NO802714L

NO802714L - Optisk aktive cefalosporin-analoge karbacefemforbindelser og salter derav, samt fremgangsmaate til fremstilling derav

Info

Publication number: NO802714L
Application number: NO802714A
Authority: NO
Inventors: Fumio Suzuki; Tadashi Hirata; Takehiro Ogasa; Shigeru Kobayashi; Kiyoshi Sato; Akira Sato; Yukio Hashimoto; Seigo Takasawa
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority date: 1979-10-25
Filing date: 1980-09-12
Publication date: 1981-04-27
Also published as: AU6235580A; ES495036A0; EP0027882B1; EP0027882A1; CA1160584A; DE3069901D1; DK389180A; ES8200142A1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører hittil ukjente optisk aktive forbindelser av cefalosporin-analoge karbacefemforbindelser med den generelle formel:

hvor betyr hydrogen, rett eller forgrenet alkyl med 1-5 kar bona tomer eller rett eller for.grene.t acyl med 1-6 karbonatomer, R2betyr hydrogen eller en}karboksylbeskyttende gruppe, og hydrogenatomene i 6- og, 7-stillingene har cis-konfigurasjon, salter derav og en fremgangsmåte til fremstilling derav..";

Tidligere er karbacefemforbindelser, som er navn-gitt ifølge nomenklaturen i J. Am. 'Chem.' Soc. 9_6, 7584 (1974), hvor svovelatomet i cefalosporin er erstattet med et karbon-.atom, og som har en substituert metylgruppe i 3-still ingen, beskrevet i ovennevnte artikkel og i J. Med. Chem. _20, 551

(1977). Imidlertid er det ikke rapportert noen forbindelse av denne type som har særlig sterk' antibakteriell aktivitet.

Man har i denne forbindelse lykkes å fremstille karbecefemforbindelser med forskjellige substituenter i 4-, 5- og 3-stillingene (nummereringssystemet er som vist i ovenstående formel (I)). Forbindelsene er beskrevet .i beskrivelsene i den japanske offentliggjorte patentsøknad nr. 128591/79, DE-OS nr. 2 911 786, og US patentsøknad nr. 23 645, innlevert 23. mars 1979..

Videre har man lykkes å fremstille hittil ukjente acylerte karbacefemforbindelser som er hittil ukjente anti-biotika med sterke antibakterielle aktiviteter. Disse er beskrevet i beskrivelsene i den japanske offentliggjorte patentsøknad nr. 128581/79, DE-OS 2 911 787 og US patent-søknad nr. 23646, innlevert 23, mars 1979.

Imidlertid fremstilles de ovennevnte cefalosporin- analoge ved syntetiske metoder under anvendelse av optisk inaktive utgangsforbindelser, og d,e optisk inaktive dl [representert ved (±)]-forbindelser, med mindre de har en optisk aktiv acylgruppe. Nærmere betegnet forefinnes forbindelser med den generelle formel: hvor har den ovenfor angitte betydning, R-. betyr hydrogen, alkyl med 1-5 karbonatomer eller acyloksy med 1-6 karbonatomer, og hydrogenatomene i 6- og. 7-stUlingene har cis-konfigurasjon, som en blanding av like store mengder av speilbilde-forbindelsene med formlene:

hvori R2 og R^ har den ovenfor angitte betydning.

Som resultat av en larig rekke undersøkelser har man nå lykkes å fremstille og isolere en av de optisk aktive speilbilde-forbindelser med den antatte formel (II-l), som ér angitt i japansk patentsøknad nr. 14533/79 (europeisk patentsøknad nr. 8010.0663 . 6).

På lignende måte forefinnes forbindelser med den ovennevnte generelle formel (I), hvor hydrogenatomer i 6- og 7-stillingene har cis-konfigurasjon, også som en blanding av like store mengder av speilbilde-forbindelsene med formlene:

hvor R, og R2 har den ovenfor angitte betydning.

Som resultat av ytterligere undersøkelser har man nå også lykkes å fremstille og isolere en av de optisk aktive speilbilde-f or bindelser med.-: den generelle formel (I-l) • ■■....

I overensstemmelse hermed er de cefalosporin-analoge karbacefemforbindelser iføpLge oppfinnelsen optisk aktive forbindelser med den tidligere angitte formel (I) og salter derav.

I formel (I) kan det sbm eksempel på rette eller forgrenede alkylgrupper med 1-5 karbonatomer representert ved R^nevnes metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sek.-butyl og t-butyl.. jAcylgruppen representeres, ved R^CO, hvor R, er en rett eller forgrenet alkylgruppe med 1-5 karbonatomer, slik som de ovenfor angitte.

Estergruppen COOR2er en gruppe som lett omdannes til COOH, benyttet innen penicillin- og cefalosporinkjemien.

Gruppen kan være en rett eller forgrenet alkylgruppe med 1-5 karbonatomer, slik.som de ovenfor angitte,

en rett eller forgrenet alkoksymetylgruppe med 1-5 karbonatomer slik som metoksymetyl og etoksymetyl, en rett eller forgrenet halogenert alkylgruppe med 1-5 karbonatomer, slik som klormetyl, 2,2 , 2-trikloretyl og 2,2,2-trifluoretyl, en q alkylsulfonyletylgruppe med 1-5 karbonatomer i alkyldelen slik som metylsulfonyletyl og etylsulfonyletyl, en aryl-métylgruppe med 7-12 karbonatomer slik som benzyl, difenyl-metyl og trifenylmetyl, en substituert arylmetylgruppe med 7-20 karbonatomer, hvori substituenten er metoksy, nitro eller lignende, og antallet av substituenter på fenylringen er 1-5, eller en karboksylbeskyttende gruppe med den generelle formel:

hvor R. betyr rett eller forgrenéit alkyl med 1-5 karbonatomer, rett eller forgrenet alkoksy med 1-5 karbonatomer eller fenyl, og R^betyr hydrogen eller rett eller forgrenet alkyl med 1-5 karbonatomer-..

De optisk aktive forbindelser av cefalosporin-analoge med den generelle formel (il) , dvs. en av de enantio-mere, fremstilles.ifølge oppfinnelsen ved en optisk selektiv deacyleringsreaksjon under anvendelse av et enzym og en optisk inaktiv dl-forbindelse med en viss acylgruppe som utgangsforbindelse. De ønskede forbindelser oppnås i be-tydelig høyt utbytte ved denne fremgangsmåte.

En forbindelse dannet ved innføring av en optisk aktiv acylgruppe i dl-formen av en;forbindelse med den generelle formel (II), i det følgende'betegnet forbindelse II, dvs. en forbindelse med den generelle formel:

adskilles i diastereoisomere (japansk offentliggjort patent-søknad nr. 128591/79, DE-OS 2 91.1 787 og. US patentsøknad nr. 23646).

De optisk aktive forbindelser som oppnås ved foreliggende fremgangsmåte antas å ha den absolutte struktur representert ved den generelle formel (I-l), dvs. (6R, 7S),

ut fra forskjellige egenskaper, sterkere antimikrobiell aktivitet av acylforbindelsene sammenlignet med aktiviteten til de tilsvarende optisk inaktive , 'dl-f or bindelser og sammen-hengen mellom cefalosporinenes absolutte struktur og deres aktiviteter. Disse ■ forbindelser er særlig nyttige som mellom-

produkter ved fremstillingen av optisk aktive acylerte forbindelser som er sterke antibakteraelle midler.

I følgende beskrivels.e. omtales de optisk aktive forbindelser under henvisning til den generelle formel (I-l). Dessuten navngis forbindelsene i de følgende eksempler og referanseeksempler ifølge den antatte absolutte strukturformel.

Optisk aktive forbindelser av de cefalosporin-anaioge med den generelle formel (I) eller forbindelser med den antatte absolutte strukturformel (I-l) fremstilles ved optisk selektiv deacylering av en forbindelse med den generelle formel:

hvor R betyr en eventuelt substituert umettet 6-leddet karbocyklisk gruppe, en eventuelt substituert fenoksygruppe eller en eventuelt substituert 5- eller 6-leddet heterocyklisk gruppe, hvor substituentené er utvalgt blant hydroksy, halogen, nitro og metansulfonamid, X betyr hydrogen,- amino, hydroksy eller alkyl med 1-5 karbonatomer, R^ og R^har den ovenfor angitte betydning, og hydrogenatomene i 6- og 7-stillingene har cis-konfigurasjon (i det følgende betegnet forbindelse V).

Som eksempler på den umettede 6-leddede karbo-cykliske gruppe og den 5- eller 6-leddede heterocykliske gruppe kan nevnes fenyl, cykloheksenyl, cykloheksadienyl, tienyl, furyl, pyrrolyl, tiazolyl, isotiazolyl, oksazolyl, isooksazolyl, imidazolyl, pyrazolyl, triazolyl, tetrazolyl, pyridinyl og pyrazinyl. Som substituenter kan nevnes hydroksy, halogen, nitro, metansulf onamid og lignende.. Alkyl med 1-5 karbonatomer kan være rette eller forgrenede slik som metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sek-butyl,

t-butyl og lignende.

Den optisk selektive deacylering av forbindelse

V for dannelse av den optisk aktive forbindelse I-l utføres

i nærvær av et enzym oppnådd fra en mikroorganisme, som er i stand til å produsere optisk aktiv forbindelse I-l ved optisk selektiv deacylering av forbindelse V.

Som mikroorganismer med evne til optisk selektiv deacylering kan nevnes slike som tilhører slektene Aeromonas, Achromobacter, Arthrobacter, Acetobacter, Alcaligenes, Escherichia, Xanthomonas, Kluyvera, Gluconobacter, Clostridium, Comamonas, Corynebacterium, Sarcina, Staphylococcus, Spirillum, Bacillus, Pseudomonas, Flavobavterium, Brevibacterium, Protaminobacter, Proteus, Beneckea, Micrococcus, Mycoplana, Phodopseudomonas, Nocardia, Neurospora, Talaromyces og Acinetobacter. De følgende stammer er eksempler på anvendenlige mikroorganismer:

Mikroorganismene nr. 32-35 anvendes til fremstilling av forbindelse V, hvor R'er. fenoksy og X er hydrogen, i;

Til utførelsen av den optisk selektive deacylering kan enzymet mer spesifikt tilføres i enhver av de følgende former: 1. Dyrkningsvæske av mikroorganismen eller behandlet materiale derav; 2. Celler utvunnet fra dyr kningsvæs.ken ved sentr ifuger ing, som kan være vasket med saltvann (vanligvis omkring 1%), buffer-oppløsning og lignende eller kan foreligge som en cellesuspensjon; 3. En nedbrutt cellesuspensjon, dvs. en suspensjon av celler som er nedbrutt mekanisk eller ' k jemisk; 4. Et cellefritt ekstrakt, dvs. en væske oppnådd ved fjerning av de nedbrutte cellebestanddeler fra den nedbrutte cellesuspensjon; eller 5. En renset enzymoppløsning som oppnås ved utfelling av enzymproteinet fra det cellefrie ekstrakt med ammonium-sulfat og rensing av enzymproteinet ved gelfiltrering, ioneveksler-cellulose-søylekromatograf i, ioneveksler-

"Sephadex',v--^-søylekromatograf i og .lignende.

Cr)

Celler eller renset enzym immobilisert ved en konvensjonell metode kan benyttes;.

Reaksjonen gjennomføres ved en temperatur på 0-50°C, fortrinnsvis 20-45°C, og ved en pH-verdi på 4-10

i et inaktivt oppløsningsmiddel som ikke påvirker reaksjonen. •

Som oppløsningsmiddel anvendes mest foretrukket vann. For å oppløse substratet eller de cefalosporin-analoge kan anvendes organiske oppløsningsmidler slik som aceton, metanol, etanol, N ,-N-dimetylf ormamid , dimetylsulf oksyd og lignende. Det er effektivt å tilsette fosfatbuffer, Veronal-buffer eller sitronsyrebuffer for å regulere pH-verdien

under reaksjonen. Reaksjonstiden' som påvirkes av enzymets art og konsentrasjon, substratets art og konsentrasjon, reaksjonstemperaturen og/eller reaksjonens pH-verdi, er vanligvis fra 30 minutter til 24'.tåmer. Det foretrekkes å avslutte reaksjonen når reaksjon.sforholdene når maksimum.

Cellekonsentrasjonen er fortrinnsvis 1-10 mg tørrvekt pr. ml reaksjonsoppløsning. Når det anvendes et renset enzym, er det passende å benytte den mengde av enzymet som har samme aktivitet som den tørre celle. Substratet, forbindelse V, anvendes i en- mengde på 0,5-50 mg pr.

ml reaksjonsoppløsning.

I tilfelle av at den. benyttede mikroorganisme også produserer et enzym som B-lagtamasé, esterase eller lignende, som har tendens til å forhindre den ønskede reaksjon, kan slike mikroorganismer muteres ved kjent teknikk for oppnåelse av en mutant stamme, som.har redusert produk-tivitet av det uønskede enzym. Alternativt kan det tilsettes inhibitorer for slike enzymer til reaksjonssystemet for å heve reaksjonsforholdet.

Etter fullendelse av reaksjonen isoleres den ønskede forbindelse på konvensjonell måte, benyttet ved isoleringen når rensingen av organiske forbindelser fra dyrkningsvæsker, slik som absorpsjon på forskjellige bærere, ioneveksler-kromatografi, gelfiltrering, væske-væske-ekstraksjon og lignende.

Blånt forbindelsene me,d den generelle formel (I) kan de optisk aktive forbindelser;av de cef alospor in-analoge med den generelle formel: .

hvor har den ovenfor angitte betydning, R2 ' betyr en karboksylbeskyttende gruppe og hydrogenatomene i '6- og 7-stillingene har cis-konfigurasjon,i også oppnås ved forestring av de optisk aktive cefalosporin-apaloge med den generelle formel:\ hvor R-^ har den ovenfor angitte betydning, og hydrogenatomene i 6- og 7-stillingene har cis-konfigurasjon, på konvensjonell måte, dvs. forbindelsen med den generelle formel: hvor R^og R'2 har den ovenfor angitte betydning, fremstilles ved forestring av forbindelsen med den generelle formel:

hvor R, har den ovenfor angitte betydning, på konvensjonell måte.

Som eksempler på salter, av forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan nevnes salter med' uorganiske eller organiske baser, f.eks. alkalimetallsaltene, slik som natrium-eller kaliumsalter, jordalkalimetållsaltene slik som magne-siumsalter, ammonium-, tr imetylamih- ,_.tr ietylamin- , pyrri-din-, prokain-, ourin-, lysin- og argininsaltene, og salter med uorganiske eller organiske syr;er, f.eks. hydroklor ider, sulfater, karbonater, fosfater, formiater, trifluoracetater, malater og fumarater.

De optisk aktive forbindelser ifølge oppfinnelsen, dvs. forbindelse I-l, forventes i seg selv å ha antimikrobielle aktiviteter, og acylforbindelsene av den optisk aktive forbindelse I (f or bindelse • ;I-1) har meget sterkere antimikrobielle aktiviteter enn acylforbindelsene av den tilsvarende optisk inaktive forbindelse I. Eksempler på slike forbindelser og antimikrobielle aktiviteter derav er beskrevet i referanseeksemplene.

Fremgangsmåter til fremstilling av forbindelse V. er beskrevet i dansk patentsøknad;nr. 3980/80.- Fremstillingen av forbindelse V er eksemplifisert i de nedenstående referanseeksempler.

Oppfinnelsen belyses nærmere ved de etter-følgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av (4S,6R,7S)-7-amino-4-hydroksy-l-azabicyklo-[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre:

1-1. Fremstilling av nedbrutt cellesuspensjon.

1) Dyrking av en mikroorganisme med evne til optisk selektiv deacylering.

Som podestamme anvendes Kluyvera citrophila ATCC 21285 [biologiske egenskaper/er beskrevet.i J. General

AppliedMicrobiology, 3, 28-31 (1957)].

Som podemedium anvendes en vandig oppløsning inneholdende 1% polypepton, 1% gjærekstrakt, 0,5% kjøtt-ekstrakt, 0,5% natriumglutaminat. pg 0,25% natriumklorid og innstilt til en pH-verdi på 7,0 med 5N natriumhydroksyd-oppløsning. En øyefull av podestammen innpodes i 10 ml av podemediet i et stort reagensglass (50 ml), og dyrking ut-føres ved en temperatur på 30°C i 24 timer. Hele podevæsken innpodes i 300 ml av dyrkningsmediét i en 2 liters Erlenmeyer-kolbe og dyrking foretas med rysting ved en temperatur på 30°C. Sammensetningen av dyrkningsmediét er den samme som av podemediet. •' '

2. Fremstilling av nedbrutt cellesuspensjon.

Etter dyrkning i 24 timer underkastes dyrknings-væsken sen.tr ifuger ing for å utvinne celler. Cellene vaskes to ganger med 50 ml 0,9% saltoppløsning og suspenderes i en konsentrasjon på 40 mg/ml etter tøirrvekt i 1/30 M fosfat-bufferoppløsning (pH 8,0).

1-2. Fremstilling av en substratoppløsning.

200 mg (±)-cis-73-f enyl'acetamido-4a-hydroksy-l-azabicyklo[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, fremstilt som i ref er anseeksempel 2 nedenfor;, tilsettes til 9 ml 1/30 M fosfatbuffer (pH 8,0). Siden forbindelsen ikke oppløses tilsettes 2N natriumhydroksydoppløsnihg i en liten porsjon og blandingen innstilles igjen til en pH-verdi på 8,0 for å oppløse forbindelsen. Endelig tilsettes avionisert vann opptil 10 ml oppløsning.

1-3. Enzymreaksjon.

10 ml av ovennevnte nedbrutte cellesuspensjon tilsettes til 10 ml av substratoppløsningen og enzymreaksjonen gjennomføres ved en temperatur på 40°C i 80 minutter. Reaksjonens tidsforløp belyses i tabell 1.

1-4. Isolering og rensing av den ønskede forbindelse.

(a) Etter fullendelse av réaksjonen fjernes cellene fra reaksjonsoppløsningen ved sentrifugering. Den ovenstående væske konsentreres under forminsket trykk og påføres på en søyle (diameter 0,88 cm, høyde--7 0 cm) pakket med 43 ml "Diaion HP-20AG" (sikt 0 , 074-0 ,14.9/mm) . Eluering foretas med avionisert vann og den ønskedeiforbindelse elueres fra 36 ml til 45 ml av eluatet. Eluatet konsentreres under forminsket trykk og underkastes høyhastighets-væske-kromatografi under anvendelse av "TRI-ROTAR" og "Shodex OH Pak B-804". Det foretas eluering med vann. Eluatene konsentreres under forminsket trykk og lyofiliseres for oppnåelse av 37,6 mg av et hvitt pulver.

Produktets egenskaper er som følger:

IRUmaks(cm<_1>) 3530, 3190, 1746, 1620, 1550.

NMR (D20, med DSS som intern standard)6: 6,17 (1H, d,

J=5,4 Hz) , 4,95 (1H, d,. J=5,4. Hz) , 4,59 (1H, m) , 4,11 (1H, m) , 2,23 (1H, m) ,. 1,80 (1H, m) .

Produktets egenskaper'stemmer godt overens med egenskapene til den tilsvarende dl-forbindelse. Den optiske dreiningsverdi er [a]^ 3 0° = +24,2 n ;(c=0,153, H20). Det antas at produktet er en blanding av den ønskede forbindelse som oppnås ved rensing ved metode b) og c), og en spormengde av en høyredreiende forbindelse.

Forbindelsen utviser en ninhydrin-positiv enkelt flekk ved. en Rf-verdi på 0,38 ved .-silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatografi [ tynns j ikts'plate. "Merck Art 5721", utviklingsoppløsningsmiddel: etanol/eddiksyre/vann = 4:1:1]. Rf-verdien stemmer overens med verdien for den optisk inaktive dl-forbindelse.

(b) Etter fullendelse av. enzymreaksjonen utført som i eksempel 1-1 til 1-3, fjernes cellene fra reaksjonsoppløs-ningen ved sentrifugering og den ovenstående væske konsentreres under forminsket trykk. Kdnsentratet påføres på en søyle (diameter 0,88 cm, høyde 70 cm) pakket med 43 ml "Diaion HP-20AG", sikt 0-, 074-0 ,14;9 .mm) . Eluering gjennom-føres med vann. Eluerte fraksjoner (36 ml til 45 ml) inneholdende den ønskede forbindelse konsentreres igjen under forminsket trykk. Konsentratet på<!>føres'på en søyle (diameter 0,88 cm, høyde 33 cm) pakket} med. 20 ml "Diaion WA-30-S" som i forveien er bragt til eddiksyreformen ved at det er ført 40 ml 0,5N vandig eddiksyre.igjennom søylen. Etter at

.20 ml vann. er ført gjennom søylen for å fjerne urenheter., slik som uorganiske ioner, føres 0,5N vandig eddiksyre igjennom den. Det ønskede produktVelueres i fraksjonene (30-45 ml) av 0,5 N vandig eddiksyre. Fraksjonene lyofiliseres for oppnåelse av 32 mg av det ønskede produkt som et blekgult pulver. Produktets egens.kaper er som følger, og produktet identifiseres som aceta.tet av den ønskede forbindelse: IRUmaks (crn_1) : 3400'1805, 1760 , ''1745 (sh), 1600 ,

1560 (sh), 1410.

NMR (D20, med DSS som intern standard)6(ppm):

6,16 (1H, d, J = 5,4 Hz), 4,89 (1H, d, J=5,4 Hz),

4,57 (m, overleiret med signalet fra H20) , 4,08 (1H, m), 2,21 (1H, m), 1,97 (3H, s),. 1,78 (1H, mm).

20° o

Optisk dreining [aJD = -62,1 (c=0,16, IM fosfatbuffer,

pH 7,0) .

(c) Fremstilling av (4S, 6R, 7S)-7-amino-4-hydroksy-l-azabicyklo[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre. (alternativ metode): (c-1) Fremstilling av (4S, 6R, 7'S) -7-t-butoksykarbonyl-amino-4-hydroksy-l-azabicyklo[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre:

Etter fullendelse av.enzymreaksjonen, utført

som i eksempel 1-1 til 1-3, fjernes cellene fra reaksjons-oppløsningen ved sentrifugering, og den ovenstående væske, konsentreres under forminsket trykk. Konsentratet påføres på en søyle (diameter 0,88 cm, høyde 70 cm) pakket med 43 ml "Diaion HP-20" (sikt 0,074-0,149 mm). Eluering gjennomføres med vann. Eluerte fraksjoner (36 ml til 45 ml) kombineres, konsentreres under forminsket trykk og lyofiliseres til oppnåelse av 100 mg av et hvitt pulver. __Til pulveret tilsettes 1,0 ml dioksan, 1,0 ml vann, 21 yl i trietylamin og 40 mg S-t-butoksykar bonyl-4 , 6-dimetyl-2-|ner kaptopyr idin og blandingen omrøres ved romtemperatur . i< 4 dager og ved 40°C i 17 timer. Reaksjonsoppløsningen konsentreres under forminsket trykk for å redusere volumet til om i.kring det halve. Resten vaskes med etylacetat tre ganger, og pH-verdien innstilles til omkring 3 med 10% vandig sitronsyre under isavkjøling. Etter ekstraksjon med etylacetat fem ganger vaskes.etylacetatlaget med mettet saltoppløsning to ganger, tørkes med vannfritt natriumsulfat og konsentreres under forminsket trykk for oppnåelse av 6,5 mg hvite krystaller. Produktet identifiseres som den ønskede forbindelse på basis av de følgende egenskaper: IRUmaks (cm_1) : 3450' 3350, 1785 / 1765, 16-40 , 1540 .

NMR6 (CD3OD) 6 (ppm)\- 6,42 (1H, d, J.= 5,4 Hz), 5,27(lH,.d,

J=5,4 Hz), 4,41 (1H, m), 3,95 (1H, m), 2,3-1,2 (2H, m), 1,46 ( 9H, s) .

-, o

Optisk dreining: [alp = -38,2°. (c = 0,11, CH3OH) .

(c-2) Fremstilling av 4S, 6R, 7S)-7-amino-4-hydroksy-l-azabicyklo[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre:

3 ml vannfritt metylénklorid tilsettes til 63 mg. (4S, 6R, 7S)-7-t-butoksykarbonylamino-4-hydroksy-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, oppnådd som i eksempel c-1, og det tilsettes 3 ml trifluoreddiksyre under omrøring og isavkjøling. Blandingen omrøres ved den samme temperatur som ovenfor i 3,5 timer. Deretter konsentreres reak-sjonsoppløsningen under forminsket trykk for oppnåelse av et brunt oljeaktig produkt. Produktet behandles med etyleter for oppnåelse av 35 mg rått ønsket produkt som et gult pulver. Produktet påføres .på en.-'søyle pakket med 50 ml; "Diaion HP-20AG" og eluering foretas med vann. Fraksjoner som er positive for ninhydrin-fargereaksjon, kombineres og konsentreres under forminsket trykk for oppnåelse av 31 mg (47,0%) av. tr if luoracetatet av deri ønskede forbindelse. Produktet identifiseres som trifluoracetat av den' ønskede forbindelse på basis av følgende; egenskaper: IRUmaks(cra_1) : 3400'1800, 1780,' 1680., 1620 .

NMR (D20)6(ppm): 6,31 (1H, d, J=5:, 4 Hz) , 5,00 (1H, d,

J=5,4 Hz), 4,60 (1H, m) , 4,1,6 (1H, m) , 2,37-1,66

(2H, m).

Optisk dreining: [a]^ on ° = -61,9° (ci=0,0743<,>H20).

De i trinn (b) og (c) oppnådde forbindelse opp-fører seg på nøyaktig samme måte som forbindelsen i trinn (a) ved tynnsjiktskromatografi under de samme betingelser.

■ EKSEMPEL 2

Fremstilling av (4S, 6R, 7S)-7-amino-4-hydroksy-l-azabicyklo-[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre (alternativ metode):

2-1) Fremstilling av immobilis.ert enzym.

Celler av Kluyvera citrpphila ATCC 21285, dyrket i fem 2 liter kolber som i eksempel 1-1, suspenderes i 1/30 M fosfatbuffer (pH 7,0) i en konsentrasjon på 40 mg/ml som tørrvekt. Cellene underkastes nedbrytning med ultralyd ved 2.00 W i 2 minutter under anvendelse av en ultrasonisk disintegrator modell UR-200P. De nedbrutte celler underkastes sentrifugering for oppnåelse av en ovenstående væske. Etter tilsetning av 1 vekt-% stréptomycinsulfat hensettes den ovenstående væskeoppløsning natten over. Nukleinsyre fjernes fra oppløsningen og ammoni-umsulf at tilsettes i en konsentrasjon på 70% metning for å' utfelle enzymproteiner. Det utfelte materiale utvinnes ve.cl sentr ifuger ing og opp-løses igjen i 50 ml a<y>ionisert vann. Oppløsningen underkastes dialyse for avsaltning. Enzymoppløsningen konsentreres under■forminsket trykk til 10 ml og 0,5 ml IM eddiksyre/natriumacetat/buffer (pH 5) tilsettes. Separat forbehandles 10 ml "Diaion WK-10" i. 1/20 M eddiksyre/natrium-acetat-buffer (pH 5). Enzymoppløshingen og "WK-10" blandes, og blandingen omrøres ved en temperatur på 30°C natten over. Således fremstilles et immobilisert enzym.

2-2) Reaksjon, isolering og rensing- av den ønskede forbindelse .

Det ovenfor nevnte immobiliserte enzym (10 ml)

og 10 ml av en substratoppløsning fremstilt som i eksempel 1-2 blandes i et stort glass og omrøres ved en temperatur på 40°C i 2 timer. Reaksjonsoppløsnihgen dekanteres og renses som i eksempel 1-4. Det oppnådde produkt utviser nesten samme egenskaper som produktet i eksempel 1.

EKSEMPEL 3

3-1) 78,8 mg (0,178 m mol) 2-(2-tritylamino-4-tiazolyl)-2-syn-metoksyiminoeddiksyre oppløses i 0,8 ml vannfritt diklormetan, og 25 yl (0,17;8 ramol) trietylamin- tilsettes ved en temperatur på -20°C.: Etter tilsetning av 37 mg (0,178 mmol) fosforpentaklorid får blandingen reagere under omrøring ved en temperatur -på -20°C i 40 minutter, hvoretter den konsentreres under forminsket trykk. Resten oppløses i 40 ml vannfritt tetrahydrofuran for dannelse av en oppløsning av syre klor idet. Separat oppløses 34 mg' (0162 mmol) av en forbindelse fremstilt som i eksempel-1-4-(å) i en blanding av 1 ml tetrahydrofuran og 1 ml vann,;og 79 yl (0,565 mmol) trietylamin tilsettes. Den ovenfpp fremstilte syreklorid-oppløsning tilsettes dråpevis til oppløsningen under om-røring og isavkjøling, og ytterligere .20 yl trietylamin tilsettes. Blandingen får reagere i .2 timer og 45 minutter under isavkjøling. Deretter innstilles blandingen til. en pH-verdi på 2,0 med 10% saltsyre og ekstraheres to ganger med 10 ml etylacetat. Etylacetatlågene vaskes med 10 ml mettet saltoppløshing, tørkes med mettet natriumsulfat og konsentreres under forminsket trykk for oppnåelse av 114 mg av en rå acylforbindelse. Produktet oppløses i 10 ml 50% eddiksyre og omrøres ved en temperatur på 50°C i 30 minutter. -Oppløsningen avkjøles til romtemperatur og konsentreres. Resten oppløses i 1 ml metanol. 20 ml eter og 20 ml n-heksan tilsettes til oppløsningen, og blandingen sentrifugeres for oppnåelse av et bunnfall.' Bunnfallet lyofiii-seres for oppnåelse av 51 mg av et fast stoff. Det faste stoff oppløses i en blanding av metanol og vann (1:1). Opp-løsningen påføres på en søyle pakket med 30 ml "HP-20AG", og eluering utføres med 40 ml av en blanding av vann og metanol (10:1), 30 ml av en blanding av vann og metanol (4:1) og 150 ml av en blanding av vann og metanol (1:1). Fraksjoner som utviser en Rf-verdi på 0,3 ved silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatografi (plate: "Merck Art. 5719", opp-løsningsmiddel : butanol/edd.iksyre/vann = 4:1:1) kombineres .og konsentreres under forminsket trykk. Konsentratet opp-løses i 20 ml eter og 20 ml n-heksan for oppnåelse av et bunnfall. Bunnfallet utvinnes ved•■ sentrifugering og lyofiliseres for oppnåelse av 29,8 mg.(utbytte 45,5%) som hvite krystaller. Produktets egenskaper er som følger: IRUmaks(cm_1): 3450'1775, 1670, 1635, 1550.

NMR (DMSO d6-CD3OD)S: 9,28 (1H, d',.J=8,4 Hz), 7,07 (2H, s) ,

6,75 (1H, s), 6,27 (1H, d, J=5,4 Hz), 5,56 (2H, m), 2,77-2,04 (2H, m). Signalet fra -OCH3er overleiret med signalene som skyldes oppløsningsmidlet.

[a]D 2 4° = -32 (c=0,5, metanol).

3-2)

<>>

Til ytterligere oppløsas 200 mg av de i eksempel 3-1 oppnådde krystaller i 1 ml metanol, og 1 ml varmt vann tilsettes under oppvarming til 50°G. Oppløsningen hensettes ved romtemperatur for dannelse -av hvite krystaller. Krystallene som oppnås ved gjentagelse av krystalliserings-prosessen to ganger, vaskes med 1 fnl vann og tørkes i vakuum ved 45°C i 12 timer. Utbytte 120. mg. Produktet identifiseres som det ønskede produkt på basis av følgende egenskaper: Smeltepunkt: Produktet blir purpurrødt ved omkring 140°C

og gradvis brunt og dekomponeres ved 176-178°C

[a]D = -1 (c=0,9, metanol)

NMR (DMSO-d5, 100M) : 13,1' (1H, br), 9,25 (1H, d, J=8,3 Hz),

7,20 (2H, br), 6,76 (1H, s) ,. 6,25 (1H, d, J=5,4 Hz), 5,48 (1H, dd, J=8,3, 5,1 Hz),. 5,26 (lH,br), 4,30 (1H, m) , .3,84 (3H, s) , 1,43-2 , 05 (2H, m), Signalet fra protonet i 6-stillingen er overleiret med signalet fra -OCH3(6 3,84).

Elementanalyse:

Funnet C: 42,33%,. H: 4,43%, N: 17,89%

Beregnet som<C>14<H>15<N>5<OgS>l/2H20

C: 43,08% H: 4,13% N: 17,94%

i Høyoppløsnings-massespektrum

De . ovennevnte krystaller, .'som oppvarmes til 60°C i

5 timer i N,O-bistrimetylsilylacetamid, anvendes som prøven..

Masse = 669, 23408 (<C>^<H>^Og<lS>^<S><S>i'4)

3-3). Alternativ metode

(4S, 6R, 7S)-7-amino-4-hydroksy-l-a'zabicyklo[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, fremstilt som i eksempel l-4-(b)

og l-4-(c), behandles på samme måte som i eksempel 3-1 og 3-2, hvorved den samme ønskede forbindelse oppnås.

EKSEMPEL 4 j

De antimikrobielle aktiviteter av den i eksempel

3 fremstilte forbindelse er som følger. Hjerteinfusjons-agarfortynningsmetoden (pH 7,2) anvendes. Cefazolin og de

i referanseeksemplene 1 og 5 frems<p>ilte forbindelsér anvendes som kontroll.

EKSEMPEL 5

Fremstilling av (6R, 7S)-7-amino-l-azabicyklo[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2—karboksylsyre:

5-1. Fremstilling av cellesuspensjon.

Som podestamme anvendes Acinetobacter calcbati-cus ATCC 21288 [biologiske egenskaper er beskrevet i Bergey's ' . Manual of Determinative Bacter iplog.y 8th Edition, side 436-438 (1974)].

Som podemedium anvendes en vandig oppløsning inneholdende 1% polypepton, 1% g jeérekstrakt, 0,5% kjøtt-ekstrakt, 0,5% natriumglutaminat.bg 0, 25% natriumklorid og innstilt til en pH-verdi på 7,0 med 5N natriumhydroksydopp-løsning. En øyefull av podestammeh podes i 10 ml av podemediet i et stort reagensglass (50;ml), og dyrking gjennom-føres under rysting ved en temperatur på 28°C i 24 timer. Hele podevæsken innpodes i 300 ml åv dyrkningsmediét i en

to liters Erlenmeyer-kolbe, og dyrking foretas med rysting ved en temperatur pa o 28 o C. DyrkninI<g>smediet<s>sammensetning er den samme som podemediet..

Etter dyrking i 24 timer sentrifugeres dyrknings-væsken for å fraskille cellene. Cellene vaskes to ganger med en 50 ml 0,9% saltoppløsning dg suspenderes i 1/30 M fosfatbufferoppløsning (pH 7,5) i 1 en konsentrasjon på 40 mg/ml beregnet på tørrvekt.

5-2. Fremstilling av en substråtoppløsning.

(1) Fremstilling av■natriumsaltet av (±)-cis-73-fenoksyacetamido-l-azabicyklo[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre (i det følgende reférerer cis til stereo-kjemien ved 6- og 7-stUlingene) :

300 mg . (1,01 mmol)'av trifluoracetatet av

(±) -cis-7 3-amino-l-azabicyklo [ 4 , 2 ,,0 ]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, fremstilt som i eksempel 10 i den offentliggjorte' japanske patentsøknad nr. 49376/80, oppløses i 5 ml 50% tetrahydrof uran/vann- og 720 y.l (5, 0-mmol) ' trietylamin tilsettes. Til blandingen tilsettes 206 yl (1,5 mmol) fenoksyacetylklorid under omrøring og isavkjøling. Blandingen Omrøres ved den samme temperatur i 1 time, innstilles til pH 3-4 med 0,5N saltsyre og underkastes ekstraksjon med 20 ml etylacetat tre ganger. Etylacetatoppløsningen vaskes med saltoppløsning, tørkes med vanhfritt natriumsulfat og konsentreres under forminsket trykk for oppnåelse av 600 mg av et pulver. Pulveret oppløses ,i•3 ml mettet natriumhydro-genkarbonatoppløsning, og oppløsningen påføres på en søyle pakket med 100 ml %Diaion HP-10Eluering gjennomføres med vann, og eluatet konsentreres under forminsket trykk for oppnåelse av 160 mg (47%) av det ønskede produkt.

-1

IR (KBr)u^ks: 3330, 1780, 1545, 1240 , 760 .

Proton-NMR'(CDC13+ CD3OD)5(ppm): 7,6-6,6 (5H, m), 6,11 (1H,

t, J=4,4 Hz), 5,37 (lH.vd, J=5,0 Hz), 4,54 (2H, s) , 2,6-1,1 (4H, m) .. (2) 40 mg av den i det ovenfor angitte trinn oppnådde forbindelse oppløses i 1 ml 1/30 M. fosfatbufferoppløsning (pH 7,5) for dannelse av en substratoppløsning.

5-3. Enzymreaksjon og isolering og rensing av det ønskede produkt.

1 ml av den ovenfor oppnådde cellesuspensjon tilsettes til 1 ml av substratoppløsning, og blandingen underkastes enzymreaksjon ved 25°C i 20 timer. Cellene fjernes ved sentrifugering, og den ovenstående væske innstilles til pH 3,0 med 2N saltsyre. Reaksjonsoppløsningen påføres på

en søyle (diameter 2,14 cm, høyde :27 cm) pakket med 97 ml "Diaion HP-20AG" (sikt 0,074-0,149 mm). Eluering foretas med avionisert vann. Det ønskede produkt elueres i fraksjonene 87 ml til 153.ml, som konsentreres under forminsket trykk og lyofiliseres. Det resulterende produkt oppløses i

en blanding av små mengder vann og:metanol (volumforhold 50:50, det samme er tilfelle i det følgende), og oppløs-ningen påføres på en søyle (diameter 0,9 cm, høyde 70 cm), pakket med 45 ml "Sephadex ® LH-20". Eluering foretas med en blanding av vann og metanol (50;50). Det ønskede produkt elueres i fraksjonene 24 ml til 30 ml. Fraksjonene konsentreres under forminsket trykk for å fjerne metanol, og resten lyofiliseres for oppnåelse av 8 mg av et hvitt pulver. Produktets egenskaper er som fø lg eir : -1

IR (KBr)u^ks: 1800 , 1775 , 1640, -1620 .

NMR (100M, D20-DSS) 6 (ppm) : 6 , 44 ■ ■( lH ,_.dd , J=3,5, 4,7 Hz),

4,86 (1H, d, J=5,2 Hz), 4,04.<5>(1H, m) , 2,5-1,5 (4H,m).

Elementanalyse viste at forbindelsen har et molekyl saltsyre

i 20° o og et molekyl vann. Den optiske direining er [a]D = +47,6 (c= 0,11, i IM f osf atbuf f eroppløsn.ing pH 7,0) . Den optiske dreiningsverdi stemmer godt overens med verdien for den optisk aktive forbindelse fremstilt i referanseeksempel 1

15° o

nedenfor, dvs. [a]D = +48,5 (c=Q,5, i IM fosfatbuffer-oppløsning, pH 7,0).

EKSEMPEL 6

Fremstilling av ( 4S , 6R, 7S)-7-amino-4-hydroksy-l-azabicyklo-[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre:

6-1. Fremstilling av cellesuspensjon.

Cellesuspensjonen fremstilles på samme måte som

i eksempel 5-1.

6-2. Fremstilling av substratoppløsning.

(1) Fr emstilling av (± ) -ci.s-73-f enoksyacetamido-4oc-hydroksy-azabicyklo[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre: 404 mg (1,29 mmol) av trifluoracetatet av (±) -cis-7 3-amino-4a-hydroksy-l-aza,bicyklo [ 4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, fremstilt som, i eksempel 22 i den offentliggjorte japanske patentsøknad nr. 128591/79, oppløses i 4 ml vann og 8 ml aceton. Oppløsningen innstilles til pH 9 ved tilsetning av natriumhydrogenkarbonat under omrøring og isavkjøling. Deretter tilsettes 0,196 ml (1,42 mmol) fenoksyacetylklorid og blandingen omrøres ved 0°C i 1 time. Etter fullføring av reaksjonen fjernes acetonet under forminsket trykk og pH-verdien innstilles til 2 med IN saltsyre. Den resulterende oppløsning mettes.'.-med natr iumklor id og ekstraheres med 20 ml etylacetat .;6 • ganger . Ekstraktet vaskes med mettet saltoppløsning og tørke$ med vannfritt natrium sulfat. Natriumsulfatet fjernes ved filtrering og filtratet konsentreres under forminsket trykk. Konsentratet oppløses i 6 ml. etanol og etyleter og n-heksan tilsettes. Det utfelte bunnfall utvinnes ved sentrifugeriing og lyofiliseres for oppnåelse av 83,8 mg (0, 252 mmol., 20%) av det ønskede produkt. Produktets"egenskaper er som følgef: -1 !•

IR '(KBrJo^ :'■ 3400, 1770, 1730, 1680.

NMR (D20)6 (ppm): 7,48-6,95 (5H, m), 6,09 (1H, d, J=5,4 Hz),

5,50 (1H, d, J=4,9 Hz) , 4,67 ;(2H, s) , 4,6-4,4 (1H, m), 4,1-3,8 (1H, m) , 1,9-1,2 (2H, ja). (2) Til 80 mg av den i trinn (1) oppnådde forbindelse tilsettes 1 ml 1/15M fosfatbufferoppløsning (pH 7,5) . Blandingen innstilles til pH 7,5 med en liten mengde 2N vandig KOH-oppløsning for å oppløse forbindelsen. Til oppløsningen tilsettes avionisert vann opptil 2 ml, som benyttes som substratoppløsning.

6-3. Enzymreaksjon og isolering og rensing av det ønskede produkt.

2 ml av cellesuspensjonen tilsettes til 2 ml av substratoppløsningen og reaksjonen foregår ved 25°C i 20 timer. Cellene fjernes ved sentrifugering og den ovenstående væske innstilles til pH 3,5 med 2N saltsyre. Oppløsningen

.påføres på en søyle (diameter 0,88: cm, høyde 70 cm) pakket med 43 ml "Diaion HP-20AG" (sikt 0,:, 074-0,149 mm). Eluering foretas med avionisert vann. Det ønskede produkt elueres i fraksjonene 35 ml til 43 ml. Fraksjonene kombineres og innstilles til pH 7,0 med 2N KOH-oppløsning. Oppløsningen påføres på en søyle (diameter 2,0 cm, høyde 9,5 cm) pakket med 30 ml av' den svakt basiske anionvekslerharpiks "Diaion WA-30-S", som i forveien er bragt i eddiksyreform ved at

det er ført 60 ml 2N vandig eddiksyre og 60 ml avionisert vann igjennom søylen. Det føres 40 ml avionisert vann igjennom søylen, og deretter føres.; 0, 5N vandig eddiksyre igjennom. Det ønskede produkt elueres i fraksjonene 52 ml til 80 ml av 0,5N vandig eddiksyre! Fraksjonene kombineres og lyoflliseres for oppnåelse av 18 mg av et blekgult pulver. Produktets egenskaper er som følger. Produktet identifiseres som acetatet av den ønskede forbindelse.

-i

IR (KBr)u^ks: 3400, 1805, 1760, 1745 (sk), 1600, 1560 (sk) ,

1410.<

NMR (100M D20-DSS) 6 (ppm) : 6,16 (1H, d, J=5,4 Hz), 4,89 (1H,

d, J=5,4 Hz), 4,57 (m, overleiret med signalet som skyldes H20) , 4,08 (1H, m) , 2,21. (1H, m) , 1,97 (3H, s) , 1,78 (1H, m)..

Optisk dreining [ot]^<u>= -61,8° (c=0,18, IM f osf atbuf f er-oppløsning, pH 7,0).

REFERANSEEKSEMPEL 1

Fremstilling av (±)-cis-73-[2-(2-amino-4-tiazolyl)-2-syn-metoksyiminoacetamido]-4a-hydroksy-l-azabicyklo-[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre:

60 mg (0,203 mmol) av trifluoracetatet av (±)-cis-7 3-amino-4a-hydroksy-l-azabicyklo[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, fremstilt véd den metode som er be-, skrevet i den offentliggjorte japanske patentsøknad nr. 128591/79, oppløses i en blanding .av 1 ml vann og 1 ml tetrahydrofuran, og 56 yl trietylamin tilsettes til oppløs-ningen. Blandingen identifiseres.som reaksjonsoppløsning A.• På den annen side oppløses 125,7 mg (0,280 mmol) 2-(2-tri-tylamino-4-tiazolyl) -2-syn-metoks,yimino-eddiksyre i 1,2 ml vannfritt metylenklorid, og oppløsningen får reagere under avkjøling i tørr is/karbontetraklorid under omrøring i 50 minutter etter tilsetning av 39,3 yl trietylamin og 55 mg (0,264 mmol) fosforpentaklorid. Reaksjonsoppløsningen konsentreres under forminsket trykk, og til resten tilsettes 1 ml vannfritt tetrahydrofuran for dannelse av en syreklorid-oppløsning. Syrekloridoppløsningen og 28 yl trietylamin tilsettes til den ovenfor fremstilte reaksjonsoppløsning A

i tre porsjoner i løpet av 5 minutter. Blandingen får reagere i ytterligere 35 minutter og innstilles til pH 2,5 med 10% sitronsyre. Oppløsningen mettes med natriumklorid og ekstraheres med etylacetat tre ganger. De organiske lag

vaskes med mettet saltoppløsning og tørkes med vannfritt natriumsulfat. Etter filtrering og konsentrer ing renses resten ved silisiumdioksydgel-kromatografi (15 g silisiumdioksydgel, oppløsningsmiddel: metanol/kloroform = 1:3)

for oppnåelse av 185,5 mg av et rått acylprodukt. Til 86 mg av acylproduktet [forbindelse (13)] tilsettes 3 ml 50% eddiksyre og blandingen omrøres ved 50°C i 50 minutter. Deretter avkjøles blandingen og det utfelte trifenylkarbi-nol fjernes ved filtrering. Filtratet konsentreres under forminsket trykk for oppnåelse av et gult glassaktig rått produkt. Produktet renses under anvendelse av 8 ml "Diaion HP-20" og et oppløsningsmiddel bestående av metanol og vann (1:9 til 2:1) for oppnåelse av 14,5 mg (44,3%) av den ønskede forbindelse. Produktets egenskaper er som følger: IRU maks (cm_1) : 3450' 1775, 1670-, 1635, 1550 .

NMR (DMSO d„-CDo0D) 6: 9,28 (1H, d-j J=8,4 Hz), 7,07 (2H, s),

6,75 (1H, s), 6,27 (1H, d, J=5,4 Hz), 5,56 (2H, m), 2,77-2,04 (2H, m).

Signalet for -OCH^er overleiret med signalene som skyldes oppløsningsmidlet.

REFERANSEEKSEMPEL 2

Fremstilling av (± ) -cis-7|3-f enylacétamido-4a-hydroksy-l-azabicyklo[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre:

194,6 mg (0,623 mmol)' av trifluoracetatet av (±)-c is-73-amino-4a-hydroksy-l-azabicyklo[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre oppløses i en'blanding av 3,1 ml vann og . 6,2 ml aceton, og' 209 mg (2,49 mmol) natriumhydrogenkarbonat tilsettes til oppløsningen. Deretter tilsettes

dråpevis 12,5 mg (0,810 mmol) f enylacetylklor id i 2 ml aceton til blandingen under omrøring og isavkjøling. Etter henholdsvis 1,5 og ' 2,5 timer tilsettes .10,5 mg (0, 068 mmol)

og 17,6 mg (0,114 mmol) f enylacet.ylklor id. Etter 2 timer og 45 minutter konsentreres reaksjpnsoppløsningen under forminsket trykk for å fjerne acetonet. Deretter tilsettes 10 ml vann og 1 ml IN saltsyre til konsentratet og den. resul- ' terende oppløsning ekstraheres tré ganger med 20 ml etylacetat. Etylacetatlaget vaskes med mettet saltoppløsning, tørkes med vannfritt natriumsulfat, filtreres og konsentreres under forminsket trykk.

Det oppnådde brune oljeaktige produkt utvinnes

med eter, frafiltreres og tørkes; for oppnåelse av 120 mg (60,4%) av et pulver av den ønskede forbindelse. Produktets egenskaper er som følger.: IRUmaks (cm~l) : 3400' 1780 , 167:6 , 1640.

NMR (CD3OD) .6 : 7,27 (5H, s) , 6,39 (lH,.d, J=5,4Hz),

5,46 (1H, d, J=5,lHz), 4,37 (1H, m), 4,01 (1H, m),

3,57 (2H, s), 2,0-1,1 (2H, m).

. REFE- RANSEEKSEMPEL 3

Fremstilling av (±)-cis-73-[2-(2-amino-4-tiazolyl)-2-syn-metoksyiminoacetamido]-43-hydroksy-l-azabicyklo-[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre:

127 mg (0, 286 mmol) 2-(2-tritylamino-4-tiazolyl)-2-syn-metoksyiminoeddiksyre oppløses i 1,3' ml vannfritt diklormetan, og 29 mg (0,286 mmol) trietylamin tilsettes ved en temperatur på -20°C. Etter tilsetning av 60 mg (0 , 286 mrnol) f osf orpentaklor id omrøres blandingen ved en temperatur på -18 til -20°C i 30:, minutter . Reaksjonsblandingen konsentreres under forminsket trykk og lyofiliseres i 30 minutter. Resten oppløses i 3 ml vannfritt tetrahydrofuran for dannelse av én syrekloridoppløsning.

i Separat suspenderes 63,8 mg (0,204 mmol) av trifluoracetatet av (±)-cis-73-amino-43-hydroksy-l-azabicyklo-[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, fremstilt som i referanseeksempel 9, suspenderes i en blanding av 1,3 ml tetrahydrofuran og 1,3 ml vann, og tilsettes 103 mg (1,02 mmol) trietylamin. Til blandingen tilsettes syreklorid-oppløsningen dråpevis under omrøring og isavkjøling, og 22 mg (0,22 mmol) trietylamin tilsettes. Blandingen får reagere i 4 timer og 45 minutter under omrøring og isav-kjøling. Etter tilsetning av 2. ml :1N saltsyre ekstraheres reaksjonsblandingen tre ganger med 20 ml etylacetat. Ekstraktet tørkes med vannfritt natriumsulfat og konsentreres under forminsket trykk for oppnåelse av det trityl-beskyttede rå produkt [forbindelse (16)] av den ønskede forbindelse. Produktet oppløses i 20 ml 50% eddiksyre,

og oppløsningen omrøres på et bad med en temperatur på 50-60°C i en time. Etter avkjøling . til romtemperatur filtreres reaksjonsoppløsningen under forminsket trykk. Filtratet konsentreres under forminsket trykk for oppnåelse

av 173 mg av et rått produkt av den ønskede forbindelse.

Produktet renses under,-' anvendelse av 40 ml "Diaion HP-20AG" og et oppløsningsmiddel bestående av vann og metanol (10:1 til 1:1). Det oppnås 32 mg (42%) av et blekgult pulver av den ønskede forbindelse. Produktets egenskaper er som følger: IRUmaks(cm<_1>): 3475r 1780, 1680, 1670, 1655, 1645.

NMR (DMSO-d6) 6 : 9,33 (1H, d, J=8(j8 Hz) , 7,18 (2H, s),

6,75 (1H, s), 6,06 (1H, d, J=l,4 Hz), 5,38 (2H, ét H er q, J=8,8, 5,4 Hz), 4,50 (1H, m), 3,98 (1H, m), 3,84 (3H, s) , 2,17-1,37 (2H, m)

REFERANSEEKSEMPEL 4

Fremstilling av (±) -cis-7(5-[ (R) -2-j;-butyloksykarbonylamino-2-fenylacetamido]-4a-hydroksy-l-azåbicyklo[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-kar boksylsyre-t-butylester : i;

23,8 mg (0,095 mmol) (R)-N-t-butyloksykarbonyl-fenylglysin oppløses i 1 ml vannfritt tetrahydrofuran, og 0,095 ml (0,095 mmol) lN-N-metylmbrfolin i tetrahydrofuran og 0,095 ml (0,095 mmol) lN-isobutylklorformiat i tetrahydrofuran ved en temperatur på -30°C. Blandingen omrøres i 30 minutter, og 20 mg (0,079 mmol) (±)-cis-73-amino-4a-hydroksy-l-azabicyklot 4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre-t-butylester, fremstilt ved den metode som er beskrevet i den offentliggjorte japanske patentsøknad nr. 128591/79, il ml vannfritt metylenklorid tilsettes. Blandingen får reagere ved en temperatur på -30°C.i 45 minutter og ved 0°C i 4 timer. Reaksjonsblandingen fortynnes deretter med 5 ml

metylenklor id og vaskes suksessivt:-'med vann, IN saltsyre,

5% natriumhydrogenkarbonatoppløsnihg, vann og mettet natrium-kloridoppløsning. Den vaskede oppløsning tørkes med vannfritt natriumsulfat og konsentreres for oppnåelse av 5 mg av en rå acylforbindelse. Rensing , veå silisiumdioksydgel-kromatografi med 5 g silisiumdioksydgel og et oppløsnings-middel bestående av n-heksan og etylacetat (15:1) gir 10 mg av den mest polare isomer, 8 mg av den minst polare isomer og 4 mg av en blanding derav. Det:totale utbyttet er 57%. Forbindelsenes, egenskaper er som følger:

Den mest polare isomer

IR m<aks>"3 (cm ): 3430, 1780, 1725 ;(sk), 1717, 1697 , 1630

Den minst polare isomer

IRU<maks>3 (cm_1) : 3430'1780, 1722.;; (sk) , 1715, 1695, 1630.

REFERANSEEKSEMPEL 5

Fremstilling av cis-7(3-[ (R)-2-fenylglysinamido-4a-hydroksy-l-azabicyklo[4,2,0]okt-2-en-8-on-2i-karboksylsyre:

56 mg (0,118 mmol) av den minst polare isomer

av cis-73-[(R)-2-t-butyloksykarbonylamino-2-fenylacetamido]-4a-hydroksy-l-azabicyklo[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre-t-butylester, fremstilt som i referanseeksempel 4, oppløses i en blanding av 1 ml vannfritt metylenklorid og 1 ml anisol, og 2 ml trifluoreddiksyre tilsettes under is-avkjøling. Blandingen hensettes i 4 timer under isavkjøling og konsentreres deretter under forminsket trykk. Etter tilsetning av tørr benzen konsentreres konsentratet igjen for oppnåelse av et olj.eaktig produkt.- Produktet utvinnes med

eter og det resulterende bunn fraskilles ved filtrering til oppnåelse av 42,1 mg (80%) av et blekgult pulver av trifluoracetatet av den ønskede forbindelse. Produktets egenskaper er som følger: IRUmaks(cra_1) 3485 ' 1780 (sk), 1770, 1700 (sk) , 1685, 1635.

Det oppnådde trifluoracetatet oppløses i 2 ml IM fosfatbuffer (pH 7,0) og underkastes rensing under anvendelse av 50 ml "Diaion HP-20AG" og et oppløsningsmiddel av vann til vann og metanol (9:1). Den rensede oppløsning lyofiliseres for oppnåelse av 28 mg (72%;) av den ønskede, forbindelse. Produktets egenskaper er. som følger: 24°

[a]^= -26,0 (c=0,53, H20) t

IRUmaks(cm_1) : 3480'1780, 1770", 1680-1705, 1570-1650.

NMR (D20) 6 : 7,52 (5H, s), 6,03 (1H, d, J=5,4 Hz), 5,5 (1H,

d, J=5>1 Hz), 5,21 (1H, s), 4,28 (1H, m), 4,06-3,85 (1H, m) , 1,76-0 , 99 (2H, m) ./;

REFERANSEEKSEMPEL 6 .

Fremstilling av (±)-cis-7-azido-l-azabicyklo[4,2,0]okt-2-en-4,8-dion-2-karboksylsyre-t-butylester:

374 mg (2,760 mmol) N-klorsuccinimid tilsettes til 7 ml vannfritt toluen, og blandingen omrøres i en strøm av nitrogen ved en temperatur på -2.5°C. Deretter tilsettes 0,35 ml (4,766 mmol) metylsulfid og blandingen omrøres i 10 minutter. Etter heving av temperaturen til -15°C tilsettes 107 mg (0,382 mmol) (±)-cis-73-azido-4a-hydroksy-l-azabicyklo-[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre-t-butylester, fremstilt

ved den metode som er beskrevet i den offentliggjorte japanske patentsøknad nr. 128591/7'9, i 25 ml vannfritt toluen til reaksjonsoppløsningen,:og blandingen omrøres i 2,5 timer. En oppløsning av 0,773 ml vannfritt trietylamin i 1,4 ml vannfri petroleumeter tilsettes til reaksjonsblandingen i løpet av 2 minutter. Isbadet fjernes og blandingen omrøres i 15 minutter. Etter tilsetning av 20 ml eter vaskes oppløsningen med en blanding av 3 ml 5% saltsyre og 20 ml mettet saltoppløsning og vaskes deretter to ganger med 5 ml mettet saltoppløsning. Eterlaget tørkes med vannfritt natriumsulfat og konsentreres under forminsket trykk til oppnåelse av 145,7 mg av'et_rått oljeaktig produkt av den ønskede forbindelse. Produktet underkastes silisiumdioksydgel-kromatografr i under anvendelse av 10 g "Wako-gel C-200" og et oppløsningsmiddel bestående av n-heksan og etylacetat (2:1) for oppnåelse av 42,5".mg (0,153 mmol) av et oljeaktig produkt av den ønskede forbindelse. Utbytte 40,1%. Produktets egenskaper er som følger:

.."I

IRUmaks3 (cm_1) : 2125, 1802, 1740, 1698 (sk), 1690.

NMR (CDC13) 6 : 6,16 (1H, s), 5,22 (1H, d, J=5,5 Hz),

4,44 (1H, m), 3,10-2,48(2H, m), 1,55 (9H, s).

■ REFERANSEEKSEMPEL 7

Fremstilling av (± ) -cis-7(3-az ido-4[}-hydroksy-l-azabicyklo-[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre-t-butylester:

47 mg (0,169 mmol) (±)-c'is-7-azido-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-4,8-dion-2-karboksylsyre-t-butylester, fremstilt som i referanseeksempel 6, oppløses i 1,6 ml tetrahydrofuran inneholdende 1% vann, og oppløsningen omrøres ved en temperatur på -40°C. Deretter tilsettes 32 mg (0,0845 mmol) natriumborhydrid, og blandingen omrøres i 15 minutter. Etter tilsetning av en blanding av. 10 ml mettet saltoppløs-ning og 1 ml 10% saltsyre ekstraheres blandingen to ganger med 20 ml eter. Eterlaget tørkes- med vannfritt natriumsulfat og konsentreres til tørrhet under forminsket trykk for oppnåelse av 43,9 mg (0,157 mmol) av et oljeaktig produkt av den ønskede forbindelse. Utbytte 92,7%. Produktets egenskaper er som følger: IRUmaks3 (cm_1) : 3450 ' 2118., 1789, 1784 (sh), 1729 (sk),

1722, 1629, 1632 s (sk) .

NMR (CHC13) 6: 6,20 (1H, d, J=l, 2 2/' Hz) , 4,86 (1H, d, J=5,37

Hz), 4,62 (1H, m),. 3,98 (lH/m), 2,45-1,65 (3H, m), 1,53 (9H, s) . '.!■;■

REFERANSEEKSEMPEL 8 ■S

Fremstilling av (±)-cis-73-amino-43-hydroksy-l-azabicyklo-[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre-t-butylester:

41,9 mg (0,149 mmol) (±)-cis-73-azido-43-hydroksy-azabicyklo[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-kårboksylsyre-t-butylester, fremstilt som i referanseeksempel . 7, oppløses i 1,5 ml etyl-alkohol, og 12 mg 10% palladium-karbon tilsettes. Blandingen omrøres i en strøm av hydrogen under isavkjøling i 2 timer og 15 minutter. Etter fjerning av palladium-karbon ved filtrering konsentreres filtratet under forminsket trykk, og den konsentrerte rest oppløses, i 10 ml etylacetat. Opp-løsningen ekstraheres med 5 ml 10%!vandig sitronsyreoppløs-ning fire ganger, og ekstraktet vaskes med 5 ml etylacetat. Etter innstilling til pH 8 med natriumkarbonat mettes den

vaskede oppløsning med natriumklorad og ekstraheres tre ganger med 30 ml etylacetat. Ekstraktet vaskes med 30 ml mettet saltoppløsning, tørkes med, vannfritt natriumsulfat og konsentreres til tørrhet under.; forminsket trykk for opp-^ nåelse av 23,4 mg (0,092 mmol) av- et blekgult pulver av den ønskede forbindelse. Utbytte 61,6%. Forbindelsens egenskaper er som følger: IRumaks (cm ): 3430'1774, 17<;>34 (sk) , 1724 , 1625 (sk) ,

1618. l-

NMR (CDC13) 6 : 6,18 (1H, bs) , 4.,'53 (1H, m) , 3,83 (3H, m) ,

2,83 (3H, bs) , 2,20 -(1H, m) , 1,51 (3H, s) ..

REFERANSEEKSEMPEL 9

Fremstilling av tr if luor acetatet: ay (±.)-cis-73-amino-43-hydroksy-l-azabicyklo[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre:

172,4 mg (0, 678 mmol) -cis-73-amino-4[3-hydroksy-l-azabicyklo[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre-t-butylester , fremstilt som i reféranseeksempel 8, oppløses i 8 ml vannfritt metylenklorid, og 8 ml trifluoreddiksyre tilsettes under omrøring og isavkjøling. Blandingen omrøres ved samme temperatur i 1,5 timer.. Oppløsningsmidlet fjernes ved destillasjon under forminsket trykk, og det resulterende brune oljeaktige produkt behandles med etyleter for oppnåelse av 121,3 mg (0,389 mmol) av et gulbrunt pulver. Utbytte 57,3%. Produktets egenskaper er.som følger: IRUmaks (cm_1) : 3440 ' 1770 , 1750 (sk), 1700 (sk), 1685.

Claims

1. Optisk aktive cefalospprin-analoge karbacefemforbindelser, karakterisert ved den.generelle formel ' :

hvor betyr hydrogen, alkyl med 1-5 karbonatomer eller acyl med 1-6 karbonatomer, og R^ . betyr hydrogen eller en karboksylbeskyttende gruppe, og salter derav.

2. Forbindelser ifølge krav 1, karakterisert ved at er hydrogen.

3. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert ved at R2 er hydrogen, dvs. (6R, 7S)-7-amino-4-hydroksy-l-azabicyklo[4,2,0 lokt-2-en-8-on-karboksylsyre.

4. Forbindelse ifølge krav 3, karakterisert ved at konfigurasjonen i 4-stillingen er "S", dvs. (4S, 6R, 7S)-7-amino-4-hydroksy-l-azabicyklo-[4,2,0]okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre.

5. Fremgangsmåte til fremstilling av optisk aktive cefalosporin-analoge karbacefemforbindelser ifølge de fore-gående krav, karakterisert ved at en forbindelse med formelen

hvor R betyr en eventuelt substituert umettet 6-leddet karbqcyklisk gruppe, en eventuelt .'substituer t fenoksygruppe eller en eventuelt substituert heterocyklisk gruppe, X betyr hydrogen, amino, hydroksy eller alkyl med 1-5 karbonatomer, R^ og R2 har den ovenfor angitte betydning, og hydrogenatomene i 6- pg 7-stUlingene har cis-konfigurasjon, omsettes med et enzym som, er i stand til å frembringe selektiv optisk deacylering,- hvoretter den dannede optisk aktive forbindelse fraskilles og, hvis R2 er H, om ønsket forestres med en karboksylbeskyttende gruppe R2 eller overføres i et salt derav.,

6. Fremgangsmåte ' ifølge. ■ krav„.5 , karakterisert ved at enzymet er oppnådd fra en mikroorganisme tilhørende en av slektene Ae.iromonas, Achromobacter, Ar throbacter , Acetobacter, Alcal igdenes , Escher ichia-, Xanthomonas,K luyvera, Gluconobacter, Clbstridium, Comamonas, . Corynebacterium, Sarcina, Staphylococcus, Streptomyces, Spirillum, Bacillus, Pseudomonas, Flacobacterium, Brevibacterium, Protoaminobacter, Proteus, Beneckea, Micrococcus, Mycoplana, Rhodopseudomonas, Nocartiia, Neurospora, Talaromyces eller Acinetobacter.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at enzymet tilføres til reaksjonen i form av en renset enzympppløsning, celler utvunnet fra. en dyrkningsvæske, en cellesuspensjon., en nedbrutt cellesuspensjon, et cellefritt ekstrakt, eller en dyrkningsvæske av mikroorganismen.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at enzymet .er immobilisert.