NO840949L - Fremgangsmaate til fremstilling av alfa-amylaseinaktivatoren tendamistat i krystallinsk form - Google Patents

Description

I tysk patent 27 01 890 samt i tysk Offenlegungsschrift

30 38 130 og 31 07 106 omtales en peptidisk a-amylaseinaktivator som også betegnes som HOE 4 67 og tendamistat, og fremgangsmåte til dens fremstilling. I Offenlegungsschrift 3 0 38 13 0 omtales videre de nye høyaktive komponenter HOE

467 A og HOE 467 B (avbygningsprodukt av HOE 467 A). Såvel HOE 4 67 som også enkeltkomponentene har den evne å hemme amylase/virksomt. På grunn av disse egenskaper kan forbindelsen f. eks. anvendes til regulering av blodsukkerspeilet.

I det følgende står HOE 467 resp. tendamistat såvel som enkeltkomponentene som også for blandingen.

Tendamistat er et polypeptid. Isolering og rensning av slike eggehvitestoffer er vanligvis omstendelig, man er ved frem-stillingen vanligvis henvist til kromatografiske eller andre omstendelige fremgangsmåter (se Albert L. Lehninger: "Biochemie" Verlag Chemie, Weinheim 1975, side 115 og følgende). Således

er også i tysk patent 27 01 890 og det tyske Offenlegungsschrift 30 38 130 blitt omtalt kromatografisk rensemetode på ioneut-vekslere resp. absorbsjonsharpikser. Kromatografiske fremgangsmåter har imidlertid den ulempe at de i teknisk målestokk på grunn av deres omstendelighet forårsaker høye omkostninger er energiintensive og endelig belaster omgivelsene.

Det ble nå overraskende funnet at fra kulturfiltratet av kulturoppløsningen av tendamistat-produserende mikroorganismer etter konsentrering og avsaltning uten etterfølgende kromatografiske fremgangsmåter kan tendamistat bringes direkte til krystallisering og renutvinnes.

Oppfinnelsen vedrører følgelig en fremgangsmåte til fremstilling av a-amylaseinaktivator tendamistat i krystallinsk form, samt inaktivatoren fremstilles etter denne fremgangsmåte..

Spesielt foretrukket er et krystallinsk tendamistat for en overveiende del, spesielt 80 % eller mer, består av HOE 467 A. Fremgangsmåten erkarakterisert vedat kulturfiltratet av kulturoppløsningen av tendamistatproduserte mikroorganismer konsentreres og avsaltes, og deretter enten

a) blandes med 0 til 30 % egnet med vann blandbart organisk oppløsningsmiddel, pH-verdien av denne oppløsning senkes ved

tilsetning av en i peptidkjemien vanlige syre av 3,2 til 5,5 eller senkes til 2 til 3, og økes en base til 3,2 til 5,5, og det i oppløsningen tilstedeværende tendamistat bringes eventuelt etter tilsetning av podningskrystaller med henstand til krystallisasjon og adskilles eller

b) en i peptidkjemien vanlige syre innstilles på en pH-verdi mellom 1,0 til 3,0, eventuelt i oppløselige forurensninger

adskilles den dannede oppløsning, blandes med et for krystallisasjonen av eggehvitestoffer vanlige salt, og det i oppløsningen tilstedeværende tendamistat bringes eventuelt etter tilsetning av podningskrystaller ved henstand til krystallisasjon og adskilles.

Det utkrystalliserte tendamistat adskilles f. eks. ved filtrering eller sentrifugering fra moderluten og tørkes deretter. Virksomme stoffer er fremstillet ved denne fremgangsmåten meget ren. Hvis nødvendig kan det omkrystalliseres og således igjen renses.

Ved styring av fermentasjonsparametere f. eks. fermentasjons-tiden, kan i kulturfiltratet den respektive del av komponentene HOE 467 A og HOE 467 B påvirkes, således at kulturfiltratet inneholder en av komponentene i overveiende deler.

Tendamistatproduserende mikroorganismer er eksempelvis streptomyce tendae ATCC 31 210 og Streptomyce tendae DSM 1912. Ved gjennomføring av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes spesielt kulturfiltratet av kulturoppløsninger av disse to stammer. Da det virksomme stoff hovedsaklig befinner seg i flytende vandige fase av kulturoppløsningen, adskilles fast-stoff delen av kulturoppløsningen på kjent måte, f.eks. ved fra-sugning. Fremgangsmåte til fremstilling av kulturfiltratene omtales eksempelvis i tysk patent 27 01 890. og tysk Offen-legungsschrif t 30 38 130. Den klare vandige fase, kulturfiltratet konsentreres f. eks. ved destillering og avsaltes ved dialyse. Fordelaktig er også ultrafiltrering idet konsentrering og avsaltning kan gjennomføres i et trinn.

Fremgangsmåte a) gjennomføres hensiktsmessig som følger: Det best mulig avsaltede kulturfiltratet dannet etter den i tysk patent 27 01 890 eller tysk Offenlegungsschrift 30 38 130 omtalte metode og en pH-verdi på 6-8, konsentreres et innhold på 3 til 300 g tendamistat/liter, fortrinnsvis 20 til 100 g/liter væske. 0 til 30 %, fortrinnsvis 5 til 15 % av et egnet med vann blandbart organisk oppløsningsmiddel tilsettes. Det frafiltreres fra eventuelt utfelte forurensninger, og oppløs-ningen konsentreres eventuelt deretter igjen. Egnede oppløs-ningsmidler er f. eks. lavmolekylære alkoholer som metanol, etanol, n-propanol og isopropanol og ketoner, som f. eks. aceton og metyletylketon, spesielt egnet er isopropanol, etanol og aceton. Oppløsningens pH-verdi senkes til 3,2 til 5,5, fortrinnsvis 4,2 til 5,2. Fordelaktig er å gå frem således at syretilsetningen bare foregår til den pH-verdi hvor opp-løsningen akkurat forblir klar (pH 4,6 til 5,2).

For innstilling av pH-verdien egner det seg i peptidkjemien vanlige syrer, som f. eks. svovelsyre, saltsyre og eddiksyre. Henstand av oppløsningen ved temperaturer fra 0° til 6 0°C fortrinnsvis fra 5° til 25°C fører til krystallisasjon. Det kan også være fordelaktig tilsetning av podekrystaller inntil blandingen. Etter 1 til 50 timer har krystalliseringen fore-gått. Den kan eventuelt fullstendiggjøre ved korrektur av pH-verdien til 3,8 til 5, samt ved avkjøling til 0 til 6°C, og ny henstand til 0,1 til 14 dager. Den dannede J^rystallmasse adskilles deretter på i og for seg kjent måte, omkrystalliseres eventuelt og tørkes. Utbyttet utgjør alt etter forurensninger av utgangsmaterialet (kulturfiltratet) inntil over 95%(referert til innholdet i kulturfiltratet).

Den omtalte fremgangsmåte er en krystallisasjon av den isoelektriske form av tendamistatet hvis isoelektriske punkt for komponent HOE 467 A er blitt bestemt til 4,35. Maksimum av tungtoppløselighet av denne isoelektriske form,

er selvsagt ved pH 4,35.

Hvis det avsaltede og konsentrerte kulturfiltratet er meget forurenset er det fordelaktig å innstille den vandige eller vandige alkoholiske resp. vandige acetoniske oppløsning på

pH 2 til 3. Tendamistatet befinner seg i dette pH-området i fravær av salter, klart i oppløsning. Nå kan man ved tilsetning av en lut, f. eks. natronlut heve pH-verdien så vidt at igjen den isoelektriske krystallisasjon kan foregå, altså

i pH-området 3,2-5,5, fortrinnsvis 3,2-4,5.

Tilsvarende fremgangsmåte b) innstilles det avsaltede og konsentrerte kulturfiltrat (oppnådd f. eks. etter i tysk patent 27 01 890, resp. tysk Offenlegungsschrift 30 38 130 omtalte metoder) som inneholder tendamistatet i vandig, opp-løsning, med en i peptidkjemien vanlige syrer til pH 1,0 til 3,0, fortrinnsvis til pH 2,0 til 2,8. Som syrer egner det seg de som er nevnt for fremgangsmåte a). Herved befinner a-amylase-inaktivatoren seg i oppløsning, mens forurensninger som f. eks. fremmedeggehviter kan danne utfellinger som eventuelt etter tilsetning av fellingsmidler kan fjernes ved filtrering resp. sentrifugering. Til den klare sure tendamistat-oppløsning setter man oppløsningen et for krystallisering av eggehvitestoffer vanlig salt. Egnede anioner er eksempelvis klorid, bromid, sulfat, fosfat, citrat, spesielt egnet er klorid-ioner. Som klorider kan det anvendes tallrike uorganiske eller organiske salter, som f. eks. natriumklbrid, kaliumklorid, ammoniumklorid, dimetylamid, hydroklorid eller lignende.

Typen av kation i saltet er av sekundær betydning. Den sure krystallisering foregår i det angitte pH-området med 0,1 til 4-molar kloridtildosering, fortrinnsvis imidlertid med 0,2 til 0,5 mol/liter.

For isolering av det virksomme stoff sentrifugeres eller filtreres blandingen etter 0,1 til 28 dager, fortrinnsvis etter 4 dager eventuelt etter tilsetning av podningskrystaller. Man får krystallinsk tendamistat som fri syre, hvis basiske grupper foreligger i hydrokloridform, eventuelt ved bromid-sulfat-, eller citratform. For ytterligere rensning kan krystallmassen oppløses i vann under natronluttilsetning idet den resulterende pH-verdi ligger mellom 5,5 og 8. Denne oppløsning kan deretter avsaltes ved dialyse eller ved ultrafiltrering, og deretter tørkes etter i og for seg kjente fremgangsmåter. Utbyttet utgjør alt etter renhet inntil over 90 % (referert til innholdet av kulturfiltratet).

Krystallene av den sure form og den isoelektriske form er ikke like: Således kan f. eks. krystalliseringen av nye blandinger ikke aksellereres ved påpodning av den eventuelt andre krystall-type: Altså den isoelektriske krystallisasjon ikke med krystallinsk fri tendamistatsyre eller krystallisasjonen i syrer med f. eks. NaCl ikke med den isoelektriske tendamistatform. Derimot fører den artsegne påpodning den eventuelle krystallisasjon til hurtig krystalldannelse. Podningskrystaller fremstiller man etter fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen, idet det som utgangsmaterial anvendes ifølge tysk patent 27 01 890 resp. tysk Offenlegungsschrift 30 38 130 fremstillet HOE

467 i form av vandigi oppløsning i steden for kulturfiltratet. Ved eventuelt flere ganger omkrystallisering oppnås tenda-mistatpreparater av stor renhet, sammenlignbar med stoffer fremstillet etter en vanlig isoleringsfremgangsmåte. Da imidlertid såvel materialanvendelsen som også den nødvendige energi er forholdsvis liten ved krystallisasjonsfremgangsmåten, er dens anvendelse et verdifullt bidrag til fremstilling av det potente virksomme stoff tendamistat.

Det var overraskende at tendamistat ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremkommer krystallinsk og i høye utbytter, da a-amylase-inaktivatoren hører til eggehvitelegemer, disse høymolekylære forbindelser tenderer bare lite til krystallisering.

Det etter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen dannede tendamistat har en i tysk Offenlegungsschrift 30 38 130 omtalt a-amylasehemmende aktivitet og egner seg derfor f. eks. like-ledes for regulering av blodsukkerspeilet.

Forbindelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eksempler.

Eksempel 1

150 liter av den etter angivelsen i det tyske Offenlegungsschrift 30 38 130 fremstilte kulturoppløsning, idet fermentasjons-tiden er nedsatt til 45 til 60 timer befries ved hjelp av sentrifuge (30 00 G) for de uoppløste bestanddeler. Herved oppstår 2 00 liter lysebrunt kulturfiltrat inneholdende 0,5 g tendamistat/liter som konsentreres med en ultrafiltrerings-anlegg til 20 liter og avsaltes.

Eksempel 2

Konsentratet fra eksempel 1 på 20 liter blandes i første rekke med 5 liter etanol og innstilles deretter med 400 ml 10 %-ig saltsyre til pH 2,3. Den dannede utfelling av høymolekylære fremmedeggehviter frafiltreres. Den klare flytende fase konsentreres deretter ved ultrafiltrering til 8 liter og vaskes idet alkoholdelen senkes til mindre enn 1 %.

Til denne oppløsning settes 107 kokesalt. Deretter avkjøles oppløsningen til 1°C og blandes med podningskrystaller. Etter henstand natten over tilsettes tre ganger daglig hver gang 10 g kokesalt til blandingen inntil 90 % av aktiviteten befinner seg i krystallfiltratet. Dette er tilfelle etter 3-4 dager. Etter foretatt krystallisering avsentrifugeres i sentrifuge ved 6000 G, det faste virksomme stoff adskilles og oppløses i maksimalt 2 liter vann under natronluttilsetning, avsaltes ved hjelp av ultrafiltrering og frysetørkes. Ut byttet utgjør 72 g tendamistat (tilsvarende 72 % referert til 200 liter kulturfiltrat) inneholdende minst 90 % HOE 467 A.

Eksempel 3

Til 20 liter av det ifølge eksempel 1 fremstilte konsentrat settes iseddik til oppnåelse av pH-verdien på 5,2, samt 2 liter isopropanol. Den derved dannede utfelling av fremmedegge-hvite-forurensning frafiltreres. Det klare filtrat konsentreres ved ultrafiltrering til 10 liter, avkjøles til 6°C og deretter innstilles ved iseddik på PH 4,8. Den til å begynne med klare isopropanoliske oppløsning krystalliserer spontant, blandes med noen podekrystaller. Etter 24 timer er det dannet seg en krystallgrøt hvis pH-verdi senkes til 4,6. Etter ytterligere 48 timer, frasentrifugeres og vaskes med vann. Den lyse krystallmasse frysetørkes deretter uten å bli oppløst. Utbyttet utgjør 61 g (tilsvarende 61 % referert til 200 liter kulturfiltrat) inneholdende minst 90 % HOE 467 A

Claims (9)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av tendamistat, karakterisert ved at kulturfiltratet av kultur-oppløsninger av tendamistat-produserende mikroorganismer konsentreres og avsaltes, og deretter enten a) blandes med 0 til 30 vekt-% av et egnet med vann blandbart organisk oppløsningsmiddel, pH-verdien av denne oppløsning senkes ved tilsetning av en i peptidkjemien vanlige syre til 3,2 til 5,5 eller senkes til 2 til 3, og økes med en base til 3,2 til 5,5 og det i oppløsningen tilstedeværende tendamistat bringes eventuelt etter tilsetning av podningskrystaller ved henstand til krystallisering og adskilles,eller b) innstilles med en i peptidkjemien vanlige syre, til en pH-verdi mellom 1,0 til 3,0, eventuelt uoppløselige forurensninger adskilles, den dannede oppløsning blandes med et for krystallisering av eggehvitestoffer vanlige salt, og det i oppløsningen tilstedeværende tendamistat bringes eventuelt etter tilsetning av podekrystaller med henstand til krystallisering og adskilles.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes kulturfiltratet av kulturoppløsningen avS treptomyces tendae ATCC 31 210 eller Streptomyces tendae DSM 1912.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som syre anvendes svovelsyre, saltsyre eller eddiksyre.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det ved fremgangsmåte a) anvendes 5 til 15 % isopropanol, etanol eller aceton som oppløsningsmiddel.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at ved fremgangsmåte a) innstilles en pH-verdi mellom 4,2 og 5,2.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at ved fremgangsmåte b) anvendes et salt hvis anion er klorid, bromid, sulfat, fosfat eller citrat.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som salt anvendes et klorid.

8. Krystallinsk tendamistat dannet ved fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2.

9. Krystallinsk tendamistat dannet ved fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, bestående til en overveiende del av HOE 467 A.