NO820943L - Fremgangsmaate ved gjenvinning av produkter produsert av vertsorganismer. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter ved fremstilling av proteiner, polypeptider eller andre produkter i dannet i vertsorganismer. Mere spesielt vedrører den en Ifrem-gangsmåte for gjenvinning av et ønsket protein, polypeptid j eller andre produkter fra en vertsorganisme som produserer ! dette produkt. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er særpreget ved at vertsorganismen utsettes for minst en blanding som forårsaker lyse eller i det minste permeabilisering av verten og frigjørelse av det ønskede produkt inn i kultur- i mediet i en fjernbar form. Det vil forstås av den etterfølg-ende beskrivelse at foreliggende fremgangsmåte er generelt nyttig ved fremstilling av forskjellige proteiner, polypeptider og andre produkter i forskjellige vertorganismer. Et

1 i ikke ubetydelig problem ved storproduksjon av proteiner, ! polypeptider og andre produkter i potensielt farlige verts-

<:>i organismer er hvorledes man skal inaktivere eller drepe vertsorganismen i kulturmediet og samtidig være i stand til

å gjenvinne det ønskede produkt...

Dette problem er blitt av større viktighet som følge av ut-viklingen av rekombinant DNA-teknologi. Slik teknologi muliggjør produksjon av fremmede produkter i vertsorganismer> som er transformerte med fremmede DNA-sekvenser som koder for disse produkter. Eksempler på slike prosesser innebefatter fremstilling av human insulin, human interferoner, hepa-titt B virusantigener, munn- og klovsykevirusantigener.og menneskelige veksthormon i bakterier eller andre vertsorganismer. To generelle måter for å løse dette problem er tidligere anvendt. I henhold til den første inaktiveres vertsorganismene i vekstkulturene under passende fysikalske betingelser, eksempelvis ved varme- syre eller annen inakti-verende behandling før oppsamling av organismene. Deretter blir de inaktiverte vertsorganismene oppsamlét og de ønskede proteiner eller polypeptider utvunnet. I henhold til den andre av de kjente fremgangsmåter blir organismene oppsamlet: og ekstrahert under fysikalske betingelser i henhold til gjeldende retningslinjer. Deretter blir eventuelle gjenværende levende celler inaktivert eller drept og de ønskede proteiner eller polypeptider utvunnet. i ! Imidlertid har ingen av disse fremgangsmåter vist seg tilfreds-stillende ved utvinning av de ønskede produkter ved storskala-fermentering av vertsorganismer som fremstiller disse produk-f ter. F.eks. i det tilfellet hvor humanleukocyttinterferon j (IFN-a) fremstilles ved .mikrobiell produksjon fra E.coli I I transformert med en DNA sekvens som koder for IFN.-a (slike ! mikroorganismer er eksempelvis beskrevet i europeisk patent- • søknad nr. 81.300050.2 av 7. januar 1981) ga den første gene-[ reile fremgangsmåte, dvs. inaktivering av den transformerte vertsorganisme enten ved varme-, syre- eller annen inaktiv-erende behandling etterfulgt av innsamling, et utbytte som ikke var mindre enn ca. 10% av interferonet eller de inter' feronlignende produkter som var produsert av mikroorganismene. Dette skyldes trolig at andre produkter i vertsorganismen danner kompleks med eller inneslutter det ønskede interferon-. produkt og forhindrer dets gjenvinning fra den inaktiverte og innsamlede kultur.

Den andre generelle behandlingsmåte som muligens er.anvendbar i laboratorieskala er teknisk vanskelig å anvende i stor' skala. F.eks. er kompleksiteten og omkostningene for fer-menteringen og bearbeidelsesutstyret for å tilveiebringe de nødvendige betingelser under innsamling og ekstraksjon av storskalakulturer av levende celler meget høye. Ytterligere er prosedyrene som må anvendes uhåndterlige og er ikke foretrukket både fra et utstyrs- og personellsynspunkt.

Foreliggende oppfinnelse løser de ovenfor nevnte problemer, ved å tilveiebringe en fremgangsmåte for gjenvinning av et ønsket protein, polypeptid eller annet produkt fra en vertsorganisme som produserer dette produkt.

Ved hjelp av oppfinnelsen er det mulig å frigjøre i kulturmediet, i gjenvinnbar form, i det vesentlige alt av det ønskede protein, polypeptid eller annet produkt fremstilt av vertsorganismen, samtidig som denne inaktiveres. Foreliggende fremgangsmåte adskiller seg derfor fra de kjente fremgangsmåter ved at den muliggjør en i det vesentlige fullstendig gjenvinning av de ønskede produkter fra en kultur av vertsorganismer og samtidig unngås ulempene, som de kjente

teknikker er belemret med.

Fremgangsmåten skal nærmere beskrives i det følgende. i]

denne beskrivelse er betegnelsen "vertsorganisme" anvendt bredt. F.eks. innebefatter de gramnegative og grampositive| bakterieverter såsom stammer av E.coli, eksempelvis E.coli HB101, E.coli X1776, E.coli X2882, E.coli DS410, E.coliMRCI, og stammer av Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus stear<i>eo-thermophilus og andre basiller, gjær og andre fungi, dyr-eller planteverter. såsom dyr, (innebefattet mennesket) eller' planteceller i kulturer eller andre verter. Valget av en spesiell vert er ikke noen del av foreliggende oppfinnels1 e. i;

Oppfinnelsen er i stedet generelt anvendbar for utvinning i av produkter fra alle verter som er lyserbare eller som i det minste kan gjøres gjennomtrengelige ved eksponering ovenfor blandingene i henhold til oppfinnelsen.

I tillegg kan foreliggende fremgangsmåte anvendes for et'' vidt antall proteiner, polypeptider og andre produkter. F.eks. gjenvinning av produkter såsom aktive bestanddeler

i vaksiner eller andre farmasøytiske eller internt nyttige blandinger, enzymer, alkaloider, aminosyrer, industrielle kjemikalier, antibiotika, matvarer og lignende er en del av oppfinnelsen. Igjen er valget av det spesielle produkt ingen del av oppfinnelsen, men oppfinnelsen er generelt anvendbar for gjenvinning av alle slike ønskelige produkter.

Sluttligen utgjør heller ikke de mange teknikker og frem-^gangsmåter for dyrkning eller fermentering av kulturer av vertsorganismer eller rensning av produkter derfra noen del av oppfinnelsen. I steden utgjør oppfinnelsen et nyttig komplement til disse teknikker og muliggjør en forbedret gjenvinning av det ønskede produkt fra disse.

Det må naturligvis forstås at ikke enhver, vert eller hver dyrknings- eller rensningsteknikk med fordel kan. produsere et gitt produkt i en spesiell vertsorganisme ved foreliggende fremgangsmåte. En fagmann må vurdere de forskjellige kjente faktorer for å velge en foretrukket vert og fore-<1>

i ■ trukne betingelser for produksjon og rensning av det ønskedej

produkt.

F.eks. har et stort antall vert/kloningsbærerkombinasjoner vært anvendt innen rekombinant DNA teknologi for å fremstille transformerte organismer som produserer et ønsket, fremmed produkt. F.eks. kan.nyttige kloningsbærere bestå av et seg-; ment av kromosomalt, ikke-kromosomalt eller syntetiske DNA sekvenser såsom de forskjellige kjente bakterieplasmider, eksempelvis plasmider fra E.coli innebefattende col El, pCRl, pBR322 og deres derivater, et bredt antall plasmider, eksempelvis RP4, fag DNA, eksempelvis de mange derivater av fag Aj eksempelvis NM989, og vektorer avledet fra kombinasjoner,av plasmider og fag DNAer såsom plasmider som er modifisert1. til å anvende DNA eller andre ekspresjonskontrollsekvenser

eller gjærplasmider såsom 2 p plasmider eller derivater derav.

Forskjellige DNA sekvenser kan også innføres i disse kloningsbærere i velkjente posisjoner for å danne hybrid DNA molekyler. Disse molekyler er nyttige, enten som fremstilt eller etter passende modifisering for å forbedre deres ekspresjonskarak-teristika eller for å modifisere produktet som i realiteten uttrykkes fra disse for å transformere vertsorganismer som ovenfor beskrevet og for å produsere1 produkter kodet av de innskutte DNA sekvenser eller ønskede fragmenter derav.

Eksempler på fremmede produkter som er produsert av slike transformerte vertsorganismer er hepatitis B virusantigener, munn- og klovsykevirusantigener,leukocyttinterferon, fibro-blastinterferon, A- og B-kjedene i humaninsulin, rottevekst-hormon, musedihydrofolatreduktase, somatostatin, menneskelig veksthormon og lignende.

Innen den ovenfor generelle teknologi er foreliggende oppfinnelse særpreget ved at vertsorganismen eksponeres ovenfor minst en blanding eller et middel,ovenfor hvilket vertsorganismen reagerer ved lyse eller i det minste blir perme-abel slik at det ønskede produkt frigjøres til kulturmediet. Disse blandinger faller i to generelle klasser. Den første klassen oppløser lipider i cellemembranen og ødelegger vertsorganismens impermeabilitet. Eksempel på denne klasse er detergenter såsom tritron og natriumdodecylsulfat ("SDS") og; enzymer såsom "Glusulase" (et 3~glukuronidase sulfatasepre- ' parat). Den andre klasse sprenger celleomhylningen i verts-;

organismen eller blokkerer enzymer som er nødvendige i célle-' ..! i veggsystemet. Eksempler på denne klasse er penicillin, I cykloserin , bacitracin, zancomycin, ristocetin, polymyxin, samt deres naturlige, syntetiske eller halvsyntetiske derivater.- j

' • ! Det må naturligvis forstås at visse vertsorganismer er mere følsomme overfor en klasse eller element i en klasse av i blandingene enn andre. F. eks. er mennes'keceller lett på-virkelige av ikke-ioniske og ioniske detergeneter. På den annen side er E.coli celler mere lettpåvirkelig mot eksponering for penicillin eller dets derivater eller mot eksponering av. SDS etter en lysozym/EDTA behandling. Gjærceller er mere påvirkelig av "Glusulase".

De forskjellige blandinger som ovenfor er beskrevet som nyttige blandinger ved foreliggende oppfinnelse har et velkjent aktivitetsspektrum ovenfor forskjellige vertsorganismer. Derfor må valget av blandingen eller middelet i henhold til oppfinnelsen for en spesiell anvendelse bestemmes av et antall faktorer. Disse innebefatter vertsorganismenes lettpåvirke-lighet av blandingen, følsomheten for vertsorganismen etter transformering, eventuelt med et hybridplasmid til blandingen, aktiviteten og stabiliteten av blandingen eller midlet i kulturmediet, stabiliteten' av det ønskede produkt i kulturmediet og i dé etterfølgende bearbeidelsestrinn, samt et eventuelt samspill mellom blandingen og det ønskede produkt.

Ved anvendelse av disse prinsipper kan en fagmann velge en spesiell blanding innen omfanget av foreliggende oppfinnelse og på nyttig måte anvende fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for å gjenvinne et ønsket produkt.

i

"Fastleggelse" av eksponeringen av vertsorganismen for den

valgte blanding i henhold til foreliggende fremgangsmåtej styres også i en viss grad av den spesiel\ le vertsorganismej blandingen som anvendes og de ønskede produkter. F.eks. I

visse behandlinger såsom lysozym/EDTA etterfulgt ved ekspo-|nering mot SDS krever at veksten av verftskulturen i mediet ' i det vesentlige må være fullstendig før man begynner å f; ri-t i • i

gjøre produktet. På den annen side vil eksponering mot

penicillin eller dets derivater, såsom ampicillin eller

andre lignende virkende blandinger muliggjøre et bredt antall "timeplaner" som kan følges. F.eks. kan man variere mengden

av tilsatt blanding, tilsetningstidspunktet i organismens j vekstsyklus, antall additiver, antall av tilsetninger eller ,

periode for vertsorganismens vekst etter tilsetning og før produktgjenvinning kan alle varieres av en fagmann uten å avvike fra oppfinnelsens omfang.

F.eks. i henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen ble en enkelt, stor dose penicillin tilsatt en voksende mikro-organisme kultur ved slutten av dens vekstperiode. Eventuelle vertsorganismer som var tilbake etter det valgte tidspunkt for en slik eksponering ble derved inaktivert og det ønskede produkt gjenvunnet. I et annet eksempel ble konsentrasjonen av penicillinet i kulturen holdt ved et lavt, mere eller mindre konstant nivå for å tillate at mikroorganismene fortsatte å vokse å produsere det ønskede produkt med ca. den samme hastighet som mikroorganismene ble lysert eller i det minste permeabilisert av penicillinet for å fri-gjøre det ønskede produkt. Derfor vil riktig valg av til-setningsskjemaer muliggjøre at det i kulturen oppnås en tilnærmet likevektstilstand. Slike prosedyrer er åpenbart nyttige i halvkontinuer1ige og kontinuerlige fermenterings-og gjenvinningsprosesser.

Det er antatt at utøvelse av foreliggende fremgangsmåte forårsaker lyse eller i det minste delvis permeabilisering av en del eller alt av vertsorganismene i den voksende kultur og derved frigjør de ønskede produkter fremstilt av disse vertsorganismer til kulturmediet. En eventuell ikke- lysert del av kulturen kan naturligvis fortsatt vokse og' produsere det ønskede produkt inntil det lyseres eller per-meabiliseres ved hjelp av foreliggende fremgangsmåte eller på annen måte inaktiveres.

Ved en ikke-kontinuerlig fremgangsmåte avsluttes fermenter-ingen ved et visst tidspunkt, fortrinnsvis ved tilsetning i av en tilstrekkelig mengde av blandingen eller midlet ifølge; oppfinnelsen. Deretter blir eventuelle vertsorganismer som er tilbake i ikke-lysert tilstand drept ved syre eller varmebehandling, idet sistnevnte behandling velges i henhold til stabiliteten for det ønskede produkt, som deretter isoleres

i og renses pa en passende mate. F.eks. renses syrestabile og syrepresipiterbare produkter (eksempel IFN-a, IFN-Ø). yed presipitering med syre og utvinning ved hjelp av ekstrak-j- I sjon. Andre produkter gjenvinnes frå det klarede lysat ved absorpsjon på ionebytterharpikser eller affinitetsharpiks eller ved presipitering med hvilken som helst av de mange velkjente additiver, såsom salter, metallioner og lignende.

I en satsprosess kan en del av kulturen fjernes ved passende tidspunkter og behandles som ovenfor angitt for å gjenvinne det ønskede produkt mens den gjenværende del av kulturen fortsetter å vokse å produsere det ønskede produkt. I en kontinuerlig prosess kan det ønskede produkt .gjenvinnes på samme måte som angitt fra mediumstrømmen etter at den har passert gjennom den imobiliserte eller på annen måte loka-liserte kultur av vertsorganismer. Oppfinnelsen skal i det etterfølgende belyses ved hjelp av de følgende eksempler.

i

Eksempel I

E.coli DS410 ( (3-Lac-AUG (a2) ) , en E.coli DS410 (ara azide'Ton' A lac y Tsx min a min b gal A xyl step<R>) stamme ble transformert med plasmid 3-lac-AUG(a2) som beskrevet i den ov' éIn-for nevnte europeiske patentsøknad. Den er deponert i the American Type Culture Collector under ATCC nr. 317 69.; Den transformerte vert inneholdt IFN-a2 genet forbundet via en AUG initiator kondon til penicillinase (3-lac) ekspresjons-kohtrollsekvensen til pBR322. Verten er resistent mot tetra-cyklin og streptomycin. Organismen ble dyrket til en celle-, densitet på 5xl0<9>(OD =6) i en 120 1 kultur ved 30°C og

i en prøve ble det bestemt hvor meget IFW som var produsert j av vertsorganismene. Kulturmediet bestod av casaminosyrer ■

(enzymatisk casein hydrolysat "C-0626", "Sigma") (30 g/l),

glycerol (98% PHHVI, rent, "Siegfried") (20 g/l), gjærekstrakt

(BBL) (2 g/l), KH2P04(ren, n.A. "Fluka") (5 g/l), NaOH (p.A. Merck, nr. 6498) (1,2 g/l), "Silikon DX31DB" (Dow Chemical)

(0,1 ml/l), MgS04 • 7H20 (Merck, z.Analyse, nr. 5886) (1 g/l)<:>.

og NaOH (som ovenfor) (ca. 2 g/l). Mediet ble fremstilt'ved varmebehandling i autoklav av kasaminosyrene, glycerolet, gjærekstraktene, Kr^PO^og silisiumoksydet i 20 min. ved 120°C. Etter avkjøling ble MgSO^-7H20 i vann som på for-

hånd var varmebehandlet tilsatt og pH justert til 7 ved hjelp av NaOH i vann. Lufting og omrøring ble utført for å sikre et innhold av oppløst oksygen på minst- 80% (i for-

hold til luft ved atmosfærisk trykk) på ethvert tidspunkt.

pH ble holdt på 7 ved tilsetning av lOM NaOH.

75 mg/l ampicillin (et penicillinderivat) ble tilsatt ved ODgj-Q - 6 og lufting og omrøring fortsatt som tidligere.

Etter at OD^rn var sunket til 4 (30-50 min.) ble kulturen

obl)

avkjølt til 10 C og H2S04(ca. 4 M) ble langsomt tilsatt for å justere pH til 1,9. I visse tilfeller ble trikloreddik-syre anvendt for å justere pH til 1,3 for således å fremme en fullstendig presipitering av det ønskede IFN produkt.

Presipitatet ble oppsamlet i en "Westphalia" separator og

det konsentrerte faststoff sentrifugert til en pasta i en "Sharples" sentrifuge. Pastaen (ca. 133 g/l, fuktig) ble

suspendert i 5 ganger dens vekt i avionisert vann, homogeni-''

i

sert ved hjelp av en "Silverson" homogenisator og pH justert

til 7,2 med 2 M NaOH (ca. 31 NaOH er vanligvis krevet). En analyse viste at i det vesentlige alt av IFN produkter

produsert av vertsorganismen var gjenvunnet. Det oppsamlede og ekstraherte IFN-a kan deretter behandles på et antall I !

forskjellige måter for rensning av produktet. Som tidligere

!I

angitt omfattes de etterfølgende teknikker ikke av oppfinn- j

eisen.. j

■ i ■ ' Eksempel II

E. coli DS410 (3-lac.AUG(a2), som ovenfor beskrevet ble dyrket til en celledensitet på 10 9/ml under de samme betingelser

i og under anvendelse av det ovenfor beskrevne medium. Også i dette tilfellet ble en prøve analysert for å bestemme nivået av IFN produksjonen. 5 ampicillin pr. ml av kulturen, ble deretter tilsatt og inkuberingen fortsatt med full lufting og omrøring. Det ble ikke observert noen forøkelse i ! antall av levende celler så trolig ble den fraksjon av cellene som ble lysert eller i det minst permeabilisert av ampicil-linet og derved avga IFN-a2 til mediet, erstattet,i alle fall innenfor grensene av den anvendte påvisningsmetode,

ved fortsatt deling av de gjenværende celler. Disse celler vil naturligvis fortsatt produsere ytterligere IFN-a2. Etter ca. 1 time viste en bestemmelse en så høy titer som 2,0 x 10<8>enheter IFN/1. Kulturen ble deretter behandlet som beskrevet i eksempel 1 og i det vesentlige all IFN aktivitet ble gjenvunnet fra kulturen i syreutfellingen.

Eksempel III

En 1 1 kultur av E.coli DS410 (3"Lac AUG(a2), som ovenfor beskrevet ble dyrket ved 3 7°C i det samme kulturmedium som ovenfor beskrevet til en celledensitet på ca. 10 ^. Kulturen ble deretter inkubert med 20 mM EDTA, 100 ;jg/ml lysozym i 30 min. ved 37°C og deretter lysert med 0,4% SDS. Etter avkjøling til 10°C ble lysatet justert til pH 2 med svovel-syre og fikk henstå i 60 min. for å avlive alle gjenværende celler. Presipitatet ble oppsamlet ved sentrifugering og homogenisert med vann (1/2 0 av det opprinnelige kulturvolum) mens pH ble justert til 7,3 med NaOH. Fjerning av uopp- j løselige bestanddeler ga en klar oppløsning med 50-100% av den opprinnelige IFN-a aktivitet. I dette tilfellet var!en

ytterligere rensing av IFN-a vanskelig trolig p.g.a. IFNj-kompleksering med hydrofobe membranproteiner som også ble ekstrahert med SDS. En slik kompleksering vil naturligvis I ikke være noen ulempe ved gjenvinning av andre ikke-inter- | feronprodukter.. |

Claims (10)

1. Fremgangsmåte ved gjenvinning av et produkt fra en ve! rtsI-organisme som produserer dette produkt,karakterisert vedå utsette vertsorganismen for i det minste en blanding eller et middel som forårsaker lyse eller i det j minste permeabilisering av vertsorganismen for derved å fri-! gjøre det ønskede produkt.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakteris e!r t véd at vertsorganismen velges fra gruppen beståendej av stammer av E.coli, Pseudomonas, bacillus subtilis, bacillus stearothermophilus, andre basiller, gjær, andre fungi, j dyr- eller planteceller eller andre vertsorganismer. ; ' ! i

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakter i - i sert ved at vertsorganismen er en stamme av E. : coli. i

4. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-3,karakterisert vedat vertsorganismen er en vertsorganisme som er transformert med en vektor omfattende en DNA sekvens som koder for produktet.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisertved at DNA sekvensen velges fra gruppen bestående av DNA sekvenser som koder for proteiner, DNA sekvenser som koder for polypeptider, DNA sekvenser som koder for enkle eller multiple aminosyrer, DNA sekvenser som koder for enzymer, DNA sekvenser som koder for industrielle kjemikalier og DNA sekvenser som koder for næringsmidler.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4 eller 5,karakterisert vedat DNA sekvensen velges fra gruppen bestående av DNA sekvenser som koder for polypeptider som utviser en immunologisk eller biologisk aktivitet for leukocyttinterferon, DNA sekvenser som koder for polypeptider'som, utviser en immunologisk eller biologisk aktivitet som fibro-, i blastinterferon, DNA sekvenser som koder for polypeptider I med antigenaktivitetene tilsvarende den for FMDV virusanjti- ■ gener, DNA sekvenser som koder for polypeptider. med antij- genaktivitet tilsvarende hepatit B virusantigener og DNA; i sekvenser som koder for andre polypeptider og proteiner som utviser en immunologisk eller biologisk aktivitet tilsvarende den for animalske eller humane produkter. !

7. Fremgangsmåte ifølge kravene 4-6, karakteri sert ved at DNA sekvensen koder for polypeptide<r>i i som utviser en immunologisk eller biologisk aktivitet'til- i svarende den for leukocyttinterferon. i i I

8. Fremgangsmåte ifølge kravene 1-7, karakteri sert ved at blandingen eller midlet velges fraj gruppen bestående av detergentér, enzymer, penicillin,, cykloserin, bacitracin, zancomycin, ristocetin, polymyksin, samt j deres derivater.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8/karakterisertved at blandingen eller midlet velges fra gruppen be,- ] stående av ampicillin og derivater derav.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakteris e,rt ved at penicillinet tilsettes til kulturen med en celle- ■ densitet på ca. 10 9celler/ml i en mengde på 15 mg/l til ca. 75 mg/l. i i- I ! i i<!.>