Det ble anvendt sera av 2 9 ambulant behandle-de atherosklerose-pasienter og 10 normale personer. Inntil undersøkelsen ble seraen oppbevart ved -18°C.

b) Metode:. Samme som i eksempel 1.

c) Resultater; På fig. 2 er resultatene av migreringsbestemmelsene igjen oppstillet etter fallende migrasjonsenheter (= antall celler pr. mm grenselinje, angitt på ordinataksen) med skraverte områder for sera av normale og ikke skraverte områder for sera av atherosklerotiske personer. Ved oppdeling av resultatene i halvdeler med høye resp. lavere migrasjonsverdier fremkom ennu tydelig sterkere forskjellige gjennomsnittsverdier på 60,9- 1,8 resp. 14,9 - 1,8 migrasjonsenheter. Seraene av to normale personer viser migrasjonsverdier i den nedre halvdel på den andre.side ligger migrasjonsverider av sera av 8 atherosklerose-pasienter ikke i den nedre halvdel eller i den nedre del av den nedre halvdel. Det samlede bilde er altså ikke så enhetlig som i eksempel 1, imidlertid ble det ved sera tilsammen 19 av de 29 pasienter entydig fastslått lavere migrasjonsenheter enn ved de samlede av de normale personer; sterkt nedsatt migrasjonsenheter er således et karakteristisk trekk av ca. 2/3 av pasientene, mens ved to, dvs. 1/5 av de normale personer ble det fastslått omtrent tilsvarende lave migrasjonsenheter. Bemerkelsesverdig■er også den tydelige adskillelse av senkede og "normale"migrasjonsenheter,

da bare 2 av tilsammen 29 pasientsera ga verdier som ikke kan tilordnes de "normale" eller senkede.

Eksempel 3: Sammenligning av migrasjonsaktiviteten av humansera på 3T 3 - B-celler (sammenlign eksempel 1) og på endothelceller av svine-aorta. a) Opprinnelse av sera: Som humansera ble det anvendt to med høy migrasjonsaktivitet og tre med lav migrasjonsaktivitet i forsøkene ifølge eksempel 2. b) Anvendte cellekulturer: Rene kulturer av endothelceller av svine-aorta ble tilberedt som følger: Av aorta av nyslaktede, 12 uker gamle svin ble endothelceller fjernet ved hjelp av kollagenase og med de minst mulig mekaniske inngrep (sammenlign J.D. Pearson et al., Biochem. Soc. Transactioris 5, 1181-1183 (1977)) og bragt sammen med Waymouth's Medium 752/1,. inneholdende 20% føtalt kalveserum i petriskåler. Etter konfluenz ble hver gang 2x10 5 celler viderekultivert i petriskåler av kunststoff av 35 mm diameter med 2,5 ml Waymouth's Medium, komplettert med 10% føtalt kalveserum. Etter 5 dager ble cellekulturene anvendt til bestemmelse av migrasjonsaktiviteten, sammenlign c).

Som 3T3-B-cellekulturer ble det anvendt de allerede i eksempel 1 omtalte.

c) Metode: Ved 3T3-B-cellekulturene var disse tilsvarende som omtalt i eksempel 1. Ved endothel-cellekulturene av svineaorta ble det i følgende punkter av-veket fra metodene i eksempel 1: Som medium ble det anvendt Waymouth's 752/1. Celletettheten var under forsøket omtrent dobbelt så stor som i skålene med

2 3T3-B-celler, dvs. 10 pr. cm i steden for ca. 5x10

pr. cm 2; de i tabellen angitte migrasjorisenheter refererer seg således likeledes til et omtrent dobbelt så stort celletall på grenselinjen.

d) Resultater:. Som det fremgår av følgende tabell, forholdt de undersøkte humansera seg med hensyn til

deres migrasjonsaktivitet i forhold til endothelceller av svine-aorta prinsipielt på samme måte som overfor 3T3-B-celler. Tallet av migrerte endothelceller fra svine-aorta var i alle tilfelle lavere enn ved 3T3-B-celler, imidlertid var forskjellene i migrasjonsaktiviteter av de forskjellige sera ennu mere utpreget med et gjennomsnittlig forhold av migrasjonsenheter av lavaktive til normalaktiv humansera fra 2,9 til 19,8 resp. 1 til 6,8, i forhold til 14,8 til 58,2 resp. 1 til 3,9 ved 3T3-B-celler. Herav kan det sluttes at endothelceller av svine-aorta.likeledes egner seg for anvendelsen i diagnosefremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som de i

eksemplene 1 og 2 utelukkende anvendte 3T3-B-celler.

Tabell til eksempel 3

Eksempel 4:

Tidsmessige forløp av migrasjonsaktivitet

av sera av svin med vekslende diett.

a) Forsøksdyr: Som sådan ble det anvendt to hunn-dvergsvin, som ved forsøkets begynnelse var 4 måneder

gamle og hver veide 12 kg.

b) Foringsmåte: Dyrene får i første rekke i 4 uker normalt svinefor, deretter i 4 uker atherogent for, dvs. svinefor med tilsetning av smult, cholesterol og jord-nøttolje, og endelig 8 uker igjen normalt svinefor. c) Bestemmelse av migreringsaktivitet: En gang ukentlig blir det uttatt serum og oppbevart til vurdering ved -18°C.

Migrasjonsaktiviteten av sera ble målt som antall migrasjonsenheter helt analogt eksempel 1. I tillegg ble det hver gang på vanlig måte bestemt også cholesterolspeilet. Resultater: De ukentlige (antall uker angitt på abscisse-aksen) fastslåtte migrasjonsenheter som gjennomsnittsverdier av seraen av begge svin (antall celler pr. mm grenselinje, angitt på venstre ordinatakse) og det til-hørende cholesterolspeil (i mg/100 ml, angitt på høyre-ordinatakse) er sammenstillet på fig. 3. De tilsvarende kurver viser entydig, at etter overgang fra normalt (ND) til atherogent for (AD) synker migrasjonsaktiviteten (uttrukket linje) minst så hurtig som kolesterolspeilet (i mg/100 ml, stiplet linje)øker, og tilbakeveksling til normal foring oppnås igjen, ennskjønt noe mindre hurtig de opprinnelige verdier.

Oppfinnelsens gjenstand er videre også en innretning til gjennomføring av diagnosefremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som inneholder de hertil nødvendige i beskrivelsen og eksemplene nevnte materialer og ut-

styr, nemlig

- egnede celler for enskiktcellekultur, f.eks. valgt av stammen Balb/c 3T3-A31, eller utvalgte endothelceller av arterier av svin eller storfe, eller utvalgte endothelceller av menneskelige navelvene; - dyrisk serum, egnet til forberedning av enskiktcellekultur, f.eks. et utvalgt, undersøkt føtalt kalveserum eller hesteserum; - egnet standardserum med normal migrasjonsaktivitet, f.eks. serum av spesielt forede svin eller et utvalgt ' menneskelig serum; - egnet standardserum med nedsatt migrasjonsaktivitet, f.eks. serum av spesielt forede svin eller et utvalgt menneskeserum; - egnet medium til kultivering av celler, som f.eks. et modifisert medium ifølge Eagle, eller et medium ifølge ' Dulbecco, eller Waymouth<1>s Medium; samt eventuelt - egnede, sterile kulturskåler av plstikmateriale; - kniver til frembringelse av sår, spesielt egnet med hensyn til egenskaper og størrelse, f.eks. tilsvarende

et halvert eller helt barberblad;

- innretning, egnet til holding av bladet for omsetning-

av sår; - innretning, egnet til holding av kulturskålene ved setting av sår;

- et egnet middel til farving av cellekjerne, som f.eks.

en 0,15 prosentig oppløsning av Leishman's farvestoffer i metanol;'- en utførlig beskrivelse for gjennomføring og vurdering av diagnosefremgangsmåten.

Innretning, hvor en eller flere av de som eventuelt tilstedeværende betegnede, lett anskaffbare utstyr og materialer mangler, omfattes også av oppfinnelsen.

Claims (16)

1. Fremgangsmåte til diagnose av atherosklerose, karakterisertvedat man sammenligner migrasjonen av endothelceller eller celler av endothellignende morfologi in vitro i nærvær av serum av den perosn- som skal undersøkes, med migrasjonen av tilsvarende celler i nærvær av serum av sunne kontrollpersoner eller av andre standardsera og iakttar en nedsatt migrasjon i nærvær av serum av personen som skal undersøkes som henvisning til mulig nærvær av atherosklerose hos denne person.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man måler cellemigrasjonen på enskikts-cellekulturer, hvori det ble fjernet en del av celleskiktet.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at man måler cellemigrasjonen på en i en petri-skål av kunststoff befinnen-de enskikts-cellekultur, hvori det er anbragt et på en side skarpt begrenset, ca. 1 cm brett, inntil kunststoff bunnen strekkende sår.

' 4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man måler cellemigrasjonen på enskikt-cellekulturen av endothelceller av svine-aorta.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man måler cellemigrasjonen på enskikts-cellekultur av Balb/c 3T3-A31-celler som celler med endothellignende morfologi.

6. Fremgangsmåte ■ ifølge krav 4, karakterisert ved at man anvender som medium for enskikt-cellekulturen Waymouth <1> s medium 752/1.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at man som medium for enskikt-cellekulturen anvender Dulbecco's medium.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6 og 7, karakterisert , ved at pasientserumet som skal undersøkes resp. normalserumet som tjener til sammenligning tilsettes til mediet i en konsentrasjon fra 4% til 8%.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man velger en forsøksvarighet mindre enn 30 timer, spesielt på 22 timer.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert vedat man som målestokk for cellemigrasjonen anvender antallet av de pr. mm av- den skarpe grenselinje ut over denne inn i de til å begynne med cellefrie sår migrerte celler.

11.. Innretning til utførelse av fremgangsmåten ifølge krav 1, som inneholder de hertil nødvendige materialer og utstyr, nemlig - egnede celler for enskikt-cellekulturer; - dyrisk serum, egnet til forbedring av enskiktscellekultur; - egnet standardserum med normal migrasjonsaktivitet, -egnet standardserum med nedsatt migrasjonsaktivitet, - egnet medium til. kultivering av cellene, samt eventuelt - egnede, sterile kulturskåler av plastikmateriale; - kniver til frembringelse av sår, - innretning til holding av kulturskålen ved setting av sårene, - innretning til holding av knivene for setting av sårene, et egnet middel til faring av cellekjernene, en utførlig beskrivelse for gjennomføring og vurdering av diagnosefremgangsmåtén.

12. Innretning ifølge krav 11, inneholdende celler av stammen Balb/c 3T3-A31.

13. Innretning ifølge krav 11, inneholdende utvalgtre endothelceller av arterier av svin eller storfe.

14. Innretning ifølge krav 11, inneholdende et medium ifølge Dulbecco til kultivering av cellene.

15. Innretning ifølge krav 11, inneholdende Waymouth's medium til kultivering av cellene.

16. Innretning ifølge krav 11, inneholdende en 0,15-prosentig oppløsning av Leishman <1> s-farvestoff i metanol.