NO831321L - Fremgangsmaate og apparat for identifisering og opptelling av mikrobe-celler - Google Patents

Abstract

En fremgangsmåte og et apparat for deteksjon og identifikasjon av mikrobeceller i en prøve som kan inneholde flere forskjellige mikroorganismer. Fremgangsmåten omfatter isolering av en eller flere porsjoner av prøven; kombinering av de respektive prøve-porsjoner med ett eller flere materialer som er kjent for å være inhibitor-reagenser for de mikrobeceller som skal undersøkes; tilføring av et elektrisk potensiale over de respektive prøveporsjoner for å indusere en elektrisk ladning på overflaten av til-stedeværende mikrobeceller; sending av en laserstråle gjennom prøveporsjonene i en tidsperiode som er tilstrekkelig lang til at lyset kan passere gjennom prøveporsjonen og bli optisk detektert; måling av prøveporsjonens dobbelt-lysbrytningsfaktor og sammenligning av denne med dobbelt-lysbrytningsfaktoren av en kontrollporsjon som inneholder de mikrobeceller som skal underskes. De respektive prøveporsjoner kan blandes med en rekke forskjellige inhibitor-reagenser for de mikrobeceller som skal undersøkes, for å utvikle en profil som nøyaktig kan identifisere de spesifikke celler og skille dem fra andre bakterier som måtte finnes i prøve-materialet.Apparatet omfatter en elektrisk celle, innrettet til å påtrykke et elektrisk felt over prøven som skal under-søkes, og en optisk følerenhet som benytter en laser-lyskilde. Et automatisk prøve-leveringssystem kan benyttes, hvor dette omfatter et eller flere prøvereser-voarer i væskeforbindelse med innløpet til den elektriske celle, for sekvensiell overføring av prøver til cellen for underskelse.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår identifisering av bakterier, og mer spesielt en. fremgangsmåte og et apparat for identifisering av bakterier ved bruk av elektro-optiske undersøkelser.

Mange fremgangsmåter er blitt utviklet og er nå i bruk for å identifisere forskjellige bakterier, med formål i områder fra oppdagelse og behandling av sykdom til mikrobeforskning. Ved den klassiske fremgangsmåte blir prøver av materiale som antas å inneholde en bestemt bakterie undersøkt ved at man først ut-

vikler en kultur i et passende vekstmedium. Deretter kan tilstedeværelse eller fravær av vedkommende bakterie bestemmes ved et utvalg av videre prøver. I tilfelle av sykdomsundersøkelser kan denne fremgangsmåte være meget tidkrevende og kan være kritisk når det gjelder liv.

I den senere tid er det foretatt visse grunn-undersøkelser

i området elektro-optikk for å lære mer om materialenes struktur og funksjon fra deres oppførsel i polarisert lys. Spesielt har flere studier av V. J. Morrid m.fl. merket at påtrykning av et elektrisk felt på en suspensjon av hovedsakelig ikke-sfæriske bakterier resulterer i en delvis orientering av bakteriene.

Dette antas å skyldes at det elektriske felt utvikler et sterkt, indusert dipol-moment på bakteriene. For å føre dette videre undersøkte V. J. Morris m.fl., Biochimica et Biophysica Acta, 392:328-334 (1975), effekten av visse antibiotika på den elektriske polariserbarhet av vannsuspensjon av E. coli, og fant at betydelige endringer i polariserbarhet fant sted som en funksjon av lysspredningseffekten. Forfatterne teoriserte at de antibiotiske molekyler, i dette tilfelle neomycin og streptomycin, ble absorbert inn i bakterieoverflåtene, og følgelig reduserte bakterienes overflateladning og det induserte dipol-moment.-

Videre studier av V.J. Morris m.fl. på dette området omfatter:

V. J. Morris m.fl., Microbics 1_7:133-139 (1976) og Biochimica et Biophysica Acta, 49J7: 253-259 (1977).

Det er alminnelig kjent, at når levende celler blir disponert i en væske og at væsken plasseres i et elektrisk felt, vil cellene innrette seg etter feltet. Denne innretting finner sted fordi cellene har asymmetrisk fordeling av elektrisk ladning på

sin overflate. Den asymmetriske fordeling av elektrisk ladning på cellenes overflate kan være en fast egenskap av cellen, i

hvilket tilfelle cellen kalles en permanent dipol, eller den kan induseres i cellens overflate ved et eksternt elektrisk felt. • I sistnevnte tilfelle kalles ladningsdistribusjonen en indusert dipol. Denne asymmetri ble identifisert og undersøkt videre av Morris m.fl. ved bruk av en lysspredende optisk teknikk som målte ved hjelp av cellens dobbelt-brytning, dvs. adskillelse av en lysstråle til to ulikt bøyde, planpolariserte lysstråler. Så langt har imidlertid dette fenomen vist anvendelighet bare som en undersøkelsesmetode med det formål å bestemme de elektriske følger av overflate-interaksjon mellom forskjellige partikler, inklusive levende celler.

Foreliggende oppfinnelse forsøker derfor å forene det beskrevne fenomen med en passende metodologi for å tilfredsstille behovet for en rask og nøyaktig undersøkelsesteknikk for deteksjon og opptelling av spesifikke mikrobeceller.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det funnet en fremgangsmåte for deteksjon og opptelling av mikrobeceller, som eliminerer den tidskrevende utvikling av vekstkulturer. Fremgangsmåten, i sitt enkleste aspekt, omfatter isolering av en spesifisert kvantitet av fluidum som antas å inne"holde en gitt mikrobecelle, kombinere en del av væsken med en inhibitor-reagens som.har en kjent effekt på den elektriske polariserbarhet av mikrobecellen, plassering av den resulterende væskeprøve i et vekselstrømfelt for å forårsake innretting av eventuelle mikrobeceller, sending av en polarisert laserstråle gjennom prøven for å måle dobbelt-brytningsfaktoren, og sammenligning av den målte dobbeltbrytnings-faktor med en referansemåling utført med en kontrollprøve som inneholder den undersøkte celle uten inhibitor-reagens.

En rekke inhibitor-reagenser kan benyttes til å utføre en serie prøver og målinger i et relativt kort tidsrom, f.eks. 10-40 minutter, for å frembringe en full identifisering av angjeldende celle., slik at en definitiv og nøyaktig bestemmelse kan bli utført. De inhibitor-reagenser som benyttes med foreliggende fremgangsmåte bør helst være materialer som ikke benyttes som kliniske antibiotika, da de undersøkte celler over en tid kan utvikle motstandskraft mot disse materialer, noe som kunne bevirke unøyaktigheter i identifiseringsprofilen for en gitt mikrobecelle.

T et videre aspekt kan foreliggende fremgangsmåte omfatte en forbehandling av væsken eller prøven før tilføring av inhibitor-reagensen, for å fjerne forurensning og andre organismer som ikke skal undersøkes.

Foreliggende fremgangsmåte kan utføres på en sekvensiell, automatisk måte ifølge videre utførelse av oppfinnelsen.

Det er således bekjentgjort et automatisk apparat som omfatter en elektrisk celle som har minst to vegger, parallelle med hverandre, med et par elektroder plassert nær veggene. Elektrodene er forbundet med passende spenningskilder, og kan etablere mellom dem et indusert elektrisk felt gjennom hvilket mikrobeprøven kan passere. En optisk følerenhet, omfattende en laser-lyskilde og detektor, er plassert slik at en laserståle sendes mellom elektrodene i den elektriske cellen, og oppfanges av detektoren når den kommer ut av cellen. En automatisk transportanordning for mikrobeprøver, bestående av f.eks. parallelle rør og pumper, kan blande og levere mikrobeprøver i sekvens til gjennomstrømnings-cellen for undersøkelse.

Laserdetektoren er forbundet med en behandlingskrets for elektriske signaler som omdanner den observerte dobbeltbrytnings-fåktor til et elektrisk signal som kan sammenlignes med referanse-målinger som er tatt med en kontrollprøve inneholdende deri spesielle mikrobecelle som skal undersøkes. En tidsforsinkelses-slynge kan settes inn mellom prøvelederen og den elektriske celle, når reaksjoner mellom reagenser er ønskelig, såsom mellom antistoff og antigen.

Muligheten til å foreta slike undersøkelser og å utføre fremgangsmåten på en automatisk måte, letter den raske og nøyaktige bestemmelse av tilstedeværelse av en gitt mikrobecelle. Nærværende fremgangsmåte egner seg for en rekke anvendelser, såsom immunitetsprøver, koagulasjonsmålinger og muligens deteksjon av kreftceller.

Følgelig er det et vesentlig formål med oppfinnelsen å frembringe eri fremgangsmåte for rask og nøyaktig deteksjon og opptelling av mikrobeceller.

Et videre formål med oppfinnelsen er å frembringe en fremgangsmåte som den ovennevnte, som eliminerer behovet for utvikling av vekstkulturer av prøvene før undersøkelse.

Et ytterligere formål med oppfinnelsen er å frembringe en fremgangsmåte som den nevnte, som kan utføres på en automatisk måte.

Enda et formål med oppfinnelsen er å frembringe et apparat for elektro-optisk deteksjon og identifikasjon av mikrobeceller.

Enda et formål med oppfinnelsen er å frembringe et apparat som det nevnte, som letter automatisk levering, undersøkelse og analyse av mikrobeprøver på en sekvensiell basis.

Andre formål og fordeler vil vise seg for de teknisk

kyndige etter gjennomgang av den følgende forklaring, som fortsetter under henvisning til den medfølgende illustrerende tegning.

Tegningen viser en skjematisk representasjon av et mulig apparat som kan anvendes med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for deteksjon og opptelling av mikrobeceller på en rask og nøyaktig måte, som egner seg for automatisk utførelse. Fremgangsmåten gjør bruk av elektro-optiske undersøkelser til å identifisere mikrobeceller på basis av deres individuelle dobbelt-lysbrytningskarakteristikker.

Som nevnt tidligere har studier av V. J. Morris, tidligere nevnt.og henvist til, demonstrert at påtrykning av et elektrisk felt på et antall celler i væskesuspe'ns jon bevirker at cellene orienteres eller retter seg etter feltet, fordi cellene har en usymmetrisk fordeling av elektrisk ladning på overflaten. Denne usymmetriske fordeling får cellene til å oppføre seg som en dipol, og i de fleste tilfeller er denne dipol-status indusert og ikke permanent. Følgelig, når det elektriske feltet fjernes, går bakteriecellene tilbake og beveger seg ut av den inntatte inn-rettingsstilling. Det ovenfor beskrevne fenomen, nemlig innretting av bakteriecellene i det elektriske felt og avslapping av cellene etter at feltet er fjernet, kan måles, og slike målinger kan utføres i praksis ved bruk av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.. Spesielt gir den mengde av lysbrytning som finner sted når lyset skinner gjennom prøven som inneholder den induksjons-ladede mikrobecelle, opplysninger som leder til identifikasjon og tilstedeværelse av de celler som blir undersøkt. Måling av avslapningstiden, dvs. den tid som går etter fjerning av det elektriske felt og mens mikrobecellen går tilbake til sin ikke-innrettede tilstand, frembringer opplysninger om størrelsen av den mikrobecelle som blir undersøkt. Begge parametere kan under- søkes og bestemmes raskt og sekvensielt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende fremgangsmåte består i grove trekk av å isolere en prøve av et materiale som mistenkes for å inneholde en spesiell mikrobecelle. Materialet kan bestå av en kroppsvæske, såsom urin,

i det tilfelle hvor bakteruria er mistenkt og bekreftelse ved

test er nødvendig.

Selv om kvantumet av prøvemateriale som kreves for testing er variabelt, er det et trekk ved foreliggende oppfinnelse at meget små mengder materiale kan benyttes, at de kan plasseres i væske-suspensjon og at porsjoner av væske på mindre enn 1 milliliter er tilstrekkelig for undersøkelse og oppdagelse av angjeldende mikrobeceller. En beskjeden mengde prøvemateriale kan derfor frembringe et tilstrekkelig antall prøveporsjoner for en serie sekvensielle undersøkelser i det tilfelle hvor det kan være ønskelig å utvikle en identifiseringsprofil av den celle som skal undersøkes. Sistnevnte teknikk blir benyttet i nærværende fremgangsmåte, og vil bli diskutert nedenfor.

For behandlingen av en gitt prøve kan det bli nødvendig med en foreløpig behandling av prøven, f.'eks. for å redusere rest-ladning i prøvematerialet eller å eliminere elektriske for-styrrelser fra uvedkommende materiale i prøvematerialet. Prøvene kan derfor undersøkes på passende måte og kan, hvis det er nødvendig med slik behandling, utsettes for filtrering fra suspensjon, sentrifugering og lignende for å fjerne forurensning, samt evt. andre behandlinger som egner seg til å redusere prøvens ladning slik at nøyaktige avlesninger kan tas når prøven blir plassert i det elektriske felt og gjennomlyst med lysstrålen. Etter at prøvene er blitt klargjort som beskrevet ovenfor, kan et kvantum av en eller flere inhibitorreagenser tilføres. Inhibitor-reagenser blir i alminnelighet definert som materialer som danner en form for overflateaksjon med de mikrobeceller som skal under-søkes, og som kan resultere i modifikasjon av ladningstettheten på celleveggene. Man skal være klar over at nærværende fremgangsmåte tar sikte på å identifisere mikrobeceller bare ved celleveggenes karakteristikk, og ikke ved cellens interne fysiologi. Den ytre ladning eller overflateladning av celleveggen vil således variere når celleveggen kommer i kontakt med forskjellige reagenser, og denne forandring kan kvantifiseres og benyttes til identifikasjons-formål.

I ett aspekt kan en enkelt prøveporsjon forberedes og undersøkes, og i et slikt tilfelle ville et kvantum av en indi-viduell inhibitor-reagens bli tilført prøven. Nærværende fremgangsmåte vurderer også at en profil av en spesiell mikrobe kan utvikles ved tilberedning av en serie kontrollprøver-, alle i kombinasjon med forskjellige inhibitor-reagenser, slik at en profil av brytningsfaktor-målinger ville bli tilgjengelig til klart å. definere den spesifikke mikrobe under test. En serie prøve-pors joner kan således bli tilberedt som beskrevet ovenfor, og deretter kan et kvantum av forskjellige inhibitor-reagenser bli individuelt tilført de respektive prøveporsjoner slik at profilen av de lysbrytningsdata som utvikles for de prøver som blir under-søkt kunne sammenlignes med en profil utviklet for kontroll-prøver for å frembringe en nøyaktig identifikasjon i det tilfelle hvor en mikrobe under undersøkelse er til stede i prøven..

Som påpekt i artiklene av Morris m.fl., diskutert ovenfor, ble visse antibiotika funnet å kunne tjene som slik inhibitor i kombinasjon med bakterier, slik at"endringer i lysbrytningens intensitet var tydelig. Med nærværende fremgangsmåte bør imidlertid de materialer som benyttes som inhibitor-reagens ikke omfatte antibiotika eller andre sammensetninger som blir benyttet klinisk i forbindelse med de mikrober som blir undersøkt, da det er en mulighet for at mikrobene kan utvikle en motstandskraft mot disse materialer, noe som ville endre og muligens ugyldiggjøre den

■ kontrollprofil som blir benyttet for endelig identifisering ved sammenligning.

Méd denne advarsel i tanken kan området av anvendelige materialer omfatte plante-lecitiner, egnede farvestoffer, forskjellige vitaminer og/eller kjemikalier. Slike materialer velges i hvert enkelt tilfelle på basis av deres kjente inhibitor-effekt på angjeldende mikrobeceller. Det nøyaktige kvantum av hver inhibitor-reagens kan være forskjellig, men bør imidlertid være tilstrekkelig til å forårsake en fjerning av eller reduksjon av mikrobecellenes overflateladning. Dette kan versifiseres ved tilberedelse av foreløpige kontrollprøver med spesielle inhibitor-reagenser, og utvikling av en tilfredsstillende profil for bruk. Valget av spesielle inhibitor-reagenser og mengden av slike reagenser som tilføres de respektive prøver kan naturligvis variere ifølge foreliggende oppfinnelse. De materialer og mengder som er spesifisert her er ment som en veiledning, og skal ikke oppfattes som begrensninger.

Etter at tilføringen av inhibitor-reagens til prøven er avsluttet blir den ferdige prøven plassert i et elektrisk felt, generert ved påtrykning av en vekselspenning, med tilstrekkelig feltstyrke til å rette inn de celler som skal undersøkes. I alminnelighet kan det elektriske feltet genereres ved et par parallelle elektroder, imellom hvilke prøver vil bli plassert eller vil passere. Prøven kan således plasseres på et egnet glidestykke eller, i en ampulle som kan bli manuelt anrettet mellom elektrodene, eller man kan benytte et gjennomstrømningskammer med elektoder anordnet deri når automatisk levering og undersøkelse av prøvene er ønskelig. I denne forbindelse henvises til tegningen, som skjematisk illustrerer et mulig apparat for automatisk prøve-tilberedning og undersøkelse.

Under henvisning til tegningen er det vist et automatisk apparat 10 for utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Apparatet 10 omfatter en elektrisk celle 12, omfattende et kammer 14 med et innløp 16 og et utløp 18. Kammeret 14 omfatter et par vegger 20 og 22, som er parallelle og plassert i en avstand fra hverandre, for å huse et kvantum av mikrobeprøver som skal undersøkes.

Elektrodeparene 24 og 26 er plassert nær de respektive vegger 20 og 22, og er likeledes i en avstand fra hverandre. Elektrodene 24 og 26 er innrettet til å motta elektrisk strøm fra en spenningskilde (ikke vist), og til å etablere mellom dem et elektrisk felt som blir påtrykt prøvematerialet som plasseres i cellen 12. På denne måte blir mikrobecellene under undersøkelse i prøven bragt til elektrisk innretting med det påtrykte felt, som en funksjon av deres polariserbarhet.

Det elektriske feltet mellom elektrodene 24 og 26 kan variere i intensitet, og er fortrinnsvis et vekselstrømtelt med tilstrekkelig høy frekvens til å oppnå observerbar celleorientering eller innretting. En. puls av høyfrekvensstrøm i området 50 Hz eller mer har vært benyttet til å oppnå tilstrekkelig celleorientering for undersøkelse og identifisering. Tilført strøm kan ha en frekvens på 700 Hz eller mer innenfor rammen av denne oppfinnelse, og betydningen av spesifikke maksima eller minima er ikke påtenkt her.

Igjen med henvisning til tegningen: Apparatet 10 omfatter en optisk følerenhet omfattende en laserlyskilde 28, vist skjematisk, plassert slik at den sender en laserstråle gjennom cellen 12 og mellom elektrodene 24 og 26. En laserdetektor 30 er plassert i linje med lyskilden 28 som illustrert, for å motta det lys som kommer ut av cellen 12. I tillegg er en polari-seringsanordning 32 plassert mellom lyskilden 28 og cellen 12, slik at laserstrålen blir polarisert som ønsket under passering gjennom prøven. Det er også en analysatorenhet 34 plassert mellom cellen 12 og detektoren 30, med det formål å blokkere inngangslys, for dermed å begrense det lys som mottas av detektoren 30 til det som blir emittert av lyskilden 28.

Apparatet 10 kan bli automatisert som vist, og benytter en automatisk prøveleveringsinnretning i væskeforbindelse med cellen 12, for sekvensiell transport av mikrobeprøver til innløpet 16. En spesiell prøveleveringsanordning kan omfatte minst ett prøve-reservoar.36 for det formål å lagre mikrobeprøvene før under-søkelse. I nærværende illustrasjon er vist flere prøve-reservoarer 36 og 36', som omfatter karusell-transportørene 38 og 38'. Hver transportør fører et flertall utdelere, henholdsvis 40 Og 40'. I illustrasjonen på tegningen kan karusellen 38 føre utdelerne 40 inneholdende mikrobeprøver, mens karusellen 38' fører utdelerne 40' med tilsvarende inhibitor-reagens. Ved en anordning som skal beskrives nedenfor, kan prøvene sekvensielt

blandes med tilsvarende reagens før innføring i cellen 12, slik at reaksjonen mellom celler og inhibitorer kan finne sted like før den elektro-optiske undersøkelse.

Leveringsanordningen omfatter også minst én sekundær-rørledning, og fortrinnsvis et flertall sekundær-rørledninger 42 og 42' som er innrettet til å strekke seg fra de respektive reservoarer 36 og 36' til innløpet 16. Rørene 42 og 42' kan,

i én utførelse, innrettes for sekvensielt vekslende forbindelse med utdelerne 40 og 40', slik at spesielle reagenser og prøver kan trekkes ut og blandes som beskrevet.

Prøveleveringsanordningen omfatter en eller flere væskepumper 44 og 44' som befinner seg i tilsvarende væskeforbindelse med sekundær-rørene 42 og 42' med det formål å overføre de respektive fluida fra reservoarene til rørene og deretter til kammeret 14.

I det tilfelle hvor det er anordnet et apparat av den type som er illustrert på tegningen, blir rørene 42 og 42' bragt til

et forbindingspunkt 46 som er plassert mellom reservoarene 38, 38' og innløpet 16. I det tilfelle, f.eks. hvor prøvene og deres respektive inhibitor-reagenser er plassert i individuelle karu-seller 36 og 36', transporterer rørene 42 og 42' de individuelle fluida til forbindingspunktet 4 6 hvor rørene kommer sammen og de respektive fluida blir blandet. De blandede fluida føres så gjennom primær-røret 48 og fortsetter til innløpet 16.

I det tilfelle, f.eks. hvor det er ønskelig å forsinke leveringen av en prøve til den elektriske celle 12, kan en passende tidsforsinkelses-anordning, såsom de illustrerte sløyfer eller slynger, bli plassert langs primær-røret i dettes bane til innløpet 16. Dette er av betydning i det tilfelle hvor den undersøkte prøve består av en blanding av antigen og antistoff, da tidsforsinkelses-anordningen 50 tillater reaksjonen av antigen og antistoff å finne sted og å fullføres før innføring i cellen 12.

Tidsforsinkelses-anordningen kan være en serie slynger som vist skjematisk på tegningen, eller den kan omfatte en holde-stasjon (ikke vist) hvor prøvevæsken blir oppbevart før den blir transportert til cellen 12. Den nøyaktige konstruksjon av dette element kan variere, og foreliggende oppfinnelse begrenser seg ikke til en spesiell struktur eller virkemåte.

Igjen med henvisning til tegningen: Apparatet 10 omfatter også en elektrisk signalbehandlingskrets, forbundet med laser-detektoren 30, som omsetter variasjoner i lysbrytning forårsaket av hver mikrobeprøve, til et elektrisk signal av kvantitative data for analyse og sammenligning med resultatene av kontroll-tester. Som indikert i blokkdiagrammet kan signalet fra detektoren bli sendt gjennom en passende signalbehandlingskrets, bg kan f.eks. bli omformet til et passende digitalsignal. Dette signal kan så bli ført til en datamaskin som har, f.eks. en sammenlignings-krets som kan gjenkjenne og sammenholde det innkommende signal med lagrede signaler som representerer resultatene av kontroll- tester. Denne sammenligning kunne straks bli identifisert ved en digitalskjerm, og som diskutert nedenfor, kunne hele under-søkelsen og målingen av en gitt prøve foregå i løpet av noen millisekunder. Naturligvis vil utstrekningen av målingene, typen av undersøkelse og antallet av undersøkte prøver bevirke variasjoner i test-tiden.

Generelt, mens det ovenfor beskrevne apparat vil omfatte de primære elementer som identifisert og forklart, vil visse variasjoner i konstruksjon og virkemåte være mulig innenfor rammen av oppfinnelsen. Denne forklaring er således ikke ment å være begrenset til den nøyaktige konstruksjon beskrevet ovenfor, men må betraktes som en illustrasjon av et apparat som i vid forstand omhandler de beskrevne strukturelle elementer, men som kan modifiseres, bl.a. ved utskifting av ekvivalente strukturer, innenfor rammen av oppfinnelsen.

Igjen med henvisning til tegningen: Som nevnt tidligere

kan prøver plasseres i de individuelle utdelere 40 og 40', i det tilfelle hvor inhibitor-reagensene blir plassert i separate beholdere, for senere sammenblanding. Sekundær-rørene 42 og 42' kan dyppes ned i eller på annen måte bringes i kontakt med væskene henholdsvis i utdelere 40 og 40', samtidig som pumpene 44 og 44' settes igang for å trekke opp de respektive fluida.

Pumpene 44 og 44' kan virke som trinn-motorer,. slik at forut-bestemte kvanta av fluidum blir transportert i definerte inkre-menter og slik at individuelle prøver vil ankomme for under-søkelse med minst mulig forurensning fra tilstøtende prøve-tilberedninger.

De respektive prøver føres gjennom sekundær-rørene 42 og 42' og blir,, som nevnt tidligere, blandet ved sammenføringen 46.

Etter blanding, f.eks. av en mikrobeprøve og den tilsvarende inhibitor-reagens, blir det resulterende prøvefluidum ført gjennom primær-røret 48 og kan, om nødvendig, føres gjennom forsinkelsesanordningen 50.

Den blandede prøve passerer deretter gjennom primær-røret 48 og blir levert til den elektriske celle 12 gjennom innløpet 16. Etter endt.innlevering av prøven til cellen 12 blir spennings-kilden (ikke vist) aktivert, og et elektrisk felt blir etablert mellom elektrodene 24 og 26. Som nevnt tidligere kan det elektriske felt variere, avhengig av prøvetypen, og i alminnelighet stilt på en frekvens som er tilstrekkelig høy til å oppnå-observerbar celleorientering. Det elektriske felt kan opprett-holdes i et tidsrom som er tilstrekkelig langt til å oppnå celle-innretting. Lengden av tiden feltet blir opprettholdt kan variere, avhengig av størrelse og elektriske karakteristikker av vedkommende celle, og oppfinnelsen er ikke begrenset til et spesifikt tidsområde. F.eks. i det tilfelle hvor antistoff/antigen-reaksjoner blir undersøkt, må tidsrommet forlenges for å tillate at undersøkelsen går frem på en tidsbasis slik at man kan observere den endringen i brytningsfaktor som finner sted når antistoff og antigen reagerer og utformer et kompleks.

På lignende måte, når cellestørrelser skal identifiseres, kan det elektriske felt fjernes mens man fortsatt observerer utstrekningen av dobbelt-lysbrytning for å bestemme det tidsrom da løsning av cellene fra innretting finner sted og avsluttes.. Denne måling kan utføres i sekvens etter identifisering av mikrobecellene, ved en enkel fjerning eller avstengning av det elektriske felt som nevnt.

Identifiseringen av mikrobecellene finner sted når laser-lyskilden 28 blir rettet gjennom prøven som er plassert mellom elektrodene 24 og 26. Som forklart ovenfor kan effektiv lysbrytning måles i et tilfelle hvor prøveporsjonen er 1 milliliter eller mindre i volum og laserstrålen er 1 mm bred og 100 mm lang. Den egentlige måling av dobbelt-lysbrytning i spesifikke prøver er basert på den observasjon at, hvis en prøve som inneholder bakterier eller andre mikrobeceller blir utsatt for en puls av høyfrekvensstrøm, vil bakteriene eller cellene orientere seg etter feltet. Det er funnet at, hvis pulsen er tilstrekkelig lang, vil det også oppstå et orienteringsekvilibrium, og en bestemt grad av orienteringsorden vil bli oppnådd. I det tilfelle hvor uttynnede suspensjoner blir utsatt for et elektrisk felt av tilstrekkelig høy frekvens, f.eks. med en rms-amplitude = E, kan det sees at den resulterende ekvilibriums-endring i sprednings-intensitet vil variere i noen grad som kvadratet av amplituden. En liten endring i amplituden av den påtrykte spenning kan således bevirke observerbare endringer i spredningsintensiteten, noe som

kan måles og benyttes som et middel for celle-identifisering.

Som beskrevet ovenfor passerer laserstrålen fra kilden 28 gjennom cellen 12 og deretter gjennom analysatoren 34 til detektoren 30. Signalet som mottas av detektoren 30 blir behandlet, og kan bli sammenlignet med data fra en kontrollprøve. En visuell fremstilling av forholdet kan straks være tilgjengelig.

Som påpekt tidligere kan tiden for tilberedning og under-søkelse av en mikrobeprøve være så kort som 10 minutter, inklusive forberedelsen av prøven for påtrykning av det elektriske felt og laserstrålen.. Selve målingen av lysbrytningsfaktoren kan foregå

i løpet av noen millisekunder etter tilkobling av lyskilden 28. Som nevnt tidligere er tilberedning og testing av et flertall prøver, og utvikling av en profil for sammenligning med en kontrollprofil, mer tidkrevende og kan ta så lenge som 40 minutter, ikke desto mindre representerer dette en betydelig reduksjon i tid for nøyaktig identifisering av mikrobeceller, og utgjør en av de viktige fordeler med foreliggende oppfinnelse.

Foreliggende oppfinnelse studerer også måling av mikrobe-cellers størrelse, såvel som identifisering. I denne forbindelse,

og som nevnt tidligere, kan størrelsen av partikler bestemmes ut fra den tid det tar for cellene å bevege seg ut av innretting med det elektriske felt etter at dette fjernes. Denne måling kan finne sted uavhengig i det tilfelle hvor feltet blir påtrykt,

cellene innrettet og feltet fjernet. Ved dette punkt kan en tids-måling finne sted, og lyskilden kan skinne gjennom suspensjonen for å muliggjøre observasjon av de endringer i lysbrytningen som reflekterer cellenes bevegelse ut av innretting med feltet.

Både identifikasjon og partikkelstørrelse kan måles sekvensielt og effektivt ved først å måle suspensjonens lysbrytningsfaktor under påtrykning av det elektriske felt, for deretter å fjerne det elektriske felt og måle den tid det tar for cellene å bevege seg ut av innretting med feltet. Den omfattende og effektive natur av denne kombinerte undersøkelse er åpenbar.

Under praktisering av nærværende fremgangsmåte er det flere faktorer som bør vurderes og kontrolleres for å sikre uniforme resultater. Spesielt må temperaturen av alle materialer holdes konstant under undersøkelsen, da det er kjent at temperaturen har en modifiserende effekt på lysbrytningsfaktor-målingene. Likeledes bør pH-verdien av den suspensjon som skal testes reguleres best mulig for å tilsvare pH-verdien av mikrobeprøvene, da variasjon i'syrlighet eller.alkalitet kan påvirke ladningen av suspensjonen og gi unøyaktige resultater. Andre faktorer, såsom avicitet og titrérvæske må naturligvis også styres for å sikre nøyaktig og uniform testing.

Som nevnt tidligere er nærværende fremgangsmåte anvendelig til forskjellige typer undersøkelser i tillegg til identifisering av mikrobeceller. Reaksjonen mellom antigen og antistoff kan f.eks. studeres på denne måte, idet man måler endringen i lys-brytningsf aktor når antigen og antistoff reagerer til å danne komplekset. I dette tilfelle kan forsinkelsesanordningen 50 komme til anvendelse, da den vil tillate de respektive oppløs-ninger inneholdende antistoff og antigen å kombinere og å begynne sin interaksjon og inkubasjon. Tilkoblingen av det elektriske felt blir så utført, og parameterene tid og lysstyrke blir målt for å identifisere reaksjonen av antigen og antistoff såvel som å utføre målinger av denne.

På lignende måte kan koagulasjonsprosessen studeres for å bestemme endringer i størrelsen av proteinmolekyler, da fordelingen av molekyl-ladning sannsynligvis endres under denne prosess. Følgelig kan flere målinger tas i intervaller under prosessen,

for å måle koagulasjonens fine struktur. Denne teknikk kunne også anvendes på blodplatefunksjonen, da bestemmelse av brytningsfaktoren kan' bli utført i løpet av noen millisekunder,

og således kan fange inn patologi av platefunksjonen som finner sted meget tidlig i samlingen.

Ytterligere en anvendelse av nærværende fremgangsmåte ligger i oppdagelse av kreft. Dette følger fra kjennskapen til at overflateladningen på T-celler endres for maligne populasjoner. Deteksjon av malignans kunne således lettere utføres med denne fremgangsmåte enn med elektroforese som nå blir benyttet.

Operasjonen av det elektriske felt kan ta flere veier,

siden et vekselstrømsfelt blir satt opp, og det er kjent at endringer i strømmens amplitude vil bevirke endringer i lys-brytningsf aktoren som kan identifisere .visse celler. Disse betraktninger er spesielt anvendelige i tilfeller hvor fremgangsmåten skal benyttes på tidsbasis over et tidsrom, såsom i måling

av antistoff/antigen-interaksjon. I det tilfelle hvor gjennom-strømningsarrangementet vist på tegningen blir brukt, og en tids-forsinkelse 23 slik som slyngen illustrert på tegningen tillater inkubasjon, kan en differensialforsterker benyttes til å subtra-here det signalet som mottas fra de ukombinerte komponenter, fra det som mottas fra komplekset. I denne forbindelse kan det signalet som mottas på grunn av tilstedeværelsen av ukombinerte materialer omformes til digital form, og så subtraheres fra et likeledes digitalisert signal mottatt fra komplekset, mens man i beregningen har bestemt det tidsintervall som gjelder forsinkelsen ved inkubasjon.

Alternative teknikker kan anvendes for å observere denne distinksjon, såsom "kvitring" av drivspenningen, dvs. sveiping med kontroll av feltet for å identifisere maksima i modulasjonen, for dermed muligens å skille ut molekylære arter. Den spennings-pulsen som passerer gjennom cellen 12 kan også drives med slik hastighet at signalet for de ukombinerte materialer bare såvidt kan følge med. I slike tilfeller kan man benytte en faselås-forsterker, og ved observasjon av kvadratursignalet kan meget små mengder av kompleksmaterialet oppdagen i større mengder av de ukombinerte materialer.

De ovenstående detaljer om virkemåten gjelder først og fremst tilfeller hvor fremgangsmåten skal benyttes til å måle tid såvel som lysspredning. Disse teknikker er ganske enkelt eksempler på synspunkter som kan tas i betraktning under bruken av denne fremgangsmåte, og er ikke ment til å legge begrensninger på oppfinnelsen.

Det må forstås at o<p>pfinnelsen ikke er begrenset til de illustrasjoner som er vist og beskrevet her. Disse er bare illustrasjoner av de beste måter for utførelse av oppfinnelsen, og kan modifiseres med hensyn til form, størrelse, arrangement av deler og detaljer i virkemåten.

Claims (25)

1. Fremgangsmåte for identifisering og opptelling av mikrobeceller i en prøve av ukjent materiale, karakterisert ved at den omfatter: A. isolering av et kvantum av prøven; B. kombinering av prøven med minst én inhibitor-reagens som har en kjent virkning på mikrobecellene; C. plassering av den kombinerte prøve i et vekselstrømsfelt, hvor feltet har en tilstrekkelig høy frekvens til å bevirke at mikrobeceller som er til stede i prøven retter seg inn etter feltet; D. sending av en polarisert stråle av laserlys gjennom den kombinerte prøve og måling av utstrekningen av dobbelt-lysbrytning; og E. sammenligning av dobbelt-lysbrytningsfaktoren av en kontrollprøve som vites å inneholde angjeldende mikrobecelle kombinert med angjeldende inhibitor-reagens; F. hvor kontrollprøven er tilberedt og målt i henhold til trinn A-D, og den tilnærmede identitet av de respektive målinger indikerer tilstedeværelse av de nevnte mikrobeceller i prøven som er under undersøkelse.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at materialet blir oppbevart i en ikke-giftig, elektrisk upåvirkelig væske før deltagelse i trinn B.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at materialet blir testet for å skille ut bestand-deler i prøven som ikke vedkommer denne fremgangsmåte.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at materialet blir behandlet ved sentrifugering.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at materialet blir behandlet ved filtrering.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at inhibitor-reagensen omfatter materialer som ikke er i klinisk bruk, og som påvirker celleveggene av mikrobecellene.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at inhibitor-reagensen er utvalgt fra en gruppe bestående av antimikrobeforbindelser; plante-lecitiner; ikke-giftige, inérte farvestoffer; vitaminforbindelser; farmasø ytiske preparater og blandinger av slike. .

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 6 eller 7, karakterisert ved at et antall prøver blir tilberedt, og at hver prøve.blir kombinert med forskjellige inhibitor-reagenser.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det elektriske felt har en frekvens på minst 60 Hz.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det elektriske felt har et frekvensområde fra ca. 60 til ca. 700 Hz.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det elektriske felt fjernes under trinn D, og at laserstrålen blir opprettholdt i en tidsperiode lang nok til å tillate mikrobecellene å bevege seg ut av innretting med det elektriske felt.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at strålen er 1 mm bred, og har en lengde på 100 mm. .

13. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at trinnene blir utført på en kontinuerlig og automatisk måte.

14. Fremgangsmåte for evaluering av antimikrobe-mottakelighet og minimum inhibitor-konsentrasjoner av spesielle mikrobeceller, karakterisert ved at den omfatter: A. isolering av et kvantum av prøven; B. kombinering av prøven med minst én inhibitor-reagens med.en kjent virkning på mikrobecellene; C. plassering av den kombinerte prøve i et elektrisk vekselstrømsfelt, hvor feltet har tilstrekkelig høy frekvens til å bevirke at mikrobeceller som befinner seg i prøven retter seg inn etter feltet; D. sending av en stråle av polarisert laserlys gjennom den kombinerte prøve og måling av utstrekningen av dobbelt-lysbrytning; og E. sammenligning av dobbelt-lysbrytningsfaktoren i den kombinerte prøve med dobbelt-lysbrytningsfaktoren av en eller flere kontrollprø ver som vites å inneholde varierende mengder av inhibitor-reagens i kombinasjon med mikrobecellene som blir undersøkt; F. hvor kontrollprøvene er tilberedt og målt i henhold til trinn A - D, og frembringer en helhet med hvilken de kombinerte prøver kan sammenlignes.

15. Apparat for identifisering og opptelling av mikrobeceller, karakterisert ved at det omfatter: A. en elektrisk celle bestående av (i) et kammer med et innløp og et utløp, (ii) minst to vegger plassert parallelt i en avstand fra hverandre, og (iii) et par elektroder, plassert nær hver av veggene og i avstand fra hverandre, med elektrodene innrettet til å motta elektrisk strøm og å etablere et indusert elektrisk felt over i det minste en del av kammeret og å fremme elektrisk innretting av mikrobeceller plassert i kammeret; B. en optisk følerenhet bestående av (i) en laser-lyskilde plassert for å sende en laser-lysstråle gjennom den nevnte elektriske celle mellom elektrodene, og (ii) en laser-lysdetektor plassert på linje med lyskilden for å motta laserlyset fra den elektriske celle; C. en automatisk innretning for levering av mikrobeprøver i væskeforbindelse med den elektriske celle, for sekvensiell transport av mikrobeprøver til innløpet; og D. en elektrisk signalbehandlings-anordning forbundet med laser-detektoren for å omsette variasjonene i brytningsfaktoren forårsaket av hver mikrobeprø ve til et elektrisk signal av kvantitative data, for analyse og sammenligning med resultatene av tidligere utført kontroll-testing.

16. Apparat ifølge krav 15, karakterisert ved at leveringsanordningen omfatter: A. minst ett prøvereservoar, B. minst ett sekundær-rør for en målt overføring av mikrobeprøver fra reservoaret til innløpet.

17. Apparat ifølge krav 16, karakterisert ved at leveringsanordningen omfatter: A. flere reservoarer, B. individuelle sekundær-rør fra hvert reservoar, C. flere væskepumper i forbindelse med de respektive sekundær-rør, D. et væskeforbindingspunkt anbragt mellom reservoarene og innløpet hvor sekundær-rørene er forbundet, og E. et primær-rør mellom det nevnte forbindingspunkt og innløpet, F. hvorved separate reagenser oppbevart, i individuelle reservoarer, kan blandes med hverandre før de når cellen, ved at de flyter sammen i nevnte forbindingspunkt og føres gjennom primær-røret.

18. Apparat ifølge krav 16 og 17, karakterisert ved at reservoarene omfatter væskeutdelere"og at de individuelle sekundær-rør er innrettet til å strekke seg inn i utdelerne.

19. Apparat ifølge krav 18, karakterisert ved at reservoarene omfatter: A. en karusell-transportør, B. et flertall utdelere plassert på transportøren, og C. sekundær-rørene er innrettet for sekvensiell og vekselvis væskeforbindelse med utdelerne for å overføre prøver derfra.

20. Apparat ifølge krav 16, 17 og 19, karakterisert ved at det omfatter en tidsforsinkelsesanordning plassert mellom sekundær-røret og innløpet for å forsinke passeringen av mikrobeprøver inn i den elektriske cellen.

21. Apparat ifølge krav 18, karakterisert ved at det omfatter en tidsforsinkelsesanordning plassert mellom sekundær-røret og innløpet for å forsinke passeringen av mikrobeprøver inn i den elektriske cellen.

22. Apparat ifølge krav 17, 18 eller 19, karakterisert ved at tidsforsinkelsesanordningen er plassert i væskeforbindelse med primær-røret for å forsinke passering av mikrobeceller inn i den elektriske cellen.

23. Apparat ifølge krav 20, karakterisert ved at tidsforsinkelsesanordningen omfatter en slynget forlengelse av sekundær-røret.

24. Apparat ifølge krav 21, karakterisert ved at tidsforsinkelsesanordningen omfatter en slynget forlengelse av sekundær-røret.

25. Apparat ifølge krav 22, karakterisert ved at tidsforsinkelsesanordningen omfatter en slynget forlengelse av primær-røret.