NO820399L - Cysteinavgivende system - Google Patents

Description

i . Foreliggende oppfinnelse vedrører et nytt cysteinavgivende.' system.

1 Spesielt vedrører oppfinnelsen en ny base aminosyreløsning (gitt oralt eller parenteralt) samt en ny fremgangsmåte

I ved fremstilling av cystein i levende celler.

' i

! Oppfinnelsen vedrører en metode ved å gjenopprette glutationnivået i en mengde vev hvor. 5-oksoprolinase er nærvær- j ende, spesielt i menneskets lever. Oppfinnelsen vedrører] også en metode ved bekjempelse av forgiftning forbundet med

reduksjon eller uttynning av glutationinnholdet i celler. ,Den er spesielt egnet ved behandling av pasienter som lider i ,'av overdoser av acetoaminofenoler. |

<!>j.. j :Oppfinnelsens art vil lettere forstås ved beskrivelsen som følger. |

i Det er kjent at 5-okso-L-prolinase (L-pyroglutamat hydro- j lase) katalyserer adenosin-trifosfat (ATP)-avhengig spaltning<!>av 5-okso-L-prolin til glutamat. Produktene, av slik spalt- I ning, dvs. glutamat, ADP (adenosin difosfat) og P, (uorganisk iortofosfat) blir dannet i forholdet 1:1:1. Det er nå funnet

at en svovelanalog på 5-okso-L-prolin, dvs. L-2-oksotiazoli-din-4-karboksylat også angripes•av

dette enzym, men produktene inkluderer heller cystein enn glutamat. Ved den sistnevnte reaksjon spaltes karboksylatet og gir et ADP/cystein i forhdldét 1:1. En.<z>ymet som utviser en affinitet til analogen i likhet med den for det naturlige substrat,, inhiberes av'analogen, både ; in vitro og vivo. Således tjener karboksylatet som en sterk inhibitor av gamma-glutamyl syklusen ved 5-oksoprolinase-trinnet. Administrering av L-2-oksotiazolidin-4-karboksylat hos mus som er

blitt redusert på grunn av hepatisk gluta.tion førte til -normalt hepatisk glutation-nivå. Da L-2-okostiazolidin-4- i karboksylat er et fremragende substrat av enzymet, er det

i<1>I i fui nnet å være en nyttig komponent i base-aminosyre -næringis-oppløsninger og som et intracellulært avgivendesystem for cystein.

I

Det er et godt terapeutisk middel for årette på tilstander

i

■ forårsaket av. glutationreduksjon eller -fortynning, for-, årsaket av:forgiftning på grunn av overskudd av acetamino-fenol i systemet.

i De kjemiske reaksjoner i dette enzyms aktivitet som nevnt ovenfor>er vist i fig. 1. i

i

Fig. 2 er et diagram som viser danningshastigheten for ' ADP og cystein; og reaksjonsfråvær når ADP manglet," o,g når L-isomere ble erstattet med D-isomere. !

i Omtrent 50% av sykehusinnlagte pasienter trenger noe nær-ingstilskudd for å motvirke underernæring og for å påskynde[ helbredelse. Mange slike pasienter kan ikke innta mat j direkte på grunn av G.I. spiserørsmalfunksjon og vanskelig oralt inntak. En av hovedgrunnene for å opprette total \ parenteral næringsinntak er infusjon av basisk aminosyre-løsninger via hovedåre- og periferalåre-administrering. ' Typisk baseaminosyre-løsninger inneholder 8 .'Tiødvendige aminosyrer og 7 unødvendige aminosyrer og blir vanligvis fremstilt og solgt i 10%.vandige oppløsninger. Den viktigste aminosyre som ikke finnes i slike løsninger er cystein. Som nevnt ovenfor, kan cystein ikke administreres intravenøst på grunn av dets giftvirkning på systemet. Cystein er helt nødvendig for det menneskelige stoffskifte - av alle amino-syrene som finnes i basiske løsninger, er L-metionin den eneste som inneholder svovel. Metionin blir metabolisert kun i leveren slik at hvis pasienten har en målfunksjon eller en delvis fungerende lever, blir hans system -.uten for svovelholdig: protein. Nærværende oppfinnelse vedrører en metode ved anvendelse av cystein som kan metaboliseres i såvel andre organer som i leveren.

Ifølge et trekk ved foreliggende oppfinnelse blir de basiske aminosyreløsninger modifisert ved tilføring av 0,25-2,5 g/dl 1 .L-2-oksotiazolidin-4-karboksylat. En typisk standard krystal!-linsk aminosyreinjeksjon (10 vekt%'s løsning) ved hovedåre- i administrering inneholder de følgende ingredienser: j

I

i En annen standard baseaminosyre-løsning ved hovedåre-

administrering inneholder bare de nødvendige aminosyrer i 5,3 vekt%~- konsentrasjon.

En standard baseaminosyre-danning ved periferalåre-injeksjon er en 3,5 vekt% løsning av de essensielle- og ikke-I essensielle aminosyrerbg elektrolytter, så som natrium, : kalium, magnesium, klorid og acetat.

Ifølge foreliggende oppfinnelse blir det ved ovennevnte

næringstilførselsløsninger tilsatt L-2-oksotiazolidin-4-karboksylat,• fortrinnsvis i form av dets nøytrale salt,

dvs. natrium, kalium, magnesium etc,, i en mengde spesi-fisert ovenfor.

Ifølge eksperimentene ble reaksjonsblandingene laget' for å inneholde (sluttvolum 0,5 ml) 100 mN Na Hepes (Na salt for N-2-hydroksyetylpiperizin-N'-2-etansulfonsyre) buffere (pH 8,0), 150 mM KC1, 8 mM MgCl2, 2mM fosfonolpyrivat, 5 mM ATP (adenosin trifosfat) , pyruvat kinase i overskudd, og substratet som indikert. '.

i i i i

L- og D-isomerene til 2-oksotiazolidin-4-karboksylat blej syntetisert ifølge metoder nevnt i Kaneko.et al, Bull, Chem.Soc. (Japan) bind 37, sidene 242-4 (1964) og modifisert

' i I ved Shah et al's metode, Cancer Research bind 39, sidene; : 3942-7 (1979). 5-okso-L-prolinase ble isolert.fra rottenyre i og befridd for 5-oksoprolin ved gelfiltrering. Andre kjemi-kalier og materialer ble .kjøpt.

Etter inkubasjon i 30 min. ved 37°C ble reaksjonsblandingenei behandlet med. 0,1 volum 1MHC1, og satt ved 0°C i 5 min; ! og en tilsvarende mengde 1 M 2-amino-2-hydroksymetyl-l,3-propandiol ble tilsatt. Mengdene ble analysert mht. amino-syrene ved bruk av Durrum Model 500 aminosyreanalysator.i j Cystein ble også bestemt i noen eksperimenter.ved reaksjon med 5,5'-ditiobis (2-nitrobenzoat) (DTNB) . j j'

i

i Når enzymet 5-okso-L-prolinase ble inkubert med L-2-okso-tiazolidin-4-karboksylat i nærvær av ATP fremkom hurtig danning av ADP og cystein. Energi til reaksjonen ble tilført ved spalting av ATP. Det ble ikke obsertvert noen reaksjon hvor ATP ble utelatt eller når L-isomeren. ble erstattet med tilsvarende D-isomere. Graden av ADP til cystein produsert økte med tiden utvilsomt på grunn av tapet av cystein som skyldtes oksydering. En mer kvantitativ karakterisering av reaksjonen ble oppnådd ved studier ved hvilke danningen av cystein ble vurdert ved,å bestemme derivatene til dette aminosyreprodukt, hvor danningen av. ADP og cystein (bestemt etter oksydering, som for cystein eller etter reduksjon og derivasjon som den tilsvarende S-acetamido-forbindelse)

ble funnet å være støkiometrisk. Det ble funnet at Km verdien for L-isomeren ér noe lavere enn den som ble funnet for det naturlige substrat, 5-okso-L-prolin; imidlertid

er den beregnede Vmaks verdi for'det naturlige substrat høyere enn det som ble funnet for L-isomeren. Som ventet er L-2-okso-tiazolidin-4-karboksylat en fremragende hemmende' faktor ved bruk av 5-okso-L-prolin ved det rensede enzym;

i reaksjonsblandingene inneholder således 1 mM 5-okso-L-prolin, tilsetningen av L-2-oksotiazolidin-4-karboksy.lat med'

konsentrasjon på 1, 5 og 10 mM gav hhv. 73, 9 2 og 97% hemming av glutamatdannelsen. Under disse betingelser hemmet ikke D-2-oksotiazolidin-4-karboksylatet glutamatdanningen. Ved. å | anvende reaksjonsblandinger sammenlignet med disse be-skrevet i det ovennevnte, ble "forsøk gjort på det naturlige substrat og på tre substratanaloger. Resultatene er summert[

i den følgende tabell. j

. (a) Bestemt ved.pyruvat-kinase-laktate-dehydrogenasé

koblet måling

(b) Som glutamat; (c) bestemt etter reduksjon med KBH^og reaksjon med iodoacetamid; (d) etter omdannelse til cystein; (e) mindre enn 20 nmol; (f) mindre enn 5 nmol. Fig. 2 viser resultatene grafisk oppnådd med reaksjonsblandingene lik disse i tabell 1 unntatt som følger: I kurve 1 og 2 var 5 nM av L-isomeren og 5 mM ATP bundet;

i kurve 3, 5 mM D-isomere og 5 mM ATP i kurve 4, 5 mM av L-isomeren, men ingen ATP ble tilsatt. Ved de indikerte intervaller ble mengdene analysert mht ADP ved metoden som er nevnt i tabellens fotnote, og for cystein ved reaksjon med

DTNB.

In vitro-resultatene viste at L-2-oksotiazolidin-4-karboksylat som hemmer 5-oksoprolin ble bekreftet ved in vivo forsøk..'i i Ved den sistnevnte ble dyr injisert med 5-okso-L-[<14>C] prolin og åndedretts-[ 14 C0„] ble samlet og målt i flere timer.. ' Resultatene viser en tydelig nedgang av [ C0z ~] hos dyr behandlet med L-isomere som utskilte omtrent 16% av

den injiserte dose i.urinen; ingen radioaktivitet ble funnet 14 ; i. urinen til kontrolldyrene. Etter injeksjon av L-[ C] glutamat, indikerte funnene at injeksjon av L-2-oksotiazol'idin-4-karboksylat ikke har noen betydelig virkning på glutamat- | metabolismen. Tidligere forsøk som er foretatt av oppfinnerne viste at injeksjon av en annen analog hhv. L-2-imidazolidon-' 4-karboksylat også tydelig hemmer in vivo 5-oksoprolin-metabolismen, men ikke glutamat-metabolismenImidlertid er L- ■ 2-oksotiazolidin-4-karboksylat en mye mer effektiv inhibitor. Sammenligner man- virkningene av tiazolidinkomponenten med disse til L-2-imidazolin-^-4-karboksylat,ser man at tiazolidin- ] komponenten er minst fire ganger mer aktiv på en molarbasis.

Virkingen av L-2-oksotiazolidin-4-karboksylat injisert i mus ble studert på nivå med hepatisk glutåtion. Resultatene indikerte at administreringen av■tiazolidin stimulerte danningen av glutåtion mer enn to ganger større enn kontrollgruppen. Den maksimale virkning ble notert omkring 4 timer etter injisering. Det ble ikke observert en slik stimulering da dyrene ble injisert med tilsvarende doser D-2-oks'otiazolidin-4-karboksylat. Disse resultater er be-tegnende for in vivo danningen av cystein etter administrering av L-2-oksotiazolidin-4-karboksylat. Intet fritt cystein ble oppdaget i kontrolldyrenes sure^ekstrakter fra leveren eller hos forsøksdyrene ved aminosyreanalyser utført etter reduksjon av ditiotreitol og derivatdannelse med 2-vinyl-pyridin. Disse resultater, som ikke er overraskende sett på bakgrunn av de meget lave mengder av vevcystein, indikerer at cystein dannet ved spalting av tiazolidin blir hurtigere nyttiggjort for glutationsynteser.

Fig. 3 viser hemmingen av 5-oksoprolin metabolisme ved L- .. 2-oksotiazolidin-4-karboksylat. Mus som hadde fastet nattenj over ble injisert intraperiotonalt med NaCl (kurve 1; åpne symboler; kontroller) eller med Na L-2-oksotiazolidin-4-karboksylat (2,5 mmol/kg) (kurve 2; lukkede symboler). Etter 10 min. ble musene injisert subkutant med 5-okso-L-[ C]'

14'

prolin (A) eller med L-[ C] glutamat (B) (0,02 mmol; 1,1 x 10 g cpm) . Deretter ble musene plassert i metabolismekamre og åndedretts-C02ble oppsamlet i etanolamin/metanol, 1: 4

■(vol/vol). På A representerer hver kurve"resultatene fra

3 dyr; punktene er middelverdier og strekene repre-'

.senterer standardavvik fra middelverdien. For B representerer hver kurve gjennomsnittet av nesten like resultater for 2 dyr. Fig. 4 viser økningen av det hepatiske nivå for glutåtion etter injisering av L-2-oksotiazolidin-4-karboksylat. Mus som hadde fastet over natten ble injisert intraperitonea.lt •med NaCl (kontroller; stiplet linje) eller med Na L-2-okso-tiazolidin-4-karboksylat (6,5 mmol/kg). I løpet, av intervaller ble dyrene avlivet og den uttatte lever ble homogeni-sert i 5 deler 1% pikrinsyre. Etter sentrifugering ble de proteinfrie supernatantløsningene analysert med hensyn til .glutåtion ved Tietze-metoden, Anal. Biochem 21_, 502-22 (1969) . Analysene ble utført to ganger. I noen av tilfellene ble verdiene sjekket ifølge 2-vinylpyridinprosedyren til Griffith, Anal. Biochem. 106; 207-12 (1980); bra overensstemmelse mel-lom de to metodene ble notert. På figuren er punktene middel'-verdier og strekene indikerer gjennomsnittsavvik fra middel-tallet. Parantesene gir antall dyr benyttet. Verdien for kontrollene var 4,40 - 0,9 umol/g.

Administrering av L-2-oksotiazolidin-4-karboksylat hos dyrene førte til en økning av cysteininnholdet i vevene, spesielt i leveren. Administrering av denne forbindelse sørger derfor på en måte å'få cystein i cellene. Man kan ikke gi kun cystein uten komplikasjoner, da denne aminosyre er tok-sisk ekstra~cellulær. Imidlertid når L-oksotiazolidin-bestanddelen blir injisert kommer den inn i cellen hvor den blir delt og forårsaker økning av cystein i cellen. I flere kliniske tilfeller, f.eks. etter forgifting med overskudd av smertestillende medikament, eksempelvis disse som inneholder aktive midler kjent som N-acetyl-para-aminofenol, paracetamol og acetaminofen, synker glutationnivået i leveren, betraktelig. Når cystein tilføres leverceller, kan tillegg av glutåtion syntetiseres og således effektivt tjene til å redusere gift- virkningen av det skadelige medikament. Derfor virker L-2-oksotiazolidin-4-karboksylat som et intracellulært avgivende system hvor cystein har egenskaper sott. et terapeutisk middel i situasjoner hvor der forekommer uttynning av glutåtion i leveren. Etter at acetoaminofenol ble gitt til eksperiment-dyrene så som mus, sank leverglutationet hurtig på grunn av stort forbruk som følge: av ~~ reaksjonen med medikamentet. Hvis man gir L-isomer bare to timer etterat medikamentet ble gitt, skjer en økning av leverglutationet som indikerer den poten-sielle verdi av denne forbindelsen under behandlingen.

Ved behandling av mennesker med L-isomer, skjer administra-sjonen c*v dens nøytrale salt fortrinnsvis direkte via spise-røret eller blir introdusert intravenøst.

Claims (1)

1. Blanding, karakterisert ved at .. den består av en vandig løsning av vannoppløselige aminosyrer og L-2-oksotiazolidin-4-karboksylat;

2. Blanding ifølge krav 1, karakterisert vedat løsningen også inneholder ernærings-i mineralbestanddeler.

3. Blanding ifølge krav 1, karakt eri-j sert ved at L-2-oksotiazolidin-4-kårboksylat-innhold--et er 0,25-2,5 g/dl av lø sningen.

4. Fremgangsmåte ved fremstilling av L-cystein . karakterisert ved at L-2-oksotiazolidin-4-karboksylat behandles med 5-okso-L-prolinase i nærvær av adenosin trifosfat.

5. Fremgangsmåte for å øke glutationnivået av e( t in vivo system, karakterisert ved at ! systemet administreres L-2-oksotiazolidin-4-karboksylat j slik at 5-okso-L-prolinase produserer S-karboksy cystein <1> , hvilket S-karboksy cystein dekarboksyleres til cystein ojg sistnevnte metaboliseres til glutåtion. jl i i 6. - En fremgangsmåte for tilførsel av cystein in' vivo celler, karakterisert ved at den består' av [ å administrere L-2-oksotiazolidin-4-karboksylat til cellene, hvoretter dette blir hydrolisert i nærvær av 5-okso-L-prolinase til cystein.

7. Fremgangsmåte for å bekjempe forgiftning forbundet med reduksjon av glutationinnholder i celler av et in vivo system, karakterisert ved at det består av å introdusere L-2-oksotiazolidin-4-karboksylat i cellene.' j i i