NO842296L - Ny vektor - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en ny plasmid-ekspresjonsvektor, en fremgangsmåte for fremstilling av denne og dens anvendelse.

Mer spesielt angår foreliggende oppfinnelse en ekspresjonsvektor som inneholder genetisk informasjon nødvendig for initiering av transkripsjon og translasjon og initiering av kodon for translasjon (ATG eller GTG), og som er foretrukket for effektiv ekspresjon av et inkorporert DNA-fragment som koder for et polypeptid. En fremgangsmåte for fremstilling av en slik ekspresjonsvektor og anvendelse derav er innbefattet i foreliggende oppfinnelse.

I de senere år har forskning og teknologi på rekombinant DNA blitt utviklet og anvendelse derav i industrien er blitt tilgjengelig. Det er viktig å utvikle en fremgangsmåte for inkorporering av et fremmed gen til en plasmidvektor og for syntetisering på effektiv måte av et polypeptid innkodet på det fremmede gen i en vert-mikroorganisme. Forskjellige metoder har blitt utviklet for på effektiv måte å uttrykke fremmede gener i vert-mikroorganismer slik som Escherichia coli. For å forhøye transkripsjonshastigheten, ble lac-promotor, trp-promoter osv. benyttet som promotor, hvilket er genetisk informasjon nødvendig for initieringen av transkripsjon. Videre, for å forhøye translasjonshastigheten ble konstruert en rekombinant, hvori avstanden mellom ribosom-bindingssetet og initieringskodonet for translasjon (hovedsakelig ATG) ble justert.

Det sistnevnte er ufordelaktig fordi for å justere avstanden mellom ribosom-bindingssetet og initieringskodonet, er det nødvendig å anvende et spesielt "syntetisk DNA" som et bindeledd for å inkorportere et fremmed gen etter festing av initieringskodonet ATG i ned-strømsretningen for promotoren, og anvende DNA- modifikasjonsenzymer slik som DNA-polymerase I, Sl-nuklease og BAL-31-nuklease, eller å anvende "syntetisk DNA" som har spesiell basesekvens.

For å forbedre de kjente plasmidvektorene har foreliggende oppfinnere utviklet en plasmidvektor som har ATG ved et hensiktsmessig sete i nedstrømsretningen fra promotor-SD,, og som er spaltbar idet den etterlater ATG," og har fullført foreliggende oppfinnelse.

Foreliggende oppfinnelse beskrives i detalj nedenfor.

Ekspresjonsvektoren ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder en promotor som er genetisk informasjon nødvendig for initiering av transkripsjon, idet et initieringskodon for translasjon (ATG eller GTG) befinner seg ved en passende posisjon nedstrøms fra det ribosom-bindingssete som er genetisk informasjon nødvendig for initiering av translasjon, og som er betegnet Shine-Dalgarno-sekvensen, forkortet "SD-sekvens" i tilfellet for Escherichia coli, og gjenkjennelsessekvens for et restriksjonsenzym slik som SphI, EcoRV, Kpnl eller SacI som etterlates som 3'-utragende ende etter spalting med restriksjonsenzymet etter initieringskodonet.

Som promotor for ekspresjonsvektoren ifølge oppfinnelsen kan anvendes hvilke som helst promotorer som har promotoraktivitet. Promotoren for laktose-operonet, det for tryptofan-operonet og det for alkalisk fosfatase-operonet blir fortrinnsvis benyttet. Som initieringskodon for translasjon anvendes ATG eller GTG. Translasjon er mulig når avstanden mellom SD-sekvensen og initieringskodonet er 2-20 basepar (bp). Eksempler på gjenkjennelsessekvensen til et restriksjonsenzym som etterlates som 3'-utragende ende etter initieringskodonet, er ATGCATGC hvor initieringskodonet ATG og gjenkjennelsessekvensen SphI overlapper, ATGATATC hvor ATG og gjenkjennelsessekvensen til EcoRV overlapper, ATGGTACC hvor ATG, og gjenkjennelsessekvensen til Kpnl overlapper, og ATGAGCTC hvor ATG og gjenk jennelsessekvensen for SacI overlapper.

Vektoren hvori initieringskodonet ATG og Sphl-spaltningssetet (GCATGC) overlapper, er valgt som et eksempel på den vektor som har den ovenfor nevnte struktur og illustrasjo-nen av strukturen omkring promotoren og SD-sekvensen er illustrert på fig. 1. Videre, spaltningsmønsteret for restriksjonsenzymene nevnt ovenfor, hvis gjenkjennelses-sete overlapper med initieringskodonet ATG, er illustrert på fig. 2.

Konstruksjon av plasmidvektoren ifølge foreliggende oppfinnelse er beskrevet i detalj under anvendelse av tryptofan-promotoren i Escherichia coli som et eksempel.

I foreliggende oppfinnelse er genetisk informasjon som er nødvendig for initieringen av transkripsjon og initieringen av translasjon ikke begrenset til den som er avledet fra prokaryoter, men kan avledes fra eukaryoter slik som gjær og høyere dyr. For å lette forståelsen gis imidlertid følgende beskrivelse hovedsakelig under henvisning til Escherichia coli som er en prokaryot klarlagt i detalj med hensyn til transkripsjons- og translas jonsmekanisme.

Som kilde for DNA-holdig trp-promotor anvendes pKYPlOO som er derivat av pKYPlO inneholdende en trp-portabel promotor (japansk patentsøknad nr. 213193/81, US patentsøknad Serial No. 452.290, europeisk patentsøknad nr. 82111895.7). Fremgangsmåtene for fremstilling av pKYPlO og pKYPlOO er beskrevet i referanseeksempler 1 og 2 nedenfor. pKYPlOO 8 (8 refererer til tallhenvisningen på fig. 6, det samme skal gjelde i det følgende) spaltes ved Clal-setet som foreligger like nedstrøms fra SD-sekvensen til trpL-genet (se fig. 6). pKYPlOO spaltes deretter igjen ved Sphl-setet som foreligger i tetracyklin-resistensgenet og det større plasmid-DNA-fragment 9 renses ved agarosegel-elektroforese.

To oligonukleotider syntetiseres separat, og disse har komplementære basesekvenser som ligerbare med hverandre for dannelse av et DNA-fragment 10 som har en struktur som er ligerbar med DNA-fragmentet 9 og et initieringskodon for translasjon (ATG eller GTG) ved en passende avstand nedstrøms fra SD-sekvensen fulgt av en gjenkjennelsessekvens for et restriksjonsenzym som etterlates som 3'-utragende ende. Det således oppnådde DNA-fragment ligeres med det rensede plasmid-DNA-fragment 9 for oppnåelse av den ønskede ekspresjonsvektor 11.

Reaksjonsbetingelser som skal til for fremstilling av det rekombinante plasmid, er som følger.

Nedbrytning av DNA med restriksjonsenzymer utføres vanligvis ved å omsette 0,1-100 mikrogram DNA med 0,1-300 enheter, fortrinnsvis 1-3 enheter restriksjonsenzym pr. 1 mikrogram DNA i en blanding av 2-200 mM, fortrinnsvis 10-40 mM Tris-HCl (pH 6,0-9,5, fortrinnsvis pH 7,0-8,0), 1-150 mM NaCl og 2-20 mM, fortrinnsvis 5-10 mM MgCl2ved 18-42°C, fortrinnsvis 32-38°C i fra 15 min. til 2 timer. Reaksjonen stoppes vanligvis ved oppvarming ved 55-75°C, fortrinnsvis 63-70°C i 5-30 min., eller alternativt ved inaktivering av restriksjonsenzymet med en reagens slik som fenol eller dietylpyrokarbonat. Oligonukleotider syntetiseres ved dietylfosfat-metoden (H.G. Khorana et al.: J. Mol. Biol., 72, 209 (1972), fosfotriester-metoden (R. Crea et al.: Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 75, 5765 (1978)) eller fosfitt-metoden (M.D. Matteucci et al.: J. Am. Chem. Soc, 103, 3185

(1981)). Fosforilering av det syntetiserte oligonukleotid utføres med 0,1-100 enheter T4-ribonukleotidkinase i en blanding av 2-200 mM, fortrinnsvis 10-70 mM Tris-HCl (pH 6,0-9,5, fortrinnsvis pH 7,0-8,0), 3-20 mM, fortrinnsvis 4- 10 mM MgCl2og 1-10 mM ditiotreitol ved 20-40°C, fortrinnsvis 35-38°C i fra 5 min. til 2 timer. Ligering av DNA-fragmentene utføres med 0,1-10 enheter T4DNA-ligase i en blanding av 2-200 mM, fortrinnsvis 10-70 mM tris-HCl (pH 6,0-9,5, fortrinnsvis 7,0-8,0), 2-20 mM, fortrinnsvis 5- 10 mM MgCl2, 0,1-10 mM, fortrinnsvis 0,5-2 mM ATP og 1-50 mM, fortrinnsvis 5-10 mM ditiotreitol ved 1-37°C, fortrinnsvis 3-20°C i fra 15 min. til 72 timer, fortrinnsvis 22-20 timer.

Plasmid-ekspresjonsvektoren ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles på den ovenfor beskrevne måte. Istedenfor spaltningen av pKYPlOO med Clal er det alternativt mulig å spalte pKYPlOO ved Hindlll-setet like nedstrøms fra Clal-setet og deretter ved Sphl-setet og innføre det syntetiske nukleotid. Når gjenkjennelsessekvensen for restriksjonsenzymet som skal overlappes med initieringskodonet for translasjon er fraværende på pKYPlOO, f.eks. Kpnl:

I i

GGTACC og SacI: GAGCTC, syntetiseres to arter av oligonukleotider som innbefatter en slik gjenkjennelsessekvens og innføres i pKYPlOO mellom Clal-setet eller Hindlll-setet og BamHI-setet eller Sall-setet.

pKYPlOO er et derivat av pKYPlO. pKYPlO er et plasmid inneholdende en trp-promotor og er beskrevet i japansk patentsøknad nr. 213193/81. Konstruksjonen av pKYPlOO fra pKYPlO utføres på følgende måte. Som illustrert på fig. 5 nedbrytes plasmid pKYPlO 1 med Hhal, og et DNA-fragment 2 med 180 bp inneholdende en trp-promotor renses ved polyakrylamidgel-elektroforese. DNA-fragment 2 behandles med Escherichia coli DNA-polymerase I.Klenow-fragment for avkutting av den 3'-utragende enden dannet ved Hhal-nedbrytning for dannelse av glatt ende. Etter nedbrytning

ved Hindlll renses et DNA-fragment 3 med omkring 100 bp inneholdende en trp-promotor ved polyakrylamid-elektroforese.

Plasmid pBR322 5 nedbrytes separat med EcoRI, og den resulterende klebende enden endres til en glatt ende ved reparerende syntesereaksjon med Escherichia coli DNA-polymerase I. Etter nedbrytning med Hindlll renses det større plasmid DNA-fragmentet 6 ved agarosegel-elektroforese ved lavgeleringstemperatur. De rensede DNA-fragmentene 3 og 6 ligeres med 5'-fosforilert Xhol-binder (PCCTCGAGG) 4 under anvendelse av T4DNA-ligase for oppnåelse av plasmid pKYPlOO 7.

Ved fremstilling av vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse som nevnt ovenfor, anvendes et spaltningssete som forekommer like nedstrøms for SD-sekvensen. Selv om et slikt spaltningssted er fraværende, kan imidlertid også den ønskede ekspresjonsvektoren dannes. F.eks. når et spaltningssete som foreligger oppstrøms for promotoren anvendes, blir et oligonukleotid inneholdende promotor, ribosom-bindingssete og initieringskodon for translasjon (ATG eller GTG) alle syntetisert og klonet i en plasmidvektor slik som PBR322. Tryptofan-promotoren i Escherichia coli benyttet som en promotor for initieringen av transkripsjon, kan erstattes med andre Escherichia-promotorer. I det tilfelle hvor organismeceller andre enn Escherichia coli anvendes som celle for ekspresjon av fremmede gener, anvendes en promotor som passer for cellen. Når promotoren i organismer andre enn Escherichia coli benyttes, er det nødvendig å erstatte basesekvensen som tilsvarer ribosom-bindingssetet for Escherichia coli med basesekvensen som inneholder den genetiske informasjon som er nødvendig for translasjonsinitieringen. Ekspresjonsvektoren som oppnås som angitt ovenfor, spaltes med restriksjonsenzymer slik som SphI, EcoRV, Kpnl og SacI og benyttes for innføring av et fremmed gen like etter initieringskodonet ved hjelp av egnede metoder, f.eks. (1) ved endring av den 3'-utragende enden til glatt ende ved bruk av 3'-5' exonukleaseaktivitet til DNA-polymerase I.Klenow-fragment fulgt av innføring av det fremmede gen (se fig. 3) eller (2) ved festing av en homopolymer-blokk (polydA, polydT, polydG eller polydC til den 3'-utragende enden vd bruk av terminal deoksynukleotidyl-transferase fulgt av innføring av det fremmede gen med en homopolymer-blokk som er komplementær med den ovenfor nevnte (se fig. 4). Det fremmede gen kan uttrykkes effektivt ved å dyrke en vert-mikroorganisme inneholdende den således oppnådde rekombinant.

Den ovenstående beskrivelse refererer til Escherichia coli for hvilken molekylære biologiske studier er mest fremskredet. Bruken av foreliggende oppfinnelse er imidlertid ikke begrenset til Escherichia coli, men gjelder også for prokaryoter andre enn Escherichia coli og eukaryoter slik som gjær og høyerestående dyr. Det vil si, en plasmid-ekspresjonsvektor som kan anvendes på andre prokaryoter slik som Bacillus subtilis kan konstrueres ved opprettholdelse av strukturen nedstrøms for initieringskodonet, erstatning av promotoren og ribosom-bindingssetet i Escherichia coli med dem i prokaryoten og festing av den genetiske informajon som er nødvendig for replikasjonen og bibeholdelsen av plasmidvektoren i prokaryoten. Videre, selv om mekanismene for transkripsjon og translasjon i eukaryoter ikke er klare i detalj, kan plasmid-ekspres jons vektoren som kan anvendes for eukaryotene, konstrueres ved å erstatte promotoren i Esherichia coli med genetisk informasjon for initiering av transkripsjon og ribosom-bindingsstedet i Escherichia coli med genetisk informasjon for initiering av translasjon og festing av genetisk informasjon som er nødvendig for replikasjonen og bibeholdelsen av plasmidvektoren i eukaryotene.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 er et skjema som viser en av vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse hvori initieringskodonet for translasjon, ATG og Sphl-spaltningssetet (GCATGC) overlapper. Fig. 2 viser restriksjonsmønsterne som passer for vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse. Fig. 3 viser fremgangsmåten for innføring av et fremmed gen i vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse under anvendelse av DNA-polymerase I.Klenow-fragment. Fig. 4 viser fremgangsmåten for innføring av et fremmed gen i vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse ved bruk av terminal transferase. Fig. 5 viser fremgangsmåten for konstruksjon av plasmid pKYPlOO. På tegningen refererer 1 seg til plasmid pKYPlO, 2 er DNA-f ragmentet med ca. 180 bp inneholdende trp-promotor, 3 refererer seg til DNA-fragmentet med ca. 100 bp inneholdende trp-promotor, 4 er Xhol-binder, 5 er plasmid pBR322, 6 er et DNA-fragment i pBR322, og 7 refererer seg til plasmid pKYPlOO. Fig. 6 viser en fremgangsmåte for konstruksjon av plasmid pTRS3. På tegningen refererer 8 seg til plasmid pKYPlOO, 9 refererer til fragmentet med ca. 3,82 Kb i pKYPlOO, 10 refererer til dobbelttrådet DNA dannet ved sammensmelting av to syntetiserte oligonukleotider, og 11 refererer til

plasmid pTrS3.

Fig. 7 viser fremgangsmåten for konstuksjon av pKYP-5. Fig. 8 viser fremgangsmåten for konstruksjon av pKYP-100. Fig. 9 viser fremgangsmåten for konstruksjon av pFJ-123. Fig. 10 viser fremgangsmåten for konstruksjon av pFM-9. Fig. 11 (A) viser fremgangsmåten for konstruksjon av pKYP-11 og (B) strukturen for pKYP-12. Fig. 12 viser fremgangsmåten for konstruksjon av pLE-3.

Beste måte for utførelse av oppfinnelsen

Fremgangsmåtene for konstruksjon og anvendelse av vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse er beskrevet i detalj i de følgende eksempler.

Eksempel 1

Konstruksjon av plasmidvektor pTRS3 inneholdende initieringskodonet for translasjon ATG og Sphl-spaltningssete nedstrøms for trp-promotoren og ribosom-bindingssetet: pTrS3 ble oppnådd fra pKYPlOO konstruert som i referanseeksempel 2 på følgende måte. 5 mikrogram pKYPlOO 8 fikk reagere med 5 enheter Clal (produkt fra Boehringer Mannheim GmbH) i 10 mikroliter av en reaksjonsoppløsning inneholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2og 6 mM 2-merkaptoetanol ved 37°C i 2 timer. Reaksjonen ble stoppet ved oppvarming • ved 65°C i 5 min. 2 mikroliter 100 mM Tris-HCl (pH 7,'5); 70 mM Mgcl2, 1#0 M NaCl," 60 mM 2-merkaptoetanol, 16 mikroliter destillert vann og 7 enheter SphI (produkt fra Boehringer Mannheim GmbH) ble tilsatt, og blandingen fikk reagere i 37°C i 2 timer. Reaksjonen ble stoppet ved oppvarming ved 65°C i 5 min., og det større plasmid DNA-f ragmentet 9 (ca. 3,82 Kb) ble renset ved agarosegel-elektroforese ved lav-geleringstemperatur (LGT-AGE) (Lars Wieslander: Analytical Biochemistry 98, 305 (1979)).

To typer av oligonukleotider 5'-CGATAAGCTATGCATG-3' og 5'-CATAGCTTAT-3' ble separat syntetisert ved fosfotriester-metoden. De to syntetiserte oligonukleotidene ble 5'-fosforilert, og 20 mikro-M hver av oligonukleotidene ble blandet med 10 mM Tris-HCl (7,5), 100 mM NaCl og 1 mM EDTA. Blandingen ble inkubert ved 65°C i 10 min., ved 37°C i 120 min. og ved romtemperatur i 120 min. for sammensmelting. De to DNA-kjedene ble sammensmeltet som illustrert nedenfor.

pCGATAAGCTATGCATG

TATT CG AT ACp

Begge endene til det resulterende DNA-fragment kan ligeres med DNA-fragmentet som har klebrige ender dannet ved nedbrytning med Clal eller SphI, og den ligerte DNA har Clal-spaltningssete eller Sphl-spaltningssete som skal rekonstrueres. Den sammensmeltede DNA 10 av de to oligonukleotidene og plasmid-DNA-fragmentet 9 renset som angitt ovenfor, ble blandet og ligert med T4DNA-ligase. Det vil si 1 pM hver av de to oligonukleotidene, pCGATAAGCTATGCATG og pCATAGCTTAT ble sammensmeltet og ca. 0,15 mikrogram av det rensede plasmid-DNA-fragment 9 ble tilsatt. Deretter ble 0,5 enheter T4DNA-ligse (produkt fra Takara Shuzo Co.) tilsatt, og blandingen fikk reagere i 20 mikroliter av en reaksjonsoppløsning inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol og 0,5 mM ATP ved 4°C i

16 timer.

Escherichia coli HV101 ble transformert med det resulterende rekombinant plasmid DNA. Plasmid-DNA'er ble isolert fra den således oppnådde transformant som er resistent overfor ampicillin og følsom overfor tetracyklin (Ap^c^) og renset. Disse plasmid-DNA'er ble nedbrutt med EcoRI, Xhol og PstI (produkter fra Takara Shuzo Co.), og Clal og SphI (produkter fra Boehringer Mannheim GmbH) for gjenkjenning av dannelsen av den ønskede plasmid-vektor pTrS3 11. Det ble funnet ved metoden ifølge Maxam og Gilbert (A.M. Maxam et al.: Proe. Nati. Acad. Sei. 74, 560

(1977)) at basesekvensen til DNA mellom Clal-setet og Sphl-setet i pTrS3 var ATCGATAAGCTATGCATGC. Escherichia coli inneholdende pTrS3 ble deponert hos the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (Ibaraki-ken, Japan) den 29. september 1982 som Escherichia coli ITrS-3 FERM P-6735. Deponeringen ble overført til det internasjonale deponeringsinstitutt den 26. juli 1983, og gitt aksesjonsnummeret FERM BP-328.

Eksempel 2

Ekspresjon av et interferon-beta (i det følgende betegnet IFN-beta)-derivat hvori et ytterligere metionin er festet til N-terminalen i IFN-beta: Et rekombinant plasmid som uttrykker et IFN-beta-derivat hvori et ytterligere metionin var festet til IFN-beta før N-terminal-metioninet, ble oppnådd på følgende måte ved bruk av ekspresjonsvektoren pTrS-3 konstruert i eksempel 1. 10 mikrogram pTrS-3 ble omsatt med 10 enheter SphI (produkt fra Boehringer Mannheim GmbH) i 40 mikroliter av en reaksjonsoppløsning inneholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl," 7 mM MgCl2og 6 mM 2-merkapto-etanol ved 37°C i 2 timer. Etter reaksjonen ble reaksjonsblandingen utsatt for fenol- og kloroformekstraksjon og etanolutfelling. Det utfelte DNA-fragmentet ble oppløst i 40 mikroliter av en blanding inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 7 mM MgCl2, 10 mM 2-merkaptoetanol, 0,25 mM dATP, 0,25 mM dCPT, 0,25 mM dGTP og 0,25 mM dTTP fulgt av tilsetning av 4 enheter Escherichia coli DNA-polymerase I.Klenow-fragment (produkt fra Bethesda Research Laboratories, Inc.) Blandingen fikk reagere ved 15°C i 2 timer. Etter reaksjonen ble blandingen underkastet fenol- og kloroformekstraksjon og etanolutfelling. Det utfelte DNA-fragment ble oppløst i 30 mikroliter av en blanding inneholdende 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 7 mM MgCl2og 60 mM 2-merkaptoetanol fulgt av tilsetning av 16 enheter EcoRI (produkt fra Takara Shuzo Co). Blandingen fikk reagere ved 37°C i 2 timer, etter nedbrytning med EcoRI ble det mindre plasmid-DNA-fragmentet (ca. 130 bp) renset ved agarosegel-elektroforese ved lav-geleringstemperatur.

Deretter ble et rekombinant plasmid pLE-3 inneholdende IFN-beta-gen omsatt med 10 enheter Clal (produkt fra Boehringer Mannheim, GmbH) i 30 mikroliter av en reaksjonsoppløsning inneholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2og 6 mM 2-merkaptoetanol ved 37°C i 2 timer.

Strukturen omkring Clal-setet i pLE-3 er som følger:

Reaksjonsblandingen ble underkastet fenol- og kloroform-ekstraks jon og etanolutfelling. Det utfelte DNA-fragmentet ble oppløst i 30 mikroliter av en blanding inneholdende 50 mM Tris-HCl, 7 mM MgCl2, 10 mM 2-merkaptoetanol, 0,25 mM dATp og 0,25 mM dATP og 0,25 mM dTTP fulgt av tilsetning av 12 enheter av Escherichia coli DNA-polymerase I (produkt fra New England Biolabs.). Blandingen fikk reagere ved 37°C i 30 min.

Ved reaksjonen ble den 5'-utragende ende dannet ved Clal-nedbrytning endret til glatt ende ved 5' > exonukleaseaktivitet i DNA-polymerase I.

I reaksjonen ble dATP og dTTP tilsatt for å hindre nedbrytning av enden til DNA-materialet i retning av 3' >5' ved 3' ^5'-exonukleaseaktiviteten til DNA-polymerase I. Den ovenfor nevnte glatte ende ble oppnådd i et forhold på 2-20%.

Reaksjonsoppløsningen ble underkastet fenol- og kloroformekstraksjon og etanolutfelling. Det utfelte DNA-fragmentet ble oppløst i 30 mikroliter av en blanding inneholdende 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 7 mm MgCl2og 6 mM 2-merkaptoetanol og 16 enheterEcoRI (produkt fra Takara Shuzo Co.) ble tilsatt. Blandingen fikk reagere ved 37°C i 2 timer.

Etter nedbrytningen med EcoRI, ble det større plasmid-DNA-fragmentet (ca. 5,1 kb) renset ved agarosegel-elektroforese ved lav-geleringstemperatur. Ca. 40 ng av DNA-fragmentet med ca. 130 bp inneholdende trp-promotor, SD-sekvens og ATG-kodon og ca. 150 ng av DNA-fragmentet med ca. 5,1 Kb inneholdende IFN-beta-gen oppnådd på denne måte, ble omsatt med en enhet T4DNA-ligase i 20 mikroliter av en blanding av 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCL2, 10 mM ditiotreitol og 0,5 mM ATP ved 4°C i

20 timer.

Escherichia coli HB101 (H. Boyer et al.: J. Molec. Biolo., 41, 459 (1969)) ble transformert med det således oppnådde rekombinante plasmid-DNA på konvensjonell måte. Plasmid-DNA pFJ-123 i en Ap<R>Tc<S->transformant stamme ble isolert og renset på konvensjonell måte som illustrert på fig. 9.

Strukturen til pFJ-123 ble bestemt ved agarosegel-elektroforese etter nedbrytning med restriksjonsenzymer EcoRI, Xhol, Pst I og BamHI (produkter fra Takara Shuzo Co.) og Clal (produkt fra Boehringer Mannheim, GmbH).

Escherichia coli HB101 inneholdende rekombinant plasmid pFJ-123 ble benevnt IFJ-123. Interferon-produktiviteten til IFJ-123 ble undersøkt på følgende måte.

Stammen ble dyrket ved 37°C i 18 timer i LG-medium inneholdende 10 g trypton, 5 g gjærekstrakt, 5 g NaCl, 1 g glukose og 1 Z vann og innstilt til pH 7,2 med NaOH. 0,2 ml av det dyrkede medium ble inokulert i 10 ml MCG-medium (pH 7,2) inneholdende 0,6% Na2HP<0>4, 0,3% KH2P<0>4, 0,5% NaCl, 0,1% NH4C1, 0,5% glukose, 0,5% casaminosyre, 1 mM MgS04og 4 mikrogram/ml tiaminhydroklorid og dyrket ved 30°C i 4-8 timer. 10 mikrogram/ml indolakrylsyre (i det følgende betegnet IAA som er en induktor for tryptofan-genet, ble tilsatt, og dyrking ble fortsatt i 5-12 timer.

Det dyrkede medium ble underkastet sentrifugering ved 8.000 omdr./min. i 10 min., og de innhøstede cellene ble vasket med en bufferoppløsning (pH 7,5) av 30 mM Tris-HCl inneholdende 30 mM NaCl. De vaskede cellene ble suspendert i 1 ml av den ovennevnte bufferoppløsning og 200 mikrogram lysozym og 5 mikroliter 0,25 M EDTA (etylendiamin-tetraacetat) ble tilsatt. Blandingen ble hensatt ved 0°C i 30 min. Frysing og smelting ble gjentatt tre ganger for å bryte cellene. De brudte cellene ble utsatt for sentrifugering ved 15.000 omdr./min. i 30 min., og den ovenstående væsken ble utvunnet. Interferonet i den ovenstående væsken ble bestemt ifølge metoden til Armstrong (J.A. Armstrong: Appl. Microbiol. 21, 723-725

<1971>) under anvendelse asv Vesicular Stomatitis Virus som et virus og Wish-clle anledet fra menneske-amnionceller som en dyrecelle. Bestemmelsen av interferon viste at stammen produserte 3 x 10^ enheter/^ interferon.

Basesekvensen omkring SD-sekvensen og ATG i plasmidet pFJ-123 i IFJ-123-stamme som bestemt ved metoden ifølge Maxam og Gilbert, er som følger:

Escherichia coli inneholdende pFJ-123 ble deponert hos the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology den 24. januar 1983 som Escherichia coli IFJ-123 FERM P-6882.

Fremgangsmåte for fremstilling av pFJ-123 som nevnt ovenfor, er illustrert på fig. 9.

Eksempel 3

Ekspresjon av et IFN-beta-derivat hvori N-terminal-aminosyren er sløyfet: Et rekombinant plasmid som uttrykker et IFN-beta-derivat hvori flere N-terminalaminosyrer var sløyfet, ble oppnådd på følgende måte ved anvendelse av ekspresjonsvektoren pTrS-3 konstruert i eksempel 1. 15 mikrogram pLE-3 ble nedbrutt med 20 enheter Clal (produkt fra Boehringer Mannheim GmbH) i 100 ml av en reaksjonsoppløsning inneholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2og 6 mM 2-merkaptoetanol ved 37°C i 2 timer. Reaksjonsoppløsningen ble underkastet fenol- og kloroform-ekstraks jon og etanolutfelling. Det utfelte DNA-fragment ble oppløst i 30 mikroliter 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) - 0,5; mM EDTA. 6 mikroliter av DNA-oppløsningen inneholdende ca. 3 mikrogram DNA, 13 mikroliter destillert vann og 5 mikroliter av en bufferoppløsning inneholdende 60 mM CaCl2, 60 mM MgCl2, 3 M NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,1) og 5 mM EDTA, ble blandet og 0,5 enheter exonuklease BAL31 (produkt fra New England Biolabs) ble tilsatt. Blandingen fikk reagere ved 30°C i 3 min. for å fjerne 1-30 bp fra begge Clal-endene til DNA-materialet. Reaksjonen ble stoppet ved fenolekstraksjon og deretter kloroformekstraksjon, og etanolutfelling ble foretatt. Det utfelte DNA-fragmentet ble oppløst i 20 mikroliter av en blanding av 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM MaCl, 7 mM MgCl2og 60 mM 2-merkaptoetanol, og 8 enheter EcoRI (produkt fra Takara Shuzo Co.) ble tilsatt. Blandingen fikk reagere ved 37°C i 2 timer. Etter nedbrytning medEcoRI, ble det større plasmid-DNA-fragmentet på ca. 5,1 kb renset ved agarosegel-elektroforese ved lav-geleringstemperatur.

Ca. 150 ng av det således oppnådde DNA-fragment med ca. 5,1 kb inneholdende IFN-beta-gen og ca. 40 ng av DNA-fragmentet med ca. 130 bp ble fremstilt i eksempel 2 og inneholdende trp-promotor, SD-sekvens og ATG-kodon, ble ligert med 1 enhet T4DNA-ligase (produkt fra Takara Shuzo Co. ) i 20 mikroliter av en reaks jonsoppløsning inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol og 0,5 mM ATP. Blandingen fikk reagere ved 4°C i 20 timer.

Escherichia coli HB101 ble transformert med den således oppnådde rekombinante plasmid-DNA på konvensjonell måte. Plasmid pFM-9 i den oppnådde Ap<R>Tc<S->transformant ble isolert og renset på konvensjonell måte som illustrert på fig. 10.

Strukturen til pFM-9 ble bestemt ved agarosegel-elektroforese etter nedbrytning med restriksjonsenzymer EcoRI, Xhol, Pstl, BamHI og Clal.

Escherichia coli HB101 inneholdende den rekombinante plasmid pFM-9 ble benevnt IFM-9. Interferon-produktivitet til IFM-9 ble undersøkt som i eksempel 2. Stammen produserte 8 x 10^ enheter/^ interferon. Stammen ble deponert hos The Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, den 24. januar 1983 som Escherichia coli IFM-9 FERM P-6883. Den rekombinante plasmid i denne stamme ble benevnt pFM-9.

Fremgangsmåte for fremstilling av pFJ-123 som nevnt ovenfor er illustrert på fig. 10.

Basesekvensen rundt SD-sekvensen og ATG i plasmiden pFM-9 i Escherichia coli IFM-9 som bestemt ved metoden ifølge Maxam og Gilbert, er som følger:

Det ble bekreftet at pFM-9 inneholder genet som koder for IFN-beta hvori de fem aminosyrene etter N-terminal Met (Ser Tyr Asn Leu Leu) er sløyfet.

Referanseeksempel 1

Konstruksjon av en plasmid-vektor pKYPlO som har en trp-promotor:

(a) rensing av tryptofan-transduserende fag DNA:

En lambda-ptr-fag, lambda-cl857trpED10 (i det følgende betegnet lambda-trpED (G.F. Miazzari et al.: J. Bacteriol. 133 1457 <1978>) ble lysogenisert i Escherichia coli JA 194-stammme (F<->, lambda", r-j^-» mk~'delta-trp E5, leu6) (J. Carbon et al.: Recombinant Molecules p.355 (1977), Raven Press). Den resulterende lysogene stamme, JA 194 (lamda trp ED) ble dyrket ved 42°C i 30 min. for å indusere lambda trp ED-fager og fremstille lambda-faglysat. Lambda-fagene ble renset fra lambda-faglysat ved likevekt-densitetsgradient sentrifugering med sesium klorid ifølge Yamakawa et al.: Chemicals of Nucleic Acids I" Tokyo Kagaku Dojin, s. 54-61 (1974). Lambda-fagene ble ytterligere renset ved fenolbehandling og kloroformbehandling ifølge metoden til Yamakawa et al.: "Chemicals of Nucleid Acids I" Tokyo Kagaku Dojin, s. 62-65 (1974). (b) Kloning av trp-promotoren til en plasmid: Kloning av trp-operonet fra lambda-trp ED fag DNA ble utført på følgende måte. Det vil si 8 mikrogram lambda trp ED DNA ble nedbrutt ved 37°C i 2 timer med 16 enheter EcoRI (produkt fra Takara Shuzo Co., det samme gjelder i det følgende) og 16 enheter Hindlll (produkt fra Takara Shuzo Co., det samme gjelder i det følgende), i 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 75 mM NaCl, 10 mM MgCl2og 5 mM ditiotreitol. 1 mikrogram av plasmid pBR325 DNA ble nedbrutt separat med 2 enheter EcoRI og 2 enheter Hindlll ved den samme metoden som nevnt ovenfor (sluttlig volum: 30 mikroliter. Reaksjonene ble stoppet ved oppvarming ved 65°C i 5 min. Deretter ble 15 mikroliter av hver av nedbrytningsmaterialene blandet med 500 mikro-M (slutt-konsentrasjon) ATP og 5 enheter T4DNA-ligase (produkt fra New England Biolabs) ble tilsatt. Blandingen fikk reagere ved 4°C i 18 timer. Escherichia coli C600 SF-stamme, Cameron et al.: Proe. Nati. Acad. Sei. 72 3416 (1975), ble transformert med den oppnådde plasmidblandingen ved metoden ifølge S.N. Cohen et al.: Proe. Nati. Acad. Sei. 69, 2110 (1972) og transformanter som var resistente overfor ampicillin (Ap<R>), resistente overfor tetracyklin (TcR) og sensitive overfor kloramfenieol (Cm<s>) ble valgt. Plasmid DNA'er ble isolert fra transformantene til Escherichia coli. En av plasmid-DNA'ene ble benevnt pKYP-1. Plasmid pKYP-1 ble nedbrutt med Taql og EcoRI og det nedbrutte materialet ble utsatt for rensing ved agarosegel-elektroforese for oppnåelse av et 2,6 Kb (kilobase; det samme skal gjelde i det følgende) DNA-fragment inneholdende tryptofan-promotoren og SD-sekvensen. 2,6 Kb DNA-f ragmentet ble klonet i en kjent vektor, pBR322, ved fremgangsmåten som illustrert på fig. 7. Det vil si, 8 mikrogram pBR322 ble nedbrutt ved 45°C i 60 minutter med 2 enheter Taql (produkt fra Takara Shuzo Co.) i 100 mikroliter av en reaksjonsblanding omfattende 10 mM Tris-HCl (pH 8,4), 6 mm MgCl2, 100 mM NaCl og 6 mM 2-merkaptoetanol. Etter delvis nedbrytning med Taql, ble det nedbrutte materialet underkastet agarosegel-elektroforese ved lav-geleringstemperatur (Lars Wieslander: Analytical Biochemistry 98, 305 (1979) for oppnåelse av et renset 4,36 Kb DNA-fragment. Ca. 1,5 mikrogram av DNA-fragmentet ble fullstendig nedbrutt ved 37°C i 3 timer med 3 enheter EcoRI, ca. 1,0 mikrogram av et ca. 4,33 Kb DNA-fragment ble utvunnet ved agarosegel-elekroforese ved lav-geleringstemperatur på lignende måte som ovenfor. Deretter ble 12 mikrogram pKYP-1 DNA delvis nedbrutt med 3 enheter Taql, nedbrytingsmaterialet ble underkastet agarosegel-elektroforese ved lav-geleringstemperatur for oppnåelse av ca. 2 mikrogram av et renset 8,5 Kb DNA-fragment, og DNA-materialet ble fullstendig nedbrutt med EcoRI ved den samme metoden som angitt ovenfor for oppnåelse av ca. 0,5 mikrogram av et renset 2,6 Kb DNA-fragment. Deretter ble 0,4 mikrogram av 4,33 Kb DNA til pBR322 og 0,25 mikrogram i 2,6 Kb DNA-fragmentet til pKYP-1 oppnådd på denne måten, tilsatt til 20 mikroliter av en reaksjonsoppløsning bestående av 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2og 10 mM ditiotreitol. Deretter ble 0,5 mM ATP og 4 enheter T4DNA-ligase tilsatt til blandingen, og reaksjonen ble utført ved 4°C i 18 timer. Escherichia coli C600 SF8-stamme ble transformert med den rekombinante plasmid-DNA oppnådd som angitt overfor. Plasmidene i transformanten med Ap<R>og Tc<R>ble isolert. Plasmid DNA-materialet ble nedbrutt med 6 restriksjonsendonukleaser, EcoRI, Hindll, Clal (produkt fra Boehringer Mannheim GmbH) Hpal (produkt fra Takara Shuzo Co.), HincII (produkt fra Takara Zhuzo Co. ) og BamHI (produkt fra Takara Shuzo Co.) for å analysere plasmidens struktur. Plasmiden ble benevnt pKYP-5. (c) Fremstilling av en portabel promotor fra trp-promotoren: Plasmidvektoren pKYP-5 nevnt ovenfor kan anvendes som en DNA-innføringsvektor siden den har et Clal-sete og et Hindlll-sete i DNA-materialet på 1-20 basepar nedstrøms fra SD-sekvensen. Et annet Clal-sete erP21 (c) Fremstilling av en portabel promotor fra trp-promotor en: Plasmidvektoren pKYP-5 nevnt ovenfor kan anvendes som en DNA-innføringsvektor siden den har et Clal-sete og et Hindlll-sete i DNA-materialet på 1-20 basepar nedstrøms fra SD-sekvensen. Et annet Clal-sete er imidlertid til stede i pKYP-5 DNA foruten Clal-setet umiddelbart etter SD-sekvensen og fragmentet med trp-promotoren oppnådd ved kutting av pKYP-5 DNA med EcoRI, og Hindlll er imidlertid litt for stort, det vil si 2,65 Kb. For hensiktsmessig anvendelse ble pKYP-5 forbedret ved fremgangsmåten som illustrert på fig. 8 for oppnåelse av en plasmid med et DNA-fragment inneholdende et kortere tryptofan-promotor. Det vil si, pKYP-5 DNA ble nedbrutt med Hpall og Hindlll, og det nedbrutte materialet ble renset for oppnåelse av et DNA-fragment på ca. 340 bp (basepar). Fragmentet ble innført i pBR322 nedbrutt med Clal og Hindlll som illustrert på fig. 6 for oppnåelse av pKYP-10. Strukturen til pKYP-10 ble bestemt ved agarosegel-elektroforese etter nedbrytning med EcoRI, Clal, Hindlll og Hpal. (d) Forbindelse av to eller flere trp-promotorer: For å konstruere en plasmid-vektor som har en sterkere promotor-aktivitet, ble to trp-promotorer innført i vektoren. Det vil si, DNA-f ragmentet med ca. 340 bp inneholdende trp-promotoren nevnt i trinn (c) ovenfor, ble innført i pKYP-10 som nedbrutt med Clal og Hindlll for oppnåelse av pKYP-11 som illustrert på fig. 11(A). Den samme metoden ble gjentatt for å illustrere pKYP-12 illustrert på fig. 11(B) hvori tre trp-promotorer ble forbundet ved den samme orienteringen. Strukturen til pKYP-12 ble bekreftet ved nedbrytning med EcoRI,Clal, Hindlll og Hpal.

Referanseeksempel 2

Konstruksjon av pKYP-100:

pKYP-100 7 som er mer hensiktsmessig for konstruksjonen av plasmidvektoren ifølge foreliggende oppfinnelse, ble konstruert som illustrert på fig. 5. Som kilde for DNA inneholdende trp-promotor, ble plasmid pKYPlO 1 (japansk patentsøknad 213193/81, se fig. 5) inneholdende en trp-portabel promotor benyttet. 50 mikrogram pKYPlO ble nedbrutt med 50 enheter Hhal (produkt fra Takara Shuzo Co. ) i 100 mikroliter av en reaksjonsoppløsning inneholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2og 6 mM 2-merkaptoetanol ved 37°C i 2 timer. Etter nedbrytning med Hhal ble et DNA-fragment med ca. 180 bp inneholdende trp-promotor, renset ved 5% polyakrylamidgel-elektroforese (A.M. Maxam et al.: Proe. Nati. Acad. Sei. 74, 560 (1977), i det følgende betegnet som PAGE). I rensingstrinnet ble 2 DNA-fragmenter andre enn den ønskede DNA oppnådd p.g.a. ufullstendig rensing med PAGE. De 3 rensede DNA-fragmentene (total mengde: ca. 4 mikrogram) fikk reagere med 8 enheter Escherichia coli DNA-polymerase I.Klenow-fragment (produkt fra Bethesda Research Laboratories, Inc.) i 30 mikroliter av en reaksjonsoppløsning inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 7 mM MgCl2, 10 mM 2-merkaptoetanol, 0,25 mM dATP,. 0,25 mM dCTP, 0,25 mM dGTP og 0,25 mM dTTP ved 15°C i 2 timer. Ved reaksjonen ble den 3'-utragende enden dannet ved Hhal-nedbrytning endret til glatt ende ved 3'—^-5<*>exonukleaseaktiviteten og 5' >• 3 '-reparas jonssynteseaktiviteten til DNA-polymerase I.Klenow-fragment. Deretter ble DNA-polymerase I. Klenow-fragment inaktivert ved oppvarming ved 72°C i 30 min., og NaCl-konsentrasjonen ble justert til 50 mM med 1 M NaCl. 8 enheter Hindlll (produkt fra Takara Shuzo Co. ) ble tilsatt, og blandingen fikk reagere ved 37°C i 2 timer. Etter nedbrytning med Hindlll ble DNA-fragmentet med ca. 100 bp inneholdende trp-promotor isolert og renset med PAGE. Separat ble 5 mikrogram plasmid pBR322 nedbrutt med 8 enheter EcoRI (produkt fra Takara Shuzo Co.) i 20 mikroliter av en reaksjonsoppløsning inneholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 7 mM MgCl2og 6 mM 2-merkaptoetanol ved 37°C i 2 timer. Etter fenol- og kloroformekstraksjon og etanolutfelling, ble det utfelte DNA-fragmentet oppløst i 20 mikroliter av en blanding av 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 7 mM MgCl2, 6 mM 2-merkaptoetanol, 0,25 mM dCTP, 0,25 mM dGTP og 0,25 mM dTTP. Deretter ble 8 enheter Escherichia coli DNA-polymerase I.Klenow-fragment (produkt fra Bethesda Research Laboratories Inc.) tilsatt, og blandingen fikk reagere ved 15°C i 2 timer. Den 5'-utragende enden dannet ved EcoRI-nedbrytning ble endret til glatt ende ved reparasjonssynteseaktiviteten til DNA-polymerase I.Klenow-fragment. DNA-polymerase I.Klenow-fragment ble inaktivert ved oppvarming ved 72°C i 30 min., og NaCl-konsentrasjonen ble innstilt til 50 mM med 1 M NaCl. 8 enheter Hindlll (produkt fra Takara Shuzo Co.) ble tilsatt, og blandingen fikk reagere ved 37°C i 2 timer. Etter nedbrytning med Hindlll ble det større plasmid DNA-fragmentet med ca. 4,33 Kb renset ved agarosegel-elektroforese ved lav-geleringstemperatur .

Ca. 50 ng av DNA-fragmentet 3 med 100 bp inneholdende trp-promotor og oppnådd som angitt ovenfor, ca. 0,2 mikrogram av DNA-f ragmentet 6 med ca. 4,33 Kb avledet fra pBR322 og oppnådd som angitt ovenfor, og 50 ng 5'-fosforilert Xhol-binder (pCCTCGAGG, produkt fra Collaborative Research), ble ligert med en enhet T4DNA-ligase (produkt fra Takara Shuzo Co.) i 20 mikroliter av en reaks jonsoppløsning inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol og 0,5 mM ATP ved 4°C i 40 timer. Escherichia coli HB101 ble transformert med den således oppnådde rekombinante plasmid-DNA, og plasmid-DNA'er ble isolert og renset fra Ap Tc -transformantene. Disse plasmid DNA'er ble nedbrutt med 8 restriksjonsenzymer EcoRI, Xhol, Hindlll og Haelll (produkter fra Takara Shuzo Co.), Clal (produkt fra Boehringer Mannheim GmbH), Taql (produkt fra Bethesda Research Laboratories) og Rsal (produkt fra New England Biolabs) for å velge det plasmid hvori DNA-fragment 3 med ca. 100 bp inneholdende trp-promotoren og Xhol-binderen 4 var klonet, ble betegnet pKYPlOO 7.

Referanseeksempel 3

Konstruksjon av pLE-3:

Plasmid pTuIFN-beta-5 isolert fra ATCC 31879 ved konvensjonell teknikk, ble nedbrutt med Hindlll. Det nedbrudte materialet ble behandlet med DNAS-polymerase I (produkt fra New Wengland Biolabs) og underkastet ligering for oppnåelse av pTuIFN-betaH-5 illustrert på fig. 12. IFN-beta-genet utvunnet fra pTuIFN-5 ble deretter klonet i plasmiden pKYP-12 med en trp-promotor. Det vil si, 2 mikrogram pKYP-12 DNA ble nedbrutt med 4 enheter Clal i

30 mikroliter av en bufferoppløsning bestående av 10 mM

Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2og 5 mM ditiotreitol (i det følgende betegnet Cla-buffer) ved 37°C i 2 timer. NaCl ble tilsatt til en sluttlig konsentrasjon på 100 mM, og reaksjonen ble fortsatt ved 37°C i 2 timer. Blandingen ble oppvarmet ved 65°C i 5 min. for å inaktivere enzymet, og ble deretter underkastet agarosegel-elektroforese ved lav-geleringstemperatur for oppnåelse av 1,2 mikrogram av et renset DNA-fragment med ca. 5 Kb inneholdende trp-promotoren. Separat ble 15 mikrogram pTuIFN-betaH-5 DNA nedbrutt med Clal og BamHI og renset ved agarosegel-elektrof orese ved lav-geleringstemperatur som beskrevet ovenfor for oppnåelse av ca. 1 mikrogram av et DNA-fragment (1,1 Kb) inneholdende IFN-beta-genet. De to DNA-fragment ene oppnådd som angitt ovenfor og illustrert som 5 Kb og 1,1 Kb på fig. 12 ble oppløst i en blanding av 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, og 500 mM ATP. 4 enheter T4DNA-ligase ble tilsatt, og blandingen fikk reagere ved 4°C i 18 timer. Escherichia coli HB101 ble transformert med den således oppnådde blanding av rekombinantene ved konvensjonell teknikk for oppnåelse av Ap<R->kolonier. Plasmidene ble utvunnet fra kulturen av koloniene. En av plasmidene er pLE-3 illustrert på fig. 12. Strukturen til pLE-3 ble bekreftet ved agarosegel-elektroforese etter nedbrytning av DNA med Clal, EcoRI, Hindlll og BamHI. Det ble bekreftet ved metoden ifølge Maxam og Gilbert (A.M. Maxam et al. Proe. Nati. Acad. Sei. 74, 560 <1977>) at basesekvensen fra SD-sekvensen, AAGG, til initieringskodonet, ATG, i plasmiden pLE-3, var "AAGGGTATCGATG".

Escherichia coli inneholdende plasmiden pLE-3 er blitt deponert hos The American Type Culture Collection (ATCC) som Escherichia coli ILE-3, ATCC 39010.

Claims (19)

1. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den har en promotor, et ribosom-bindingssete og et initieringskodon for translasjon fulgt av en gjenkjennelsessekvens for et restriksjonsenzym som vil etterlates som 3'-utragende ende etter spalting med restriks jonsenzymet.

2. Ekspresjonsvektor ifølge krav 1, karakterisert ved at initieringskodonet for translasjon er ATG eller GTG.

3. Ekspresjonsvektor ifølge krav 1, karakterisert ved at restriksjonsenzymet er SphI, EcoRV, Kpnl eller SacI.

4. Ekspresjonsvektor ifølge krav 1, karakterisert ved at promotoren er avledet fra en prokaryot.

5. Ekspresjonsvektor ifølge krav 5, karakterisert ved at promotoren er en Escherichia coli-promotor valgt fra trp, lac og lambda-fag eller en Bacillus subtilis-promotor.

6. Ekspresjonsvektor ifølge krav 1, karakterisert ved at promotoren, ribosom-bindingssetet og initieringskodonet for translasjon er avledet fra en eukaryot.

7. Fremgangsmåte for ekspresjon av et fremmed gen, karakterisert ved at man med et restriksjonsenzym spalter en ekspresjonsvektor som har en promotor, et ribosom-bindingssete og et initieringskodon for translasjon fulgt av en gjenkjennelsessekvens for restriksjonsenzymet som vil etterlates som 3'-utragende ende etter spalting med restriksjonsenzymet, endrer den 3'-utragende enden til en glatt ende med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) eller T4DNA-polymerase, inkorporerer det fremmede gen ved den glatte enden for dannelse av en rekombinant, transformerer en vert-organisme med rekombinanten og dyrker den således oppnådde transformant.

8. Fremgangsmåte for ekspresjon av et fremmed gen, karakterisert ved at man med et restriksjonsenzym spalter en ekspresjonsvektor som har en promotor, et ribosom-bindingssted og et initieringskodon for translasjon fulgt av en gjenkjennelsessekvens for restriksjonsenzymet som vil etterlates som 3'-utragende ende etter spalting med restriksjonsenzymet, festing av en homopolymer-blokk til den 3'-utragende enden under anvendelse av terminal deoksynukleotidyl-transferase, inkorporering av det fremmede gen med en homopolymer-blokk som er komplementær til den ovenfor nevnte homopolymer-blokk for dannelse av en rekombinant, transformering av en vert-mikroorganisme med rekombinanten og dyrking av den således oppnådde transformant.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 7 eller 8, karakterisert ved at initieringskodonet for translasjon er ATG eller GTG.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 7 eller 8, karakterisert ved at restriksjonsenzymet er SphI, EcoRV, Kpnl eller SacI.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 7 eller 8, karakterisert ved at promotoren er avledet fra en prokaryot.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at promotoren er en Escherichia coli-promotor valgt fra trp, lac og lambda-f ag.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 7 eller 8, karakterisert ved at promotoren, ribosom-bindingssetet og initieringskodonet for translasjon er avledet fra en eykaryot.

14. Mikroorganisme, karakterisert ved at den inneholder ekspresjonsvektoren ifølge krav 1.

15. Escherichia coli ITrS-3.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at det fremmede gen er et gen som koder for interferon eller et derivat derav.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at vert- mikroorganismen tilhører Escherichia coli.

18. Escherichia coli IFJ-123.

19. Escherichia coli IFM-9.