NO823111L - Fremgangsmaate for paavisning av meget smaa mengder av antigener og antistoff ved en forbedret agglutinasjonsinhiberende test - Google Patents

Abstract

I. Fremgangsmåte for påvisning av meget små mengder antigener og antilegemer ved hjelp av en forbedret agglutineringsinhiberingstest.Denne fremgangsmåte anvender en immunologisk mekanisme av typen antigen- antilegemer og erat antilegemene omsettes med antigenene i en væskefase i en primær immunologisk reaksjon hvoretter det tilsettes et sensibilisert indikatorsystem med en forsinkelse som kan oppgå fra 15 min. til 18 timer etter at antigen- antilegeme-reaksjonen har funnet sted.Ved hjelp av denne nye fremgangsmåte oppnås enkning av sensibiliteten for agglutineringsinhiberings-testen med en faktor på fra 10 til 20.

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder en fremgangsmåte for oppdagelse av meget små mengder antigener og antilegemer ved hjelp av en forbedret agglutineringsinhiberingstést.

Bestemmelsen av substanser for diagnostiske eller vitenskaplige formål i flytende prøver ved hjelp av agglutinering og inhibering av agglutineringen i en sensibilisert fast fase, som f.eks. røde blodlegemer, kolloidale partikler, latex eller lignende har vært kjent i mer enn 20 år. Testen foregår som følger: den faste bærerfasen aktiveres ved hjelp av. et bindende middel (f. eks. garvesyre, glutar-aldehyd, difluor-dinitrobenzen) og sensibiliseres ved hjelp av et antigen eller antilegeme. I nærvær av et tilsatt løse-lig antigen, kan dette antigen forbinde seg med antilegemet,

og således inhibere agglutinering eller aggregasjon av den faste fasen.

På samme måtå vil en fast, granulert fase som er sensibilisert ved hjelp av et antilegeme aggregere eller glutinere i nærvære av en bestemt mengde antigen og denne, aggregasjon kan inhiberes ved hjelp av et tilsatt løselig antilegeme.

Dette systemet er meget følsomt men er i de senere år erstattet av mere raffinerte teknikker, blandt hvilke radioimmunologiske prøver er mest brukt. De radioimmunologiske prøvene krever fadioelementer, kostbare måleinstrumenter og høyt kvalifisert arbeidskraft. Det er derfor ikke uintre-ant å forsøke å forbedre følsomheten til den testen som er basert på agglutinering av en fast sensibilisert fase, på

en slik måte at den kan ko/nkurrere med de radioimmunologiske prøvene.

Foreliggende oppfinnelse gjelder således en fremgangsmåte for oppdagelse av antigener, som f.eks. det lutiniserende hormon (LH) det korioniske gonadotropin-hormonet (HCG), : ::a-fetoproteinet (AFB) progesteronet, det karsino-endri-oniske genet, testosteronet, surt fosfatase og andre antigener som f.eks. heroinet, kokainet, glyserginsyren og dens derivater, såvel som deres antilegemer. Hovedgrunnen til at det ikke finnes en enkel og pålitelig agglutinasjons-

test for oppdagelse av disse strukturer er deres lave konsentrasjon i plasmaet, urinen, gjerne ryggmargsvæsken og

andre. For å illustrere denne situasjonen uten at dette eksemplet på noen måte skal være begrensende, skal her lutiniseringshormonet (LH) analyseres, hvilket er et tegn på eggløsning hos pattedyr.

Hos kvinnen utskilles LH normalt på den 14.ende

dag i menstruasjonssyklusen, men dette hormonet utskilles også i små mengder utenom denne toppen liksåvel som av menn. Dette hormonet er meget lik graviditetshormonet (det korioniske gonatropin-hormonet) som utskilles fra fertilitets-øyeblikket og også av visse maligne tumorer.

Begge disse proteiniske hormonene har underenheten

u~. De skiller seg litt fra hverandre ved at underenheten . J3'/. hydrogenbundet til underenheten '.et , er 21 amino-syrer kortere i LH sammenlignet med HCG.

Graviditetstester som bestemmer - a og ' . (^-under-enhetene i HCG er velkjente. Disse immunologiske testene, såvel som mer spesifike tester som baserer seg på bruken av antilegemer mot LH, kan anvendes for bestemmelse av LH. Likeledes kan graviditetstester som er spesifike for underenheten i HCG anvendes for oppdagelse av tumorer som utskiller underenheten " g i HCG.• For tiden anvendes imidlertid bare kompliserte og kostbare radioimmunologiske tester for oppdagelse av små mengder av LH eller

HCG.

Grunnen til at agglutinasjons- og aggregasjons-testene ikke anvendes er de meget små mengder lutiniserende hormon som utskilles ved eggløsningsøyeblikket, såvel som det meget lave nivå op tumormarkører som utskilles av maligne tumorer i det øyeblikk de oppstår, dvs. nøyaktig i det øyeblikk det er viktig å oppdage dem. De konvensjonelle agglutinasjons-testene er ikke tilstrekkelig følsomme til å oppdage dem.

En konvensjonell immonologisk agglutinasjonstest for oppdagelse av . g HCG eller LH anvendes på følgende måte: Urinen eller en annen kropsvæske som inneholder den substansen som skal bestemmes tilsettes til en blanding av sensibiliserte indikatorceller (som regel fåreceller som er sensibilisert av antigenet) som f.eks. et spesifisert antilegeme fortynnet på .Passende måte. Dersom den analyserte væsken er fri for antigen, agglutinerer antilegemene i blandingen de røde blodlegemene og disse sedimenterer som et jevnt teppe på bunnen av serologirøret eller på bunnen av skålen.

Dersom væsken inneholder antigen, vil dette antigen reagere med de solubiliserte antilegemene og en inhibering av agglutinasjonen vil opptre. Cellene sedimenterer da fritt på bunnen av røret i en kompakt ring. En test av denne type anvendt på australsk antigen er beskrevet i US patent-skrift 3 887 697.

Antigen- antilegemereaksjonen er meget langsom ved

4°C og testen IHA utføres vanligvis ved omgivende temperatur (T.A) eller ved 37°C. Når de anvendte reaktantene lagres i et kjøleskap, oppvarmes de vanligvis til T.A. før de tilsettes til indikatorsystemet. Et slikt system er beskrevet i "Methods in Enzymology, vol.70, Immunochemical Techniques, side 462-463, Academic Press".

Systemet er meget følsomt og har muliggjort en rekke spesielle anvendelser, som de som er beskrevet i US patent-skrifter 3 887 697 og 4 308 026.

Denne fremgangsmåte muliggjør bestemmelse av omtrent 125 internasjonale enheter av HCG pr. liter væske eller også 275 internasjonale enheter av LH pr. liter.

I og med at begynnende tumorer utskiller meget små mengder av 6-HCG (oppdaget ved hjelp av en spesifik radio-immunologisk tést for underenheten g) for det første, og at topputskillelsen av LH på den 14.ende dag etter starten på menstruasjonsperioden er i middel 40 internasjonale enheter av LH pr. liter, er agglutineringsinhiberingstestene som er disponible for oppdagelse av 3-HCG eller LH for lite følsomme for oppdagelse av eggløsningen hos en kvinne med normal syklus eller for oppdagelse av tumormarkøren B-HCG

i det øyeblikk tumoren oppstår.

Det er ifølge foreliggende oppfinnelse overraskende funnet at sensibilitetsgrensen for en agglutineringsinhiberingstest kan forbedres med en faktor fra 10 - 20 ganske enkelt ved å forsinke det øyeblikket da systemindikatoren, fortrinnsvis sensibiliserte røde blodlegemer, tilsettes til antilegemet- antigen-blandingen. Det er funnet at de proteaser som vanligvis finnes i dé analyserte væskene (plasma, serum, urin, gjerne ryggmargs-væsken) ikke er tilstrekkelig aktive til på signifikant måte å innvirke på reaksjonen antigen- antilegeme i "den tid som er nødvendig for at denne reaksjonen skal bli fullstendig. Uttrykt på annen måte, foreliggende oppfinnelse har som formål en fremgangsmåte for oppdagelse av antigener og antilegemer ifølge en immunologisk mekanisme av typen reaksjon antigen- antilegeme,karakterisert vedat den omfatter to på hverandre følgende trinn: A - Antilegemene omsettes med antigenene i en flyt ende fase i en primær immunologisk reaksjon, og

B et sensibilisert indikatorsystem tilsettes med en forsinkelse som kan oppgå til fra 15 min. til 18 min. etter at reaksjonen antigen- antilegemer har funnet sted.

Ifølge en spesiell utførelsesform av denne fremgangsmåte, er det sensibilisrerte indikatorsystemet fortrinnsvis en fast, granulert fase som er sensibilisert av antigenet eller av et spesifikt middel. Denne faste, granulerte fase består fortrinnsvis av sensibiliserte erytrositter eller av sensibiliserte bakterier.

Ifølge en spesiell utførelsesform lyofiliseres de spesifike antilegemene i bestemte mengder i enkelte rør og antigenet kan likeledes fordelaktig lyofiliseres i bestemte mengder i enkelte rør.

For at systemet'skal bli mer pålitelig, er det videre funnet at den reaktant som inneholder antilegemene kan inne-holde proteaserinhibitorer og bakteriostater og baktericider, som f. eks. natriumadcid, mertiolat, trasylol, di-isopropy.J-fluorfosfat, EDTA og andre substanser som inhiberer akti-viteten til bakteriene og proteasene under den tid da den immunologiske reaksjonen finner sted, uten imidlertid å sette denne reaksjonen i fare.

Typisk tilveiebringes en på forhånd bestemt mengde av spesifike antilegemer mot antigenet som skal bestemmes (f. eks. 6-H.CG, FP, CEA, heroin) fortynnet i et passende løs-ningsmiddel i flytende form, og lyofiliseres fortrinnsvis for å oppnå større stabilitet under lagring. Til disse spesifike antilegemer tilsettes testvæsken (f.eks. 0,1 til 0,15 ml) inneholdende det antigenet som skal. bestemmes. I stedet for straks å tilsette den sensibiliserte indikatorbestanddelen til blandingen (dvs. sensibiliserte polymer-perler eller sensibilisert latex eller sensibiliserte røde blodlegemer eller lignende) og avlese resultatene av den komplekse reaksjonen straks som en aggregasjon eller etter avstøtning av den faste fase på bunnen av et rør, utsettes tilsetningen av indikatorsystemet til den senere tid. Antigener og spesifike antilegemer i væskefase får så anledning til å reagere med hverandre ved en temperatur som vanligvis oppgår til 20 til 25°C. Det tidsrom primærreaksjonen får lov til å fortsette før tilsetningen av den sensibiliserte indikatorbestanddelen, definerer sensibilitetsnivået for testen. Indikatorsystemet består av en fast, granulert fase som er sensibilisert av et antigen eller et antilegeme.

De følgende eksempler illustrer anvendelse av oppfinn-elsen uten imidlertid å begrense den..

Eksempel 1

Urin fra en mann blandes med HCG i konsentrasjoner som varierer fra 2 00 til 7,5 UI/1. Antilegemer mot underenheten 3 av HCG oppnådd ved inokulering av undårenheten B

hos kaniner, fortynnes på en slik måté at det i en agglutineringsinhiberingstest med fåreceller som er sensibilisert av HCG, en følsomhet på 100 UI/1 i den analyserte væske.

50 ml av antilegemeløsningen, som inneholder 10 _ 3 m di-iso-propylfluorfosfat som proteininhibitor, ble innført i sere- ■', logirør og lyofilisert. For en HCG-bestemmelse fikk hvert av rørene en bestemt dose HCG i o,15 ml urin. Noen før får stå ved omgivende temperatur i noen timer, og ved bestemte intervaller innføres røde blodlegemer som er sensibilisert av HCG i rørene. De røde blodlegemene er suspendert i o,25 ml reaktant. Tabellen på neste side illustrerer det sensibilitetsnivå som oppnås i løpet av tiden.

I denne tabell angis en positiv inhiberende agglutinerings-reaksjon, dvs. nærvær av HCG i den analyserte væske, ved tall som varierer fra 0 til 3, idet 0 betyr en sterk positiv reaksjon og 3 en svak reaksjon. En negativ reaksjon, dvs. fravær av HCG, betegnes med 4 som betyr full agglutinering. Det observeres at IHA-testen, når den utføres på vanlig måte, dvs. med umiddelbar tilsetning av den faste indikator-fase sammen med den reagerende væske til antilegemene ved tiden 0 er sensitiv for 100 Ul HCG pr. liter urin. Denne sensibiliteten er nesten den beste som kan oppnås ved eh slik test. Testens sensibilitet øker signifikant når tilsetningen av indikatorsystemet forsinkes. En 20 gangers økning i sensibilitet oppnås således når den primære antigen-antilegeme-reaksjon i væskefase får fortsette over natten. Det således oppnådde sensibilitetsnivå er det samme som oppnås ved radioimmunoforsøk.

Prisen på bestemmelsen av 3-HCG ved hjelp av den nye IHA-testen, tiden som er nødvendig for å praktisere den, kompetansenivået til brukerne, er alle faktorer som på

meget fordelaktig måte kan sammenlignes med de radioimmunologiske og enzymoimmunologiske-testene.

Eksempel 2

Antilegemer ble oppnådd mot underenheten av HCG som

er identisk med underheten a av LH. 50 microliter av en

_3 passende fortynning av antilegemer inneholdende 10 m

di-isopropyl-fluorfosfat (DFP) og 0,4% EDTA lyofiliseres i serologirør. Etter lyofilisering mottok, rørene 0,15 ml mannlig urin inneholdende varierende mengder av LH eller HCG. Inkubering fant sted i løpet av 18 timer ved omgivelsestemperatur, hvoretter 0,25 ml av en suspensjon av sensibiliserte røde blodlegemer ble tilsatt til alle rørene. En sedimentasjon av celler fant sted i løpet av 2 timer og resultatene ble nedtegnet. Disse er oppsummert i tabell II, hvor 4 betegner fullstendig agglutinering, dvs. fravær av antigen i den analyserte væske, og fra 3 til 0 betegner økende konsentrasjon av antigen i den analyserte væske.

Testen er mer følsom for HCG enn for LH. En konstrasjon av LH i den analyserte væske oppdages uten usikkerhet opptil

et nivå på 50 UI/1 og resten er følsom for 25 UI71. Denne ekstreme sensibiliteten gjør testen anvendbar for oppdagelse av eeLiøsning.

Eksempel 3

Bakterien E. koli ble sensibilisert av HCG. Antilegeme-anti-HCG ble oppnådd fra kaniner ved .'.inokulering av HCG og blødning 14 dager etter en forsterknings inokulering..

Det ble fremstilt en fortynning av antilegemene anti-HCG hvilken inneholdt i 50 yl fortynningsmiddel, ble til--3

satt 10 m DFP og 0,4% EDTA, hvilket var tilstrekkelig til å oppnå en inhibering av aggregasjon av de HCG-sensibiliserte

bakteriene suspendert i 50 yl fortynningsmiddel (0,1 m glycin, pH 8,0 inneholdende 1% kvegalbumin og 0,1% natrium-.acid) da denne suspensjon ble blandet med 50 yl' urin inneholdende 500 UI/HCG pr, liter. Ved en lavere konsentrasjon av HCG i urinen, ble bakteriene aggregert av antilegemene. 50 microliter av antilegemeløsningen ble tilsatt til sero-logirørene og holdt ved 4°C til anvendelsesøyeblikket.

For utførelse av testen ble antilegemeløsningene opp-varmet til omgivelsestemperaturen 50 yl ufin inneholdende forskjellige konsentrasjoner av HCG som varierte fra 500 til 62,5 Ul pr. liter ble tilsatt til løsningen i sero-logirørende og holdt ved omgivelsestemperatur. Ved bestemte intervaller ble 50 yl HCG-sensibilisert bakteriesuspensjon tilsatt til rørene som innholdt antigen- antilegemeblandin<Jen og totalblandingen (0,15 ml)'ble så straks overført til et objektglass hvor væsken ble holdt i omrøring i 3 min.

ved langsom rotasjon av platen.

Etter denne tid ble en vurdering av aggregasjonen eller inhiberingen av aggregasjonen gjennomført. En positiv test, dvs. nærvær av løselige HCG, ble bemerket ved en inhibering av aggreasjonen og en negativ test, dvs. fravær av løselige / HCG ble bemerket ved en aggregasjon av bakteriesuspensjon. Tabell III oppsummerer resultatene fra dette forsøk.

Denne tabell, viser at forsinkelsen ved tilsetning av den

faste indikatormassen til antigen- antilegemeblanding gjør testen mer følsom. En forsinkelse på 15 min. fordobler sensibiliteten, og en forsinkelse på 60 min. øker sensibiliteten

fire ganger.

For praktiske anvendelser foreligger det flere typer

av arbeidsbetingelser.

De spesifike antilegemer og indikatorceller kan tilveiebringes i væske- og suspensjon-form i to adskilte flasker som inneholder proteaseinhibitorer og baktericide og bakterio-statiske midler. Fortynningene og fordelingen av de nødvend-ige væsker for å oppnå en optimal sensibilitet og da ut-føres av brukeren og denne . arbeidsmåte begrenser bruken av testene til medisinske analyselaboratorier.

Antilegemer som forhåndsfortynnet til passende nivå kan tilsettes til serologirør. De kan dessuten lyofiliseres for å forlenge deres stabilitet. Oppdeling av antilegemene i definerte mengder er foretrukket fordi konsentrasjonen av antilegemer må være korrekt justert for å oppnå gode resul-tater. Alt som så behøves er å tilsette til røret en bestemt mengde av testvæske som skal analyseres, vente til den primære reaksjonen er fullstendig og så tilsette indikatorsystemet.

Dersom testen er bestemt for vanlige mennesker, er en foretrukken fremgangsmåte å tilveiebringe serologirørene inneholdende forhåndstynnede antilegemer i lyofilisert form. Dersom indikatorsystemet består av sensibiliserte røde blodlegemer, innføres rørene over et speil og de røde blodlegemene inneholdes i plastposer. Antallet poser som inneholder indikatorsystemet er lik antallet tilveiebragte rør.

Brukeren skal så:

1) Tilsette 2-3 dråper urin til et rør,

2) vente 5-7 timer avhengig av det ønskede sensibilitetsnivå,

3) tilsette inneholdet i en pose til samme rør,

4) vente i 2 timer og avlese i speilet den oppnådde type sedimentasjon.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for oppdagelse av antigener og antilegemer ved hjelp av en immunologisk antigen- antilegeme-reaksjon, karakterisert ved følgende trinn: A - Antilegemene omsettes med antigenene i en væske fase i en primær immunologisk reaksjon, og B - et sensibilisert indikatorsystem tilsettes med en forsinkelse som kan oppgå fra 15 min. til 18 timer etter at reaksjonen mellom antigener og antilegemer har funnet sted.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat det sensibiliserte indikatorsystemet er en fast, granulert, antigensensibilisert fase.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det sensibiliserte indikatorsystemet er en fast, granulert fase som er sensibilisert av spesielt middel.

4. Fremgangsmåte ifølge kravene 1, 2 og 3, karakterisert ved at den faste, granulerte fase består av sensibiliserte erytrocytter.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 2 og 3, karakterisert ved at den faste granulerte fase består av sensibiliserte bakterier.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at de spesifike antilegemene lyofiliseres.i bestemte mengder i individuelle rør.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at antigenet lyofiliseres i bestemte mengder i individuelle rør.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det faste indikatorsystemet fremstilles i form av en suspensjon i enhetsvolumer.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at det faste indikatorsystemet fremstilles i form av en suspensjon i enhetsplast-poser.

10. Fremgangsmåte ifølge kra 1, 5 og 6, karakterisert ved at løsningen av antigener og antilegemer inneholder baktericide og kateriostatiske midler og proteaseinhibitorer.