NO821818L - Fremstilling og anvendelse av genetisk modifiserte mikroorganismer. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører fremstilling og anvendelse av genetisk-modifiserte mikroorganismer og spesielt en fremgangsmåte for fremstilling av éncelle protein (SCP) ved dyrkning av genetisk-modifiserte bakterier på et kulturmedium som inneholder .metanol, videre genetisk-modifiserte bakterier for anvendelse ved fremgangsmåten, samt en fremgangsmåte for fremstilling av slike genetisk-modifiserte bakterier.

I vårt britiske patentskrift nr. 1370892 beskriver vi en fremgangsmåte for fremstilling av SCP ved hvilken bakterier som blant annet tilhører arten Methylophilus methylotrophus

(tidligere kalt Pseudomonas methylotropha) dyrkes i et vandig medium som omfatter metanol som karbonkilde og aktuelle uorganiske næringsstoffer. Ved en slik prosess er det ønskelig at det oppnås høy karbon-omdannelse (dvs. omdannelse av substrat- eller metanolisk karbon til cellulært karbon). Fra studier av den karbon-begrensede (dvs. metanol-begrensede) kontinuerlige vekst av Methylophilus methylotrophus i en kjemostat har vi lært at vekst ikke bare begrenses av forrådet av karbon, men også av den samtidige tilførsel av energi. Således kan karbon-omdannelse forbedres hvis mikroorganismen gjøres mer energetisk effektiv,

dvs. hvis den modifiseres genetisk for å redusere den energi som forbrukes ved dens egen metabolisme, eller øke tilførsel av energi til cellen. I vårt britiske patentskrift nr. 2003926B

og vår publiserte europeiske patentsøknad nr. 35831 har vi beskrevet den genetiske modifisering av metanolforbrukende mikroorganismer, f.eks. Methylophilus methylotrophus, ved utbytting av en bane for ammoniakk-assimilering med en annen som er energetisk mer gunstig, i den hensikt å forbedre karbonomdannelsen når disse mikroorganismer anvendes i en prosess for fremstilling av éncelle protein.

De fleste mikroorganismer som har evne til vekst på metanol som kilde for karbon og energi, er kjent for å metabolisere metanol til formaldehyd. To distinkte klasser av reaksjoner er blitt identifisert for denne metabolisme, nemlig: (a). i gjær med evne til å vokse på metanol, en metanol-oksydasjonsreaksjon, som involverer molekylært oksygen og produserer hydrogenperoksyd katalysert av enzymet metanol-oksydase (MO), hvilket er oppsummert i ligning (1):

ingen energi konserveres som ATP i denne reaksjon; (b) i bakterier med evne til å vokse på metanol, en metanol-oksydasjonsreaksjon som ikke involverer molkylært oksygen direkte, men som benytter en alternativ elektron-akseptor som, i tilfellet av mikroorganismen Methylophilus methylotrophus, er oksydert cytokrom c. Denne reaksjon katalyseres av enzymet metanol-dehydrogenase (MDH) som er oppsummert i ligning (2)

Det reduserte cytokrom c reoksyderes, for at det skal kunne brukes om igjen i reaksjonen, ved hjelp av en kompleks-kjede av elektronbærere med oksygen som den endelige oksydant i den reaksjon som produserer vann.Metabolismen av metanol til formaldehyd ved denne reaksjon tilveiebringer tilstrekkelig energi til å muliggjøre ett mol av ATP til å bli syntetisert fra ett mol ADP og ett mol uorganisk fosfat for hvert mol metanol som oksyderes slik. Det således syntetiserte ATP er tilgjengelig for anvendelse i biosyntesen av cellulære materi-aler.

Den eksakte mekanisme ved hvilken ATP produseres og/eller anvendes er uvesentlig. Imidlertid ville mer effektiv bruk av ATP i biosyntese eller syntesen av mer ATP pr. mol metanol som er metabolisert enn hva som oppnås i reaksjonene (1) og (2) gjøre metabolisme mer energetisk effektivt og øke karbonomdannelsen. Intet ATP konserveres ved mekanismen fra reaksjon 1 under anvendelse av MO. Reaksjonsmekanismen fra reaksjon 2 under anvendelse av MDH fører til konservering av ett mol ATP, ekvivalent med tilnærmet 8 kcal/mol av nyttig biosyntetisk energi pr. mol metanol som er oksydert til formaldehyd. Imidlertid gir oksyderingen av metanol til formaldehyd i over-kant av 50 kcal varme. Således er den biologisk katalyserte reaksjon, når den utføres i metanol-forbrukende bakterier under anvendelse av MDH, tilnærmet 16% effektiv uttrykt som energi konservert som ATP. Når den utføres i metanol-forbrukende gjærsopper under anvendelse av MO, er den enda mindre effektiv. Utbytting av et eksisterende enzymatisk system for metanolmetabolisme i en metanol-forbrukende mikroorganisme ved et alternativt enzymsystem som er energetisk mer effektivt, vil tilveiebringe forbedret karbon-omdannelse ved denne mikroorganisme i en prosess for fremstilling av SCP.

Forklaring av termer og symboler

I denne beskrivelse har de termer og symboler som er angitt nedenunder, følgende betydninger:

ADP - adenosindifosfat,

ATP - adenosintrifosfat,

NAD(P) - nikotinamid-adenindinukleotid (eller

NAD-fosfat) i sin oksyderte form,

NADH - nikotinamid-adenindinukleotid (eller

NAD-fosfat) i sin reduserte form,

DNA - deoksyribonukleinsyre - genetisk materiale

fra alle selv-replikerende organismer,

mdh-gen - den gen-spesifikke metanol-dehydrogenase (MDH),

nøkkel-enzymet for metanolmetabolisme til stede i metanol-forbrukende bakterier.

Km - "Michaelis-konstanten" til et enzym for sitt substrat, som er lik konsentrasjonen av det substrat ved hvilket reaksjonshastigheten er 1/2 av sin maksimale hastighet. For et enzym som adlyder klassisk Michaelis-reaksjons-kinetikk er den lik dissosiasjonskonstanten for enzymsubstrat-komplekset.

mo-gen - den gen-spesifikke metanol-oksydase (MO),

nøkkel-enzymet for metanolmetabolisme til stede i metanol-forbrukende gjærsopper. adh - et gen som er spesifikt for en alkohol-dehydrogenase (ADH), et enzym som normalt katalyserer reaksjonen:

RCH2OH + NAD(P) < > RCHO + NAD (P) H

hvor R er en uforgrenet alkylgruppe, vanligvis en metyl-, etyl- eller propylgruppe,

dvs. RCH2OH er en primær alkohol.

I henhold til foreliggende oppfinnelse tilveiebringer vi en fremgangsmåte for fremstilling av éncelleprotein ved aerobt å dyrke en genetisk-modifisert, metanol-forbrukende mikroorganisme i et vandig dyrkningsmedium som omfatter metanol som kilde for assimilerbart karbon og uorganiske næringsstoffer hvor den metanol-forbrukende mikroorganisme er blitt genetisk modifisert for fjerning fra dens gen eller gener koding for enzym-aktiviteten til metanol-dehydrogenase (MDH) eller metanol-oksydase (MO) og for å erstatte denne ved innlemmelse av DNA-materiale omfattende et adh-gen som er i stand til å utkode en enzymkatalysator for oksydasjon av metanol til formaldehyd.

Videre i henhold til oppfinnelsen tilveiebringer vi aerobt dyrkede mikroorganismer av en eller flere arter som er i stand til å forbruke metanol som kilde for karbon og energi, som er blitt genetisk-modifisert for å fjerne genet eller genene som koder for enzymaktiviteten til metanol-dehydrogenase (MDH) eller metanol-oksydase (MO) og for å erstatte dette med DNA-materiale som omfatter et adh-gen som er i stand til å utkode én enzym-katalysator for oksydasjon av metanol til formaldehyd.

Videre i henhold til oppfinnelsen tilveiebringer vi en fremgangsmåte for fremstilling av en genetisk-modifisert, metanol-forbrukende mikroorganisme ved i en metanol-forbrukende mikroorganisme å utbytte genet eller genene som koder for enzym-aktiviteten til metanol-dehydrogenase (MDH) eller metanol-oksydase (MO) med DNA-materiale som omfatter et adh-gen som er i stand til å utkode en enzymkatalysator for oksydasjon av metanol til formaldehyd, og denne fremgangsmåte omfatter trinnene (1) å oppnå fra en første mikroorganisme som har adh-genet ved in vitro- eller in vivo-hjelpemidler et replikon som inneholder nevnte gen, (2) å produsere en mutant av en metanol-forbrukende mikroorganisme som er i underskudd på det eller de gener som koder for enzymaktiviteten til metanol-dehydrogenase (MDH) eller metanol-oksydase (MO) og (3) å overføre nevnte adh-gen på en egnet vektor inn i en annen mikroorganisme. Den annen mikroorganisme kan være den gen-manglende mutant som er ment som den siste resipient av adh-genet, eller den kan være et mellomprodukt, idet DNA-materialet som omfatter adh-genet over-føres via en eller flere intermediære mikroorganismer fra den første mikroorganisme til mutanten som mangler det eller de gener som koder for enzymaktiviteten av MDH eller MO. Fortrinnsvis er de intermediære resipienter stammer hvor utkoding av adh-genet kan klassifiseres.

Ved sammenligning med kjente metanol-forbrukende mikroorganismer er oksydasjonen av metanol til formaldehyd i de genetisk-modifiserte mikroorganismer i henhold til oppfinnelsen energetisk mer effektiv. Grunnen til dette skal diskuteres nedenunder.

La oss betrakte oksydasjonen av etanol til acetaldehyd ved hjelp av etanol-forbrukende mikroorganismer. Denne katalyseres av en alkohol-dehydrogenase (ADH) enzym og skrider frem i henhold til ligning (3):

I dette tilfelle er elektron-akseptoren NAD(P), og det NAD (P) H som produseres i reaksjonen kan anvendes direkte for biosyntese eller kan reoksyderes av en kompleks blanding av enzymer, elektronbærere og oksygen. Denne prosess (oksydasjon av NAD(P)H ved hjelp av oksygen) gir 3 mol ATP fra 3 mol ADP og uorganisk fosfat pr. mol NAD(P)H som er oksydert i egnede organismer. Hvis således syntesen av 1 mol ATP er ekvivalent med 8 kcal, konserveres tilnærmet 24 kcal av nyttig biosyntetisk energi fra de 50 kcal som tilnærmet blir produsert i denne reaksjon i hvilken etanol omdannes til acetaldehyd og som er potensielt tilgjengelig for konservering. Energiomdannelseseffektiviteten er således tilnærmet 48%. Vi har funnet at visse alkohol-dehydrogenase-enzymer og spesielt visse etanol-dehydrogenase-enzymer er i stand til å oksydere metanol til formaldehyd under anvendelse av NAD(P) som elektron-akseptor og under produksjon av NAD(P)H. Inkorporering av slike alkohol-dehydrogenase-enzymer i metanol-forbrukende mikroorganismer i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse vil derfor øke energiomdannelsen merkbart og øker derfor karbonomdannelsen under en SCP-produksjonsprosess. Spesielt slike metanol-forbrukende mikroorganismer som metanol-forbrukende gjærsopper, som inneholder en metanol-oksydase og derfor oksyderer metanol ifølge reaksjon (1) ovenfor i hvilken ingen energi konserveres som ATP, vil bli sterkt forbedret uttrykt som øket effektivitet hvis metanol-oksydasen erstattes av en NAD(P)-bundet alkohol-dehydrogenase som er i stand til å katalysere oksydasjonen av metanol til formaldehyd.

Mikroorganismer som på nyttig, måte kan modifiseres ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen for inkorporering av et adh-gen inkluderer følgende metanol-forbrukende bakterier: Methylophilus methylotrophus - kulturer av en rekke stammer av hvilke det er deponert som følger og som er beskrevet i britisk patentskrift nr. 1370892: NCIB 10508-10515 og 10592-10596, alle inklusive;

NRRL B 5352-B 5364 inklusive;

FRI 1215-1227 inklusive;

genetisk-modifisert Methylophilus methylotrophus produsert ved fremgangsmåten i henhold til publisert europeisk patentsøknad nr. 35831, og av hvilken er deponert en kultur som NCIB 11585. Pseudomonas methylonica - hvis karakteristika er beskrevet i britisk patentskrift nr. 1451020, og av hvilken en kultur er

deponert som følger:

FRI 2247 og 2248

Pseudomonas methanolica - britisk patent nr. 1352728-ATCC 21704; Pseudomonas sp. - britisk patent nr. 1326582-ATCC 21438

og 21439;

Methylomonas methanolica britisk patent nr. 1420264-NRRL B 5458; Pseudomonas utilis - britisk patent nr. 1444072-FRI 1690

og 1691;"

Pseudomonas inaudita - britisk patent nr. 1444072-FRI 169 3

og 1694;

Methylomonas clara - USP 4166004-ATCC 31226;

og de metanol-forbrukende gjærsopper, for eksempel metanol-forbrukende stammer av artene Candida, Hansenula og Pichia.

NB: NCIB er National Collection of Industrial Bacteria,

Aberdeen, Storbritannia.

NRRL er Collection som holdes av US Department

of Agriculture, Peoria, Illinois;

ATCC er American Type Culture Collection;

FRI er Fermentation Research Institute,

Japan.

Slike mikroorganismer kan anvendes i prosesser for fremstilling av SCP hvor, etter modifikasjon ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, de dyrkes aerobt i et vandig medium som inneholder metanol som kilde for assimilerbart karbon og uorganiske næringsstoffer, fulgt av gjenvinning av SCP fra dyrkningsmediet.

Betingelsene ved fremgangsmåten for fremstilling av SCP er bekvemt som beskrevet i britisk patentskrift nr. 1370892.

Ved fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse for fremstilling av en genetisk-modifisert mikroorganisme kan trinn (1) anvendes for å produsere ethvert egnet replikon som inneholder adh-genet. Imidlertid er replikonet fortrinnsvis en plasmidvektor.

I oppfinnelsen er kilden for adh-genet som er i stand til å utkode en enzymkatalysator for oksydasjon av metanol til formaldehyd, dvs. den første mikroorganisme ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, passende en stamme av arten Bacillus stearothermophilus som viser adh-aktivitet på metanol. Fortrinnsvis er stammen av Bacillus stearothermophilus en stamme av Bacillus stearothermophilus var Non diastaticus som oppviser adh-aktivitet på metanol. En slik stamme av Bacillus stearothermophilus var Non diastaticus er stamme D2 166 som er

beskrevet av N. Grossowicz og I. Epstein, J. Bacteriol. , 99,

s. 414, 1969. En kultur av stamme D2 166 er deponert ved National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Torrey Research Station, PO Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen, Storbritannia, og har fått tilgjengelighetsnummeret NCIB 11739. Ikke alle stammer av Bacillus stearothermophilus viser adh-aktivitet på metanol, f.eks. vises ikke slik aktivitet av Bacillus stearothermophilus NCIB 8924 som derfor ikke er egnet for anvendelse som den første mikroorganisme ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen.

Ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen foretrekkes det, når adh-genet overføres fra den første mikroorganisme til den siste resipient-mikroorganisme under anvendelse av en intermediær mikroorganisme, at den intermediære mikroorganisme er en stamme av E. coli som mangler adh-genet. Fortrinnsvis overføres adh-genet fra den første mikroorganisme til den intermediære mikroorganisme ved anvendelse av et derivat av plasmidet R300b, f.eks. plasmid pTB 107.

Det er flere konsekvenser som resulterer fra introduksjonen av et adh-gen i en metanol-forbrukende mikroorganisme ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen. Den mest betydningsfulle av disse, som antydet ovenfor, er forbedret karbon-omdannelse i SCP-produksjonsprosessen. Denne kunne være så høy som 20-30% forbedring i molar vekst-utbytte fra metanol. Den høye Km for ADH for metanol er slik at de modifiserte mikroorganismer i henhold til oppfinnelsen fortrinnsvis dyrkes i nærvær av metanol-konsentras joner som er høyere enn dem som vanligvis anvendes ved fremgangsmåten i henhold til britisk patent nr. 1370892, f.eks. metanolkonsentrasjoner i området 5-500 ml-1. Effekten av den høyere startkonsentrasjon for metanol som kreves for karbon-begrenset vekst er å gjøre organismen meget mindre sensitiv over-for f luktuering i metanolkonsentrasjon fordi området av metanol-konsentras jon i hvilket karbonbegrensning (og følgelig effektiv vekst) opprettholdes, nå er meget videre. Som en konsekvens reduseres nødvendigheten for komplekse metanolfordelingssystemer i de fermentorer som anvendes i SCP-produksjonsprosessen, f.eks. slike systemer som er beskrevet i britisk patentskrift nr. 1523583, i høy grad. Andre konsekvenser av den genetiske modifikasjon inkluderer nedsatt fermenteringsvarme og med-følgende reduksjon i avkjølingsomkostninger, redusert oksygen-behov pr. tonn produkt og medfølgende reduksjon i gass- kompresjonsomkostninger og nedsatt utvikling av karbondioksyd pr. tonn produkt som produseres, hvilket tillater mer effektiv bruk av fermenterings-variable så som trykk.

Oppfinnelsen skal nå illustreres ved hjelp av et eksempel.

Eksempel

Overføring av adh-gen fra Bacillus stearothermo<p>hilus var Non diastaticus-stamme til Methylophilus methylotrophus-stamme

adh-genet ble overført fra Bacillus stearothermophilus var Non diastaticus-stamme D2 166, som inneholder et adh-gen som viser aktivitet på metanol, til Methylophilus methylotrophus-stamme NCIB 10515 ved den metode som er beskrevet nedenunder.

1. Utvikling av vektor

adh-genet fra stamme D2 166 ble plassert på plasmid pTB 107 (et derivat av plasmid R300b anvendt ved fremgangsmåten i henhold til europeisk patentsøknad 35831). Dette ble gjort ved å kutte plasmid-DNA under anvendelse av restriksjonsenzymet X ho 1 og å innsette DNA som inneholdt adh-genet fra D2 166, i plasmid-DNA. Det modifiserte plasmid pTB 107 som bar adh-genet ble an-brakt i en E. coli-stamme som var adh og ace (dvs. manglet adh- og pyruvat-dehydrogenase-genene). Restriksjonsenzymet X ho 1 kutter plasmid-DNA ved sete i Km<r->genet (dvs. den gen-spesifikke kanamycin resistans). Således ødelegger innlemmelse av fremmed-DNA ved X ho 1-sete kanamycin-resistans, og celler som inneholder DNA innsatt som beskrevet er kanamycin-sensitive Km . Behandlede E. coli-celler ble klassifisert på følgende

3 alternative måter for at man skulle finne celler som inneholdt plasmidet pTB 107 som bar adh-genet: Alternativ 1 - de E. coli-céller som ble anvendt hadde et suksinatbehov. Tilsetning til disse celler av plasmid pTB 107 som inneholdt adh produserer celler hvor suksinatbehovet delvis er avhjulpet ved etanol - slike celler som har suksinatbehovet delvis avhjulpet, ble søkt ved konvensjonelle klassifiserings-metoder;

Alternativ 2 - behandlede E. coli-celler ble omsatt med et adh-antistoff, som forårsaket utfelling av protein i de celler som har mottatt plasmider som bærer adh-gener ; og

Alternativ 3 - et stykke av DNA ble konstruert som er komplemen-tært til en DNA-sekve.ns som, fra sin aminosyre-sekvens, kan forutsies å være en del av DNA-sekvensen i adh-genet. Det kon-struerte DNA ble radioaktivt merket og ble brukt i hybridi-serings-eksperimenter for å identifisere kloner av kanamycin-sensitive celler som er i besittelse av DNA-sekvensen for adh-genet.

2. Produksjon av mdh~-mutant av NCIB 10515

En mdh~-mutant av stamme NCIB 10515 ble produsert ved å mutere celler av NCIB 10515 for å forårsake en uegnethet til å vokse på metanol som den eneste karbonkilde. Muteringen kan foregå på hvilken som helst av de følgende måter:

(a) i det strukturelle mdh-gen-,

(b) i genet for syntese av ko-faktoren for mdh;

(c) i genet for syntese av det spesifikke cytokrom C

for mdh-genet; og/eller

(d) i et gen eller gener involvert i reguleringen av genene

brukt i (a), (b) eller (c).

3. Overføring av adh-gen til mdh~ NCIB 10515

Plasmid pTB 107 kan ikke mobilisere seg selv inn i celler av mdh~-stamme NCIB nr. 10515, dvs. pTB 107 overføres ikke fra en stamme som bærer pTB 107 til en annen stamme. Denne vanskelighet ble overvunnet ved å innsette i E. coli-cellene som inneholdt pTB 107 : adh et ytterligere plasmid som kan mobilisere seg selv inn i celler av mdh~ NCIB 10515. Det ekstra plasmid som ble innsatt var RP4 hvis egenskaper muliggjør det å tilveiebringe en fremgangsmåte for overføring av plasmider, f.eks. plasmid pTB 107: adh fra en celle til en annen. E.coli-celler ble derfor fremstilt som inneholdt plasmidene pTB 107: adh og RP4. En streptomycin-resistensmarkør (Sm ) bæres av plasmid pTB 107. mdh~ NCIB 10515 mangler denne resistens. Denne streptomycin-resistens ble deretter benyttet for å selektere for overføring av pTB 107 adh til mdh~ NCIB 10515.

Ved anvendelse av plasmid RP4, ble plasmid pTB 107 som bar adh-genet overført til NCIB 10515 for produksjon av en stamme av Methylophilus methylotrophus modifisert i henhold til oppfinnelsen for å inneholde et adh-gen med evne til å utkode en enzym-katalysator for oksydasjonen av metanol til formaldehyd.

Claims (16)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av éncelleprotein ved aerobt å dyrke en genetisk-modifisert, metanol-forbrukende mikro organisme i.et vandig kulturmedium som omfatter metanol som kilde for assimilerbart karbon og uorganiske næringsstoffer, hvor den metanol-forbrukende mikroorganisme er genetisk modifisert for å fjerne fra den det eller de gener som koder for enzym-aktiviteten til metanol-dehydrogenase (MDH) eller metanol-oksydase (MO) og for å erstatte dette ved innlemmelse av DNA-materiale som omfatter et adh-gen med evne til å utkode en enzym-katalysator for oksydasjon av metanol til formaldehyd.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det anvendes en genetisk modifisert mikro-, organisme som stammer fra en eller flere stammer av arten_ Methylophilus methylotrophus.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at det anvendes en genetisk modifisert mikroorganisme som stammer fra en eller flere av stammene NCIB 10508-10515 og 10592-10596 inklusive.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det anvendes en genetisk modifisert mikroorganisme som stammer fra en eller flere av stammene FRI 2247, FRI 2248, ATCC 21704, ATCC 21438, ATCC 21439, NRRL B-5458, FRI 1690, FRI 1691, FRI 1693, FRI 1694 og ATCC 31226.

5. Aerobt dyrkede mikroorganismer av en eller flere arter som har evne til å forbruke metanol som kilde for karbon og energi, som er blitt genetisk-modifisert for fjerning av det eller de gener som koder for enzym-aktiviteten til metanol-dehydrogenase (MDH) eller metanol-oksydase (MO) og for å erstatte dette ved DNA-materiale som omfatter et adh-gen som har evne til å utkode en enzym-katalysator for oksydasjon av metanol til formaldehyd.

6. Aerobt dyrkede mikroorganismer som angitt i krav 5, produsert ved den genetiske modifikasjon av en eller flere stammer av arten Methylophilus methylotrophus.

7. Aerobt dyrkede mikroorganismer som angitt i krav 6, produsert ved den genetiske modifikasjon av en eller flere av stammene NCIB 10508-10515 og 10592-10596 inklusive.

8. Aerobt dyrkede mikroorganismer som angitt i krav 5, produsert ved den genetiske modifikasjon av en eller flere av stammene FRI 2247/ FRI 2248, ATCC 21704, ATCC 21438, ATCC 21439, NRRL B-5458, FRI 1690, FRI 1691, FRI 1693, FRI 1694 og ATCC 31226.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av en genetisk-modifisert, metanol-forbrukende mikroorganisme ved å erstatte i en metanol-forbrukende mikroorganisme det eller de gener som koder for enzymaktiviteten til metanol-dehydrogenase (MDH) eller metanol-oksydase (MO) med DNA-materiale som omfatter et adh-gen med evne til å utkode en enzym-katalysator for oksydasjon av metanol til formaldehyd, karakterisert ved at den omfatter trinnene (1) å oppnå fra en første mikroorganisme som har adh-genet, ved in vitro- eller in vivo-hjelpemidler et replikon som inneholder nevnte gen, (2) å produsere en mutant av en metanol-forbrukende mikroorganisme som mangler det eller de gener som koder for enzymaktiviteten til metanol-dehydrogenase (MDH) eller metanol-oksydase (MO), og (3) å overføre nevnte adh-gen på en egnet vektor inn i en annen mikroorganisme.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 9, karakterisert ved at den annen mikroorganisme er den siste resipient for adh-genet.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 9, karakterisert ved at den annen mikroorganisme er en intermediær mikroorganisme og at DNA-materiale som omfatter adh-genet over-føres via en eller flere intermediære mikroorganismer fra den første mikroorganisme til den mutant som mangler i genet eller genene som koder for enzymaktiviteten av MDH eller MO.

12. Fremgangsmåte som angitt i hvilket som helst av kravene 9 til 11, karakterisert ved at i trinn (1) er det replikon som inneholder adh-genet, en plasmidvektor.

13. Fremgangsmåte som angitt i hvilket som helst av kravene 9 til 12, karakterisert ved at den første mikroorganisme er en stamme av arten Bacillus stearothermophilus som oppviser adh-aktivitet på metanol.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert ved at den første mikroorganisme er en stamme av Bacillus stearothermophilus var Non diastaticus som oppviser adh-aktivitet på metanol.

15. Fremgangsmåte som angitt i krav 14, karakterisert ved at den første mikroorganisme er Bacillus stearothermophilus-stamme D2 166 (NCIB 11739).

16. Fremgangsmåte som angitt i hvilket som helst av kravene 9 og 11 til 15, karakterisert vedat det anvendes en intermediær mikroorganisme som er en stamme av E. coli.