NO843431L - Fremgangsmaate for fremstilling av lymfotoksin eller lymfotoksin-mrna - Google Patents

Abstract

Fremgangsmåte for fremstilling av lymfotoksin og lymfotoksin-mRNA ved inkubering av transformerte T-lymfocytter i kontinuerlig kultur og derpåfølgende adskillelse av de således dannede celleprodukter.

Description

Fra litteraturen er det kjent at visse celler fra pattedyr etter passende stimulering er i stand til å fremstille såkalte lymfotoksiner in vitro (se eksempelvis Evans i Cancer Immunol. Immunother. 12, 181-190 (1983) og Granger et al. i Biology of

the Lymphokines s. 141-180, Academic Press 1979). I disse tilfeller utgjør lymfotoksin fra en bestemt art ikke noe enhetlig protein in vitro, snarere beskrives en rekke undertyper som adskiller seg fra hverandre med hensyn til molekylvekt, ladning og stabilitet ( se eksempelvis Granger et al. i. Biology of the Lymphokines s. 141-180, Academic Press 1979). I det humane systemet skilles det for eksempel mellom fire klasser lymfotoksiner, hvor molekylvektene ligger i området fra 10 000 til 20 000 for yLT, 35 000 til 50 000 for ØLT, 70 000 til 90 000 for aLT

og 200 000 til 600 000 for LT-kompleks.

In vitro har lymfotoksiner evne til å

a) forhindre den maligne transformasjon av celler (se Evans et al., Int. J. Cancer 21_, 45-49 (1981) og Ransom et al., J. Nati. Cancer Inst. 69, 741-744 (1982)), b) virke cytostatisk eller til og med cytolytisk på tumorceller (se Evans et al., Immunopharmacology 3, 347-359 (1981)) og c) øke tumorcellers ømfintlighet overfor organismens cellulære immunforsvar (se Evans et al., Cell. Immunol. S_ 3, 1-15 (1981) og

Ransom et al., Int. J. Cancer 29, 451-458 (1982)).

Videre er det kjent fra litteraturen at lymfotoksinprepa-rater kan føre til regresjon av tumorer i forsøk med dyr (se Khan et al., Proe. Soc. Exptl. Biol. Med. 169, 291-294 (1982)).Lymfotoksin har derfor stor betydning for forebyggelse og behand-ling av ondartede sykdommer.

De fremgangsmåter for utvinning av lymfotoksiner som hittil er blitt gjort kjent, går i de fleste tilfeller ut fra primære celler, f.eks. fra leukocytt-preparater av perifert blod eller tonsiller fra mennesker (se Williams et al., J. Immunol. 130, 518-520 (1983)), fra miltceller fra mus (se Aksamit et al., Infect. Immun. 3$, 1028-1035 (1982) og Trivers et al., J. Immunol. 117, 130-135 (1976)) eller fra leukocytter fra bukhulen hos syriske hamstere eller marsvin,,'(se eksempelvis Evans et al., Int. J. Cancer 2J_, 45-49 (1981)). Her må cellene først initieres til fremstilling av lymfotoksiner ved inkubasjon med høymolekylæ-re mitogener, f.eks. fytohemagglutinin. Så kunne det da i dyrk-ningsvæsken fra B-lymfocytt-cellelinjer tidligere bare påvises liten lymfotoksin-aktivitet (se Granger et al., J. Immunol. 104, 1476 (1970) og Amino et al., J. Immunol. 113, 1334-1345 (1974)).

Ettersom det ved de tidligere anvendte fremgangsmåter for fremstilling av lymfotoksiner bare kunne fremstilles små mengder og bare i dårlig renhet, kunne de hittil fremstilte lymfotoksiner bli stilt til rådighet hverken i en til homogenitet renset form eller i tilstrekkelig store mengder for omfangsrike under-søkelser av den antineoplastiske virkning i dyreforsøk. Videre kunne det tidligere heller ikke påvises noen biologisk aktiv lymfotoksin-mRNA; dette er dog forutsetning for den molekylære kloning av lymfotoksin-genet ved hjelp av genteknologiske fremgangsmåter.

Til grunn for den foreliggende oppfinnelse lå det således den oppgave å fremstille lymfotoksin samt lymfotoksin-mRNA i tilstrekkelig stor mengde og renhet.

Ifølge oppfinnelsen er det nå funnet at celler av den såkalte T-lymfocytt-typen hos apekatter, særlig slekten Saguinus,

for eksempel cellelinjene L-77/5, A651, A2543, 70N2, 1022 og 1670, fortrinnsvis dog cellelinjene 1022 og 1670, som ved infek-sjon med virus, fortrinnsvis med herpesvirus som herpes virus saimiri eller herpes virus ateles, transformeres in vitro eller in vivo og gjøres skikket til permanent dyrking i kultur, produ-serer betydelige mengder lymfotoksin og lymfotoksin-mRNA spontant, dvs. uten ytterligere induksjon, i et passende dyrkingsmedium.

Videre ble det funnet at ved tilsetning av en såkalt stimulator til dyrkningsmediet, f.eks. en fra litteraturen kjent tumorpromoter som et diterpen-derivat, fortrinnsvis av tiglian- eller dafne-type, f.eks. mezerein eller en ester av forbol, fortrinnsvis 12-0-tetradekanoylforbol-13-acetat (se Diamond et al., Advances in Cancer Research Vol. 32, side 1-74, Academic Press 1980 og Hecker, Carcinogenesis Vol. II, Mechanisms of Tumor Promotion and Cocarcinogenesis, side 11-48, Raven Press, New

York 19 78), ved en konsentrasjon på 1-1000 ng/ml, ble produksjonen av lymfotoksin og av lymfotoksin-mRNA ytterligere økt.

Som dyrkingsmedier kommer her de vanlige serumfrie og serum-holdige dyrkingsmedier i betraktning, eksempelvis "Eagle's Minimum Essential Medium" eller "Roswell Park Memorial Institute Medium 1640" (RPMI1640), som eventuelt kan tilsettes serumet fra kalvefoster og antibiotika, fortrinnsvis inntil 10 % serum fra kalvefoster, penicillin og streptomycin.

Ved fremstillingen av lymfotoksinproteiner utføres fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis på den måten at transformerte celler, etter tilsetning av 10 til 100 ng/ml 12-0-tetra-dekanoylforbol-13-acetat eller mezerein som stimulator, holdes i et serumholdig, under bestemte betingelser også i et serumfritt dyrkingsmedium, f.eks. i RPMI 1640, i 1 til 7 dager, fortrinnsvis dog i 3 til 4 dager, og at det således dannede lymfotoksin deretter separeres fra dyrkingsvæsken etter en i og for seg kjent fremgangsmåte, konsentreres og renses. Denne fremgangsmåten ut-føres imidlertid særlig fordelaktig ved at cellene etter formering i et serumholdig medium i begynnelsen, overføres til et ser-umfattig, fortrinnsvis serumfritt medium.

Ved fremstillingen av lymfotoksin-mRNA gjennomføres fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis på den måten at transformerte celler etter tilsetning av 10-100 ng/ml 12-0-tetra-dekanoylforbol-13-acetat eller mezerein som stimulator, inkuberes i et serumholdig dyrkingsmedium, f.eks. i RPMI 1640 og med 10 % serum fra kalvefoster, i 6-48 timer, fortrinnsvis 12-24 timer, hvoretter cellene fraskilles og mRNA isoleres på i og for seg kjent måte etter ødeleggelse av cellene.

Ved isoleringen av det således dannede celledyrkingsproduk-tet har, for rensingen av det således erholdte lymfotoksinet, kromatograferingen over porekontrollert glass som for første gang ble anvendt, og ekstraksjonen av lymfotoksin-mRNA for eksempel med fenol etter ødeleggelse av cellemembranen og fjern-ing av cellekjernen, vist seg særlig egnet.

Den videre rensing av lymfotoksinet skjer eksempelvis ved hjelp av HPLC.

Det således erholdte lymfotoksin med en molekylvekt på

60 000 _+ 15 % er egnet til forebyggelse og bekjempelse av tumorceller, f.eks. i en vandig isoton oppløsning.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse har de føl-gende fordeler sammenlignet med teknikkens stand:

1. Det anvendes en homogen cellepopulasjon med ubegrenset levedyktighet hvor formeringen kan utvides til en hvilken som helst målestokk, 2. lymfotoksin-produksjonen i disse kulturene skjer spontant, dvs. at ingen høymolekylære mitogene stoffer tilsettes, 3. produksjonen av lymfotoksin kan økes ytterligere ved tilsetning av lavmolekylære stimuleringsmidler, 4. produksjonen av lymfotoksin kan skje i serumfritt medium med høye utbytter; man får følgelig et fremragende utgangsmate-riale for den videre proteinkjemiske rensing og 5. den fra cellene isolerte RNA oppviser umiddelbart påvisbar lymfotoksin-mRNA-aktivitet og utgjør derved et fremragende ut-gangsmateriale for den videre anrikning av denne mRNA, noe som

igjen utgjør en vesentlig forutsetning for den molekylære kloning av mRNA. Den klonede apekatt-lymfotoksin-mRNA kan igjen anvendes som prøveforbindelse for isoleringen av den homologe humane lymfotoksin-mRNA henholdsvis det tilsvarende gen etter kjente fremgangsmåter.

De følgende eksempler skal forklare foreliggende oppfinnelse nærmere, dog uten å begrense den:

EKSEMPEL 1

Fremstilling av lymfotoksin ved hjelp av herpesvirus-transformerte ape- T- lymfocytt- cellelinjer

De anvendte lymfoide cellelinjer ble inkubert i "Roswell

Park Memorial Institute Medium 1640" (RPMI 1640) med tilsetning i av 10 % kalvefosterserum, penicillin og streptomycin i stasjonær kultur ved 37°C under en atmosfære på 95 % luft og 5 % karbondi-oksyd, og fortynnet tre ganger ukentlig med friskt medium. I alle eksperimentene ble kulturer med stor celletetthet fortynnet 1:2 til 1:3 med friskt medium, på den neste dag fortynnet 1:3 nok en gang og av og til ble 5 ml overført til en dyrkingsflaske. Dyrkingsvæsken ble utvunnet ved sentrifugering etter 3 dager, nedfrosset og lagret ved -20°C inntil den skulle testes.

Tabellen nedenunder inneholder lymfotoksinaktivitetene som ble funnet i tre forskjellige dyrkingsvæsker for hver cellelinje:

Litteraturhenvisninger:

A = Fleckenstein et al., Int. J. Cancer 19, 546-554 (1977)

B = Abb et al., Cancer Immunol. Immunother. 9, 219-226 (1980) C = Falk et al., Bacteriol. Proe. 38, 191 (1972)

D = Johnson et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78, 6391-6395

(1981) E = Kaschka-Dierich et al., J. Virol. 44, 295-310 (1982) Oversiktsartikkel: Fleckenstein, Biochem. Biophys. Acta 560, 301-342 (1979).

For fremstilling av større cellemengder ble det anvendt omrørte kulturer istedenfor stasjonære kulturer. Til det ble cellene (for eksempel cellelinjen 1670) dyrket for eksempel i RPMI 1640-medium med tilsetning av 10 % kalvefosterserum i

1- eller 2-liters Erlenmeyer-kolber på rotasjonsrystere (0,5 1 kultur pr. 1 liters-kolbe; 1 liter kultur pr. 2 liter-kolbe; 40 omdreininger pr. minutt; 37°C i normal atmosfære) og fortynnet i forholdet 1:2 til 1:3 tre ganger ukentlig med friskt dyrkingsmedium. På denne måten er produksjonen av dyrkingsvæske i størrelsesorden på 10-100 1 ukentlig uten videre mulig.

Produksjonen av lymfotoksin i 16 70-celler var bortimot stabil over lange tidsrom: etter 9 måneder i kontinuerlig kultur kunne det ikke fastslås noen betydelig reduksjon i lymfo-toksinaktivitet i dyrkingsvæskene.

Karakterisering av lymfotoksin:

a) Til den biologiske påvisningen av lymfotoksin-aktivitet ble følgende påvisningsmetode anvendt (modifisert etter Trivers et a., J. Immunol. 117, 130-135 og Evans, Cell. Immunol. 63, 1-15 (1981)): Transformerte museceller av cellelinjen L929 ble dyrket over natten med 1 mikroCurie 3H-thymidin/ml dyrkingsmedium (fortrinnsvis "Eagle's Minimum Essential Medium" med 10 % kalvefosterserum), deretter trypsinbehandlet og suspendert i friskt dyrkningsmedium med 5 % kalvefosterserum. 0,5 ml av denne suspensjonen med ca. 30 000 celler ble pipettert over i dyrkingsskåler (diameter 16 mm) og inkubert i 3-6 timer. Deretter ble det utført seriefortynninger på prøvene som skulle testes og det ble inkubert i 3 dager (alle inkubasjoner ved 37°C).

Til slutt ble radioaktiviteten i dyrkingsvæsken målt i væske-scintiliasjonsteller.

Fig. 1 viser påvisningen av lymfotoksin-aktivitet i en dyrkingsvæske fra 1670-celler. Hver fortynning ble testet parallelt i 4 dyrkingsskåler. Bare gjennomsnittsverdiene ble angitt, standardavviket utgjorde ved de første tre fortynninge-ne 3-4 %, ved den høyeste fortynning 6 %. Dyrkingsvæsken som ble brukt i dette forsøket, ble nedfrosset i mer enn hundre am-puller og brukt som referanse-standard i alle lymfotoksinprøve-ne; dens aktivitet ble vilkårlig fastslått til 100 referanse-enheter pr. milliliter (RE/ml).

Til sammenligning ble dyrkingsvæsker fra en rekke T-lymfocytt-cellelinjer fra menneske (MOLT-4, 1301, JURKAT, Karpas-45, CCRF-CEM og CCRF-HSB-2) undersøkt i den ovenfor nevnte biologiske lymfotoksinprøven. Ikke i noen av tilfellene kunne det påvises en betydelig økning i frigjøringen av 3H-thymidin i forhold til ikke behandlede kontroller.

b) Den fysikalsk-kjemiske karakterisering av lymfotoksinakti-vitet i dyrkingsvæske fra cellelinje 1670 ble foretatt ved hjelp

av følgende forsøk:

Stabilitet overfor varmebelastning

Stabilitet overfor sur pH-verdi

Stabilitet overfor nedfrysing/opptining

Stabilitet overfor natriumdodecylsulfat (SDS)

Stabilitet overfor reduserende midler (2-merkaptoetanol) Molekylvektbestemmelse ved høytrykksvæske-kromatografi (HPLC)

Den følgende tabell viser resultatet av stabilitetsprøvingen:

Aktiviteten er svært stabil overfor merkaptoetanol, overfor oppvarming og flere perioder med nedfrysing/opptining, ogødelegges fullstendig ved pH 2 i løpet av 24 timer.

Forsøkene vedrørende varme- og pH-stabilitet samt stabilitet overfor nedfrysing/opptining ble gjennomført med standard-dyrkingsvæsken fra ubehandlede 16 70-celler i nærvær av 10 % kalvefosterserum. De øvrige to forsøkene ble gjennomført med en dyrkingsvæske som var oppkonsentrert og anriket over porekontrollert glass (se eksempel 4) av med mezerein (20 ng/ml; se eksempel 4) behandlede 1670-celler (proteininnhold 1-2 mg/ml), som etter inkubasjonen med SDS henholdsvis merkaptoetanol ble fortynnet 50 ganger med komplett dyrkingsmedium (10 % kalve-serum) .

Molekylvekten til lymfotoksin fra 16 70-celler ble bestemt

ved høytrykks-væske-kromatografi (HPLC - se fig. 2).

200 mikroliter av en over porekontrollert glass oppkonsentrert dyrkingsvæske fra ubehandlede 1670-celler ble separert ved hjelp av HPLC på et anlegg fra WATERS (2 kolonner 1-125; 20 mM natriumfosfat pH 7, 1 M NaCl, 0,1 % "Tween 20" (polyoksy-etylen-sorbitan-monolaureat, n = 20, molekylvekt: ca. 1200),

25 % (v/v) propylenglykol; 0,5 ml pr. minutt).

0,5 ml store fraksjoner ble samlet opp og testet. Som kalibreringsproteiner for bestemmelse av molekylvekten ble serumalbumin, ovalbumin, trypsinogen og lysozym separert i det samme systemet. Analysen viste en eneste aktivitetstopp ved en molekylvekt på 60 000 + 15 %.

c) Den veksthemmende virkningen av dyrkingsvæsker fra cellelinje 1670 ble undersøkt på en rekke transformerte (tumor-)

cellelinjer. I disse forsøkene ble tumorcellene (dyrket i "Eagle<1>s Minimum Essential Medium" med 10 % kalvefosterserum, penicillin og streptomycin) plassert i kulturskåler (50 000 celler pr. skål med 3 cm diameter) og 1 time senere tilsatt medium eller standard-dyrkingsvæsken fra cellelinje 16 70 (sluttkon-sentrasjon 16 RE/ml; 3 ml/skål). Celletallet pr. skål ble bestemt etter 3 eller 4 dagers inkubering ved 37°C (i alle for-søkene ble 2 skåler tilsatt lymfotoksin henholdsvis medium parallelt). For tre cellelinjer ble celleantallet bestemt daglig. Resultatene er gjengitt i den følgende tabell henholdsvis i fig. 3:

Dette viser at dyrkingsvæske fra 16 70-celler kan hemme formeringen av tumorceller hos forskjellige arter. Denne egen-skapen er karakteristisk for lymfotoksin (Evans, Cancer Immunol. Immunother..12, 181-190 (1983)); den adskiller denne gruppen proteiner spesielt fra interferoner, som likeens kan hemme veksten av tumorceller, men som vanligvis er arts-spesifikk, idet særlig humaninterferon er svært lite eller overhodet ikke aktiv overfor museceller.

De ovenfor nevnte transformerte T-lymfocytt-cellelinjene fra menneske samt (tumor-)cellelinjene er kjent fra litteraturen .

Cellelinjen 1670 ble 28. mars 1984 deponert ifølge regel

28 i den europeiske patentkonvensjon under nummer 1-294 hos "Collection nationale de cultures de microorganismes (C.C.C.M.), Institut Pasteur, Paris".

Eksempel 2

Økning av lymfotoksin-produksjonen i ape-T-lymfocytt-cellelinjer med diterpen- forbindelser

Kulturer med stor celletetthet ble fortynnet 1:2 til 1:3 med friskt medium, fortynnet 1:3 nok en gang den neste dag og den samme stamkulturen ble fordelt i tre kolber med 5 ml i hver. Stimuleringsmidlet ble tilsatt (stamoppløsning 100 mikrogram pr. milliliter i dimetylsulfoksyd) t og kulturene ble inkubert i 3 dager. Deretter ble cellene fjernet ved hjelp av sentrifugering, supernanten ble nedfrosset og oppbevart ved -20°C inntil lymfotoksinprøven.

Den følgende tabell viser virkningen av to utvalgte diterpen-tumorpromoterer, nemlig 12-0-tetradekanoyl-forbol-13-acetat (TPA) og mezerein, på lymfotoksinproduksjonen i utvalgte T-lymfocytt-cellelinjer fra ape:

Eksempel 3

Fremstilling av lymfotoksin i serumfritt medium

Etter formeringen av celler i serumholdig medium (analogt med eksempel 2) ble cellene overført til serumfritt medium.

Tabellen nedenunder viser en sammenligning mellom lymfo-toksinproduksjon i 16 70-celler analogt med eksempel 1 i serumholdig og serumfritt medium i nærvær av 20 ng mezerin/ml:

Proteinbestemmelsen ble gjennomført etter fremgangsmåten til Bradford (se Anal. Biochem. 72, 298 (1976)).

Eksempel 4

Oppkonsentrering og rensing av lymfotoksin fra 16 70-celler ved kromatografering over kolonner av porekontrollert glass 16 70-celler ble dyrket i RPMI-1640-medium med 10 % kalvefosterserum i roterende Erlenmeyer-kolber (0,5 liter kultur i en 1 liters kolbe, rotasjonshastighet 40 omdreininger pr. min.). Celler fra godt voksende kulturer ble utvunnet ved sentrifugering, vasket og på nytt suspendert i serumfritt RPMI-1640-medium med tilsetning av 20 ng/ml mezerein. Suspensjonen ble oppbevart i 3 dager i 150 cm 2 dyrkingsflasker av plast (200 ml pr. flas-ke) , deretter ble dyrkingsvæsken utvunnet ved sentrifugering og filtrering.

Den således fremstilte dyrkingsvæske ble kromatografert over 10 ml porekontrollert glass (porediameter; 350 Ångstrom, partikkelstørrelse: 120-200 mesh; kolonnediameter: 9 mm, strømningshastighet: 140 ml/time). Deretter ble kolonnen vasket med 10 mM natrium-fosfatpuffer pH 7,2/1,5 M NaCl og til slutt eluert med den samme puffer i 50 % etylenglykol (volum/volum).

Den følgende tabell gjengir resultatene av to således gjennomførte forsøk:

Eksempel 5

Påvisning av lymfotoksin-mRNA-aktivitet i RNA-preparater fra 1670- og 1022- celler

Cellene ble suspendert i 800 ml celledyrkingsmedium med

10 % kalvefosterserum ved en celletetthet på ca. 5 x 10 5 celler/ml og tilsatt 20 ng mezerin/ml. 20 timer senere ble cellene høstet ved sentrifugering, vasket i en passende buffer (f.eks. 10 mM Tris.HCl pH 7,4, 140 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2) og suspendert i 10 ml lyseringsbuffer (f.eks. 10 mM Tris.HCl pH 8,4, 140 mM NaCl, 1,5 mM MgCl-, 0,5 % "Nonidet-P 40" [ikke-ionisk Detergens ]). Etter 10 minutter lang inkubering i is-bad ble suspensjonen rystet en kort stund og cellekjernene fjernet ved sentrifugering. Fra supernatanten fra sentrifugeringen (= cytoplasma) ble RNA isolert ved en i og for seg kjent fremgangsmåte, f.eks. ved ekstraksjon med fenol (se Aviv et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69, 1408-1412 (1977)). RNA ble

til slutt oppløst i vann (konsentrasjon ca. 3-5 mg/ml) og

translatert i oocytter Xenopus laevis ved i og for seg allerede kjent fremgangsmåte (se eksempelvis Colman et al., Cell 17, 517-526 (1979), Hitchcock et al., Anal. Biochem. 109, 338-344

(1980) og Contreras et al., Anal. Biochem. 113, 185-187 (1981)). Translasjonsproduktene ble etterkontrollert i den biologiske prø-ven på deres lymfotoksin-aktivitet.

Den følgende tabell viser den cytotoksiske aktivitet som ble funnet i oocytt-dyrkingsvæske sammenlignet med RNA-preparater fra M0LT-4-celler, en human T-lymfocytt-cellelinje hvis dyrkingsvæsker ikke oppviser noen påvisbar lymfotoksin-aktivitet, samt dyrkingsvæsker fra ubehandlete oocytter:

Tabellen viser at alle tre RNA-preparatene fra 16 70-celler samt et RNA-preparat fra 1022-celler i opp til 14 7 gangers fortynning bevirker en signifikant økning i frigitt radioaktivitet, mens RNA fra M0LT-4-celler ikke oppviser noen slik aktivitet. Disse forsøkene viser at det i RNA-preparater fra 1670- og 1022-celler finnes biologisk aktiv lymfotoksin-mRNA.

Claims (13)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av lymfotoksin eller lymfotoksin-mRNA, karakterisert ved at ape-T-lymfocytter som er transformert med virus, dyrkes i et egnet medium i kontinuerlig kultur og at lymfotoksinet eller lymfotoksin-mRNA isoleres etter i og for seg kjente metoder.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som virus anvendes herpesvirus, fortrinnsvis herpesvirus saimiri eller herpesvirus ateles.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som ape-T-lymfocytter anvendes celler fra slekten Saguinus.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at det som T-lymfocytt-cellelinje anvendes cellelinjen 1022, 1670, 70N2, L77/5, A651 eller A 2543.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3. karakterisert ved at det som T-lymfocytt-cellelinje anvendes celle- ' linjen 1022 eller 1670 .

6. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 5, karakterisert ved at dyrkingsmediet tilsettes opp til 10 % kal-vef osterserum .

7. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 6, karakterisert ved at dyrkingsmediet for produksjonsstimulering tilsettes lavmolekylære tumorpromoterer, fortrinnsvis diterpener, særlig av dafne-, ingelan- og tigliantype, eller indolalkaloider.

8. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 7, karakterisert ved at det for stimulering av lymfotoksinproduksjonen under inkubasjonen tilsettes som tumorpromoter en ester av forbol eller mezerein i en konsentrasjon på 1-1000 ng/ml, fortrinnsvis 10-100 ng/ml.

9. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 7, karakterisert ved at det for stimulering av lymfotoksinproduksjonen under inkubasjonen tilsettes som tumorpromoter en ester av forbol eller mezerein i en konsentrasjon på 1-1000 ng/ml, fortrinnsvis 10-100 ng/ml.

10. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 8, karakterisert ved at cellene overføres til cellefritt medium etter formering av cellene i. serumholdig medium.

11. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 8 og 10. karakterisert ved at lymfotoksinet separeres fra dyrkingsvæsken etter 1 til 7 dager, fortrinnsvis etter 2 til 4 dager.

12. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 8, 10 og 11, karakterisert ved at lymfotoksinet anrikes over en kolonne med porekontrollert glass.

13. Fremgangsmåte ifølge kravene 1 til 7 og.9, karakterisert ved at cellene inkuberes i et dyrkingsmedium som inneholder kalvefosterserum, og at lymfotoksin-mRNA isoleres fra cellene etter 3 til 48 timer, fortrinnsvis etter 6 til 24 timer.