NO802574L - Fremgangsmaate for fremstilling av antibiotikum ka-6643 - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder fremstilling av

antibiotikum KA-6643.

Det er isolert forskjellige stammer fra jord-mikroorganismer for å undersøke deres evne til å produsere antibiotika.. I de undersøkelser som førte til foreliggende oppfinnelse er det funnet at en nylig isolert stamme, referert til som KC-6643, er i stand til å produsere to former av nye antibiotika med utmerkede antibakterielle aktiviteter både mot gram-positive og gram-negative bakterier, og det er lykkes å isolere slike antibiotika fra dyrkingsvæsken.

Disse to former av antibiotika som fremstilles ifølge oppfinnelsen er strukturelt nær beslektet med hverandre. Som det fremgår av deres fysikalsk-kjemiske egenskaper og biologiske egenskaper som skal beskrives senere, er antibiotikumet en ny substans som er forskjellig fra alle kjente antibiotika.

Ifølge ett aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et antibiotikum som minst omfatter én substans som er representert ved formelen (I):

hvor R betyr et hydrogenatom eller -SO^H.

Ifølge et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse omfatter den en fremgangsmåte for fremstilling av et slikt antibiotikum bestående av trinnene å dyrke en mikroorganisme som tilhører slektenStreptomyces og å isolere den antibiotiske substansen fra dyrkingsvæsken.

I foreliggende søknad betegnes blandingen av de to former av antibiotikumet hvor R er H og -SO^H respektive som substansen KA-6643. Den form hvor R i formel (i) er et hydrogenatom betegnes videre som substansen KA-6643-A, mens den andre hvor R

i formel (I) er SO^ H. betegnes som substans KA-6643-B.

Andre gjenstander, trekk og fordeler ved oppfinnelsen vil lett fremgå av den følgende beskrivelse av visse foretrukne eksempler derav, sett i forbindelse med de medfølgende tegning ene, selv om variasjoner og modifikasjoner kan gjennomføres innen oppfinnelsesområdet.

I tegningene er:

Fig. 1 et ultrafiolett absorpsjonsspektrum-diagram av et natriumsalt av substansen KA-6643-A; Fig. 2 et infrarødt absorpsjonsspektrum-diagram av natriumsaltet i fig. 1; Fig. 3 et "<*>"H kjernemagnetisk resonansspektrum-diagram av natriumsaltet i fig. 1; Fig. 4 er et infrarødt absorpsjonsspektrum-diagram av metylesteren av substansen KA-6643-A; Fig. 5 et ''"H kjernemagnetisk resonansspektrum-diagram av metylesteren fra. fig. 4; 13 Fig. 6 et c kjernemagnetisk resonansspektrum-diagram av metylesteren fra fig. 4; Fig. 7 et ultrafiolett absorpsjonsspektrum-diagram av et dinatriumsalt av substansen KA-6643-B; Fig. 8 et infrarødt absorpsjonsspektrum-diagram av dinatriumsaltet fra fig. 7; og Fig. 9 et kjernemagnetisk resonansspektrum-diagram av di-na triumsaltet fra fig. 7. ;Den organisme som ifølge oppfinnelsen produserer substansen KA-6643 har følgende taksonomiske egenskaper. Det skal bemerkes at de morfologiske trekk i forskjellige iSP-media observeres når den dyrkes ved 2 7°C i 21 dager ved hjelp av vanlige metoder og at farven uttrykkes for den modne kultur overensstemmende med klassifikasjonen i ColorHarmony Manual (Container Corporation of America), om ikke annet er angitt. ;I. Morfologiske egenskaper;Den stamme som produserer substansen KA-6643 (heretter referert til som "StammeKC-6643") danner et luftig mycelium i forskjellige media som er enkeltvis forgrenet. Sporoforen produseres på det luftige mycelium hvorved rette sporekjeder tilveiebringes. Hver spore har en størrelse på 0,4 til 0,5^um x 0,9 til 1,0^um, har en oval til sylindrisk form og danner kjeder av 20 eller flere sporer hvis overflater er glatte. Sporekjedene er ofte sammensmeltet slik at de danner en hinne-lignende struktur, og oppdelingen av substratmyceliet observeres ;i noen media som anvendes i taksonomiske studier.;II. Dyrkingsegenskaper i forskjellige media;1) Sukrose-nitrat-agar;Vekst: God, flat spredning, farveløs - brungult (2fb) Luft-mycelium: Moderat, pulveraktig, hvitt (a) ;Løselig pigment: Intet;2) Glukose-asparagin-agar;Vekst: Moderat, flat og smøraktig, krem (1 1/2 ca ) - pastellgult (2hb) ;Luftmycelium: Intet;Løselig pigment: Intet;3) Glycerol-asparagin-agar;Vekst: God, vortet, rynket, brungul (2fg) - bambus (2gc) Luftmycelium: God, pulveraktig, perle (3ba) ;Løselig pigment: Intet;4) Stivelse-uorganisk saltagar;Vekst: God, rynket, smøraktig, bambus (2gc) - honninggul ;(2ic) ;Luftmycelium: God, pulveraktig, hvit (a) - perle (3ba) ;Løselig pigment: Intet;5) Tyrosin-agar;Vekst: God, betydelig vortet, rynket, gelatinøs kanel ;Luftmycelium: God, pulveraktig, perle (3ba);Løselig pigment: Intet;6) Næringsmiddel-agar;Vekst: Middels, svakt vortet, rynket, gelatinøs farveløs-lysegul (1 1/2 ea) ;Luftmycelium: Intet;Løselig pigment: Intet;7) Gjærekstrakt/maltekstrakt-agar;Vekst: Rikelig, rynket, smøraktig - gelatinøs sennep (2/e) Luftmycelium: God, pulveraktig, hvit (a) - perle (3ba) ;Løselig pigment: Intet;8)Havremel-agar ;Vekst: Moderat, flat predning, krem (1 1/2 ca) -smørgul ;(1 1/2 ga);Luftmycelium: Moderat, pulveraktig, hvitt (a) Løselig pigment: Intet ;9) Pepton-g jaer-jern-agar;Vekst: God, betydelig vortet, rynket, smøraktig, lysegul;(1 1/2 ea);Luftmycelium: Intet;Løselig pigment: Intet;III. Fysiologiske egenskaper;1) Vekst-temperaturområde: 3 - 33°C;2) Optimalt vekst-temperaturområde: 27'- 33°C;3) Flytendegjøring av gelatin: positiv;4) Hydrolyse av stivelse: Positiv;5) Koagulering av skummetmelk: Negativ;Peptisering av skummetmelk: Positiv;6)Dannelse av melanoid-pigment: Negativ;IV.Utnyttelse av karbonkilder;Utnyttelse av karbonkilder iPridham og Gottlieb agarmedium ble undersøkt med følgende resultater:Utnyttede karbonkilder: L-arabinose, D-xylose, D-glukose, D-furaktose, inositol og L-ramnose Ikke-utnyttede karbonkilder: Sukrose, raffinose og D-mannitol V. Den foreliggende stamme inneholder LL-diaminopimelinsyre i celleveggene. ;I betraktning av de foran angitte egenskaper antas stammen KC-6643 å tilhøre slekten Streptomyces, men viser karakteristiske egenskaper som f.eks. fragmentering av substratmyceliet, sammen-smelting av sporekjedene og lignende som er litt forskjellig fra de typiske mycelier av slekten Streptomyces. ;Det er imidlertid velkjent at de stammer som klassifiseres som tilhørende slekten Streptomyces, ofte antar spesifikke strukturer som f.eks. fragmentering av mugg i mediet og abnormali-tet i sporekjedene, og derfor anses det riktig å klassifisere stammenKC-6643 som tilhørende slekten Streptomyces. ;Når stammer av en natur hvor sporekjedene er rette, over-flaten av sporen er glatt, luftmyceliet er hvitt, baksiden av kolonien ikke viser noen karakteristisk farve, og de ikke produserer noe løselig pigment eller melanoid pigment, ettersøkes blant kjente stammer som er angitt i "Bergy's Manual ofDetermina-tiveBaeteriology", 8de utg., ISP av Shirling og Gottlieb, og "The Actinomycetes" av S.A. Waksman, 2 (1961), kan det nevnes syv mulige stammer omfattende Streptomyces albovinaceus (ISP 5136), Streptomyces aureocirculatus (ISP 5386), Streptomyces baarnensis (ISP 5232), Streptomyces chrysomallus (ISP 5128), Streptomyces candidas. (ISP 5141), Streptomyces gougeroti ;(ISP 5324) og Streptomyces griseoloalbus (ISP 5468). ;Streptomyces albovinaceous (ISP 5136) er forskjellig fra stammen KC-6643 i det at den vokser dårlig i sukrose-nitrat-agarmedium og vokser dårlig ved 5°C i forskjellige media, og har dårlig evne til å flytendegjøre gelatin og til å utnytte karbonkilder (d.v.s. den utnytter D-mannitol og ikke inositol). Streptomyces aureocirculatus (ISP 5386) skiller seg fra stammen KC-6643 ved at den danner dårlig luftmycelium og vokser ved 3 7°C, men dårlig ved 5°C, og at den hydrolyserer stivelse svakt og oppviser forskjellige grader av evne til å utnytte karbonkilder (d.v.s. den utnytter D-mannitol og ikke L-ramnose). Streptomyces candidas (ISP 5141) skiller seg fra stammen KC-6643 ved at den vokser dårlig i et sukrose-nitrat-agarmedium og knapt vokser ved 5°C, og også utnytter karbonkilder dårlig (d.v.s. det utnytter D-mannitol men ikke inositol). Streptomyces gougeroti (ISP 5324) skiller seg fra stammen KC-6643 ved at den vokser dårlig i et sukrose-nitrat-agarmedium og danner dårlig luftmycelium, er dårlig til å flytendegjøre gelatin og til peptonisering av skummetmelk og utnyttelse av karbonkilder (d.v.s. den utnytter L-mannitol men hverken inositol eller L-ramnose). Streptomyces griseoloalbus (ISP 5468) skiller seg fra stammen KC-6643 ved at den vokser ved 3 7°C men ikke ved 5°C, og også ved flytendegjøring av gelatin, utnyttelse av karbonkilder ;(d.v.s. den utnytter D-marinitol) og svakt gulaktig farve på luftmyceliet. Streptomyces baarnensis (ISP 5232) er relativt lik i dyrkingsnatur sammenlignet med stammen KC-6643 men er forskjellig i at den vokser dårlig ved 5°C og produserer et brunt, løselig ;pigment i et gelatinmedium, og har også dårlig evne til å utnytte karbonkilder (d.v.s. den utnytter D-mannitol men ikke inositol).. Streptomyces chrysomallus (ISP 5128) har dyrkingsegenskaper som er meget like egenskapene til stammen KC-6643, men vokser ikke ved 5°C eller i et skummetmelk-medium. videre skiller den seg fra stammen KC-6643 ved at den produserer et gult, løselig pigment i mange media og har evnen til å utnytte ;karbonkilder (d.v.s. den utnytter D-mannitol og ikke inositol). ;Som en stamme som kan produsere et produkt som er lik en metabolitt av stammenKC-6643 er det kjent 32 stammer til-hørende 11 arter omfattende Streptomyces cattleya, Streptomyces flavogriseus, streptomyces olivaseus, Streptomyces flavovirence, Streptomyces flaves, Streptomyces flavoviridis, Streptomyces algenteolus,Streptomyces shioyaensis, Streptomyces lipmanii, Streptomyces cremeus og Streptomyces gedanensis. Ingen av disse kjente stammer har imidlertid en slik natur at luftmyceliet har hvit farve og at inositol og ikke D-mannitol utnyttes. ;Fra de ovennevnte resultater er det konkludert med at stammenKC-6643 er en ny stamme som tilhører slekten Streptomyces og den betegnes som Streptomyces sp.KC-6643. Denne stamme er deponert iFermentation Research institute of the Agency of Industrial Science&Technology beliggende i nr. 1-3,Higashi 1-chomé,Yatabe-machi,Tsukuba-gun,Ibaragi-ken, Japan, den 7. april 1978, og er gitt mottagningsnr.FERM-P 4467. Stammen er også deponert i American Type Culture Collection beliggende i parklawn Drive 12301,Rockville, Maryland, the united States of America, 12. mars 1979, og er gitt mottagningsnr. ATCC 31493. ;Ved utførelsen av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan ikke bare stammenKC-6643 selv men også dens spontane og kunstige mutanter anvendes. ;Dyrkingen av foreliggende stamme kan foregå ved hjelp av enhver vanlig metode for dyrking av actinomyceter. Som karbon-kilde i media kan det anvendes en rekke kilder. Fortrinnsvis anvendes stivelse, glycerol, maltose, dekstrin, fruktose, melasse og lignende alene eller i kombinasjon. Det kan også anvendes hydrokarboner, organiske syrer, planteoljer og lignende.Nitrogenkilder omfatter soyabønnemel, gjærekstrakter, tørrgjær, pepton, kjøttekstrakter, mais-støpevæsker, casamino-syre, løse-lige stoffer fra brenneriet, ammoniumklorid, ammoniumsulfat, urea, natriumnitrat og lignende. Disse kilder kan anvendes alene eller i kombinasjon. Om nødvendig kan det tilsettes uorganiske salter, f.eks. natriumklorid, kaliumfosfat, natriumfosfat, magnesiumsulfat, kalsiumklorid, kalsiumkarbonat, kalsiumhydroksyd, koboltklorid, sinksulfat, jernklorid, jernsulfat og lignende, ;og spor av tungmetaller. videre kan det tilsettes organiske og uorganiske substanser som hjelp for veksten av myceliet til ;substansen KA-6643 og eventuelt lette produksjonen derav. Når det anvendes en luftet dyrkingsmetode foretrekkes det ytterligere å tilsette et antiformingsmiddel som f.eks. en fet olje, silikonolje eller paraffin. ;Selv om dyrkingen av stammen i et fast medium er mulig, foretrekkes dyrking i en væske, spesielt en neddykket dyrking som i det tilfelle hvor det produseres antibiotika. Slik dyrking gjennomføres under aerobe betingelser ved temperaturer i om-rådet 3 til 35°C, fortrinnsvis 27 til 33°C. ;Antibiotikumet KA-6643 kan produseres enten ved hjelp av;en rystedyrking eller en tankdyrking. Når en slik dyrking fortsettes i 2 til 10 dager, oppsamles det en aktiv substans i dyrkingsvæsken. Dyrkingen avsluttes ved den tid da mengden av produktet når et maksimum i dyrkingsvæsken. ;For å isolere substansen KA-6643 fra den således oppnådde dyrkingsvæske og rense den isolerte substansen kan forskjellige metoder anvendes som vanligvis anvendes for slike formål. ;Dyrkingsvæsken kan eksempelvis først sentrifugeres eller filtreres for å fjerne myceliet derfra, og filtratet underkastes enhver fritt valgt kombinasjon av følgende behandlingsmetoder. Filtratet kan føres gjennom en basisk anionvekslerharpiks for ;å tillate det ønskede produkt å absorberes på harpiksen, og det ønskede produkt oppnås ved eluering med en saltløsning eller en vandig metanolisk løsning av saltet. Eksempler på slike ione-vekslerharpikser omfatter sterkt basiske anionvekslerharpikser, f.eks. "Dowex" 1x2 (TheDow Chemical Co.), "Diaion" PA-318, ;316, 306S, 308 og 312 (MitsubishiChem. Ind.,Ltd), "Amberlite" IRA-400, 401 og 410 (Rohm&Haas Co.) og lignende, og svakt basiske anionvekslerharpikser som f.eks. "Amberlite" lRA-68. Alternativt kan dyrkings filtratet underkastes adsorpsjon med et adsorpsjonsmiddel som f.eks. aktivt karbon, og det ønskede produkt oppnås ved eluering med vandig metanol, vandig aceton eller lignende løsningsmiddel. ;Deretter føres den aktive fraksjon inkludert substansen KA-6643 gjennom en sterkt basisk anionvekslerharpiks, f.eks. "Dowex" 1x2, for å absorbere substansen KA-6643, hvoretter substansen trinnvis elueres under gradvis forandring av saltkonsentrasjonen i en fosfat-bufferløsning. I denne elueringsoperasjon elueres substansen KA-6643-A i et tidlig trinn, med etterfølgende eluering av substansen KA-6643-B, hvorved substansene KA-6643-A og KA-6643-B skilles fra hverandre. Alternativt kan den aktive fraksjon føres gjennom en kolonne pakket med en moderat polar eller ikke-polar, hydrofob, tverrbundet polymer som f.eks. "Amberlite"XAD-2 eller "Diaion" HP-20 for å skille substansene KA-6643-A og KA-6643-B på grunn av forskjellig adsorptivitet mellom dem. ;De således oppnådde substanser KA-6643-A og KA-6643-B underkastes, videre gelfiltrering ved å bruke en gel, f.eks. "Biogel" P-2 (BIO.RAD Lab.) eller "Sephadex" G-lO (Pharmacia FineChemicals), eller underkastes en omvendt fasekromatografi ved ;å anvende en kolonne som er pakket med "Bondapack" C,0 (Waters ;lo Associates, Inc.), hvorved det oppnås meget rene substanser KA-6643-A og KA-6643-B. ;Om nødvendig kan både substans KA-6643-A og KA-6643-B om-dannes på hvilken som.helst vanlig måte til alkalimetallsalter, jordalkalimetallsalter, primære, sekundære eller tertiære amin-salter eller kvartære ammoniumsalter derav. ;Substansen KA-6643 fremstilt ifølge oppfinnelsen har følg-ende fysikalsk-kjemiske egenskaper og biologiske egenskaper, og oppviser antibakteriell aktivitet mot gram-positive og gram-negative bakterier. Videre har substansen utmerket aktivitet mot bakterier som er resistente mot forskjellige typer av fi-laktam-antibiotika, og har/3-laktamase-inhiberende aktivitet. ;I. Fysikalsk- kjemiske egenskaper;A)Natriumsaltet av substansen KA- 6643- A;1)Utseende:Hvitt pulver;2) Smeltepunkt: Gradvis spaltet over 145°C;3) Ultrafiolett absorpsjonsspektrum: Når det måles i en vandig løsning er spektret i hovedsak det samme som er vist i fig. 1 med maksimal absorpsjon ved 240 nm og 288 nm og minimal absorpsjon ved 265 nm. 4) Infrarødt absorpsjonsspektrum: Når den opptas iKBr har substansen i hovedsak samme spektrum som vist i fig. 2. 5) Løselighet i løsningsmidler: Lett løselig i vann, men i det vesentlige uløselig i aceton, kloroform, etylacetat og petroleter. 6) Kjernemagnetisk resonansspektrum ''"H kjernemagnetisk resonansspektrum: Ved måling i er spektret i hovedsak det samme som vises i fig. 3. ;7) Tynnsjiktskromatografi;Rf-verdi: 0,6 (plate: TLC aluminiumark-cellulose ^ 254' 0,2 nm (Merck&Co., Inc.); løsningsmiddel: butanol-isopropylalkohol-vann (7:7:6)) ;Rf-verdi: 0,55 (plate: TLCaluminiumark-silikagel 60F254»0,2 mm (Merck&Co., Inc.), løsningsmiddel: isopropyl-alkohol-vann (7:1)) ;8)Væskekromatografi med høy ytelse;Elueringstid: 10,5 minutter;Kolonne: "yj-Bondapack" C^g (Waters Associates, Inc.),;4 x 300 mm ;Løsningsmiddel: Metanol-0,0lm fosfatbufferløsning (1:9), pH 6,8 ;Strømningshastighet: 1 m^</>min.;9) Molekylvekt: 364 (beregnet fra den verdi som ble oppnådd ved masse-spektrometri av monometylesteren). 10) Molekylformel: C-^H^^OgSNa (bestemt fra molekylformelen til metylesteren beregnet fra resultatene av masse-spektrometri ) . 11) Stabilitet:Halveringstiden ved forskjellige pH-verdier er som følger : ; Løsningsmiddel:;pH 4,0-7,0:Mcllvanine's bufferløsning (natriumfosfat- sitronsyre) ;pH 10,0: 0,lm natriumkarbonat-natriumhydrogenkarbonat-bufferløsning ;Måling:;Ultrafiolett absorpsjons-spektroskopi;<*>J. Antibiot., 32, 295-304 (1979)

B)Monometylester av. substansen KA- 6643- A

1) utseende:Farveløst faststoff

2) Molekylvekt: 356 (massespektrometri)

3) Elementæranalyse (som cj_5H2oN2°6S^

4) Molekylformel: ci5H2o<N>2°6S

5) Ultrafiolett absorpsjonsspektrum: Spektret i metanol har maksimal absorpsjon ved 243 nm og 300 nm og minimal

absorpsjon ved 2 74 nm.

6) Infrarødt absorpsjonsspektrum

Når den opptas iKBr, har substansen i hovedsak det spektrum som er vist i fig. 4.

7) Kjernemagnetisk resonansspektrum

1) H kjernemagnetisk resonans:

Ved måling iCDCl^ved bruk av tetrametylsilan som intern standard, er det oppnådde spektrum i hovedsak det samme som vises i fig. 5.

13

2) C kjernemagnetisk resonansspektrum:

Ved måling i CDCl^og bruk av tetrametylsilan som intern standard er det oppnådde spektrum i hovedsak det samme

som vises i fig. 6.

8) Tynnsjiktkromatografi

Rf-verdi: 0,44 (plate:TLCaluminiumark-silikagel 60F2g<4,>0,2 mm (Merck&Co., Inc.), løsningsmiddel: metylenklorid-metanol (9:11)).

9) Spesifikk rotasjon: ta]^<3>- 96,0° (cl, CH2Cl2)

C) Dinatriumsaltet av substansen KA- 6643- B

1)Utseende:Hvitt pulver

2) Smeltepunkt: Ikke angitt noe bestemt punkt og det ble gradvis gult til brunt ved temperaturer over ca. 130°C.

3) Elementæranalyse:

4) Ultrafiolett absorpsjonsspektrum: I hovedsak det samme som vises i fig. 7 og med maksimal absorpsjon ved 240 nm og 285 nm og et minimums absorpsjonsbånd ved 265 nm. 5)Infrarødt absorpsjonsspektrum: Det infrarøde absorpsjonsspektrum av substansen opptatt i KBr-tabletter er i hovedsak det samme som vises i fig. 8.

6) Kjernemagnetisk resonansspektrum:

Ved måling iD20 og bruk av tetrametylsilan som ytre standard, er det kjernemagnetiske resonansspektrum i hovedsak det samme som vises i fig. 9. 7) Løselighet i løsningsmidler: Lett løselig i vann, men i hovedsak uløselig i organiske løsningsmidler som f.eks. aceton, kloroform, etylacetat, petroleter og lignende. 24 o

8) Spesifikk rotasjonsevne: [a]D - 145 (cl, H20)

9) Stabilitet:Halveringstiden ved forskjellige pH-verdier er som følger:

Løsningsmidlet og målingene er de samme som i substansen KA-6643-A.

10) Tynnsjiktkromatografi:Resultatene er vist i tabell 1.

11)<p>apirkromatografi

Filtrerpapir: Toyo filter paper nr. 51 (Toyo Filter Paper

Co.,Ltd.) Løsningsmiddel: Acetonitril/vann (3:2), stigende metode Rf-verdi: 0,9

12)Væskekromatografi med høy ytelse

Kolonne: '^j-Bondapack" C-^g (Waters Associates, Inc.),

4 x 300 mm

Løsningsmiddel: 0,lm fosfatbufferløsning, pH 6,8 Strømningshastighet: 1 ml/min.

Retensjonstid: 23,5 minutter

13) Høyspennings-papirelektroforese

Når det anvendes en høyspent papirelektroforeseinnretning og substansen beveges i en l/30m fosfatbufferløsning (pH 7,0) ved 3000 V i 30 min., går den 8,5 cm mot anoden. Penicillin N'som er testet på lignende måte beveget seg 4,4 cm mot anoden.

II. Biologiske egenskaper

1) Antibakterielt spektrum

De antibakterielle spektra mot forskjellige mikroorganismer er vist i tabell 2 sammenlignet med spektrene til amino-benzyl-penicillin (AB-Pc) og cefoxitin (CFX).

Som det fremgår av det foranstående oppviser substansen KA-6643 intens antibakteriell aktivitet mot gram-negative og gram-positive bakterier inkludert de som er resistente mot forskjellige penicillin- og cefalosporin-antibiotika.

2)/3-laktamase-inhiberende aktivitet

i) Antibakteriell aktivitets-forbedrende virkning mot

/3-laktam-resistente bakterier

I penassay-agar (av hvilken 12 g ble oppløst i 500 ml destillert vann,Kyoei pharm. Co., Ltd.) ble det inokulert Escherichia coli EC-1 (PC-ase) og Citrobacter 24 (CS-ase) som

var/3-laktamase-produserende organismer, og 10ml av det inoku-lerte medium ble bragt til å flyte på en<p>etri-skål med 9 cm diameter og fastgjort for å gi et test-medium.

I dette agarmedium ble det plassert masseskiver med 8 cm diameter i hvilke det ble innført 30 ug av vandige løsninger av antibiotika, respektive, fulgt av dyrking ved 37 o C i 18 ti.mer og så måling av diameteren av en inhiberingssone rundt hver skive. Resultatene er oppført i tabell 3.

ii)/3-laktamase-inhiberende aktivitet

Når det som /3-laktamase-enzym anvendes penicillin-amido-hydrolase EC3.5.2.6 (TokyoChem. Syn. Co., Ltd.) oppnådd fra bakterier tilhørende slektenBacillus, var i5Q-verdien for

substansen KA-6643-A 0,5 ng/ml og for substansen KA-6643-B

12,8 ng/ml.

I5_ 0-verdien ble målt ifølge metoden til C. Reading og M. Cole (Antimicr. Agents andChemoth. 11, 852-857 (1977)).

Det kan derfor ventes at substansene KA-6643-A og KA-6643-B vil oppvise uttalte synergistiske virkninger i kombinasjon med andre/3-laktam-antibiotika.

I lys av de forskjellige egenskaper som er angitt ovenfor, er det fastslått at substansene fremstilt ifølge oppfinnelsen er /3-laktam-baserte antibiotika. Mens det er en kjent substans, d.v.s. MM 4550 (MC696-SY2-A), som har lignende ultrafiolett-spektrum som foreliggende substanser, skiller dette kjente antibiotikum seg fra substansene KA-6643-A og KA-6643-B på følgende punkter.

1) papirelektroforese

Underkastet papirelektroforese ved 3000 V i 25 min. Løsningsmiddel: 0,lm fosfatbufferløsning (pH 8,0) KA-6643-A: Beveget seg 5 cm mot anodesiden

• MM 4550:Beveget seg 10,2 cm mot anodesiden

2) væskekromatografi med høy ytelse

Kolonne: "u-Bondapack" C18(waters Associates,Inc.)

4 x 30 cm

Løsningsmiddel: 0,05m fosfatbufferløsning (pH 7,0) Strømningshastighet: 1 ml/min

Retensjonstid: KA-6643-A 1 time

KA-6643-B 30 min.

MM 4550 17 min.

Fra de ovenstående resultater er det funnet at substansen KA-6643 er en ny forbindelse som er forskjellig fra det kjente /3-laktam-antibiotikum.

Siden substansen KA-6643. fremstilt ifølge oppfinnelsen har en karboksylgruppe i molekylet, kan den anvendes i form av en fri syre, men den anvendes fortrinnsvis i form av salter.Egnede salter er eksempelvis salter av alkali- eller jordalkali-metaller som f.eks. natrium, kalium, kalsium og lignende; og ammoniumsalter som f.eks. ammonium, trimetylamin, dimetylamin og lignende. videre kan substansen anvendes i form av lavere alkylestere som metylester, etylester og lignende, eller høyere fettsyreestere .■

Oppfinnelsen skal illustreres ved hjelp av følgende eksempler hvor alle deler og prosenter er angitt etter vekt om ikke annet er angitt.

Eksempel 1

i) 30 1 av et væskemedium som inneholdt 3% stivelse, 1,5% soyabønnemel, 0,28% enbasisk kaliumfosfat, 0,18% tobasisk nat-riumfosfatdodekahydrat,0,0005% koboltklorid-heksahydrat,

0,05% magnesiumsulfat-heptahydrat og 0,001% ferrosulfat og som var justert til pH 6,0 ble tilveiebragt, og alikvoter på 100 ml av mediet ble hver innført i en 500ml Erlenmeyer-kolbe og sterilisert.Mycel av stammenKC-6643 ble inokulert i mediet og dyrket under rysting ved 2 7°C i 4 dager ved 220 opm.

ii) Etter fullført dyrking ble "Celite" (Johns-Manville Co..,Inc.) tilsatt som filterhjelpemiddel til dyrkingsvæsken, og mycelet ble fjernet ved filtrering.Filtratet (25 1) ble ført gjennom en kolonne (6 x 30 cm) av en,sterkt basisk anionvekslerharpiks, "Diaion"PA316 (Cl-typen,Mitsubishi Chem. Ind., Ltd.), fulgt av vasking med vann og eluering med en 0,0lm fosfatbufferløsning med pH 7,0som inneholder0,5m natriumklorid, for å oppsamle én aktiv fraksjon. Den resulterende aktive fraksjon ble ført gjennom en kolonne (4 x 30 cm) med aktivt karbon og, etter vasking med vann, så behandlet med 50 v/v % vandig aceton for å oppsamle en aktiv fraksjon. Den oppsamlede aktive fraksjon ble ført gjennom en kolonne (4. x 40 cm) av en basisk anionvekslerharpiks, "Amberlite" IRA-68 (Cl-type), fulgt av vasking med vann og så eluering med en 0,0lm fosfat-buf f erløsning med pH 7,0 inneholdende0,2m natriumklorid, for

å oppsamle en aktiv fraksjon. Den således oppnådde, aktive fraksjon ble ført gjennom en kolonne (3 x 30 cm) av aktivt karbon, som ble vasket med vann og eluert med 50 v /v % vandig aceton for å oppsamle en aktiv fraksjon.

iii) Den således oppnådde fraksjon ble ført gjennom en kolonne (4 x 30 cm) av en sterkt basisk anionvekslerharpiks, "Dowex" 1x2 (100 - 200 masker, Cl -type), fulgt av vasking med vann og behandling ved en konsentrasjonsgradient-eluering med en strømningshastighet på 3 ml/min mellom en løsning av 0,0lm fasfatbuffer med pH 7,0 inneholdende 0,lm natriumklorid og en løsning inneholdende0,4m natriumklorid, hvorved fraksjonen

deles i ytterligere to fraksjoner, idet den ene er en opprinnelig eluert fraksjon og den annen en deretter eluert fraksjon,

og oppsamling av de to fraksjoner separat.

iv) Den opprinnelig eluerte aktive fraksjon som var oppsamlet slik (ca. 1 liter) ble konsentrert til ca. 100 ml under redusert trykk ved under 30°C. Konsentratet ble ført gjennom en kolonne av "Diaion" HP-20som på forhånd var vasket med en 20%-ig saltløsning, fulgt av eluering med avionisert vann med en strømningshastighet på 4 ml/min. 'Det ble oppsamlet en aktiv fraksjon og konsentrert til ca. 2 ml ved temperatur under 30°C, fulgt av frysetørking for å oppnå 80 mg av et rått pulver av KA-6643-A.

v) Den etterfølgende eluerte aktive fraksjon ble behandlet på samme måte som i trinn iv) hvorved det ble oppnådd 240 mg av et rått pulver av KA-6643-B.

Eksempel 2

i) Et medium med en sammensetning på 2% stivelse, 1,5% soyabønnemel, 0,28% enbasisk kaliumfosfat, 0,18% tobasisk natriumfosfat-dodekahydrat,0,0005% koboltklorid-heksahydrat, 0,05% magnesiumsulfat-heptahydrat og 0,00l% ferrosulfat og som var justert til pH 6,0 og sterilisert, ble inokulert med mycel av stammen KC-6643, fulgt av for-dyrking ved 2 7°C i ca. 48 timer for å gi et første kim-medium. I hver av to tanker, hver med et volum på 200 1, ble det tilsatt 100 1 av et medium med samme sammensetning som ovenfor, men med 1% tilsatt bomullsfrøolje. Den første kim-kultur ble inokulert i hver tank i en mengde på 500 ml og dyrket ved 30°G ved hjelp av et luftet omrørings-system (300 omdr./min., en strømningshastighet på 50 l/min) i 4 dager.

ii) Etter at dyrkingen var fullført ble det til dyrkingsvæsken (170 1) tilsatt 10 v/v % "Dicalite<p>erlite" 4109 (Dicalite Orient Co., Ltd.) som filterhjelp, og mycel ble fjernet ved filtrering.

Det resulterende filtrat (150 1) ble justert i konduktivi-tet til 1,5 ml/cm og ført gjennom en kolonne (21,5 x 45 cm) av en sterkt basisk anionvekslerharpiks, "Diaion" PA316 (Cl -typen,MitsubishiChem.Ind.,Ltd.) med en strømningshastighet på 200 ml/min. Etter vasking med en 0,0lm fosfatbufferløsning (pH 7,0) ble harpiksen underkastet eluering med en 0,Olm fos fatbuffer-løsning (pH 7,0) inneholdende 2m natriumklorid i 2 v/v % ved en strømningshastighet på 150 ml/min for å oppsamle en aktiv fraksjon. Den således oppsamlede aktive fraksjon ble ført gjennom en kolonne (16 x 10 cm) av "Diaion" HP-20, som var justert med en 10 vekt/volum%-ig natriumkloridløsning, med en strømningshastighet på 400 ml/min, og, ble etter vasking med en 10 vekt/volum%-ig løsning av natriumklorid, eluert med avionisert vann med en strømningshastighet på 200 ml/min for å oppsamle en aktiv fraksjon.

iii) Den således oppsamlede aktive fraksjon ble ført gjennom en kolonne (6 x 70 cm) av en sterkt basisk anionvekslerharpiks, "Amberlite" IRA-458 (Cl~-typen,Rohm&Haas co.) med en strøm-ningshastighet på 50 ml/min og eluert med en 0,0lm fosfatbuffer-løsning (pH 7,0) inneholdende 0,15m natriumklorid. Den gjen-værende aktive fraksjon ble deretter eluert med en0,0lm fosfat-buf f erløsning (pH 7,0) inneholdende 2m natriumklorid.

iv) Den opprinnelig eluerte fraksjon i trinn iii) ble underkastet samme behandling som beskrevet i trinn iv) i eksempel 1, hvorved det ble oppnådd 700 mg av et rått pulver av substansen KA-6643-A.

v) Den etterfølgende eluerte aktive fraksjon ble ført gjennom en kolonne (6 x 70 cm) av "Diaion" HP-20 som på forhånd var behandlet med en 20vekt/volum%-ig vandig natriumklorid-løsning, og så eluert med avionisert vann med en strømnings-hastighet på 20 ml/min- for å oppsamle en aktiv fraksjon. Den således oppsamlede aktive fraksjon ble fortynnet med avionisert vann for å få en elektrokonduktivitet på ca. 700^J^cm og ført gjennom en kolonne (3 x 30cm) av en svakt basisk anionvekslerharpiks, "DEAE-Sephadex" A-25 (Pharmacia Fine Chemicals), som var justert til pH på 7,0 ved å bruke en 0,0lm fosfatbuffer-løsning, fulgt av vasking med vann og eluering med en fosfat-buf f erløsning (pH 7,0) inneholdende 0,15m natriumklorid ved en strømningshastighet på 35 ml/min for å oppsamle en aktiv fraksjon. Det således oppsamlede eluat ble konsentrert under redusert trykk ved temperaturer under 30°C og så ført gjennom en kolonne (3,5 x 40 cm) av "Diaion" HP-20som var behandlet på forhånd med en 10vekt/volum%-ig, vandig natriumkloridløsning og eluert med avionisert vann med en strømningshastighet på 20ml/min for å oppsamle en aktiv fraksjon. Den aktive fraksjon ble konsentrert under redusert trykk til ca. 2 ml og fryse-tørket for å oppnå 190 mg av et rått pulver av substansen KA-6643-B.

Det således oppnådde rå pulver ble oppløst i 1 ml avionisert vann og ført gjennom en kolonne (2 x 30 cm) av "Diaion" HP-20 og så eluert med avionisert vann med en strømningshastig-het på 1 ml/min for å oppsamle en aktiv fraksjon. Den således oppsamlede aktive fraksjon ble konsentrert under redusert trykk og ført gjennom en kolonne av "Sephadex" G-lO, fulgt av ut-vikling med avionisert vann med en strømningshastighet på 0,2 ml/min. Den aktive fraksjon ble oppsamlet, konsentrert under redusert trykk til ca. 2 ml og så frysetørket for å oppnå 80 mg av et rått pulver.

vi) 80mg av det således oppnådde pulver ble oppløst i

0,1 ml av en0,lm fosfatbufferløsning (pH 6,8) og ført gjennom en kolonne (0,8 x 120 cm) av "Bondapack" C^g/"Polasil" b (WatersAssociates, Inc.) som var forhåndsbehandlet med en 0,lm fosfatbufferløsning, fulgt av eluering med den samme buffer-løsning med en strømningshastighet på 6 ml/min for å oppsamle en aktiv fraksjon. Den aktive fraksjon ble ført gjennom en kolonne (0,9 x 5 cm) av aktivt karbon, vasket med avionisert vann og eluert med 50vekt/volum%-ig vandig aceton for å oppsamle en aktiv fraksjon. Den aktive fraksjon ble konsentrert under redusert trykk til ca. 1 ml og frysetørket for å oppnå

35 mg av et renset pulver av KA-6643-B

Eksempel 3

120mg av det rå pulver som ble oppnådd i eksempel 1 iv) eller eksempel 2 iv) ble oppløst i 1 ml avionisert vann og så ført gjennom en kolonne (0,8 x 60 cm) av "Bondapack" C,Q/-"Polasil" B (Waters Associates, Inc.) for høy-ytelses væskekromatografi og eluert med en 0,0lm fosfatbufferløsning med pH 6,8 inneholdende 2% metanol med en strømningshastighet på

6 ml/min for å oppsamle en aktiv fraksjon.

Den således oppsamlede aktive fraksjon ble konsentrert til 5 ml under redusert trykk og ført gjennom en kolonne (2 x 15 cm) av "Diaion" HP-20, som var vasket med en saltløsning fulgt av eluering med avionisert vann med en strømningshastighet på 1 ml/min for å oppsamle en aktiv fraksjon. Fraksjonen ble konsentrert til 1 ml og så ført gjennom en kolonne (3 x 150 cm) av "Sephadex" G-10 og eluert med avionisert vann med en strøm-ningshastighet på 1 ml/min. Deretter, ble den resulterende aktive fraksjon konsentrert til 2 ml under redusert trykk og frysetørket for å oppnå 4 mg av et renset produkt av et natriumsalt av KA-6643-A.

Claims (10)

1. Et antibiotikum, karakterisert ved at det minst inneholder en substans med formel (I):

hvor R betyr et hydrogenatom eller -SO^H , eller et salt eller en ester derav.

2. Antibiotikum ifølge krav 1, karakterisert ved at det bare omfatter substansen med formel (i) hvor R betyr et hydrogenatom.

3. Antibiotikum ifølge krav 1, karakterisert ved at det bare omfatter en substans med formel (I ) hvor R betyr -SO^H.

4.A ntibiotikum ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter en blanding av forbindelsene med formel (I), hvor R betyr et hydrogenatom og -SO^ H respektive.

5. Antibiotikum ifølge et av kravene 2 til 4, karakterisert ved at det omfatter et salt eller en ester av substansen eller hver av substansene med formel (I ).

6. Antibiotikum ifølge krav 5, karakterisert ved at det har spektrumsegenskaper for ultrafiolett absorpsjon, infrarød absorpsjon og kjerneresonans som vist i figurene 1 til 9 i tegningene.

7.F remgangsmåte for fremstilling av antibiotikum som krevet i krav 1, karakterisert ved at den omfatter trinnene å dyrke en mikroorganisme som tilhører slekten Streptomyces som vil produsere en substans eller substanser med formel (I) og isolere den antibiotiske substans eller de antibiotiske substansene fra dyrkingsvæsken.

8.F remgangsmåté ifølge krav 7, karakterisert ved at den nevnte mikroorganisme som- anvendes er stammen Streptomyces sp.KC -6643.

9.F remgangsmåte for fremstilling av et antibiotikum ifølge krav 7, karakterisert ved at fremgangsmåten er i hovedsak som beskrevet med henvisning til et av de foran-gående eksempler.

10. Anvendelse av stammen betegnet som Streptomyces sp. 6643 og er deponert i American Type culture collection (mottagnings-nummer ATCC 31493) i fremgangsmåten fra krav 7.