NO843464L - Syntetisk varmestabilt enterotoxin-polypeptid av escherichia coli og multimerer derav - Google Patents

Description

Krysshenvisning til beslektet søknad

Foreliggende søknad er en "continuation-in-part" av søknad 455 265 innlevert 3. januar 1983.

T eknisk område

Foreliggende oppfinnelse angår et syntetisk polypeptid svarende til varmestabilt enterotoxin av Escherichia coli,

og nærmere bestemt syntetiske polypeptider og multimerer derav som omfatter prinsipale determinantområder som er ansvarlige for antigenisiteten av det E. coli varmestabile enterotoxin.

Kjent teknikk

Akutte diaréiske sykdommer grunnet skiftende koloniser-ing i tynntarmen av enterotoxigene stammer av Escherichia coli (E. coli eller ETEC) er et stort helseproblem av global måle-stokk både for mennesker og husdyr. Disse organismer, sammen med rotavirus, er den prinsipale årsak til den ofte fatale akutte diaré som er vanlig blant barn som lever i underut-viklede land og blant nyfødte dyr, i særdeleshet lam og små-gris. ETEC—stammer er også den vanlige årsak til akutt diaré blant personer fra tempererte soner som reiser til tropene og kan være ansvarlige for sporadiske eller epidemiske episoder med diaré blant barn og voksne som lever enten i tempererte eller tropiske områder.

Sykdommen fremkalt av ETEC, formidles ved frigivelse

av to enterotoxiner, enten alene eller sammen. Det høy-molekylære, antigeniske varmelabile toxin (LT) er blitt renset til homogenitet, og dets subenhetstruktur er blittkarakterisertsom fem B-subenheter som binder holotoxinet til de spesifikke GM^gangliosidreseptorer på slimhinneoverflaten,

og en enkel A-subenhet som stimulerer intracellulær adenylat-cyclaseaktivitet som således fremkaller væske og elektrolytt-sekresjon.

Det lavmolekylære, varmestabile toxin (ST) som dannes av ETEC-stammer av human eller svineopprinnelse, er også nylig blitt renset. Preparater av ST har et relativt høyt innhold av halv-cystin, fremkaller sekresjon med stimulering av guanylatcyclase og er hapteniske som fastslått ved deres kapasitet til å danne en antitoxinrespons i dyr immunisert med toxinet koplet til en høymolekylær bærer.

Den mest praktiske løsning for forhindring av ETEC-fremkalt diaré ville være et immuniseringsprogram som gir beskyttelse mot heterologe ETEC-serotyper som produserer enten den ene eller både LT- eller ST-enterotoxinene. Immunisering med enten biologisk LT- eller biologisk ST-toxin fremkaller en antitoxinrespons i forsøksdyr som beskytter mot homologe og heterologe serotyper av stammer som danner det spesifikke toxin anvendt for immunisering. Immunisering med LT-heltoxin eller dens B-subenhet gir beskyttelse mot levedyktige heterologe stammer som produserer dets toxin alene (LT+/LT ) eller sammen med ST (LT<+>/ST~), men ikke mot de som danner bare ST (LT~/ST<+>).

Immunisering med biologisk ST koplet til en høymolekylær bærer dannet serum-antistoffer som passivt nøytraliserer den sekretoriske effekt ved diegivende musemodell av ST produsert av heterologe stammer. Immunisering gir også beskyttelse mot direkte utfordring med levedyktige heterologe LT /ST+, men ikke LT-produserende stammer. Ingen av disse toxiner er imidlertid egnet for immunisering når de gies alene på grunn av deres toksisitet, deres sviktende evne til å gi beskyttelse mot stammer som produserer den andre toxinform, og det faktum at de høymolekylære bærere som er blitt anvendt for å gjøre det hapteniske biologiske ST-molekylantigenisk, er uegnet for human bruk.

Klipstein et al., Infect. Immun., 37:550-557 (1982) har rapportert utvikling av en vaksine fremstilt ved konjugering av det biologiske ST-toxin til LT-toxinet ved hjelp av carbo-diimidreaksjonen. Som et resultat av denne reaksjon oppnår biologisk ST antigenisitet når det koples til den høymole-kylære LT-bærer, men begge tverrbundne toxiner bibeholder mesteparten av sin antigenisitet, men mister mesteparten av sine toksiske egenskaper. Rotter immunisert med den således fremstilte vaksine, ble sterkt beskyttet mot utfordring med enten LT eller biologisk ST og med levedyktige ETEC-stammer

som produserer disse toxiner.

Et halv—rent preparat av biologisk ST ble anvendt for denne vaksine på grunn av det relativt lave utbytte av rent biologisk ST erholdt ved de tilgjengelige renseteknikker som innbefatter flere kromatografiske separasjonstrinn. Innbe-fattelse av det heterogene materiale i vaksinen kan imidlertid utelukke dets anvendelse for humanimmunisering.

Foreliggende oppfinnelse som angår syntetisk fremstilt ST, har overvunnet problemet med anvendelse av ST avledet fra naturlige kilder ved at syntetisk ST kan fremstilles i store mengder og i renset form og har egenskaper lik de som er beskrevet for rent ST erholdt ved bakteriedyrkning av en human ETEC-stamme. [Staples et al., J.Biol. Chem., 255:4716-4721

(1980); og Chan et al., J. Biol. Chem., 256:7744-7746 (1981)].

Minst to typer av ST er blitt identifisert ved sine fysikalske egenskaper. Den første type kjent som ST I (også angitt som STa) er løselig i methanol og er aktiv ved diegivende musemodell. Den andre type, ST II (også angitt som STb) er methanoluløselig og ikke aktiv i diegivende musemodell, men er aktiv i tester på ombundne griseileumsløyfer.

Blant ST I-polypeptidene er minst tre lignende polypeptider eller determinantområder av disse polypeptider, blitt identifisert, og deres aminosyresekvenser er blitt bestemt. Disse tre typer av ST I er her angitt som (i) ST Ia som først ble funnet i en okse E. coli-stamme og hvor en del av denne også er innkodet i grisestammer, (ii) den som angis som ST Ib fra et humant isolat av E. coli og, (iii) ST Ic også isolert fra human-infiserende E. coli.

Den nucleotidsekvens som koder for ST Ia-polypeptidet,

er blitt bestemt. Oversettelse av nucleotidsekvensen til en polypeptid-aminosyresekvens fører til et polypeptid som inneholder 72 aminosyrer avsluttet ved carboxyenden med en tyrosin-gruppe [So et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77:4011-4015

(1980)]. ST Ic-polypeptidet er også antatt å inneholde 72 aminosyrer såvel som flere områder som er homologe med ST Ia-polypeptidet. ST Ib-polypeptidet er rapportert å inneholde bare 18 aminosyrer [Chan et al., J. Biol. Chem., 256:7744-7746 (1981)]. De 18 aminosyrer i ST Ib-polypeptidet (18-mer) utviser stor homologitet med aminosyrer 55 til 72 for polypeptidet av ST Ia. Den homologe, praktisk talt identiske region er illustrert i det etterfølgende som starter ved aminosyre nr. 55 fra venstre til høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden av ST Ia-polypeptidet:

Nylige rapporter av Takeda et al., Abstracts, 19th Joint Conference US-Japan Cooperative Medical Science Program, Cholera Panel (^where&when&other info<**>), 87-88 (1983)

og Ikemura et al., Chem. Letters, (Chem. Soc. Japan), 101-104

(1983) har indikert nærvær av ytterligere polypeptid-sekvenser for dette 18-mer-polypeptid. Disse forskere anga ST-molekylet erholdt fra humane og svinestammer av ETEC som ST^ og STp. Aminosyrerestsekvensene angitt av disse forskere, fra venstre til høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden, er:

Som det fremgår fra en sammenligning mellom begge de ovenfor angitte sett av sekvenser, dvs. ST, Ia, ST Ib, ST^og STp, deles en stor grad av homologitet mellom de 14 car-boxyenderester i hver av de viste fire sekvenser.

Disse forskere har også beskrevet en syntese for ST^. Oppløsningsmetoder ved syntesen ble anvendt for å fremstille det blokkerte polypeptid. Blokkerende grupper ble fjernet med hydrogenfluorid, og Cys-mercaptogrupper (thioler) ble luftoxydert. Luftoxydasjonen ble utført til en polypeptid- konsentrasjon på 10 5molar i destillert vann justert til en pH-verdi på 8,0 med vandig ammoniakk. Oxydasjonen ble fortsatt inntil de frie thiolgrupper forsvant.

Biologisk aktivitet av det syntetiske ST^ved den diegivende museprøve ble rapportert å være den samme som for naturlig toxin. Toksisiteten av det syntetiske materiale ble angitt å være nøytralisert av antisera mot det naturlige toxin.

Undersøkelse av de ovenfor fire 18-aminosyre-polypeptid-sekvenser viser også at 6 halv-cystin-(Cys) rester er tilstede. Oxydasjon av disse halv-cystinrester til cystinrester inneholdende intramolekylære disulfidbindinger i det naturlig forekommende enterotoxin, er antatt å tilføre materialet dets observerte varmestabilitet.

Det skal imidlertid ennvidere bemerkes at selv om cystin-disulfidbindinger er kjent for å være tilstede i biologisk ST, er det ikke kjent hvilke par av halv-cystinrester som kombineres under dannelse av de tre disulfidbindinger som er tilstede i det naturlige ST-molekyl. Disse tre disulfidbindinger kan teoretisk være dannet fra 15 forskjellige kombinasjoner av de 6 tilstedeværende Cys-rester.

Staples et al., supra, har vist at disulfidkjedene i biologisk ST er nødvendige for biologisk aktivitet av toxinet. Kjemisk reduksjon under dannelse av halv-cystiner eller per-maursyreoxydasjon til cysteinsyre ble vist å ødelegge den biologiske aktivitet av toxinet. I tillegg har Chan et al., supra, rapportert at de første 4 rester fra aminoenden av de homologe 18-aminosyrer av den ovenfor angitte sekvens av ST Ib ikke er nødvendig for biologisk aktivitet. Således ble biologisk aktivitet erholdt fra det aminosyreholdige polypeptid omfattende de ovenfor angitte 14 carboxyende-aminosyrer og deres disulfidbindinger.

Aimoto et al., Biochem. Biophys. Res. Chem., 112:320-326 (april 15, 1983) har rapportert syntesen av de 14 carboxyende-aminosyrerester av de ovenfor beskrevne ST^. Dette syntetiske molekyl ble angitt å ha biologisk aktivitet som var 2-5 ganger aktiviteten av naturlig ST^på molarbasis, under

anvendelse av den diegivende musebestemmelse.

Ved en muntlig presentasjon 29. august 1982 av Duflot et al., Proceedings European Peptide Symposium:683-686, publisert i Berlin i juni 1983, rapporterte disse forskere syntesen av et svine- og humant ST 18-mer-polypeptid som har sine Cys-mercaptogrupper blokkert (S-blokkert) med acetamido-methylgrupper. Disse aminosyrerestsekvenser ble påstått å være identiske med sekvensene rapportert av So et al., supra, for ST Ia og av Chan et al., supra, for ST Ib. Imidlertid var den 7. aminosyrerest fra aminoenden av sekvensene rapportert av Duflot et al., en glycinrest (Gly), mens denne rest i de ovenfor beskrevne sekvenser er en glutaminsyrerest (Glu).

Duflot et al. rapporterte at immunisering av mus eller kaniner med deres S-blokkerte svine ST-toxin koplet til tetanus toxoid eller ovalbumin ga antistoffer som erkjente de naturlige eller de syntetiske toxiner like godt. Hovedsakelig ingen biologisk aktivitet ved den diegivende musebestemmelse ble rapportert for det S-blokkerte, svine-, syntetiske polypeptidtoxin. Disse forfattere anga at mangelen på biologisk aktivitet skyldtes fravær av intramolekylære disulfidbindinger i det S-blokkerte molekyl, hvilket er i overensstemmelse med den tidligere rapport av Staples et al., supra.

S ammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår et syntetisk polypeptid som har en antigenisitet som en fri monomer eller som en multimer, som er minst 10% av aktiviteten av biologisk E. coli varmestabilt enterotoxin (ST). Det syntetiske polypeptid innbefatter aminosyrerestsekvensen tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden, representert ved formelen:

hvori de 3 spesifikke aminosyrerester i parentes hver er et alternativ til den umiddelbart foregående aminosyrerest i sekvensen;

a-f og g-1 er hele tall som hver har en verdi på 0 eller 1, forutsatt at hvis verdien av hvilke som helst av a-f eller g-1 er 0/ er den tilsvarende R 1—6 _— eller R 7—1, 2-gruppe fraværende, og når en R ..-gruppe er fraværende, danner svovelatomet i Cys-resten som har en fraværende RSLI^-gruppe, en cystindisulfidbinding, mens når verdien av a-f eller g-1

1—6 7—12

er 1, er den tilsvarende Ra_f~ eller Rg_i -gruppe tilstedeværende;

hvor Ra^ —x^-gruppene når disse taes individuelt, er like eller forskjellige grupper bundet til svovelatomet i Cys-restene og er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, en alkylgruppe inneholdende 1-4 carbonatomer, en substituert alkylgruppe inneholdende 2-20 carbonatomer, en acylgruppe inneholdende 1 til 8 carbonatomer, og en substituert acylgruppe inneholdende 2-10 carbonatomer;

7-12 Rg_l -gruppene er like eller forskjellige alternative aminosyrerester til hver av den umiddelbart foregående Cys-rest; minst to av a-f og to av g-1 er 0 og to Cys-rester er tilstede forutsatt at det syntetiske polypeptid inneholder minst én intramolekylær cystindisulfidbinding dannet fra minst to tilstedeværende Cys-rester; og

"m" er et helt tall med verdien 0 eller 1 forutsatt at hvis "m" er 0, er R 13 fraværende, og hvis "m" er 1, er R<13>valgt

m m fra gruppen bestående av en kjede inneholdende 1 til 54 amino-

syrerester, en kjedende gruppe, og acyldelen av en carboxylsyre inneholdende 1 til 20 carbonatomer som danner en amidbinding med aminet av aminoenderesten.

I monomer form er den ovenfor angitte, i det minste ene disulfidbinding, en intramolekylær cystindisulfidbinding dannet mellom i det minste to Cys-rester tilstedeværende i det antigeniske polypeptid. Når det antigeniske polypeptid er i multimer form som inneholder et flertall av polypeptid-repeterende enheter, kan den ovenfor angitte, i det minste ene disulfidbinding være et intramolekylært cystindisulfid dannet mellom i det minste to Cys-rester tilstedeværende i hver polypeptid-repeterende enhet, eller disulfidbindingen kan være et intramolekylært cystindisulfid dannet mellom en av i det minste to Cys-rester tilstedeværende i en første repeterende enhet og en annen av i det minste to Cys-rester tilstedeværende i en andre repeterende enhet. Hvorvidt cystin-disulf idbindingen foreligger i monomere eller multimere former, er denne intramolekylær. I det monomere ST er imidlertid disulfidbindingen en intrapolypeptidbinding, mens disulfidbindingen i multimere ST-utførelsesformer kan være en intrapolypeptid- eller interpolypeptidbinding.

Det ovenfor angitte antigeniske polypeptid kan anvendes i dets monomere form alene slik som når det anvendes i en diagnose hvor konkurrerende bindingsbestemmelser utføres, eller mer foretrukket som et monomert immunogen av en vaksine når det konjugeres til et bærermolekyl slik som svine-immunoglobulin G. I en mer foretrukken utførelsesform anvendes det antigeniske polypeptid i en multimer form.

Når det anvendes i multimer form, er polypeptidet et av et flertall av repeterende enheter av en multimer. I en ut-førelsesform inneholder multimeren minst to av de antigeniske ST-polypeptider bundet sammen hode-til-hale gjennom en amidbinding dannet mellom amingruppen av aminoenden av et polypeptid og carboxylgruppen i carboxyenden av et annet polypeptid. I en annen multimer utførelsesform er det antigeniske polypeptid et av et flertall av repeterende enheter av en polymer hvis polypeptid-repeterende enheter er bundet sammen ved interpolypeptid-cystindisulfidbindinger dannet mellom Cys-restene av de polypeptid-repeterende enheter.

I en mere foretrukken utførelsesform for de monomere og multimere former av syntetisk ST, under henvisning til den ovenfor angitte formel for det antigeniske syntetiske polypeptid er:

a-f hele tall med en verdi på 0 eller 1 forutsatt at:

"e" er 0 når "a" er 0,

"d" er 0 når "b" er 0, og

"f" er 0 når "c" er 0;

forutsatt ennvidere at minst én av "a", "b" eller "c" må være

13 4 " 6

0 slik at den tilsvarende R-er fraværende slik som R-,

a-f d-r hvis indeks er 0 når "a", "b" eller "c" er 0 og en intramolekylær cystindisulfidbinding er tilstede mellom de respektive Cys-rester for hvilke en indeksverdi på 0 krever at en annen indeksverdi skal være 0; og

når en verdi for a-f er 1, er angitte R^ ^-grupper når disse taes individuelt, like eller forskjellige grupper bundet til svovelatomet i Cys-resten og er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, en alkylgruppe inneholdende 1 til 4 carbonatomer og en substituert alkylgruppe inneholdende 2 til 20 carbonatomer;

hvori g-1 er hele tall med en verdi på 0 eller 1 som ovenfor angitt, forutsatt at:

hver av "g" og "k" er 0 når "a" er 0,

hver av "h" og "j" er 0 når "b" er 0, og

hver av "i" og "1" er 0 når "c" er 0; og

når verdien av g-1 er 1, er R 7-1, 2-gruppene den samme eller y forskjellige alternative aminorester til hver umiddelbart foregående Cys-rest.

Det monomere eller multimere antigeniske syntetiske polypeptid kan således sees å inneholde minst ett intramolekylært disulf id som er en intrapolypeptid- eller interpolypeptid-disulfidbinding av en cystinrest dannet mellom to Cys-rester. I de mere foretrukne utførelsesformer dannes den intrapolypeptide cystindisulfidbinding mellom parene av Cys-5 2 4 3 6 rester av grupper R og R , eller R, og R,, eller R og Rf.

cl 6 0 CL CX

I en ytterligere foretrukken utførelsesform inneholder det monomere syntetiske polypeptid minst to cystinrester, og deres disulfidbindinger dannes mellom de ovenfor angitte par av Cys-rester, og i de mest foretrukne utførelsesformer inneholder det syntetiske polypeptid tre cystinrester mellom de ovenfor angitte Cys-rester.

Biologisk, naturlig ST inneholder tre disulfidbindinger dannet blant de seks Cys-rester. Det mest foretrukne monomere syntetiske ST ifølge oppfinnelsen har en identisk 18-aminosyrerestsekvens med et biologisk, naturlig ST, og inneholder også tre intramolekylære, intrapolypeptiddisulfidbindinger dannet blant dets seks Cys-rester. Imidlertid er de tynnskiktskromatografiske og elektroforetiske mobiliteter sammenlignet med litteraturverdiene, og de immunologiske egenskaper av biologiske og syntetiske, monomere ST-molekyler forskjellige selv om de to molekyler har samme primærstruktur og hver inneholder tre intramolekylære, intrapolypeptid-disulfidbindinger .

Det monomere eller multimere syntetiske ST ifølge oppfinnelsen som har minst 10% av antigenisiteten av biologisk ST, kan fremstilles ved syntetisering under ikke-oxyderende til-stander av et første, uoxydert polypeptid slik som det tidligere beskrevne polypeptid hvori hydrogen er R a. *~ I--gruppen av i det minste to av a-f som er 1. For det monomere syntetiske ST og de multimere former av syntetisk ST innbefatter mer fordelaktig det første uoxyderte polypeptid aminosyrerestsekvensen tatt fra venstre til høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden, formelen:

hvori den mer foretrukne aminosyrerestsekvens uten de tre 7-1? spesifikke aminosyrerester i parentes og R__-i -gruppene til-y svarer aminosyreresten av ST Ib-polypeptidet nummerert fra 5 til 18 fra aminoenden fra ST Ib-polypeptid; hvor de tre spesifikke aminosyrerester i parentes hver er et alternativ til den umiddelbart foregående aminosyrerest; 7 8 9 10 11 l7 R , R^,R^, Rj , R^ og R1" er de samme eller forskjellige alternative aminosyrerester til den foregående Cys-rest; g-1 er hele tall som hver har verdien 0 eller 1, forutsatt at hvis noen av g-1 har en verdi lik 0, er den tilsvarende, 7-12 individuelle Rg_~L -gruppe fraværende, og verdien av minst to av g-1 er 0, forutsatt ennvidere at minst ett par av de ikke-tilgrensende par av Cys-rester fra Cys-restene som går forut 7-12 for de individuelle Rg_^ -grupper er tilstedeværende, idet de ikke-tilgrensende par av Cys-rester er valgt fra gruppen bestående av Cys-restene svarende til aminosyrerest-stillingene i ST Ib-polypeptidet som er nummerert 5 eller 6 og 9 eller 10, 5 eller 6 og 14, og 9 eller 10 og 17 fra aminoenden av ST Ib-polypeptidet.

Så snart det første polypeptid er syntetisert, oppløses eller suspenderes dette i et vandig materiale i en konsentra- . sjon på mindre enn 5 mg pr. ml, og fortrinnsvis mindre enn 2 mg pr. ml, og helst i en konsentrasjon på 1 mg pr. ml til 0,1 mg pr. ml. Fortrinnsvis er den vandige sammensetning alkalisk og har en pH-verdi på mindre enn 10,5.

Det erholdte første polypeptidholdige materiale bringes deretter i kontakt med molekylært oxygen som et oxydasjonsmiddel. Kontakten mellom materialet og molekylært oxygen opprettholdes i et tidsrom på fra 1 til 24 timer under dannelse av i det minste én intrapolypeptid eller én interpolypeptid-cystindisulfidbinding mellom de i det minste to tilstedeværende Cys-rester.

Ved en foretrukken fremstilling av det monomere molekyl dannes disulfidbindingen mellom parene av Cys-rester svarende til aminosyrereststillingene i ST Ib-polypeptidet nummerert 5 og 14, 6 og 10, og 9 og 17 fra aminoenden av ST Ib-polypeptidet. Fortrinnsvis opprettholdes kontakten mellom molekylært oxygen og løsningen inneholdende det første polypeptid i et tidsrom tilstrekkelig til å danne to disulfidbindinger mellom de ovenfor angitte par av Cys-rester, og helst for å danne tre intramolekylære cystindisulfidbindinger mellom disse par av Cys-

rester.

Foreliggende oppfinnelse medfører flere fordeler. En slik fordel er at den tilveiebringer en kilde av immunologisk aktivt ST som kan fremstilles i store mengder og i hovedsakelig ren form. En av fordelene med oppfinnelsen er at det syntetiske ST kan anvendes for å vaksinere mennesker og andre dyr mot stammer av E. coli som danner ST. En annen fordel med oppfinnelsen er at det syntetiske ST kan anvendes i et diagnostisk reagens eller reagenssystem for å bestemme nærvær av en infeksjon fremkalt av ST-produserende E. coli.

En annen fordel med oppfinnelsen er at ST-molekyler som utviser flere ganger høyere antigenisitet enn naturlig toxin, kan fremstilles. En ytterligere fordel med oppfinnelsen er at syntetiske ST-polypeptider kan fremstilles som har hovedsakelig mindre biologisk aktivitet enn naturlig toxin. Ytterligere fordeler ved oppfinnelsen fremgår fra den detaljerte beskrivelse, eksempler og krav som følger.

Kort beskrivelse av tegningene

I tegningene som utgjør en del av foreliggende beskrivelse, illustrerer: fig. 1 styrken av syntetisk og biologisk ST når det gjelder å fremkalle væskesekresjon i den diegivende musebestemmelse. En museenhet (MU) er definert som den mengde av toxin som gir et intestinal (tarm):skrott-vektforhold på minst 0,083. De viste verdier for MU er pr. mikrogram toxin. Abscissen viser toxindosen i nanogram (ng). Fig. 2 illustrerer væskesekresjon etter drypp av toxinene i 18 timer i ombundne ileumsløyfer i fastende rotter. Verdiene på ordinaten er i mikroliter væske pr. cm intestinal-lengde. Verdiene på abscissen er i nanogram av toxindosen. ED^0angir den dose i nanogram som fremkaller halvparten av den maksimale sekretoriske respons. Fig. 3 illustrerer antigenisiteten av syntetisk og biologisk ST bestemt ved en dobbelt lagdelt ELISA-teknikk under anvendelse av hyperimmune antisera mot biologisk ST. Antigenisiteten av de to ST-toxiner var hovedsakelig den samme når de ble testet mot hyperimmunt antisera overfor syntetisk ST. Ordinaten er i enheter for optisk densitet, mens abscissen er i nanogram av ST som antigen. Fig. 4 illustrerer den nøytraliserende effekt av hyperimmunt antisera overfor enten syntetisk eller biologisk ST på den sekretoriske effekt av toxiner i den diegivende musebestemmelse. Fig. 5 viser sammensetningen og egenskaper av konjugater avledet ved konjugering av et begynnelsesmolarforhold mellom syntetisk ST og LT holotoxin på 100:1 i nærvær av varierende konsentrasjoner av carbodiimidreagenset l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDAC). Verdier for prosenten av ST i de sluttelige konjugater (ordinat) er basert på vekten av Lowry-protein [Lowry et al., J. Biol. Chem., 193:265-275 (1951)]. Den andre, utsparede abscisse viser rest LT holotoxin-toksisitet i konjugatet som en prosent av toksisiteten av ikke-konjugert LT holotoxin. Fig. 6 illustrerer effekten av begynnelses-molarforholdet mellom syntetisk ST og LT B subenhet på mengden av ST innarbeidet i det sluttelige konjugat som bestemt under anvendelse av en spordose av radiojodert ST. EDAC/konjugatforholdet var 2:1. Fig. 7 illustrerer effekten av å variere EDAC/konjugat-forholdet på sammensetningen og antigenisiteten av konjugater erholdt fra et begynnelses-molarforhold mellom syntetisk ST og B subenhet på 50:1. Data for ST er vist i venstre felt, mens data for B-subenheten er vist i høyre felt. Antigen-enheter, uttrykt pr. lOO^ug konjugat, ble utledet ved å multiplisere prosenten av tilstedeværende toxin (på vektbasis) med prosenten av antigenisiteten. De innsirklede tall angir forholdet mellom EDAC og hvert spesikke toxin. Fig. 8 illustrerer effekten på sammensetningen og antigenisiteten av konjugatene ved å variere begynnelses-molarforholdet mellom syntetisk ST og B subenhet. Dataene er uttrykt som i fig. 7. Innsirklede tall angir forholdet mellom EDAC og hvert spesifikt toxin. EDAC/konjugatforholdet var 1,5:1. Fig. 9 illustrerer beskyttelsen oppnådd i rotter immunisert med graderte antigen-enhetsdoser av enten B-subenheten eller syntetiske ST koplet til svine-immunoglobulin G (PIG). Rotter som ble gitt varierende doser for intraparenteral (i.p.) primærimmunisering (venstre felt), mottok alle en total peroral (p.o.) booster-dose på 2.000 antigen-enheter; og de som ble gitt variable p.o.-booster-doser (høyre felt), mottok alle i.p.-primærimmunisering med 200 antigenenheter. Mucosale IgA antitoxinverdier (mucosal AT) i hvert felt er økningen i den resiprokale verdi for den geometriske midlere titer i immuniserte rotter dividert på den for uimmuniserte kontroller. Tall innen kvadrater angir de ST mucosale AT-verdier, mens tall innen sirkler angir de mucosale AT-verdier for LT B-subenheten. Fig. 10 illustrerer beskyttelsen som ble oppnådd mot utfordring med den humane LT + /ST + E. coli-stamme (0 0) sammenlignet med den mot humane LT- eller bare ST E.coli-stammer (• • ) i rotter immunisert med graderte p.o. antigen-enhetsdoser av enten B-subenheten eller syntetisk ST koplet til PIG. Alle rotter mottok i.p. primærimmunisering med 200 antigenenheter. Fig. 11 illustrerer effekten av å variere begynnelses-molarforholdet mellom ST (• • ) og B-subenheten (0 0) på antigenisiteten av komponenttoxinene i den tverrbundne vaksine. Forholdet mellom carbodiimid og konjugatprotein var 1,5:1 på vektbasis. Fig. 12 illustrerer immunogenisiteten av ST når dette gis koplet til PIG eller som en komponent av den tverrbundne vaksine. Alle rotter mottok (i.p.) primærimmunisering med 200 ST-antigenenheter, etterfulgt av graderte perorale (po) boostere av ST som vist på abscissen, og ble deretter utfordret med den humane LT /ST+ E. coli-stamme. Mucosale AT-verdier er vist med tall innen sirkler eller kvadrater og er som angitt i fig. 9. Fig. 13 illustrerer toksisiteten av ukoplet, syntetisk ST (venstre felt) og av ST koplet til PIG som en vaksine (høyre felt) ved den diegivende musebestemmelse. Verdier er middelverdien - standardfeil av middelverdien for 3 mus for hvert datumpunkt. MED, minimum effektiv dose, er den dose (her i nanogram eller mikrogram) som gir en positiv respons av et tarm/skrott-vektforhold på minst 0,08 3. Abscisser viser de administrerte doser i nanogram (venstre felt) eller mikrogram (høyre felt). Fig. 14 illustrerer toksisiteten av ukoplet syntetisk ST (venstre felt) og av ST koplet til PIG som en vaksine (høyre felt) i rotte-ombundne ileumsløyfer. Verdiene er middelverdien - standardfeil for gjennomsnittet for 3 rotter for hvert datumpunkt. ED5oer ^en dose i nanogram eller mikrogram som gir halvparten av den maksimale sekretoriske respons. "Oppvarmet" indikerer at vaksinen var utsatt for 65°C i 1 time før testing. Abscissene viser de administrerte doser i nanogram (venstre felt) eller mikrogram (høyre felt). Fig. 15 illustrerer beskyttelsen oppnådd i immuniserte rotter. Den horisontale linje angir 50% av den maksimale sekresjon i uimmuniserte dyr, og ED^Q angir den dose i nanogram som ga denne verdi i denne gruppe av rotter. PI angir beskyttelsesindekset, og IP/PO (intraperitoneal/peroral) angir immuniseringsmåten. Det øvre felt viser resultater fra utfordring med LT, mens det nedre felt viser resultater fra utfordring med monomert ST. Abscissene for begge felt viser dosen av utfordrende toxin i nanogram. Ordinaten viser volumet av sekresjon i ml/cm ileumsløyfe. Fig. 16 illustrerer beskyttelsen oppnådd i immuniserte kaniner. Betegnelsene er de samme som i fig. 15, med det unntak at de utfordrende doser og ED^-verdiene er i mikrogram, og IM/PO angir immunisering ved intramuskulær/peroral administrering . Fig. 17 er en kurve som illustrerer separasjonen av et polymert ST-(P-ST) preparat under anvendelse av Sephadex pG-50 kolonnekromatografi. Tallene på abscissen refererer til kolonne-eluatoppsamlingsrørnumraer, idet hvert rør mottok 4,5 ml eluat, mens nummerne på ordinaten henviser til den optiske densitet av innholdet i oppsamlingsrøret målt ved 278 nanometer. Innholdet i oppsamlingsrør nummerert 5-9 ble oppsamlet under dannelse av en løsning inneholdende hovedsakelig P-ST, mens innholdet i oppsamlingsrør nummerert 10-18 ble oppsamlet under dannelse av en løsning som primært inneholdt syntetisk monomert ST (M-ST). Fig. 18 illustrerer grafiske fremstillinger for dose-sekresjonsresponsverdier for immuniserte (•) og uimmuniserte (0) rotter som ble utfordret ved drypp av graderte doser i ombundne ileumsløyfer i 18 timer med E. coli ST ( ) eller med Klebsiella pneumoniae ST Rottene ble immunisert med en vaksine inneholdende syntetisk monomert ST konjugert til en naturlig LT-B subenhet som immunogenet. Abscissen viser nanogram av det utfordrende toxin, mens ordinaten viser sekresjonsresponsene av disse ileumsløyfer i mikroliter pr. cm sløyfe. ED50an9"ir den dose som gir 50% maksimal sekresjon i uimmuniserte rotter. PI er den beskyttelsesindeks som erholdes ved å dividere dosen av toxin i immuniserte dyr som gir den samme sekresjon som den 50% effektive dose (ED^q) i uimmuniserte dyr med verdier for uimmuniserte dyr. Fig. 19 er en kurve som illustrerer relative antigenisiteter av syntetisk monomert ST (M-ST; • •), en syntetisk multimer hode-til-hale ST-dimer (ST/ST; 0 0) og av et preparat av polymert syntetisk ST (P-ST; A A) som bestemt ved en dobbelt-lagdelt ELISA-teknikk med hyperimmune antisera dannet mot et M-ST-konjugat. Prosent anti-gensitet er basert på mengden mikrogram av ST som er nødvendig for å oppnå en optisk densitet ved 410 nanometer på 0,600. Abscissen viser mengden av ST pr. mikrotiter platebrønn i mikrogram. Fig. 20 gir grafiske illustrasjoner av egenskapene av tre preparater av ST konjugert til LT B subenheten under anvendelse av glutaraldehyd som koplingsmiddel ved et molarforhold mellom glutaraldehyd og B subenheten på 700:1. Felt A illustrerer konjugater fremstilt under anvendelse av syntetisk monomert ST (M-ST), felt B illustrerer konjugater fremstilt under anvendelse av syntetisk multimer hode-til-hale ST-dimer (ST/ST), og felt C illustrerer konjugater fremstilt ved anvendelse av polymert syntetisk ST (P-ST). Nummerne på abscissen i hvert av feltene representerer de molare forhold med det angjeldende ST-preparat og B-subenhet i start-konjugasjonsreaksjonsblandingen. Den venstre ordinat for hvert av feltene representerer prosenten av toxin på vektbasis i reaksjonsblandingene, og datapunkter sammenbundet med heltrukne linjer ( ) viser molarforhold mellom de to toxiner i reaksjonsblandingen. Den høyre ordinat i hvert felt viser det bestemte antall av antigenenheter pr. mg av den fremstilte vaksine, og datapunkter sammenbundet med stiplede linjer viser antigenisiteten for hvert konjugat. Punkter som refererer til ST—toxinet, er angitt ved fylte sirkler (•), mens punkter som refererer til B-subenhettoxinet er angitt ved åpne sirkler (0). Bokstavene "B" og "ST" som angir data refererende til B-subenheten og syntetisk ST, er også anbrakt nær opptil hver linje for tydelighetens skyld. Antigenenheter for konjugatene ble bestemt ved den doble lagdelte ELISA-teknikk med antisera overfor M-ST; og ST—verdier for alle konjugater er uttrykt i M-ST-antigenenheter. Fig; 21 illustrerer immunogenisiteten av vaksiner inneholdende konjugater av syntetisk monomert ST (M—ST) eller av polymert syntetisk ST (P-ST) med LT B-subenheten når det gjelder å tilveiebringe redusert sekresjon (ordinat i begge felter) og forøkede mucosale IgA antitoxintitere etter immunisering. Alle rotter mottok primære intraperitoneale immuniseringer inneholdende 200 antigenenheter av hvert konjugat etterfulgt av perorale (p.o.) boostere med varierende mengder av samme vaksine. Rottene ble utfordret med en levedyktig human LT /ST<+>stamme ved drypp av denne stamme. Verdiene for mucosalt IgA antitoxin (AT) er angitt i sirkler og er vist som den midlere økning i titere i immuniserte rotter i forhold til de i uimmuniserte kontroller, og AT i rotter immunisert med vaksinen inneholdende P-ST-konjugatet ble målt og er uttrykt som M-ST-titere. Dataene i felt A er uttrykt som totale perorale (p.o.) doser i M-ST-antigenenheter, mens dataene i felt B er uttrykt som totale perorale (p.o) doser i mikrogram av ST, som M-ST, inneholdt i de administrerte boostere. Fig. 22 inneholder to felter med kurver som illustrerer prosenten av toxin på vektbasis og antall antigenenheter pr.

mg av konjugater fremstilt fra polymert ST (P-ST) og LT B-subenheten som en funksjon av det molare forhold mellom P-ST

og B-subenheten i konjugatene. Egenskapene av konjugater fremstilt under anvendelse av dimethyl-suberimidat (DMS) er vist i felt A, mens egenskaper av konjugater fremstilt under anvendelse av EDAC [l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid] er vist i felt B. Data som henhører til LT B-subenheten i begge felter, er vist som triangler, mens data henhørende til P-ST,

er vist som sirkler. Fylte triangler og sirkler (A, •), og heltrukne linjer henviser til toxinprosentdata, mens åpne triangler og sirkler (A, 0) og stiplede linjer henviser til antigenenhetdata. Vektforhold mellom koplingsmiddel og B-subenhet var 1:1 for DMS og 1,5:1 for EDAC.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

I. Syntetisk ST

Foreliggende oppfinnelse angår syntetisk fremstilte polypeptider med aminosyre-restsekvensen av i det minste de 14 carboxyende-aminosyrerester av det varmestabile entero-

toxin (ST) produsert av Eschericia coli (E. coli). De syntetiske polypeptider ifølge oppfinnelsen i monomere og multimere former, er anvendbare som immunogener eller deler derav av vaksiner som kan anvendes ved beskyttelse mot diaréiske infeksjoner produsert av E. coli som danner slike toxiner såvel som mot infeksjoner fremkalt av andre bakterier slik som Klebsiella pneumoniae som danner lignende toxiner.

De monomere og multimere syntetiske ST-polypeptider og antistoffer dannet mot disse, er også anvendbare i diagnoser for å bestemme nærvær av ST~produserende organismer slik som E. coli.

Når de syntetiske ST—polypeptider anvendes som en vaksine for immuniseringer, kan de anvendes alene slik som tilfellet er for polymer ST (P-ST) multimer, eller anvendes kjedet til en bærer som et konjugat slik som tilfellet er for monomert ST (M-ST) og ST-multimerer. Det syntetiske ST-immunogen er tilstede i en effektiv mengde i en slik vaksine og dispergeres eller oppløses i et fysiologisk akseptabelt

fortynningsmiddel.

Særlig anvendbare konjugatbærere innbefatter det varrae-labile enterotoxin av E. coli (LT) såvel som den mindre B-subenhet av dette toxin (LT B). Ytterligere anvendbare bærere innbefatter svineimmunoglobulin G (PIG), nøkkelhull-hemocyanin (KLH) (keyhole limpet hemocyanin), tetanus toxoid, poly-L-(Lys:Glu), peanøtt-agglutinin, ovalbumin, soyabønne-agglutinin, okseserumalbumin (BSA), humant serumalbumin og lignende.

Fysiologisk akseptable fortynningsmidler innbefatter vann, saltvann, fosfatbufret saltvann (PBS) og lignende, og innbefatter typisk en adjuvans. Freunds fullstendige adjuvans (CFA), Freunds ufullstendige adjuvans (IFA) og alum er typisk anvendte adjuvanser som er velkjente innen faget, og er tilgjengelige kommersielt fra flere kilder.

ST-immunogenet inneholdt i en vaksine er tilstede i en "effektiv mengde", hvilken mengde avhenger av et utall faktorer som er velkjente innen det immunologiske fag. Innbefattet blant disse faktorer er kroppsvekt og arten av det dyr som skal immuniseres, bæreren når slik anvendes og midlet anvendt for å kople ST til bæreren, adjuvansen når slik anvendes og varigheten av den ønskede beskyttelse, og immuniser-ingsprotokollen som anvendes.

I enkelte utfordringsstudier mottok f .eks. rotter

1500 til 2500 antigenenheter (definert i avsnitt III B i det etterfølgende) når disse ble immunisert med et ST-konjugat i en protokoll hvori en intraparenteral injeksjon ble etterfulgt av to perorale boostere. I en annen utfordringsstudie mottok kaniner 2500 til 3000 antigenenheter av et ST-holdig konjugat og ble beskyttet.

Vekten av syntetisk ST i slike vaksiner avhenger av antigenisitetene av det anvendte ST-preprat og av det ST-holdige konjugat. Under anvendelse av den kunnskap at rotter ble beskyttet mot utfordring når de ble immunisert med totalt 1500 til 2500 antigenenheter av ST-holdig vaksine, ble 1500 til 2500 mikrogram av et M-ST—LT B-konjugat pr. rotte administrert, mens 100 til 300 mikrogram av P-ST—LT B-konjugatet pr. rotte ble administrert for å oppnå et lignende resultat. Totalt 600 mikrogram ukoplet (ikke-konjugert) P-ST ble anvendt i kaniner for å tilveiebringe en antiserumtiter som var tilstrekkelig for å indikere beskyttelse mot utfordring.

Det fremgår således at mengden av ST som er nødvendig

for å tilveiebringe en "effektiv mengde", kan variere vidt. Fagmannen vil imidlertid kunne fastslå den effektive mengde under anvendelse av rutine-laboratorieprosedyrer ut fra den diskusjon og de henvisninger som følger.

Syntetisk ST som er en utførelsesform av oppfinnelsen, utviser antigenisitet som en monomer alene eller bundet til en proteinbærer som et konjugat eller som en multimer alene eller bundet til en bærer som et konjugat, som er minst 10%

av den som utvises av biologisk naturlig ST erholdt fra E. coli som infiserer mennesker og andre dyr. Det er kjent

at det monomere, naturlige forekommende, biologiske ST inneholder 6 Cys-rester som danner 3 intramolekylære, intrapolypeptid-disulfidbindinger av cystinrester. Nærvær av cystindisulfidbindinger har av andre, Chan et al., supra,

vært vist å være nødvendig for funksjonen av naturlig forekommende ST.

To av de seks Cys-rester av ST kan teoretisk kombineres på 15 forskjellige måter under dannelse av en disulfidbinding av én cystinrest. 6 mulige kombinasjoner av parede Cys-

rester gjenstår for dannelsen av en andre disulfidbinding, og deretter finnes det bare én kombinasjon for den tredje disulfidbinding. Således er det totalt 90 (15x6x1) teoretisk mulige sekundære strukturelle isomerer for hver primær aminosyre-restsekvens av ST som inneholder 6 Cys-rester og 2 eller 3 disulfidbindinger.

På grunn av den praktiske vanskelighet med å danne en cystindisulfidbinding mellom par av tilstøtende Cys-rester av hvilke det er to par i ST-molekylet, og overflødige mulige strukturer, er det betydelig færre enn 90 sekundære strukturelle isomerer inneholdende 2 eller 3 disulfidbindinger. De spesifikke par av Cys-rester som danner disulfidbindingene tilstedeværende i naturlig forekommende biologisk ST, er ikke kjent.

Det er nå funnet at et immunologisk aktivt syntetisk ST kan fremstilles som har en primær aminosyre-restsekvens som er hovedsakelig den samme som den av naturlig forekommende biologisk ST, men hvis sekundære struktur, slik som bestemt ved disulfidbindingsdannelsen, er forskjellig fra den av naturlig forekommende ST. Antigenisk aktivitet er funnet med monomere syntetiske ST-molekyler som inneholder bare én intrapolypeptidcystin-disulfidbinding blant parene av tilstedeværende Cys-rester. Forøket antigenisitet tilveiebringes til det syntetisk monomere ST ved dannelse av to disulfidbindinger mellom to intrapolypeptidpar av Cys-rester, mens maksimal antigenisk aktivitet tilveiebringes ved dannelse av 3 intrapolypeptid-disulfidbindinger mellom 3 par av Cys-rester. For multimere former av syntetisk ST er minst én intramolekylær, intrapolypeptidcystin-disulfidbinding eller én intramolekylær, intrapolypeptidcystin-disulfidbinding tilstede som diskutert i det etterfølgende.

Det syntetiske ST som anvendt her, beskrives som å være

i monomere og multimere former. Monomert syntetisk ST inneholder minst 14 aminosyrerester (14-mer) som vist i det etter-følgende i formel I, innbefattende de forskjellige beskrevne R-grupper. Multimert syntetisk ST inneholder et flertall av minst 14-mere syntetiske ST-repeterende enheter. I en utfør-elsesform er de syntetiske ST-repeterende enheter av multimeren bundet sammen hode-til-hale>dvs. aminoendeaminet av en repeterende enhet er bundet med en amidbinding til carboxyende-carboxylgruppen av en andre syntetisk ST-repeterende enhet under dannelse av en multimer inneholdende minst to ST-repeterende enheter.

ST-multimerer inneholdende ST-repeterende enheter bundet sammen hode-til-hale, vil enkelte ganger bli angitt som dimer, trimer, tetramer og lignende ST-multimerer for å indikere antall ST-repeterende enheter inneholdt i multimeren. En dimer ST-multimer vil også enkelte ganger bli angitt ved

den forkortede formel ST/ST, en trimer ST-multimer ved den forkortede formel ST/ST/ST og lignende, hvor hver "ST" representerer minst 14-mer-polypeptidet hvis sekvens er vist i formel I.

En annen utførelsesform av oppfinnelsen er en ST-multimer som angis her som "polymer syntetisk ST", som en "syntetisk ST-polymer" eller som "P-ST". I denne utførelses-form er de individuelle ST-polypeptid-repeterende enheter bundet sammen ved interpolypeptidcystin-disulfidbindinger dannet mellom og blant Cys-restene av de ST-repeterende enheter. Hver av de ST-repeterende enheter av det polymere syntetiske ST inneholder også minst de 14 aminosyrerester som er illustrert i formel I.

De multimere former av ST ifølge oppfinnelsen kan også beskrives ved den terminologi som hyppig anvendes innen polymerkjemien. Under anvendelse av slik terminologi kan hode-til-hale multimer ST hvis repeterende enheter som har en ST-aminosyre-restsekvens, er bundet sammen med en amidbinding mellom carboxylgruppen ved carboxyenden av en repeterende enhet og aminogruppen ved aminoenden av en annen repeterende enhet, også beskrives som en rettkjedet ST-oligopolymer (oligomer) eller som en blokk-oligomer hvis repeterende blokker har aminosyre-restsekvensen av et ST-polypeptid. Det tidligere beskrevne polymere ST hvis repeterende enheter som har en ST-aminosyre-restsekvens, er bundet sammen med interpolypeptidcystin-disulf idbindinger , er antatt å kunne beskrives som en tverrbundet eller nettverkpolymer hvis flertall av repeterende enheter har aminosyre-restsekvensen av et ST-polypeptid og hvis tverrbindinger er tilført ved interpolypeptidcystin-disulf idbindinger .

Under anvendelse av den ovenfor angitte terminologi kan de ovenfor beskrevne multimerer inneholdende repeterende enheter som har hovedsakelig bare én ST-aminosyre-restsekvens, angis som rettkjedede ST-homo-oligopolymerer eller tverrbundne (nettverk) homopolymerer. Multimerene kan også inneholde repeterende enheter som har forskjellige aminosyre-restsekvenser eller lengder, i hvilket tilfelle disse multimerer kan angis som rettkjedede ST-co-oligopolymerer eller som tverrbundne (nettverk) copolymerer.

Det skal forståes at de ovenfor beskrevne multimere former av syntetisk ST bare representerer to av de mange mulige ST- multimerer. Når f.eks. multimeren angitt som en hode-til-hale-multimer eller rettkjedet homo-oligopolymer som er to repeterende enheter, fremstilles ved oxydasjon av et første 36-rest polypeptid som har en aminosyre-restsekvens svarende til den av to ST-polypeptider, dannes også noe polymert ST som har interpolypeptidcystin-disulfidbindinger (en nettverk-homopolymer)'. De repeterende enheter i denne nettverk-homopolymer inneholder to av de 18-mere aminosyre-restsekvenser av ST i den repeterende enhet. En copolymer kan fremstilles ved oxydasjon av de første 18-mere ST-polypeptider sammen med de ovenfor angitte første 36-mere multimere ST-polypeptider under dannelse av et nettverk eller tverrbundet materiale hvis repeterende enheter har en ST-polypeptid-aminosyre-restsekvens.

Ordet "syntetisk" anvendes her for å angi at ST-poly-peptidmolekylet eller de polypeptid-repeterende enheter er blitt bygget opp på kjemisk måte (kjemisk syntetisert) istedenfor på biologisk måte (biologisk syntetisert) slik som det fra naturlig forekommende ST-produserende E. coli eller ved genetiske konstruksjonsteknikker. De syntetiske polypeptider er derfor frie for naturlig forekommende proteiner og fragmenter derav. Den velkjente kjemiske syntese i fast fase hvori blokkerte aminosyrerester tilsettes serievis under dannelse av et polypeptid, er den foretrukne syntesemetode, og denne er diskutert i det etterfølgende.

Et syntetisk polypeptid ifølge oppfinnelsen innbefatter aminosyresekvensen som en monomer alene, eller som en repeterende enhet i en multimer, som fra venstre til høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden er representert ved sekvensen av formel I:

hvori de tre spesifikke aminosyrerester i parentes hver er et alternativ til den umiddelbart foregående aminosyre-

rest i sekvensen;

a, b, c, d, e og f (a-f) og g, h, i, j, k og 1 (g-1)

er hele tall som hver har verdien 0 eller 1, forutsatt at hvis verdien av en hvilken som helst av a-f eller g-1 er 0,

er den tilsvarende R , R, , R , R,, R eller R- (R ~%-)gruppe

7 89lo Ti c 12e 7-12 a

eller r' R° r*, R^ , r£ eller r| (R _7 -) gruppe fra-gni k i g i

værende, og når en R --gruppe er fraværende, danner svovel-

atomet i Cys-resten som har en fraværende R 1-6--gruppe, en cys-cl X tindisulfidbinding, mens hvis verdien av en hvilken som helst av a-f eller g-1 er 1, er den tilsvarende R 1—6 -- eller R 7 —1, 2-gruppe tilstede; hvor

Ra"*" —r^-gruppene, når disse taes individuelt, er like eller forskjellige grupper bundet til svovelatomet i Cys-resten og er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, en alkylgruppe inneholdende 1 til 4 carbonatomer, en substituert alkylgruppe inneholdende 2 til 20 carbonatomer, en acylgruppe inneholdende 1 til 8 carbonatomer og en substituert acylgruppe inneholdende 2 til 10 carbonatomer;

7-12 Rg_^ er like eller forskjellige alternative aminosyrerester til hver av den umiddelbart foregående Cys-rest; og

minst to av a-f og to av g-1 er 0 og to Cys-rester er tilstede, forutsatt at det syntetiske polypeptid inneholder minst én intramolekylær cystindisulfidbinding dannet fra minst

to tilstedeværende Cys-rester.

I monomer form er den ovenfor angitte, i det minste ene disulfidbinding et intramolekylært, intrapolypeptidcystin-disulfid dannet mellom minst to Cys-rester tilstedeværende i det antigeniske polypeptid. Når det antigeniske polypeptid er i en multimer form som inneholder et flertall av polypeptid-repeterende enheter, kan den ovenfor angitte, i det minste ene disulfidbinding, være et intramolekylært, intrapolypeptid-cystindisulfid dannet mellom i det minste to tilstedeværende Cys-rester i hver polypeptid-repeterende enhet, eller denne disulfidbinding kan være en intramolekylær, interpolypeptidcystin-disulf idbinding dannet mellom en av i det minste to tilstedeværende Cys-rester i en første repeterende enhet og en annen av i det minste to tilstedeværende Cys-rester i en andre repeterende enhet. Det fremgår derfor at en intramolekylær cystindisulfidbinding er tilstede både i monomere og multimere former av ST. I det monomere ST er denne cystin-disulf idbinding en intrapolypeptidbinding, mens i multimert ST kan disulfidet være en interpolypeptid- eller en intrapolypeptidbinding .

I en mer foretrukken utførelsesform av de monomere og multimere former av syntetisk ST er under henvisning til det ovenfor angitte antigeniske syntetiske polypeptid av formel I:

"e" lik 0 når "a" er 0,

"d" lik 0 når "b" 0, og

"f" lik 0 når "c" er 0; og

hver av "g" og "k" lik 0 når "a" er 0,

hver av "h" og "j" lik 0 når "b" er 0, og

hver av "i" og "1" lik o når "c" er 0.

Sekvensen vist i formel I uten de tre spesifikke alternative aminosyrer og substituent- og alternative R-grupper svarer til den 14 aminosyre-restsekvens ved carboxyenden av ST IB og er homolog med aminosyrerester nummerert 59-72 av

ST Ia fra aminoenden. De 14 aminosyrerester omfattende aminosyrer 59-72 av ST Ia avviker fra sekvensen illustrert i formel I uten dets alternative aminosyrer og R-grupper ved stilling 65 hvori en asparagirr (Asn)rest erstatter tyrosin-(Tyr) resten ved stillingen nummerert 11 fra aminoenden av ST Ib (reststilling 8 fra carboxyenden), og ved stilling 72 (carboxyenden) hvori en tyrosinrest erstatter den viste asparaginrest.

Således kan Tyr-resten umiddelbart til høyre for den fjerde Cys-rest fra aminoenden (Tyr-65) erstattes med Asn-resten som er angitt i parentes i den ovenfor angitte formel. En lignende erstatning av en Tyr-rest med Asn-rest kan også finne sted ved carboxyenden som vist ved at den endelige Tyr-rest er angitt i parentes.

Den analoge 14 aminosyre-restsekvens fra ST Ic er den samme som den av ST Ib bortsett fra stilling 69 i ST Ic hvori en threonin- (Thr) rest erstatter en alanin- (Ala) rest av ST Ib. Denne erstatning er også illustrert i den ovenfor angitte formel ved at Thr-resten er angitt i parentes.

Det er særlig foretrukket at minst én av de fire amino-ende-aminosyrerester tilstedeværende i sekvensen av det 18 rest— ST Ib molekyl også er tilstede i dets naturlige stillingssekvens i det syntetiske ST. Det er enda mer foretrukket at alle fire av disse ytterligere aminosyrer er tilstede i det syntetiske ST i den samme, naturlige stillingssekvens som de er tilstede i ST Ib.

De foretrukne fire ytterligere aminosyrer ved aminoenden av det syntetiske ST-molekyl tilsvarer aminosyrenummer 55-58 av ST Ia og er identiske med disse fire aminosyrer i ST Ib. Tre av de fire aminosyrer av ST Ic avviker fra de i enten ST Ia eller ST Ib ved stilling 55-58 av ST Ia. Under anvendelse av det ovenfor i parentes angitte alternative navngivningssystem har 4-aminosyre-polypeptidet (4-mer) ved aminoenden av det syntetiske ST av formel I i en foretrukken utførelsesform en sekvens, tatt fra venstre til høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden som er representert ved formel II:

hvori den i parentes angitte aminosyre kan erstatte den umiddelbart foregående aminosyrerest.

Det monomere syntetiske polypeptid inneholder minst én intramolekylær, intrapolypeptid-disulfidbinding, fortrinnsvis to intramolekylære, intrapolypeptid-disulfidbindinger og helst tre intramolekylære, intrapolypeptid-disulfidbindinger. Disulfidbindingene er antatt å være dannet mellom parene av

15 2 4

Cys-rester av R og R , og R, og R, såvel som mellom Cys-restene av R 3 og R5-, når a-f har verdien 0.

12 3 4 Cys-restene av R og R, såvel som de av R og R, er

J a 3 b c r d imidlertid tilgrensende par. Følgelig kan syntetiske ST-polypeptider inneholdende én disulfidbinding, ha hovedsakelig like sekundære strukturer og antigenisiteter uten hensyn til hvorvidt denne enkle disulfidbinding er dannet mellom Cys-15 2 5

restene av R& og Rg eller av R^og Rg. Lignende resultater gjelder sekundære strukturer dannet på grunn av disulfid-dannelse mellom Cys-restene av R og R^ snarere enn R^og R^og lignende.

Det første polypeptid som syntetiseres før den oxydative dannelse av en intramolekylær, intrapolypeptid-disulfidbinding inneholder minst to Cys-rester, slik at verdien av minst to av 7-12 g-1 er 0 og de tilsvarende Rg_]_ -grupper er fraværende. I lys av likheten ved den sekundære struktur som tilveiebringes ved dannelse av en intramolekylær, intrapolypeptidcystin-disulfidbinding mellom en av to tilstøtende Cys-rester og en annen Cys-rest, tilføyes det forbehold for foretrukket monomert og multimert syntetisk ST at minst ett par av ikke-tilstøtende

7-12

Cys-rester fra Cys-restene som går foran R__-i -gruppene, er

y

tilstede. Dette par er valgt fra gruppen bestående av Cys-

7 8 9 10 7 8 11 rester som går forut for R , R, og R. , R. , R , R, og R, , 9 10 12 gn 1 J g n *

og R^, Rj og R^ . Uttrykt ved aminosyre-reststillingene i ST IB er parene av ikke-tilstøtende Cys-rester i monomert syntetisk ST valgt fra gruppen bestående av de som er nummerert 5 eller 6 og 9 eller 10, 5 eller 6 og 14, og 9 eller 10 og 17 fra aminoenden av det ST Ib 18-mere polypeptid.

Multimere syntetiske ST-molekyler som er bundet sammen hode-til-hale, inneholder fortrinnsvis minst én intramolekylær, intrapolypeptidcystin-disulfidbinding pr. repeterende enhet. De intrapolypeptidcystin-disulfidbindinger som er tilstede

i hver repeterende enhet av slike multimerer, er fortrinnsvis mellom de samme Cys-rester som de som er tilstede i de monomere molekyler. Nærvær av to intrapolypeptidbindinger mellom Cys-rester av hver repeterende enhet er mere foretrukket, mens nærvær av tre intrapolypeptidcystin-disulfidbindinger pr. repeterende enhet er mest foretrukket.

For de polymere syntetiske ST-molekyler hvori de polypeptid ST-repeterende enheter er bundet sammen med intramolekylære, interpolypeptidcystin-disulfidbindinger, er det ikke antatt nødvendig at de to tilstedeværende Cys-rester er ikke-tilstøtende. Det er imidlertid foretrukket at disse Cys-rester er ikke-tilstøtende som ovenfor diskutert.

I tillegg til dets primære aminosyre-restsekvens er et monomert syntetisk ST-molekyl inneholdende en intrapolypeptidcystin-disulf idbinding blant dets seks Cys-rester også hensiktsmessigkarakterisert vedat dets antigeniske aktivitet er minst 10% av den antigeniske aktivitet av biologisk ST inneholdende tre disulfidbindinger. Forskjeller i tynnskiktskromatografiske og elektorforetiske mobiliteter mellom monomere syntetiske ST-molekyler inneholdende tre intramolekylære, intrapolypeptid-disulfidbindinger og litteraturverdier for biologisk ST kan også være nyttig ved karakterisering av syntetiske ST-molekyler inneholdende é<*>n intramolekylær, intrapolypeptid-disulf idbinding når et slikt syntetisk ST kan danne, tre intramolekylære, intrapolypeptidcystin-disulfider.

Da slike pardannelser av Cys-rester forskjelliga fra de som er spesielt foretrukne også kan finne sted for monomere syntetiske ST-molekyler inneholdende to intramolekylære, intrapolypeptid-disulfidbindinger, er også slike ST-molekyler hensiktsmessigkarakterisert vedå ha en antigenisk aktivitet som er minst 10% av den av biologisk ST inneholdende tre disulf idbindinger . Tynnskiktskromatografiske og elektroforetiske mobiliteter er igjen nyttige ved karakterisering av monomere syntetiske ST-molekyler inneholdende to intramolekylære, intrapolypeptid-disulfidbindinger når det tredje disulfid også

kan dannes.

Antigenisiteten av et syntetisk ST som en prosent av antigenisiteten av biologisk ST diskuteres i detalj i etter-følgende avsnitt II. Kort angitt er imidlertid prosenten av antigenisiteten av syntetisk ST et relativt mål for mengden av anti-biologisk ST-antistoff som erkjenner et syntetisk ST sammenlignet med biologisk ST erkjent av samme anti-biologiske ST-antistoffer. Antigenisitetberegninger er basert på vekten av anvendt ST-antigen og er uavhengig av hvorvidt det under-søkte antigen er monomert eller multimert.

Egnet antigenisitet er også blitt funnet for syntetiske ST-molekyler hvori svovelatomene i Cys-restene omfatter deler av kjeder som er forskjellige fra cystin-disulfidbindinger.

På grunn av dette faktum er Cys-resten i den ovenfor angitte sekvens av formel I for syntetisk ST vist bundet til Ra_f-grupper hvis identiteter er diskutert i det etterfølgende.

Det skal imidlertid bemerkes at fordi minst én intramolekylær, intrapolypeptidcystin-disulfidbinding er nødvendig for antigenisk aktivitet i det monomere syntetiske ST, og biologisk aktivitet når slik er ønsket, kan ikke alle seks av 1—6

RSLX- -gruppene være tilstede i ett syntetisk ST-molekyl.

Bare fire av disse grupper kan være tilstede i ett molekyl. Hvor f.eks. CyJ s-restene av R a og R eer kombinert under dannelse av en intramolekylær, intrapolypeptidcystin-disulfidbinding,

er således verdiene av "a" og "e" 0 (under), R - og R -gruppene

2 3 4 6 ^ ^

er fraværende og bare R^, Rc, R^ og R^ kan være tilstede i et monomert syntetisk ST-molekyl.

For å forklare nærværet av 1, 2 eller 3 intramolekylære disulfidbindinger av cystinrester dannet blant de 6 Cys-rester, er hver av R-gruppene 1-6 også blitt merket med indeks-bokstaven a-f. Hver indeksbokstav representerer et helt tall med en verdi på 0 eller 1. For mer foretrukne utførelsesformer tilføyes det forbehold at "e" er 0 når "a" er 0, "d" er 0 når "b" er 0, og "f" er 0 når "c" er 0, med det ytterligere forbehold at minst én av "a", "b" eller "c" må være 0, med det ytterligere forbehold at en disulfidbinding er tilstede mellom de respektive par av Cys-rester for hvilke en indeksverdi på 0

krever at en annen indeksverdi også må være 0.

Hver avRa_£-gruppene tilstedeværende i det syntetiske ST, kan være hydrogen. I et slikt tilfelle er Cys-resten

til hvilken r]" ^-gruppen er bundet, usubstituert ved at

a—x

hydrogen er en normal gruppe bundet til svovelatomet av en Cys-rest. Nærvær av hydrogen bundet til svovelatomet av et cystein er her angitt med betegnelsene Cys eller CysH.

R^_^-gruppene kan også være alkylgrupper som inneholder

1 til 4 carbonatomer. Eksempler på slike R1_ —6- -grupper er methyl, ethyl, propyl, i-propyl, n-butyl, i-butyl og lignende. 1 — 6 Ra_ — x--gruppene kan ytterligere være substituerte alkylgrupper inneholdende 2 til 20 carbonatomer hvori substi-tuentene innbefatter aryl, substituert aryl, hydroxy, amino, carboxy, carboxamido, halo, substituert vinyl, substituert thio og lignende. Eksempler på slike substituerte alkylgrupper er benzyl, a-tolyl, 2-hydroxyethyl, 2-hydroxypropyl, 2-amino-ethyl, carboxymethyl (-CH2C02H), carboxamidomethyl (-CH2CONH2), p-klorbenzyl, ethylen-bis-acrylyl, 2-thioethancarboxy (-SCH2CH2C02H) og lignende.

Innbefattet blant de substituerte alkylgrupper fra hvilkeRa_f-gruppene kan være valgt, er en kjedende gruppe som er anvendbar for binding av det syntetiske ST til et annet molekyl slik som en antigenbærer slik som B-subenhet av et E. coli varmelabilt (LT) toxin. Eksempler på slike kjedende grupper er diacrylater slik som ethylen-bis-acrylat som kan reagere en dobbeltbinding med et svovelatom av en Cys-gruppe via en Michael addisjonsreaksjon, mens den andre dobbeltbinding etterlates fri for binding til en bærer; thioeddiksyre, thiopropionsyre, cystein og N-2-hydroxyethyl-2-thiosuccinimid som kan danne blandede disulfidbindinger med svovelatomet i en Cys-rest og kan reagere med et annet molekyl slik som en bærer via deres carboxylgrupper, cystein-aminogruppen eller hydroxyethylgruppen.

En R^ ^-gruppe i en mindre foretrukken utførelsesform kan være en acylgruppe inneholdende 1 til 8 carbonatomer eller en substituert acylgruppe inneholdende 2 til 10 carbonatomer. Eksempler på acylgrupper inneholdende 1 til 8 carbonatomer, innbefatter formyl, acetyl, propionyl, hexanoyl, benzoyl og lignende. Eksempler på substituerte acylgrupper inneholdende 2 til 10 carbonatomer innbefatter 2-methoxyacetyl, 3-ethoxy-propionyl, 4-klorbenzoyl, 3-carboxypropionyl (et maleinsyre-anhydridaddukt) og lignende. Acyl og substituerte acylgrupper er mindre foretrukne på grunn av at deres thioesterbindinger ikke er særlig stabile i vandige media.

1~ 6

R - -gruppene kan være tilstede separat i et syntetisk 1-6

ST-molekyl, eller blandinger av R cl X. -grupper kan være tilstede i ett ST-molekyl. Når alle av indeksbokstavene a-f i et monomert syntetisk ST-molekyl har en verdi på 0, er R^f"gruppene fraværende, og tre intramolekylære, intrapolypeptidcystin-disulf idbindinger er tilstede.

Indeksbokstavene a-f kan også alle ha verdien 0, og

Rc^ l*— J% _ -gruppene kan være fraværende i et polymerisert syntetisk ST-molekyl (P-ST) hvori intramolekylære, interpolypeptidcystin-disulf idbindinger mellom syntetiske ST-polypeptid-repeterende enheter er tilstede. Intramolekylære, intrapolypeptid-disulfidbindinger innen de syntetiske ST-repeterende enheter kan også være tilstede i P-ST. Gjennomsnittlig inneholder de repeterende enheter av en slik polymer minst to slike inter-polypeptidcystinbindinger pr. repeterende enhet. Følgelig har fortrinnsvis minst to av a-f og to av g-1 en verdi på 0 for slike polypeptid-repeterende enheter, og minst to R ^-grupper

7-12

og to tilsvarende Rg_^ -grupper er fraværende på grunn av dannelse av minst to interpolypeptidcystin-disulfidbindinger.

. Antigenisitet og biologisk aktivitet kan også oppnåes under anvendelse av syntetiske ST-molekyler inneholdende minst én intramolekylær, intrapolypeptidcystin-disulfidbinding mellom parene av Cys-rester slik som de vist i formel I som

1 5 4 3 6

bundet til R og R , R" og R,, eller R og R-, svarende til

a eb d c f

stillingene nummerert 5 og 10, 6 og 14, og 9 og 17 fra aminoenden av ST-Ib-molekylet, når Cys-restene som ikke er innbefattet i disulfidbindingen, er erstattet med samme eller forskjellige alternative aminosyrerester. De foretrukne alternative aminosyrerester for Cys-restene av formel I gir ingen ionisk ladning til det syntetiske polypeptid når det syntetiske

polypeptid oppløses i en vandig løsning med fysiologiske pH-verdier, dvs. de foretrukne alternative aminosyrerester er frie for ioniske ladninger når de utgjør endel av polypeptidet og i vandig løsning.

De alternative aminosyrerester til de ikke-disulfid-bindende Cys-grupper er illustrert i den ovenfor angitte 7 8 9 10 11 12 formel I ved Rg, Rh, R±, R^ , Rk og R1 -gruppene angitt i parentes, hvor hver av disse kan erstatte den foregående Cys-rest, og hvori indeksene g-1 er hele tall som har verdien 0 eller 1. I foretrukne syntetiske ST-polypeptider er hvis "a" er lik 0, "g" og "k" begge 0; hvis "b" er 0, er "h" og "j" hver lik 0; og hvis "c" er 0, er "i" og "1" hver lik 0.

Aminosyrerestene alanin (Ala) og serin (Ser) er eksempler på foretrukne alternative aminosyrer som er anvendbare for å erstatte Cys-rester. Biologisk og antigenisk aktivitet tilveiebrakt av syntetiske ST-molekyler med Cys-rester erstattet med Ser-rester, er illustrert i det etterfølgende.

Den ovenfor angitte beskrivelse når det gjelder grupper 16 7 12 R&-Rj og Rg-R^ , kan like godt anvendes på syntetiske ST-polypeptider inneholdende de 14 aminosyrerester vist i formel I og det mer foretrukne syntetiske ST-polypeptid inneholdende 18 aminosyrerester hvis sekvens, tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden, er representert ved formel III:

hvori de i parentes angitte aminosyrerester og R 1 -R6_ og

7 12 at Rg~Rl

Både det foretrukne syntetiske polypeptid av formel I

og det mer foretrukne syntetiske polypeptid av formel III

kan også innbefatte en ytterligere gruppe Rm 13 bundet til aminet av aminoenderesten av polypeptidet, hvori "m" er et helt tall som har verdien 0 eller 1, forutsatt at hvis verdien av "m" er 0, er R 13 fraværende, og amino-endeaminet er usubsti-

m 13

tuert. Hvis verdien av "m" er 1, kan Rmvære et peptid inneholdende 1 til 58 aminosyrerester, en kjedende gruppe,

og acyldelen av en carboxylsyre inneholdende 1 til 20 carbonatomer som danner en amidbinding mellom aminet i amino-enderesten.

Når R^ 13 innbefatter ytterligere aminosyrerester bundet til aminoenden av det syntetiske polypeptid av det 14 rests polypeptid av formel I, kan de ytterligere aminosyrerester i en foretrukken utførelsesform ha den sekvens, fra amino-

enden til carboxyenden som er vist tidligere i formel II. Addisjon av aminosyre-restsekvensen av formel II til den foretrukne 14 aminosyre-restsekvens gir sekvensen av det mer foretrukne 18 aminosyre-rest-polypeptid av formel III som i seg selv svarer til carboxyende-aminosyre-restsekvensene av ST Ia og ST Ic og hele ST Ib-sekvensen skrevet sammen som én sekvens.

I foretrukken utøvelse når det gjelder det 14 rests poly-13

peptid er verdien av "m" 1 og R^ er en kjede inneholdende den 4 aminosyre-restsekvens av formel II. Enda mer foretrukket er de i parentes angitte aminosyrerester av formel II fra-

13

værende og Rmer en peptidkjede inneholdende aminosyre-restsekvensen av de 4 amino-enderester av ST Ib, dvs. AsnThrPheTyr, fra venstre til høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden.

Binding av 58 eller 54 aminosyrerester til syntetiske ST-polypeptider med 14 eller 18 rester kan gi en syntetisk polypeptidsekvens svarende til sekvensen av naturlig ST Ia eller ST Ic. Da imidlertid de foretrukne 14, og mer foretrukne 18, aminosyre-restsekvenser av formel I og III, kan gi antigenisk og biologisk aktivitet som er hovedsakelig lik eller bedre enn de fra naturlig ST, er syntetiske polypeptider inneholdende aminosyresekvenser lengre enn ca. de 18 aminosyrerester av formel III for å stemme overens med hele sekvensen av ST Ia og ST Ic, ikke nødvendig- heller ikke er de ønskelige. Imidlertid kan ytterligere aminosyrerester nyttig være bundet til aminoenden av polypeptidene av formel I og III.

Således kan det være ønskelig å innbefatte en ytterligere Cys-rest ved polypeptid-aminoenden for å anvende denne som et middel for festing av det syntetiske polypeptid til et annet molekyl, slik som en bærer eller en kjedende gruppe. Anvendt under slike betingelser er det hensiktsmessig å anvende en svovelatom-blokkerende gruppe forskjellig fra en konvensjonell fast fase-blokkerende gruppe med mindre den tilsatte aminoende-Cys danner en cystin-disulfidbinding med en Cys-rest innen sekvensen. En måte på hvilken et Cys-svovelatom kan blokkeres under syntesen og selektivt avblokkeres, er ved anvendelse av en isothiourea-analog av Cys som ved splitting resulterer i dannelse av en Cys-rest.

I en annen foretrukken utførelsesform kan et flertall av 14-mer eller 18-mer syntetiske ST-polypeptider bindes sammen på en hode-til-hale-måte under dannelse av en multimer ST-utførelsesform av oppfinnelsen. Denne multimer inneholder minst to av de antigeniske ST-polypeptider og fortrinnsvis

2 til 3 av slike repeterende enheter, bundet sammen gjennom en amidbinding dannet mellom aminogruppen i aminoenden av et polypeptid og carboxylgruppen av carboxyenden av det andre

polypeptid. Et eksempel på en hode-til-hale-multimer ST inneholdende 36 aminosyrerester og som har aminosyre-restsekvensen av to ST Ib-polypeptider som repeterende enheter, er beskrevet i detalj i det etterfølgende.

Hver av de ytterligere ST-repeterende enheter kan ha den sekvens som er vist i formel I. Multimere syntetiske ST-molekyler som inneholder et flertall av syntetiske ST-repeterende enheter bundet hode-til-hale, kan fremstilles ved den fast fase-syntetiske metode som er beskrevet i avsnitt II. På grunn av vanskelighetene innbefattet med syntetisering av store polypeptider foretrekkes det at slike hode-til-hale-multimerer inneholder 2 til 3 ST-repeterende enheter.

13

I en ytterligere foretrukken utførelsesform kan R -

m gruppen være et syntetisk polypeptid hvis aminosyre-restsekvens tilsvarer et protein eller polypeptid forskjellig fra ST. Eksempelvis kan determinant-aminosyre-restsekvenser fra et toxin slik som det av E. coli LT B-subenhet anvendes for å tilveiebringe et kombinert immunogen eller antigen mot begge toxiner. Anvendbare aminosyre—restsekvenser som tilsvarer determinanter av LT B-subenheten, er blitt funnet å foreligge ved stilling 37 til 62 [LT B-(37-62)] og ved stillingene 27-36 [LT B-(27-36)] fra aminoenden av det LT B hvis fullstendige aminosyre-restsekvens er blitt rapportert av Dallas et al., Nature, 288:499-501 (1982). Disse aminosyre-restsekvenser er vist i det etterfølgende fra venstre til høyre og i retning av aminoenden til carboxyenden:

Carboxygruppen av carboxy-enderesten av den ene eller andre av de ovenfor angitte polypeptider kan være bundet til aminet av amino-enderesten av ST ved en amidbinding mellom disse. En slik binding er et annet eksempel på en hode-til-hale-binding som er anvendbar i enkelte multimere ST-utfør-elsesformer slik som tidligere beskrevet. LT B-(27-36) og LT B-(37-62)-polypeptidene kan også være bundet sammen hode—

13

til-hale under dannelse av et R med hele sekvensen fra

m

stilling 27 til 62 av LT B-subenheten til aminoenden av ST.

Det er særlig hensiktsmessig å syntetisere et uoxydert første ST-polypeptid med det ovenfor angitte LT B-polypeptid bundet til amino-ende ST-resten under anvendelse av den tidligere diskuterte trinnvise, fast fase-teknikk. Dette første polypeptid oxyderes deretter under dannelse av den amino- terminale, R^3-gruppe-substituerte ST. Slike ST-molekyler vil i det etterfølgende bli angitt som LT B-(27-36)—ST

eller LT B-(37-62)—ST for å indikere nærvær av den ene eller andre av LT B-subenhet-beslektede polypeptider som bundet til et ST.

Hver av de ovenfor angitte LT B-(27-36)—ST og LT B-(37-62)—ST-polypeptider ble koplet separat til en lik vekt av tetanus toxoid under anvendelse av glutaraldehyd på lignende måte som diskutert i etterfølgende avsnitt VI A. Vaksiner fremstilt fra 400 mikrogram av de rensede konjugater ble injisert i separate kaniner i Freunds fullstendige adjuvans, etterfulgt 14 dager senere med boostere av den samme mengde av immunogen i Freunds ufullstendige adjuvans, og 7 dager deretter med boostere av den samme mengde av immunogen i alum. 7 dager deretter (dag 28) ble kaninene tappet for blod, og antistoffer overfor ST og overfor B-subenheten ble oppsamlet. Titere av disse antistoffer mot naturlig B-subenhet og syntetisk ST ga verdier på 10 og 160-3 20 for LT B-(27-36)—ST-immunogen, og verdier på 160 og 1280 for

LT B-(37-62)--ST-immunogen. Således er konjugatene av begge kjedede polypeptider immunogene, såvel som antigene (tabell 2).

<13->gruppen kan også være en kjedende gruppe i tillegg til en tilsatt Cys-rest. Innbefattet blant slike kjedende grupper er reaksjonsproduktene av det syntetiske polypeptid og: (i) omega-amino-monocarboxylsyrer inneholdende 3 til 6 carbonatomer slik som 3-alanin og 6-aminohexansyre, (ii) en dicarboxylsyre eller syreklorid eller syreanhydrid inneholdende 3 til 8 carbonatomer slik som maleinsyre, fumar-syre, ravsyreanhydrid, fthalsyreanhydrid og lignende,

(iii) en blokkert mercaptanholdig carboxylsyre innbefattende

2 til 4 carbonatomer i syrekjeden slik som et isothiourea eller derivat av thioglycolsyre eller thiopropionsyre, (iv) et dialdehyd inneholdende 2 til 8 carbonatomer slik som glutaraldehyd eller p-fthalaldehyd og lignende.

Således kan kjedende grupper inneholdende fri amino, carboxyl, mercapto og aldehydgrupper, tilveiebringes for anvendelse ved binding av det syntetiske polypeptid til et

annet molekyl slik som en bærer.

13

Rm kan ogsa være acyldelen av en monocarboxylsyre inneholdende 1 til 20 carbonatomer som danner en amidbinding med aminet av amino-enderesten av det syntetiske polypeptid. Eksempler på slike monocarboxylsyregrupper er eddiksyre, propionsyre, hexansyre, laurinsyre, myristinsyre, stearin-syre/oljesyre og lignende. En langkjedet fettsyre R^^-gruppe slik som stearoyl, bindes hensiktsmessig til et syntetisk ST for passive hemagglutinasjonsbestemmelser, mens kortkjedede

13

Rm -grupper slik som acetyl bundet til ST, tilveiebringer antigeniske aktiviteter som er ubetydelig redusert sammenlignet med det uderivatiserte 18-rest polypeptid.

Således kan de syntetiske ST-polypeptider av formel I og 13 III inneholdende R^ -gruppen, være representert ved de aminosyre-restsekvenser som er vist i formel I-A og III-A i det etterfølgende, tatt fra venstre til høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden:

hvori hver spesifikke aminosyrerest i parentes er et alternativ til den umiddelbart foregående aminosyrerest, og

1— 6 7—12 13

R R_ -, - og R -grupper er som tidligere beskrevet,

a-r g-1 m^

En utførelsesform av oppfinnelsen inneholdende Rmgruppen bundet til amino-enderesten av en 18-rest syntetisk ST som også inneholder to intramolekylære, intrapolypeptidcystin-disulf idbindinger , er representert, fra venstre til høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden av formelen:

hvori linjene mellom Cys-rester representerer intramolekylære, intrapolypeptidcystin-disulfidbindinger, hver av de 6 spesifikke aminosyrerester i parentes er et alternativ til den

umiddelbart foregående aminosyrerester, og R , R^, R<7>, R?"<1>,

a e g k

13

og Rm er som tidligere definert.

Det mest foretrukne syntetiske 18-rest ST (18-mer)

som har 3 intramolekylære, intrapolypeptidcystin-disulfidbindinger, er representert ved den aminosyre-restsekvens som er vist i formel IV, tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden:

hvori linjer mellom Cys-rester representerer intramolekylære, intrapolypeptidcystin-disulfidbindinger, og hvor hver av de 6 spesifikke aminosyrerester i parentes er et alternativ til den umiddelbart foregående aminosyrerest.

Det ovenfor angitte syntetiske polypeptid av formel IV angitt også å inneholde Rm 13-gruppe bundet til amino-enderesten, er vist i det etterfølgende, fra venstre til høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden:

II. Fremsti lling av syntetisk_ST

Det 18-rest humane ST--polypeptid (ST Ib) i uoxydert form ble syntetisert etter den velkjente fast fase-metode under anvendelse av et Beckman Model 9 90B Peptide Synthesizer, Beckman Instruments Co., Berkeley, CA. Se Houghten et al.,

Int. J. Pept. Prot. Res., 16:311-320 (1980) og Merrifield,

J. Am. Chem. Soc. , 85:2149-2154 (1963).

Kort angitt ble for hver syntese 1,00 g (0,2-0,6 milliekvivalenter/g) benzhydrylaminharpiks anvendt med den først beskyttede aminosyrerest som er a-O-benzyl-N-Boc-aspartin-syre. Vanlige sidekjedebeskyttende grupper ble anvendt for de gjenværende aminosyrerester som følger: 0-(p-brombenzyloxy-carbonyl) for tyrosin, 0-benzyl for threonin, serin og glutaminsyre, og S-methoxybenzyl for cystein. Beskyttede aminosyrer ble omkrystallisert fra egnede løsningsmidler under dannelse av enkle flekker ved tynnskiktskromatografi. Koplinger ble typisk utført under anvendelse av 10-dobbelt molart overskudd av både beskyttet aminosyre og dicyclohexylcarbo-diimid i forhold til antall milliekvivalenter begynnelses-N-terminal aminosyre. Et 2 molar overskudd av begge reagenser kan også anvendes. For asparagin ble en lik molar mengde av N-hydroxy-benzotriazol tilsatt til den beskyttede aminosyre, og dimethylformamid ble anvendt som løsningsmiddel. Alle kop-lingsreaksjoner var mere enn 99% fullstendige som vist ved picrinsyretesten ifølge Gisin, Anal. Chem. Act, 58:248-249

(1972) .

En del av den resulterende, beskyttede polypeptid-polymer (1 g) ble behandlet med 2 ml anisol, og 20 ml vannfritt hydrogenfluorid ble kondensert i reaksjonskaret ved tørris-temperatur. Den resulterende blanding ble omrørt ved 4°C i 1,0 time for å splitte de beskyttende grupper og fjerne polypeptidet fra harpiksen. Etter fordampning av hydrogen-fluoridet ved en temperatur på 4°C med en strøm av N2ble residuet ekstrahert med vannfri diethylether tre ganger for å fjerne anisolen, og residuet ble tørket i vakuum.

Det vakuumtørkede materiale ble først ekstrahert med 5% vandig eddiksyre (3 ganger 50 ml hver gang) etterfulgt av ekstraksjoner under anvendelse av 50% vandig eddiksyre

(4 ganger 50 ml). Den første ekstraksjon fjernet lavmolekylære polypeptider og tyrosin som ble anvendt i enkelte fremstillinger for å beskytte Cys-mercaptogruppene. Den andre ekstraksjon separerte det frie polypeptid fra harpiksen. Etter for-

tynning med vann til en konsentrasjon på 10-20% eddiksyre ble den resulterende løsning lyofilisert under dannelse av et monomert, uoxydert, første polypeptid.

Et således fremstilt typisk 14-rest første monomert polypeptid er representert ved aminosyre-restsekvensen, tatt fra venstre mot høyre, og i retning fra aminoenden til carboxyenden som vist i formel V:

hvori hver av de 3 spesifikke aminosyrerester i parentes er et alternativ til den umiddelbart foregående aminosyrerest, 7-12

og hvor R g-1. er som tidligere definert.

Et således fremstilt typisk 18-aminosyrerest-holdig syntetisk første monomert polypeptid er representert ved den aminosyre-restsekvens, tatt fra venstre mot høyre i retning fra aminoenden mot carboxyenden som er vist i formel VI:

hvori hver av de 6 spesifikke aminosyrerester i parentes er et alternativ til den umiddelbart foregående aminosyre-7-12

rest, og hvor R _, er som tidligere definert.

Et første, monomert polypeptid hvis aminosyresekvens tilsvarer sekvensene vist i formel I eller III, kan også fremstilles hvori minst to av a-f og g-1 er 0, slik at minst to Cys-(CysH) rester er tilstedeværende slik som diskutert tidligere. Slike polypeptider kan også innbefatte den tid- 13

ligere diskuterte R^ -gruppe.

Det første, monomere polypeptid kan anvendes i oxyda-sjonstrinnet i den renhetstilstand som erholdes etter den ovenfor angitte lyofilisering, eller dets renhet kan forøkes ved at det føres gjennom kromatografikolonner inneholdende Sephadex^G-10 eller G-50-harpikser (Pharmacia, Piscataway, N.J.) og/eller DEAE<J>5ephacel" (Pharmacia) etter metoden

ifølge Staples et al., supra. I hvert tilfelle er det viktig at det således fremstilte monomere polypeptid beskyttes mot for tidlig oxydasjon. Følgelig utføres manipuleringer på

det første, monomere polypeptid etter dets splitting fra har-piksbæreren og fjerning av de beskyttende grupper fra funksjonelle gruppeholdige aminosyrerester under ikke-oxyderende betingelser.

Etter oxydasjon av Cys-sulfhydrylgruppene under dannelse av de intramolekylære cystindisulfidbindinger som beskrevet i det etterfølgende, er det ingen frie sulfhydrylgrupper tilbake. Nærvær eller fravær av frie sulfhydrylgrupper, Cys-mercaptogrupper, ble bestemt ved metoden ifølge Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82:70-77 (1959).

Det urene, oxyderte monomere polypeptidprodukt ble renset ved gelfiltrering på Sephadex^ G-10 (Pharmacia) etterfulgt av ionebyttekromatografi på DEAE-"Sephacel" (Pharmacia). Aminosyreanalyse, gel- og papirelektroforese og andre kromatografiske data indikerte alle et homogent produkt. Det totale utbytte var ca, 25% av teoretisk. Syntetiske ST-preparater fremstilt ved 5 forskjellige anledninger, ble undersøkt med hensyn til biologisk styrke og antigenisitet. Alle ga hovedsakelig de samme responser som her beskrevet for det beskrevne preparat.

De polymere ST-multimerer hvis flertall av ST-repeterende enheter er bundet sammen med intramolekylære, interpolypeptidcystin-disulf idbindinger , ble fremstilt fra de ovenfor fremstilte monomere polypeptidprodukter ved å følge den oxydasjonsprosedyre som er beskrevet i det etterfølgende.

En første ST-multimer dimer (ST/ST) som er bundet sammen på en hode-til-hale-måte, ble fremstilt ved den ovenfor an gitte fast-fasemetode. Her ble en første ST/ST-multimer hvis hver repeterende enhet hadde ST Ib 18-mer-sekvensen, fremstilt ved serieaddisjon av 36 egnede blokkerte aminosyrerester, ved å følge den ovenfor angitte prosedyre for det første 18-mer ST-polypeptid, og deretter å gjenta samme sekvens for de neste 18 rester inntil det første 36-mer polypeptid var fremstilt.

O xydasjon sprosedyre for monomert ST

Et første polypeptid som har 18-restsekvensen av ST Ib, ble fremstilt som ovenfor diskutert, og hadde den aminosyre-restsekvens, tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden, som er vist i formel VII:

Det første polypeptid (50 mg) ble tilsatt under forsiktig omrøring til en vandig 0,1 molar ammoniumcarbonatholdig løsning (pH-verdi 7,8-8,3) under dannelse av en sluttkonsentra-sjon på 1 mg avblokkert første polypeptid pr. ml løsning. Fortsatt forsiktig omrøring i et tidsrom på 5-15 minutter ved romtemperatur ga en klar løsning av det første polypeptid.

Forsiktig omrøring ved romtemperatur ble fortsatt i et totalt tidsrom på 8 timer under hvilket tidsrom molekylært oxygen (02) i luften ble brakt i kontakt med løsningen som oxydasjonsmiddel for å oxydere de 6 Cys-rester og danne 3 intramolekylære, intrapolypeptidcystin-disulfidbindinger. Tapet av frie sulfhydrylgrupper ble fulgt med Ellman—reagens

[Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82:70-77 (1959)] og ble funnet å være 15%, 40%, 60% og 98% fullstendig ved 0,5, 1,5,

2,5 og 8,0 timer.

Det resulterende, oxyderte polypeptid ble oppsamlet ved lyofilisering. Det kunne anvendes i uren form, men ble renset ved kolonnekromatografi.

Det urene materiale ble først ført gjennom en Sephadex® G-50 (Pharmacia) kolonne (1,5 x 80 cm) ekvilibrert med 0,1 molar ammoniumacetat. Fraksjoner på 3,5 ml/20 minutter ble oppsamlet hvor materialer ble funnet i fraksjoner 12-15 og 22-28. Innholdet i disse fraksjoner ble oppsamlet ved lyofilisering og ga hhv. 10 og 36 mg. Materialet i fraksjoner 22-28 var monomert syntetisk ST som indikert ved at dets eluering var i den identiske stilling som finnes ved kromatografi av biologisk ST. Polymert syntetisk ST hvis fremstilling er diskutert ytterligere i det etterfølgende, ble også erholdt ved denne separasjon.

Den etterfølgende diskusjon angår monomert ST og etterfølges av en diskusjon vedrørende fremstilling av multimere syntetiske ST-molekyler under undertittelen "Fremstilling av multimert ST".

Det delvis rensede monomere syntetiske ST kunne igjen anvendes som det var, men ble renset ytterligere ved kromatografi på DEAE-Bio Gel A- (Bio Rad, San Raphael, CA) kolonne (1,0 x 25 cm). Eluering ble utført under anvendelse av en trinnvis gradient hvor hovedmengden av materiale eluerte mellom 50 og 100 millimolar natriumklorid. Dette materiale ble oppsamlet ved lyofilisering.

Det lyofiliserte materiale ble oppløst på nytt i vann og ble avsaltet på en Sephadex® G-25 (Pharmacia) kolonne. Det resulterende materiale ble oppsamlet ved lyofilisering under dannelse av 28 mg rent, syntetisk ST, hvilket representerer et utbytte på 56% basert på vekten av det urene, første polypeptid. Aminosyreanalyse av det således fremstilte syntetiske ST ga følgende verdier basert på et 18-rest polypeptid (teoretisk i parentes):

Den biologiske aktivitet av dette syntetiske ST ble bestemt ved den diegivende musebestemmelse ifølge Giannella, Infect. Immunity, 14:95-99 (1976) og ble funnet å være hovedsakelig den samme som biologisk ST slik som vist i fig. 1. Hovedsakelig identitet når det gjelder sekresjonsresponser i ombundne ileumsløyfer mellom syntetiske og biologiske ST-molekyler er vist i fig. 2.

Den mer betydningsfulle antigenisitet av syntetisk ST ble sammenlignet med den av biologisk ST ved reaktivitet mot antistoffer overfor biologisk ST under anvendelse av ELISA-teknikken ifølge Klipstein et al., Infect. Immunol., 37:550-557 (1982). Disse resultater er illustrert i fig. 3 som viser at antigenisiteten av det syntetiske ST ifølge denne fremstilling var ca. 70% av antigenisiteten av biologisk ST. Imidlertid illustrerer fig. 4 at seronøytralisering på sekresjonseffekter av hyperimmunt sera var praktisk talt identisk.

Lokalisering av intramolekylære disulfidbindinger i monomert ST

De tre intramolekylære, intrapolypeptide disulfidbindinger ble funnet å dannes i forskjellig grad. Denne observa-sjon muliggjorde identifisering av lokaliseringen av parene av Cys-rester som kombineres under dannelse av disulfidbindingene.

Således ble ytterligere preparater av det ovenfor beskrevne første polypeptid oxydert under samme betingelser, og de frie sulfhydrylgrupper ble alkylert med jodeddiksyre eller jodacetamid til forskjellige tider under oxydasjonsreaksjonen. De resulterende delvis oxyderte-delvis alkylerte polypeptider ble deretter fulgt under anvendelse av en Beckman modell 890 sekvenser (Beckman Instruments Co.) for å bestemme hvilke Cys-rester som ble alkylert på de forskjellige tidspunkter under oxydasjonsreaksjonen. Forholdet mellom alkylerte Cys-rester ved gitte stillinger i det delvis alkylerte-delvis oxyderte ST sammenlignet med fullstendig alkylert-uoxydert ST gjenspeilet lokaliseringen og rekkefølgen for dannelsen av disulfidbindingene.

Et 10-dobbelt molart overskudd av alkyleringsmiddel ble anvendt i forhold til antall mol Cys-rest. Oxydasjons-alkyleringsreaksjonsblandingen ble omrørt i et tidsrom på 10 minutter etter tilsetning av alkyleringsmidlet, etterfulgt av tilsetning av et 10-dobbelt overskudd av dithiothreitol i forhold til alkyleringsmidlet, og ble ytterligere omrørt i 1 time for å forbruke alkyleringsmidlet.

De intramolekylære, intrapolypeptidcystin-disulfidbindinger i det monomere syntetiske ST ble funnet å bli dannet mellom den første og femte, andre og fjerde, og tredje og sjette Cys-rest fra aminoenden; dvs. de Cys-rester som tilsvarer restene av ST Ib nummerert 5 og 10, 6 og 14, og 9 og 17 fra aminoenden. Disse Cys-rester tilsvarer også Cys-restene bundet til R1 og R5, R^ og R^, ogR^ og R^ hvis still-a e d d cx inger fra carboxyenden i det her fremstilte 18-restpolypeptid er analoge med carboxyendestillingene i 14-restpolypeptidet vist i formel I.

Dannelsesgraden ble funnet å være i rekkefølgen av Cys-restene av R^ og R^, etterfulgt av Cys-restene av R^ og R^ og

deretter etterfulgt av Cys-restene av R^ og R^. Ved anvend-

a e

else av nummerering fra aminoenden av ST Ib var rekkefølgen av disulfidbindingsdannelsen mellom Cys-restene nummerert 6 og 14, deretter 9 og 17 etterfulgt av 5 og 10.

Den primære og sekundære struktur av det således fremstilt monomere syntetiske ST var fra aminoenden til carboxyl-enden derfor:

hvori linjene som sammenbinder Cys-restene, representerer de intramolekylære, intrapolypeptidcystin-disulfidbindinger som ble dannet mellom disse rester.

Graden av intramolekylær, intrapolypeptidcystin-disulf idbindingsdannelse som en funksjon av pH-verdien under anvendelse av det ovenfor beskrevne humane ST første polypeptid og oxydasjon med molekylært oxygen brakt i kontakt med en forsiktig omrørt løsning inneholdende 1 mg pr. ml av det første polypeptid/ er vist i det etterfølgende:

Omrøringshastighet og temperatur påvirker også oxyda-sjonshastigheten. Økninger i den ene eller begge parametre gir hurtigere oxydasjonshastighet og disulfidbindingsdannelse.

En studie ble også utført for å fastslå effekten av pH-verdien ved hvilken oxydasjonen av det første polypeptid ble utført. Også her ble det ovenfor angitte 18-mer første polypeptid anvendt, og dette ble oxydert ved romtemperatur til en konsentrasjon på 1,0 mg pr. ml, og inntil ingen frie sulfhydrylgrupper kunne påvises med Ellman-reagenset som tidligere diskutert. De første polypeptider ble oppløst i en vandig løsning inneholdende 0,1 molar ammoniakk. Etter opp-løsning ble pH-^verdiene på løsningene nedsatt under anvendelse av en løsning på 50% vandig eddiksyre. Antigenisiteter etter lyofilisering og uten rensing ble bestemt i forhold til antigenisiteten av biologisk ST under anvendelse av den tidligere diskuterte ELISA-teknikk. Resultatene er vist i det etterfølgende:

Sammenligning av fysikalske egenskaper av monomert syntetisk

og biologisk ST

Tynnskiktskromatografi under anvendelse av cellulosebelagte plastark (Eastman Kodak, Inc., Nutley, NJ) og et løs-ningsmiddel av butanol:eddiksyre:vann (200:30:75 volumdeler)

ga en RF~verdi på 0,307 for det ovenfor fremstilte syntetiske ST som har 3 intrapolypeptid-disulfidbindinger. Staples et al., supra, rapporterte en Rp-verdi på 0,8-0,9 under anvendelse av det samme løsningsmiddelsystem og cellulosebelagte glass-plater (Eastman).

Papirelektroforese via pH 2,1, 500 V i 90 minutter ved romtemperatur ga en Rp-verdi på 0,80 i forhold til lysin for det ovenfor angitte syntetiske ST. Staples et al., supra, rapporterte under anvendelse av tynnskiktselektroforese på cellulose ved pH 1,9 en mobilitet for biologisk ST som var tilnærmet den samme som den for glutaminsyre. Omdannelse av glutaminsyremobilitet under de betingelser som anvendt av Staples et al. til mobiliteten av lysin under de betingelser som ble anvendt for det syntetiske ST, gir en relativ Rp-

verdi på 0,50 for biologisk ST.

Preliminære resultater fra optiske rotasjonsdispersjons-bestemmelser under anvendelse av det ovenfor angitte syntetiske ST og dets biologiske motpart, viste at de to molekyler er forskjellige.

Monomere syntetiske ST— molekyler innehold ende to disulfidbindinger

Syntetiske 18-rest-polypeptider analogt med humane ST Ib-molekyler ble fremstilt på hovedsakelig samme måte som den som er beskrevet ovenfor, med det unntak at par av Cys-rester ble erstattet i det første polypeptid og resulterende,

7-12 oxyderte, monomere ST-molekyler med alternative Rg_^ -grupper som ikke tilveiebrakte noen ionisk ladning til det syntetiske ST-polypeptid når dette polypeptid oppløses i vandig løsning til fysiologiske pH-verdier. De således fremstilte syntetiske ST-molekyler ble deretter bestemt med hensyn til deres anti-7-12 geniske og biologiske aktiviteter. Rg-i -gruppene anvendt i disse bestemmelser, var aminosyren serin (Ser).

Det første polypeptid fra hvilket disse syntetiske ST Ib-analoger ble fremstilt, hadde aminosyresekvensen, tatt fra venstre mot høyre i retning fra aminoenden til carboxyenden som vist i formel VIII:

7-12 hvori hver av Rg_^ -gruppene var en alternativ Ser-rest til den umiddelbart foregående Cys-rest.

For denne gruppe av immunologiske bestemmelser såvel som for alle andre slike bestemmelser ble de hapteniske syntetiske ST Ib-og biologiske ST Ib-molekyler først koplet til svineimmunoglobulin G (PIG) som en bærer i hovedsakelig samme mengder og under hovedsakelig samme betingelser som diskutert i avsnitt IV i det etterfølgende. Antisera ble deretter dannet mot de således fremstilte immunogener. Disse med to antiseras evne til å erkjenne hvert av ST-molekylene, ble målt og sammenlignet ved hjelp av den tidligere diskuterte ELISA-teknikk ifølge Klipstein et al., Infect. Immun., 37:550-557 (1982). Erkjennelse av renset syntetisk ST og biologisk ST av deres egne antisera ble satt til 100%, og graden av erkjennelse for hvert av de andre ST-molekyler ble deretter beregnet. Den diegivende musebestemmelse ble anvendt for å bestemme biologisk aktivitet.

7-12 For disse sammenlignende bestemmelser ble par av Rg_^ anvendt hvori verdien av fire av g-1 var 0, mens verdien 7-12

av to av g-1 var 1. Parene av anvendte alternative R g-1, - grupper var de hvis foregående par av Cys-rester er vist i formel I for 14-rest-polypeptidet for å bli bundet til

gruppene R1 og R5, R og R^, og R, og R^. Disse grupper cl S G I O Q svarer til Cys-restene nummerert 5 og 10, 6 og 14 og 9 og 17

7-12

fra aminoenden av ST Ib aminosyresekvensen. R , -gruppene

7 11 9^ 12

for hvilke g-1 var 1, var derfor R og R, , R. og R, , og

8 10 g k i i

R^og Rj , av aminosyresekvensen av formel VIII. Resultatene av disse sammenligninger er vist i tabell 1 sammen med standarder for biologisk ST Ib, det ovenfor fremstilte syntetiske ST Ib og svine ST Ia.

Resultatene i den ovenfor angitte tabell illustrerer flere trekk ved oppfinnelsen. For det første kan betydelig immunologisk aktivitet, eksempelvis antigenisitet, erholdes uten nærvær av 3 disulfidbindinger i ST-molekylet. Et annet og beslektet trekk viser at alle av Cys-restene ikke be-høves og at enkelte kan erstattes med andre aminosyrerester. For det tredje kan biologisk aktivitet som kan føre til diaré i et vaksinert dyr, reduseres, mens betydelig antigenisk aktivitet opprettholdes.

Et fjerde trekk ved oppfinnelsen som de ovenfor angitte resultater illustrerer, er at det biologiske ST Ib-molekyl og det syntetiske ST Ib-molekyl inneholdende 3 disulfidbindinger, er immunologisk forskjellige enheter som derved fremhever de tidligere observerte forskjeller i kromatografiske, elektroforetiske og optiske rotasjonskarakteristika for de to molekyler. Således erkjente antistoffer overfor biologisk ST det syntetiske ST 263% bedre enn de erkjente det biologiske ST overfor hvilket de var dannet. På lignende måte erkjente antistoffer dannet mot det syntetiske ST biologisk ST bare 35% så bra som de erkjente det syntetiske ST.

Forskjellen mellom de syntetiske og naturlige ST-molekyler underbygges ennvidere av ST Ia (svin) som knapt ble erkjent av antistoffer overfor syntetisk ST, men som ble erkjent 10 til 100 ganger bedre av antistoffer dannet overfor bilogisk ST enn biologisk ST i seg selv, idet man må ta i be-traktning det faktum av 450%-verdien kan være unormalt høy. Selv om verdien på 4 50% er for høy med en faktor på ca. 5, erkjente antistoffene dannet overfor biologisk ST Ib svine-ST Ia minst 20 ganger bedre enn hva antistoffene gjorde overfor det syntetiske ST Ib. Hvis de biologiske og syntetiske ST Ib-molekyler var de samme, ville antistoffer overfor hver

av disse kunne forventes å erkjenne svine ST Ia med tilnærmet samme effektivitet. Da dette avgjort ikke var tilfelle, må biologiske ST Ib-og syntetiske ST Ib-molekyler være forskjellige selv om begge inneholder identiske primæraminosyresekvenser og begge inneholder 3 intramolekylære disulfidbindinger.

Andre fremstilling er av monomert ST

Ytterligere første polypeptider og ST-molekyler er blitt fremstilt (i) via forskjellige oxydasjonsmåter, (ii) med forskjellige aminosyresekvenser fra ST Ib, (iii) erstatninger av forskjellige R ,^-grupper, (iv) alkylerte Cys-R --grupper

13 g a

og (v) R -grupper bundet til den N-terminale aminosyrerest av

det 18-rest ST Ib molekyl. Mange av disse materialer er blitt undersøkt med hensyn til antigenisk og/eller biologisk aktivitet ved de ovenfor angitte ELISA- og diegivende muse-teknikker under anvendelse av antisera overfor syntetisk ST fremstilt i (3) i det etterfølgende. Resultatene av flere av disse fremstillinger og utprøvinger er oppført i etter-følgende tabell 2.

^ Et første polypeptid svarende til sekvensen av formel VIII hvori g-1 var 0, ble anvendt for hver av (1)-(17). Første polypeptider tilsvarende de ST Ib-carboxyterminale 14-aminosyrer og 15-aminosyrer, ble anvendt i (18) og (19). Første polypeptider tilsvarende de angitte substitusjoner til sekvensen i formel VIII, ble anvendt for (20)-(22) og ble deretter oxydert. Reaksjonsbetingelser ble tilveiebrakt i rekkefølgen

temperatur; konsentrasjon av første polypeptid i mg/ml; molarkonsentrasjon av tilsatte bestanddeler; pH-verdi ved hvilken oxydasjonen ble startet; og varighet av oxydasjons-prosedyren. Hver løsning ble forsiktig omrørt for å bringe løsningen i kontakt med atmosfærisk molekylært oxygen som oxydasjonsmiddel med mindre annet er angitt. Produktene ble utprøvet uten ytterligere rensing.<2>ELISA ble utført som angitt i tabell 1 med antisera dannet mot ST fremstilt som i (3) som basis for sammenligningene. Dette ST-preparat ble renset før kopling, mens preparat (3) viser resultatene for det urensede preparat.<3>Den diegivende museutprøvning ble utført som angitt i tabell 1 hvor prosentene er basert på verdien for biologisk ST, verdiene i parentes er nanogram av ST som tilveiebringer et tarm/helkroppsforhold på 0,083.

4

N.D. = ikke bestemt.

Det er antatt at den erholdte antigenisitetverdi er unormalt lav.

De ovenfor angitte resultater illustrerer at den høyeste antigeniske aktivitet (ELISA) oppnåes under oxyda-sjonsbetingelser hvori det første syntetiske polypeptid er tilstede i løsningen ved en konsentrasjon på mindre enn 2 mg pr. ml, hvor oxygen i luften er oxydasjonsmidlet, pH-verdien er under 10 og i særdeleshet hvor pH-verdien er 7,5 til 8,0, temperaturen under reaksjonen er fra 0 til 25°C, og hvor oxydasjonsreaksjonstiden er mindre enn 24 timer.

Fre mst illing av multim ert ST

A. Mu ltimer syntetisk ST- dimer ( ST/ ST)

Et første polypeptid som har 36-restsekvensen av to

ST Ib-molekyler forbundet hode-til-hale med en amidbinding, ble fremstilt ved den trinnvise, fast fase-syntesen som tid ligere er beskrevet. Aminosyre-restsekvensen av dette materiale, tatt fra venstre mot høyre og i retning av fra aminoenden til carboxyenden, er vist i formel IX:

Dette molekyl ble deretter oppløst til en konsentrasjon på 1 mg pr. ml i en 0,05 molar ammoniumbicarbonatbuffer med en pH-verdi på 8,0. Den resulterende løsning ble omrørt forsiktig i nærvær av atmosfærisk molekylært oxygen som oxydant inntil frie sulfhydrylgrupper ikke kunne påvises med Ellman-reagenset, supra, dvs. over natten. De således fremstilte ST/ST—molekyler ble fraskilt fra det gjenværende materiale i reaksjonsmediet ved kolonnekromatografi, ble frysetørket og deretter anvendt uten ytterligere rensing. Aminosyreanalyse av det første 36-mer polypeptid var i overensstemmelse med sekvensen vist i formel IX.

Det resulterende ST/ST uten ytterligere rensing hadde en antigenisitet overfor antistoffer dannet mot naturlig, monomert ST på 233% sammenlignet med antigenisiteten av det naturlige ST Ib overfor disse samme antistoffer. Den biologiske aktivitet av dette ST/ST var mindre enn 1% av aktiviteten av naturlig ST Ib i den diegivende museundersøkelse, supra, opptil forsøksgrensene, her 640 nanogram.

Syntetisk trimer (ST/ST/ST), tetramer (ST/ST/ST/ST), og lengre hode-til-hale-multimerer av syntetisk ST kan fremstilles på lignende måte. Syntetisk dimer og trimer ST-molekyler er særlig foretrukne på grunn av vanskelighetene man støter på ved fremstilling av syntetiske polypeptider som inneholder mere enn totalt 60 aminosyrerester.

Resultater under anvendelse av den syntetiske dimer (ST/ST) ved fremstilling av en vaksine er diskutert mer detaljert i etterfølgende avsnitt V.

B. Multim er syntetisk ST- polymer

Det første syntetiske 18-mer ST Ib polypeptid som tidligere beskrevet, ble anvendt illustrativt for fremstilling av syntetiske ST-polymerer hvis flertall av syntetiske ST-repeterende enheter er kjedet sammen ved intramolekylære, interpolypeptidcystin-disulfidbindinger.

Ved en illustrativ fremstilling ble det polymere syntetiske ST (heretter enkelte ganger angitt som P-ST) fremstilt ved oppløsning av det overfor fremstilte, første syntetiske ST-polypeptid (18—mer) i 0,1 molar ammoniumbicarbonatbuffer med en pH-verdi på 8,0 under dannelse av en løsning som har en konsentrasjon på 1 mg pr. ml av det første syntetiske ST-polypeptid. Volumer av slike løsninger på 10

til 100 ml ble anvendt. Den således fremstilte løsning ble omrørt forsiktig ved romtemperatur i et åpent kar for å tilveiebringe oxydasjon av Cys-rnercaptaner. Analyse av reaksjonsmediet etter en oxydasjonstid på 16-24 timer under anvendelse av Ellman-reagenset, supra, indikerte at ingen frie sulfhydrylgrupper var tilstede.

Det oxyderte reaksjonsmedium ble lyofilisert, og det resulterende, tørkede materiale ble resuspendert i en 0,1 molar ammoniumbicarbonat-(pH 8,0-8,5) buffer og ble anbrakt på en Sephadex® G-50 kromatografikolonne ekvilibrert med samme buffer for separering. En typisk separering av polymert syntetisk ST (P-ST) fra monomert syntetisk ST (M-ST) er illustrert i kurven på fig. 17 under anvendelse av en slik kolonne.

Ordinaten på kurven er i enheter av optisk tetthet av-lest ved 278 nanometer. Abscissen viser nummererte fraksjoner på 4,5 ml hver av eluat oppsamlet fra kolonnen. Elu-atet fra fraksjoner nummerert 5-9, ble oppsamlet idet disse inneholdt P-ST, mens fraksjonene nummerert 10-17 ble oppsamlet idet disse inneholdt syntetisk monomert ST (M-ST).

Fraksjonering av det således erholdte P-ST under anvendelse av en kolonne inneholdende Bio Rad P-30 (Bio Rad,

San Raphael, CA) som den separerende harpiks, indikerte at hovedmengden av P-ST isolert under anvendelse av Sephadex® G-50-kolonnery hadde en midlere molekylvekt på minst 40.000 dalton (40 kd P-ST). Ytterligere fraksjonering av 40 kd P-ST under anvendelse av Bio Gel A-I,5 m harpiks (Bio Rad) indikerte at mesteparten av dette materiale hadde en midlere molekylvekt på 400.000 dalton og hvor noe materiale hadde en molekylvekt på over 1.500.000 dalton (1500 kd P-ST). Ytterligere molekylvektfraksjonering under anvendelse av en kolonne inneholdende Bio Gel A-I,5 m harpiks (Bio Rad) opp-løste det 1500 kg P-ST i en fraksjon som innbefattet P-ST med en molekylvekt på over 15.000.000 dalton (15.000 kd P-ST) og en andre fraksjon med en midlere molekylvekt på 4.000.000 dalton (4.000 kd P-ST).

De ovenfor angitte molekylvekter er tilnærmede basert på en antatt globular form for P-ST og en kjennskap til hulvolumet og ekslusjonsgrensene for kolonnen, men uten anvendelse av indre standarder med kjente molekylvekter. Hver av de ovenfor erholdte fraksjoner ble lyofilisert etter eluering fra kolonnen.

De etterfølgende beskrevne resultater (avsnitt V og VI) under anvendelse av P-ST er for lyofiliserte, Sephadex® G-50 rensede preparater som for det meste inneholder polymer hvis midlere molekylvekt er minst 40.000 dalton, dvs. 40 kd P-ST. Arbeider foregår for tiden når det gjelder antigenisitet, immunogenisitet og biologisk aktivitet av fraksjoner av P-ST med varierende molekylvekter.

Typiske preparater av 40 kd P-ST har en antigenisitet overfor antistoffer mot naturlig ST Ib på mellom 900 og 1500% av antigenisiteten av det naturlige materiale (ST Ib)

og har en biologisk aktivitet ved den diegivende museunder-søkelse, supra, på 20% eller mindre enn aktiviteten av naturlig ST Ib.

Gene rell syntetisk prosedere

En generell syntetisk prosedyre for fremstilling av et monomert eller multimert syntetisk ST-molekyl som har minst 10% av antigenisiteten av biologisk ST basert på de ovenfor angitte resultater og flere andre bestemmelser, er som følger:

(1) Et monomert, første syntetisk polypeptid fremstilles i hovedsakelig fravær av oxydasjonsmiddel. Det første syntetiske polypeptid innbefatter aminosyre-restsekvensene av formel I, formel III, formel V, formel VI eller formel IX, minst to Cys-rester hvis R 1—6- -grupper er hydro- cL~L. gen; dvs. to CysH-rester, og er fri for enhver intramolekylær, cystindisulfidbinding, og kan inneholde en Rm 13-gruppe hvori "m" har verdien 1. (2) Det således fremstilte første polypeptid tilveiebringes og oppløses eller dispergeres i et vandig materiale til en konsentrasjon på mindre enn 5 mg pr. ml, mere fordelaktig til en konsentrasjon på mindre enn 2 mg pr. ml og helst til en konsentrasjon på 1 mg pr. ml til 0,1 mg pr. ml. pH-verdien på materialet i hvilket det første polypeptid opp-løses eller dispergeres, er fortrinnsvis alkalisk og mindre enn 10,5, og fortrinnsvis 7,5 til 10,5. (3) Det første polypeptidholdige materiale bringes deretter i kontakt med molekylært oxygen i luften som oxydasjonsmiddel. pH på løsningen under oxydasjonen er fortrinnsvis 7,0 til 9,5, og mer fordelaktig fra 7,5 til 9, og helst fra 7,5 til 8,0. Løsningen bringes fortrinnsvis i kontakt med oxydanten ved forsiktig omrøring i et åpent kar. (4) Kontakt mellom materialet og luft opprettholdes i et tidsrom på fra 1 til 24 timer, og mere fordelaktig i fra 2 til 8 timer under dannelse av minst én intramolekylær, intrapolypeptid eller interpolypeptidcystin-disulfidbinding fra minst to tilstedeværende Cys (CysH)-rester. For monomert syntetisk ST og hode-til-hale ST-multimerer er den i det minste ene cystin-disulfidbinding en intramolekylær, intrapolypeptidbinding, mens for det polymere syntetiske ST (P-ST) er den i det minste ene cystin-disulfidbinding en intramolekylær, interpolypeptidbinding. Det foretrekkes at hver ST-repeterende enhet av P-ST danner gjennomsnittlig to interpolypeptidcystin-disulf idbindinger slik at P-ST-molekylene

som har mer enn to ST-repeterende enheter, dannes.

I en foretrukken utførelsesform for fremstilling av monomert syntetisk ST dannes disulfidbindingen mellom Cys-restene som går forut for parene R7 og B.}^, R^ og R^°, og R?129<*>n 3 i og R1i formel I, III, V eller VI, hvilket svarer til stillingene av restene nummerert 5 og 10, 6 og 14, og 9 og 17 fra aminoenden av ST Ib-molekylet. I en mer foretrukken utførelses-form opprettholdes kontakten mellom molekylært oxygen og løs-ningen i et tidsrom tilstrekkelig til å danne to disulfidbindinger, fortrinnsvis mellom de ovenfor angitte par av Cys-rester, og mer fortrinnsvis i et tidsrom tilstrekkelig til å danne tre disulfidbindinger, igjen fortrinnsvis mellom angitte par av Cys-rester.

Oxydasjonen utføres fortrinnsvis med en temperatur på

0 til 25°C.

(5) Etter fullføring av oxydasjonsreaksjonen oppsamles det syntetiske ST ved lyofilisering og renses ved kolonnekromatografi.

III. Anvendelse av monomert syntetisk ST

Det monomere syntetiske ST fremstilt som ovenfor diskutert, ble kjedet til et bærermolekyl eller anvendt alene i ELISA-målinger i studier utført under ledelse av dr. Fredrick A. Klipstein, University of Rochester Medical Center, Rochester, New York. Resultatene av eksperimentelle bestemmelser og prosedyrene for utførelse av disse bestemmelser er diskutert her og i avsnitt IV i det etterfølgende. Med mindre annet er angitt, ble studiene diskutert i avsnitt III og IV utført med det monomere syntetiske ST (M-ST) ifølge oppfinnelsen .

A. Egenskaper

ST Ib renset til homogenitet fra human E. coli LT /ST+ stamme 18D (042:H47) har en anslått molekylvekt på 1.972 og består av 10 forskjellige aminosyrer arrangert i en rekkefølge på 18 aminosyrer [Staples et al., supra] hvis primærstruktur ble av Chan et al., supra, vist å være AsnThrPheTyrCysCysGluLeuCysCysTurProAlaCysAlaGlyCysAsn. Et syntetisk molekyl med denne primærstruktur ble fremstilt (avsnitt II), og de biologiske egenskaper av dette polypeptid ble sammenlignet med det av rent ST erholdt ved bakterievekst av stamme 18 D (biologisk ST).

Evne til å fremkalle væskesekresjon

Syntetisk og biologisk ST var hovedsakelig like kraftige i deres evner til å fremkalle væskesekresjon ved den diegivende museundersøkelse (fig. 1) og rotteombundne ileum-sløyfer (fig. 2). De ubetydelige observerte variasjoner i de minimale effektive doser av de to toxiner i hver forsøks-modell var innen området for eksperimentell variasjon, og i realiteten fremkalte flere påfølgende fremstilte preparater av syntetisk ST en identisk respons med den av naturlig eller biologisk ST i den diegivende museundersøkelse. Eksponering for 100°C i 30 minutter påvirket ikke styrken av noe toxin i noen av dyreundersøkelsessystemene.

Tidligere observasjoner har vist at destruksjon av disulfidbroene i biologisk ST ved behandling med reduserende reagenser slik som 2—mercaptoethanol eller dithiothreitol opphevet dets biologiske aktivitet, Staples et al., supra. Eksponering av syntetisk ST overfor 5 x 10 -4 molar dithiothreitol i 60 minutter opphevet også dets sekresjonsaktivitet ved den diegivende museundersøkelse.

Immunologisk forhold

Antigenisitetene av syntetisk og biologisk ST var like når hvert ble testet ved enzymkjedet immunosorbentutprøvning (ELISA) under anvendelse av hyperimmune antisera overfor biologisk ST. Når de konsentrasjoner som ga en optisk tetthet på 0,600 ved 410 nm ble sammenlignet, ble antigenisiteten av syntetisk ST observert å være 70% av antigenisiteten av biologisk ST (fig. 3), men antigenisiteten av toxinene var identisk når begge ble testet under anvendelse av hyperimmunt antisera overfor syntetisk ST. Disse resultater ble betydelig forbedret i senere preparater som illustrert i tabell 1 ovenfor, hvor syntetisk ST var ca. 3 ganger bedre enn biologisk ST Ib i denne samme ELISA-undersøkelse.

For å bestemme den nøytraliserende effekt av hyperimmunt antisera overfor enten syntetisk eller biologisk ST på sekre-sjonseffekten av toxinene i den diegivende museundersøkelse ble 3 mus for hvert datumpunkt gitt 100^ul intraintestinalt inneholdende 2 museenheter (MU), to ganger den minimale effektive dose (se materialer og metoder avsnitt IV A) av hver toxin som var blitt inkubert med den angitte antiserumfortynning i 3 timer ved 37°C (fig. 4). Antall av museenheter nøytralisert av 1 ml antiserum, ble utledet ved å multi-lisere den planlagte antiserumfortynning som var nødvendig for å nøytralisere (dvs. utbytte tarm:helkropp på minst 0,08 3)

den sekretoriske effekt ganger den tidoble fortynningsfaktor ganger faktoren på 2 for å justere for de to anvendte museenheter.

Hyperimmunt antisera overfor hvert av toxinpreparatene seronøytraliserte den sekretoriske effekt ved den diegivende museundersøkelse av syntetisk og biologisk ST til den tilnærmede samme grad: 1 ml av hyperimmunt kaninantiserum overfor biologisk ST nøytraliserte 160 MU av syntetisk og 190 MU av biologisk ST, mens 1 ml av geite-hyperimmunt antiserum overfor syntetisk ST nøytraliserte 220 MU av syntetisk og 240 MU av biologisk ST.

Immunisering av rotter

Immunisering med syntetisk ST ga serum-antitoxintitere på 1:32 (fire ganger større enn for kontrollene) og mucosale IgA-titere på 1:64 (fem ganger større enn for kontrollene). Væskesekresjon ble redusert i en betydelig grad somvar sammen-lignbar med en mengde som tidligere var blitt observert i rotter immunisert med halvrent biologisk ST [Klipstein, et al., Infect. Immun., 34:637-639 (1981)] i rotter utfordret med enten syntetisk eller biologisk ST og med den levedyktige ST-produserende stamme (tabell 3) i det etterfølgende.

De ovenfor angitte resultater viser at immunisering med et syntetisk fremstilt ST-toxin hvis struktur er basert på den av humant ST, gir beskyttelse mot utfordring med ST-produserende enterotoxigene stammer av E. coli av human opprinnelse .

Ytterligere detaljer ved de studier som er diskutert i dette avsnitt (III A), kan finnes i Klipstein et al., Infect. Immun., _39:117-121 (1983).

B. ST- LT- konjugater

Resultatene diskutert i dette avsnitt, angår konjugat-materialer og deres egenskaper erholdt ved tverrbinding, under forskjellige betingelser, av syntetisk ST (avsnitt II) til enten LT holotoxin eller dets ikke-toksiske komponent, B-subenheten som en bærer som er ansvarlig for binding av toxinet til spesifikke reseptorer på slimhinneoverflaten. Effektiviteten av en vaksine bestående av syntetisk ST tverrbundet til B-subenheten når det gjelder å danne spesifikke serum og mucosale antitoxinresponser overfor hvert av komponenttoxinene, er også blitt demonstrert, hvilket således tilveiebringer en sterk beskyttelse i immuniserte rotter mot utfordring med den ene aller andre toxinform eller heterologt levedyktig ETEC som produserer enten ST eller LT.

Konjugasjon av ST til LT

Syntetisk ST ble konjugert til LT-holotoxinet ut fra et begynnelsesmolarforhold mellom ST og LT på 100:1 under anvendelse av forhold mellom l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDAC) og totalt konjugatprotein som varierte mellom 0,5:1 til 40:1 (fig. 5). Kopling av den maksimale mengde av ST til LT fant sted ved et EDAC til konjugatforhold på 1:1,

men en uakseptabel grad av rest LT-toksisitet forelå imidlertid ved dette forhold. Økning av forholdet mellom EDAC og konjugatprotein resulterte i en progressiv nedsettelse i rest LT-toksisitet, men dette var ledsaget av en tilsvarende reduksjon i antigenisiteten av begge toxiner i konjugatet.

Et EDAC/konjugatforhold på 20:1 resulterte i et konjugat med en akseptabel grad av redusert LT-toksisitet (0,3%), men antigenisiteten av begge komponenttoxiner var redusert til mindre enn 25% ved dette forhold, hvilket indikerer at dette konjugat ville være et virkningsløst antigen. Disse observasjoner ledet til anvendelse av den ikke-toksiske B-subenhet istedenfor LT, hvilket førte til at man omgikk problemet med LT-toksisitet.

Konjugasjon av ST til B- subenhet

Syntetisk ST ble konjugert til B-subenhet ut fra et begynnelsesmolarforhold mellom ST og B-subenhet på 100:1,

under anvendelse av EDAC/konjugatproteinforhold som varierte mellom 0,5:1 og 40:1. Mønsteret av ST-innarbeidelsen og forandringene i antigenisiteten var lik de som ble observert for ST-konjugasjon til LT med det unntak at den maksimale mengde av ST ble koplet ved et EDAC/konjugatforhold på 2:1. Toksisiteten av konjugatet erholdt ved dette forhold, ble begrenset til toksisiteten av tilstedeværende ST; og den var redusert til 0,3% av usvekket toxin.

Et EDAC/konjugatforhold på 2:1 ble derfor anvendt i studier som gjorde bruk av radiomerket ST for å bestemme inn-flytelsen av begynnelses-molarforholdet mellom ST og B-subenhet på mengden av ST innarbeidet i konjugatet. 10 nanomol ST

(5 nanomol kald, umerket ST pluss 5 nanomol radiomerket ST) ble blandet med fra 2 til 0,1 nanomol B-subenhet som ga begynnelses-molarforhold mellom ST og B-subenhet på fra 5:1 til 100:1

(fig. 6). Økning av begynnelsesforholdet mellom ST og B-subenhet resulterte i progressivt større mengder av ST koplet til B-subenheten. Selv om et begynnelsesforhold mellom ST og B-subenhet på 25:1 ga et sluttkonjugat som inneholdt mere enn 90% på molarbasis, var mengden av ST bare 25% på vektbasis, og den sistnevnte verdi ble øket når større begynnelsesmolarforhold ble anvendt.

A ntigenisitet av konjugatene

Effekten av EDAC-konsentrasjonen på materialet og antigenisiteten av de individuelle toxiner i de sluttelige konjugater ble bestemt ved konjugering av et 50:1 molarforhold av ST i forhold til B-enhet under anvendelse av EDAC/konjugatforhold som varierte mellom 1:1 og 2:1 (fig. 7). Maksimal konjugasjon av ST fant sted ved et EDAC/konjugatforhold på

2:1, men forhold på mer enn 1,5:1 resulterte imidlertid i et bratt fall i ST-antigenisitet og en moderat nedsettelse i B-subenhet-antigenisitet. Det maksimale antall ST-antigen-enheter (utledet ved å multiplisere prosenten av tilstedeværende toxin ganger prosenten av dets antigenisitet) ble oppnådd ved et EDAC/konjugatforhold på 1,5:1.

Et EDAC/konjugatforhold på 1,5:1 ble derfor anvendt i studier som bestemte effekten av begynnelsesmolarforholdet mellom ST og B-subenhet på sammensetningen og egenskapene av det sluttelige konjugat. Økning av begynnelsesmolarforholdet mellom ST og B-subenhet fra 50:1 til 100:1 resulterte i en progressivt større mengde av ST i det sluttelige konjugat

(fig. 8) .

Da forandringer i begynnelsesmolarforholdet ble oppnådd ved å holde mengden av ST (300 nanomol) konstant og å redusere mengdenav tilsatt B-subenhet (fra 6 til 3 nanomol), øket for holdet mellom EDAC og ST, mens forholdet mellom EDAC og B-subenhet steg ettersom begynnelsesmolarforholdene ble øket. Denne forandring forklarte det faktum at ST-antigenisiteten steg svakt, mens antigenisiteten av B-subenheten falt moderat. Nettoeffekten av disse to faktorer (sammensetning og antigenisitet) var at en økning av begynnelsesmolarforholdet resulterte i progressivt økende mengder av ST-antigenenheter med et tilsvarende fall i B-subenhet-antigenenheter i det sluttelige konjugat.

Egenskaper av vaksinen anvendt for immunisering

Det er tidligere vist at B-subenheten er et svakere antigen enn LT-holotixinet på molarbasis [Klipstein et al., Infect. Immun., 31:144-150 (1981)], og preliminære studier indikerer at det er et svakere antigen uttrykt ved antigen-enheter enn både LT-holotoxin og syntetisk ST. Dette førte til valg av en vaksine som inneholder mere B-subenhet- enn ST-antigenisitet.

Antigenet ble produsert ved konjugering av et begynnelses-ST/B-subenhet-molarforhold på 50:1 under anvendelse av et EDAC/konjugatforhold på 1,5:1. Konjugatet inneholdt 36%

(på vektbasis) ST som hadde 85% bibeholdt antigenisitet og 0,13% vedvarende toksisitet, og 64% (på vektbasis) B-subenhet som bibeholdt 89% av dets antigenisitet. Når dette ble testet direkte (dvs. i prøver som ikke var justert til å inneholde 100% av hvert toxin), inneholdt vaksinen 37 ST og 59 B-subenhet-antigenenheter pr. lOO^ug og hadde en rest ST-toksisitet på 0,06%.

Resultater av immunisering

Rotter immunisert med den ovenfor angitte vaksine ble gitt l.OOOyug primærimmunisering intraparenteralt (i.p.) etterfulgt av to 3.000yUg perorale (p.o.) boostere. Tidligere studier har vist at i rotter immunisert med LT stemte graden av antitoxinrespons og graden av beskyttelse overens med den totalt p.o.-dose [Klipstein et al., Infect. Immunol., 31:144-150 (1981); Klipstein et al., Infect. Immunol., 37:1086-1092 (1982); Klipstein et al., Infect. Immunol., 31:252-260 (1981)]. Denne immuniseringstabell oppgikk til 2.200 ST og 3.4 50 B-subenhet-antigenenheter.

Serum IgG-antitoxintitere overfor ST ble øket 4 ganger, og de av B-subenheten ble øket 5 ganger over verdien i uimmuniserte kontrollrotter. Mucosale sekretoriske IgA-antitoxintitere av både ST og B-subenhet ble øket 7 ganger i immuniserte rotter i forhold til kontroller. Immuniserte rotter ble signifikant beskyttet mot utfordring med LT eller med enten syntetisk eller biologisk ST såvel som mot heterologe, levedyktige organismer som produserer disse toxiner enten alene eller sammen slik som vist i etterfølgende tabell 4.

De ovenfor angitte observasjoner at syntetisk fremstilt, renset ST kan anvendes under dannelse av et effektivt, ikke-toksisk antigen når dette tverrbindes til LT toxin B- subenheten, overvinner en hovedhindring ved utvikling av en sikker, praktisk vaksine som gir beskyttelse mot ETEC-stammer som produserer enten ST- eller LT-form av toxin. Tidligere resultater viste at tverrbinding av et halvrent preparat av biologisk ST til LT ga et antigen hvori ST opp-nådde antigenisitet som en funksjon av kopling til det høy-molekylære LT-molekyl, og hvori, under riktige konjugasjonsbetingelser, mesteparten av antigenisiteten av komponent-toksinene ble opprettholdtmens deres toksiske egenskaper var sterkt redusert [Klipstein et al., Infect. Immunol., 37:550-557 (1981)].

Selv om denne vaksine med biologisk ST ga sterk beskyttelse i immuniserte dyr mot utfordring med ETEC-stammer som produserer den ene eller annen toxinform, vil den heterogene sammensetning av den halvrene ST-toxinkomponent klart utelukke dens tilpasning for human bruk. Den kompliserte og langsomme metodikk som er innbefattet ved bearbeidelse av biologisk ST til fullstendig renhet gjør produksjon i stor skala av dette materiale vanskelig. De ovenfor angitte observasjoner indikerer at syntetisk fremstilt ST, som lett kan fremstilles i store mengder, gir en like effektiv vaksine.

Reaksjonsbetingelsene for konjugater avledet fra syntetisk ST som gir maksimal innarbeidelse av ST i bæreren sammen med optimale egenskaper når det gjelder rest-antigenisitet og toksisitet, avviker fra de som tidligere er observert for konjugasjon av halvrent biologisk ST til LT. Under begge omstendigheter var (1) en kritisk mengde av det konjugerende reagens carbodiimid nødvendig for kopling av den maksimale mengde av ST til bæreren, (2) mengden av ST tilstedeværende i det endelige konjugat var avhengig av begynnelses-molarforholdet av ST blandet med LT, og (3) økning av forholdet mellom carbodiimid og ethvert toxin i konjugatet resulterte i en progressiv nedsettelse både i antigenisiteten og i toksisiteten på de tverrbundne toxiner. Når det gjelder halvrent biologisk ST, ble konjugasjonsbetingelser identifisert som ga et konjugat med maksimal innarbeidelse av ST til LT og samtidig bibeholdt mesteparten av antigenisiteten, men som markert reduserte toksisiteten av begge de tverrbundne toxiner.

Noe slikt fant imidlertid ikke sted når syntetisk ST ble konjugert til LT. Maksimal kopling av syntetisk ST til LT fant sted ved meget lavere carbodiimid/konjugatforhold under hvilke betingelser rest LT—toksisiteten av dette konjugat var uakseptabelt høyt. En reduksjon i LT-toksisiteten til akseptable nivåer ble oppnådd bare ved carbodiimid/toxin-forhold som alvorlig gikk på akkord med antigenisiteten av begge de tverrbundne toxiner. Disse observasjoner førte til en omgåelse av dette problem ved å anvende den ikke-toksiske B-subenhet istedenfor LT-holotoxinet som bærer.

Graden av antigenisitet (uttrykt som antigenenheter)

for hvert av komponenttoxinene tilstedeværende i det endelige konjugat avledet ved tverrbinding av syntetisk ST til B-subenheten kan forandres ved å variere betingelsene ved konju-gasjonsreaksjonene. I nærvær av den riktige konsentrasjon av carbodiimid ga et lavt begynnelses-molarforhold mellom ST og B-subenhet et konjugat med en dominerende ST-antigenisitet/mens et høyt begynnelses-molarforhold ga et hvori B-subenhet-antigenisiteten var størst.

Preliminære observasjoner antydet at syntetisk ST er et mer effektivt antigen enn B-subenheten. Dette førte til valg av et tverrbundet antigen for undersøkelse ved immunisering i rotter som inneholdt grovt regnet 1/3 ST og 2/3 B-subenhet antigenisk aktivitet. Når denne vaksine ble gitt i store p.o.-doser, ble det dannet en minst 4-dobbelt serum-og mucosal antitoxinrespons mot begge komponenttoxiner, hvilket ga en signifikant beskyttelse mot utfordring av både ST- og LT-toxinene og heterologe, levedyktige bakterier som produserer den ene eller andre toxinform.

Da alle ETEC-stammer fremkaller diaré via oppbygning

av LT- eller ST-toxiner, enten alene eller sammen, gir en dannelse av en tilstrekkelig sterk antitoxinrespons overfor hvert av disse toxiner en ensartet effektiv beskyttelse mot alle ETEC-stammer uten hensyn til den somatiske serotype, spesifikt fimbrialt antigen eller type av dannet toxin. Dette ble vist å være tilfelle ved den ovenfor angitte studie blant

rotter immunisert med tverrbundet ST-B-subenhetvaksine.

Immunisering med LT gitt utelukkende parenteralt, fremkalte bare en serum IgG-antitoxinrespons som tilveiebrakte bare forbigående beskyttelse i rotter, mens p.o.-booster-immunisering ga utstrakt beskyttelse på grunn av dannelsen av mucosalt sekretorisk Ig-antitoxin. [Klipstein et al., Infect. Immun., 37:1086-1092 (1982) og Klipstein et al., Infect. Immun., 27:81-86 (1982)].

Mucosale sekretoriske IgA-antitoxintitere overfor både ST- og B-subenheten i rotter immunisert peroralt med tverrbundet vaksine i den ovenfor angitte studie overgikk de som tidligere var blitt funnet å være nødvendige for å tilveiebringe utstrakt beskyttelse i rotter immunisert med nettopp LT.

Dette gjør det klart at den tverrbundne vaksine bør gis ved peroral administrering. De ovenfor angitte data er util-strekkelige til å bestemme hvorvidt primær immunisering ved parenteral administrering er en forutsetning for etterfølgende effektiv p.o.-immunisering, da dette er blitt funnet å være tilfelle for rotter immunisert med LT [Klipstein et al., Infect. Immun., 31:144-150 (1981); Klipstein et al., Infect. Immun., 37:1086-1092 (1982); og Klipstein et al., Infect. Immun., 27:81-86 (1980)] og rotter og hunder immunisert med koleratoxoid [Pierce et al., Infect. Immun., 21:185-193 (1978); Pierce et al. J. Infect. Dis., 135:888-896 (1977)].

Ytterligere detaljer vedrørende disse studier diskutert

i dette avsnitt (III B), kan finnes i Klipstein et al.,

J. Infect. Dis., 147:318-326 (1983).

C. Syntetisk ST-immunisering i rotter

I mmunoge nisitet av ST og B- subenhet

Rotter ble immunisert med graderte antigen-enhetsdoser

av enten B-subenheten eller syntetisk ST koplet til svine-immunoglobulin G (PIG; materialer og metoder, avsnitt C) som vist i fig. 9. De rotter som ble gitt variable doser av den i.p. primære immunisering, mottok alle to p.o.-booster-immuniseringer på 1.000 antigen-enheter hver, og de som ble gitt variable doser av p.o.-boostere, mottok alle en i.p.-primær-

immunisering med 200 antigen-enheter. Rotter immunisert med ST, ble utfordret med human LT /ST<+>stamme Tx 4 52 og de som ble immunisert med B-subenheten, ble utfordret med human LT<+>/ST~ stamme PB 258.

Økning av antigen-enhetsdosene av enten den i.p. primære immunisering eller p .o.-boosterne av begge antigener, resulterte i parallelle økninger i antitoxintitere og i graden av beskyttelse mot utfordring med de respektive organismer. Verdier for serum IgG-antitoxintitere steg proporsjonalt, men var gjennomført én eller to ganger mindre enn mucosale antitoxintitere .

Doser av hvert antigen på 100 antigen-enheter for i.p.-primærimmunisering og totalt 2.000 antigenenheter for p.o.-boosterne (dvs. 2 boostere på 1.000 antigen-enheter hver) var nødvendig for å oppnå en i det minste firedobbelt økning i mucosalt IgA-antitoxintitere og signifikant beskyttelse

(dvs. mer enn 50% redusert sekresjon) mot utfordring med LT-eller ST-produserende stamme.

Beskyttelse mot en LT+/ ST+- stamme

For å bestemme den minimale antigen-enhetsdose av ST eller B-subenhet som er nødvendig for å oppnå sterk beskyttelse mot en stamme som produserer både LT og ST, ble rotter immunisert med hvert toxin separat under anvendelse av en i.p.-primærimmunisering på 200 antigen-enheter etterfulgt av variable antigen-enhetsdoser av p.o.-boostere, og ble utfordret begge med de respektive LT- eller ST-produserende stammer og med humant LT<+>/ST<+->stamme H 10407 (fig. 10) .

Sterk beskyttelse mot LT /ST -stammen ble oppnådd bare med en total p.o.-boosterdose på 2.000 antigen-enheter. I hvert tilfelle var graden av beskyttelse mot LT<+>/ST<+->stammen mindre enn den for stammen som produserte bare det enkle homologe toxin.

Konjugasjonsbetingelser for vaksinen

De foregående observasjoner indikerer at den optimale vaksine må inneholde like antigeniske mengder av hvert komponenttoxin. Det ble vist i avsnitt B at når forholdet mellom carbodiimid og totalt konjugatprotein ble holdt konstant ved 1,5:1 på vektbasis, ga økning av begynnelses-molarforholdet av ST blandet med B-subenhet et sluttelig konjugat med progressivt mer ST og mindre B-subenhet-antigenisitet.

Når begynnelses-molarforholdet mellom ST og B-subenhet ble variert mellom 60:1 til 75:1, ble det funnet at et forhold på 70:1 resulterte i et konjugat som besto av 50% av hver toxinkomponent på vektbasis og som inneholdt 460 ST og 440 B-subenhet-antigenenheter pr. mg (fig. 11). Alle etterfølgende konjugater diskutert i dette avsnitt, ble fremstilt på denne måte. I fem fortløpende prøver var midlere antigen-enheter pr. mg 4 74 for ST og 4 60 for B-subenheten under anvendelse av de ovenfor angitte forhold.

Egenskaper av vaksine

(i) I mmunogenisitet

For å bekrefte det faktum at immunogenisiteten av toxin-komponentene tverrbundet i vaksineform er den samme som for de individuelle komponenter, ble rotter immunisert ved i.p. primærimmunisering på 200 ST antigen-enheter etterfulgt av graderte p.o. boosterdoser av ST, gitt enten i vaksineform eller koplet til den immunologisk ikke-spesifikke bærer PIG. Resultatene er vist i fig. 12. Som det fremgår fra fig. 12, var antitoxinresponsen og graden av beskyttelse mot den humane LT /ST+-stamme hovedsakelig identisk i rotter immunisert med den ene eller andre form av ST-konjugat.

(ii) T oksisitet. Undersøkelse over graderte mengder

(av proteininnhold) av ST alene eller av vaksinen i diegivende mus viste at vaksinen inneholdt 0,14 museenheter av ST-aktivitet pr.^ug, hvilket representerte 0,08% av verdien av 175 museenheter pr.^ug av ST alene (fig. 13). Når graderte mengder av enten ST alene eller vaksinen ble testet i rotte-ombundne ileumsløyfer, var ED^Q av vaksinen, 2,6^,ug, 0,08% av den av verdien av de 2,0 ng for ST alene (fig. 14). B-subenheten hadde alene en ED^Q på 95 ng i de ombundne ileumsløyfer som var 0,2% av verdien av 0,19 ng for LT-holotoxinet. Hvorvidt

denne sekretoriske aktivitet skyldtes B-subenheten i seg selv eller en manifestasjon av ubetydelig eller på annen måte upå-vist forurensning med LT, er usikkert.

For å bestemme hvorvidt B-subenhetkomponenten bidro med rest-sekretorisk aktivitet til vaksinen i den rotte-ombundne ileumsløyfeundersøkelse, ble graderte doser av vaksine testet etter varmeinaktivering av B-subenheten (eller dens LT-for-urenser) ved eksponering for 65°C i 1 time. Den sekretoriske respons overfor oppvarmet og uoppvarmet vaksine var den samme, hvilket utelukket B-subenhetens rolle i denne respons. Disse observasjoner indikerer at toksisiteten av en dose av vaksine inneholdende 1.000 antigen-enheter av hvert komponenttoxin vil bestå av ekvivalenten av l,7^,ug av usvekket ST. (iii) B eskyttelse mot humane og svinestammer Rotter ble immunisert ved primær i.p.-immunisering med vaksine inneholdende 200 antigen-enheter av hvert komponenttoxin og to p.o.-boostere som hver hadde 1.000 antigen-enheter av hver toxinkomponent. Dette fremkalte S—doble serum IgG-antitoxintitere overfor begge toxinkomponenter og 5-doble mucosale IgA-antitoxintitere overfor ST og 6-doble mucosale IgA-antitoxintitere overfor B-subenheten. De immuniserte rotter ble signifikant beskyttet (P mindre enn 0,001) mot utfordring med levedyktige humane eller svinestammer som produserer LT»-eller ST-toxin, enten alene eller sammen, som vist i etterfølgende tabell 5.

Primær parenteral immunisering ble gitt til en ytterligere gruppe av rotter ved subcutan (s.c.) administrering under anvendelse av alum som adjuvans, fremstilt som beskrevet tidligere for LT-immunisering [Klipstein et al., Infect. Immun., 37:1086-1092 (1982)]. Da denne problemstilling var blitt funnet å kreve dobbelt så mye av den dose som ble anvendt for i.p.-administrering for å oppnå effektiv LT-primærimmunisering, ble den subcutane dose av vaksinen doblet til 400 antigen-enheter, men den perorale dose ble holdt uforandret på 1.000 antigen-enheter. Dette fremkalte i det minste 5-doble mucosale IgA-antitoxintitere av begge toxinkomponenter og ga tilstrekkelig beskyttelse mot utfordring, med sekresjon redusert med 77 - 3% mot den humane LT+/ST -stamme og med 71 - 2% mot den humane LT /ST+-stamme.

De ovenfor angitte resultater indikerer at - vurdert i henhold til Klipstein et al., Infect. Immun., 31:144-140 (1981) - er antigenisiteten av det syntetisk fremstilte ST hovedsakelig den samme som den av B-subenheten. Vesentlig for denne sammenligning var at dosen av konjugert toxin var uttrykt i antigen-enheter istedenfor på vektbasis.

Denne informasjon førte til modifisering av de konjugasjonsbetingelser som tidligere var anvendt for å tverrbinde syntetisk ST til B-subenheten, avsnitt B ovenfor, for å fremstille en vaksine som inneholder en lik antigenisk mengde av ST og B-subenhet. Antigenisiteten av den syntetiske ST-komponent i vaksineform ble vist å være identisk med antigenisiteten av dette toxin når dette ble gitt koplet til en ikke-spesifikk immunoglobulinbærer. Immunisering av rotter med vaksine, gitt ved disse antigen-enhetsdoser som var blitt funnet å være effektive for hvert av komponenttoxinene gitt separat, fremkalte en sterk antitoxinrespons overfor hvert av komponenttoxinene og ga en signifikant beskyttelse mot levedyktige ETEC-stammer som fremkaller LT eller ST, enten alene eller sammen. Observasjoner utledet fra immuniseringer med hver toxinkomponent gitt separat, indikerte at beskyttelsen som gies av vaksinen mot LT<+>/ST<+->stammen, tilskrives begge toxinkomponenter.

Frantz og Robertson har rapportert at antisera overfor svine ST reagerer med ST fra ETEC-stammer av svin, okse og human opprinnelse [Infect. Immun., 33:193:198 (1981)]. De ovenfor angitte resultater indikerer at kryssbeskyttelse kan oppnåes ved immunisering med det ene eller andre toxin uten hensyn til dets kilde. Således ga immunisering med den tverrbundne vaksine inneholdende en B-subenhet avledet fra svine LT og syntetisk ST basert på strukturen av humant ST, like sterk beskyttelse mot humane og svine LT- og ST-produserende stammer.

Immunisering ble gitt i den ovenfor angitte studie ved hjelp av parenteral primærimmunisering etterfulgt av p.o.-boostere fordi det tidligere var blitt funnet i rotte-dyremodellen at (1) parenteral primærimmunisering er en forutsetning for sterk effektiv p.o.-booster-immunisering,

(2) bare p.o.-immunisering danner mucosale IgA antitoxin titere, og (3) utstrakt beskyttelse oppnåes bare når en tilstrekkelig p.o.-dose gies som danner minst 4-doble mucosale IgA-titere. Immunisering med den tverrbundne vaksine etter dette oppsett ga økninger av denne størrelsesorden i mucosale IgA-antitoxintitere overfor begge komponenttoxiner. Subcutan (s.c.) administrering og alumadjuvans ble vist å være like effektive for immunisering.

Ytterligere detaljer av studiene diskutert i dette avsnitt (III C), kan finnes i Klipstein et al., Infect. Immun., 40:924-929 (1983).

D. Syntetisk ST- immunisering i rotter dg kaniner

De ovenfor diskuterte resultater (avsnitt III C) ble erholdt i rotter under anvendelse av i.p.-immuniseringer etterfulgt av p.o.-boostere. Resultatene diskutert i det etter-følgende, ble erholdt både i rotter og kaniner under anvendelse av peroral administrering både for den primære og booster-immuniseringene.

Resultatene i det etterfølgende indikerer at peroral administrering ved immunisering er like effektiv som intraperitoneal administrering. I tillegg observeres det at vaksinen ikke fremkaller diaré i noe dyr når den gies peroralt, heller ikke fremkalte den væskesekresjon når den ble dryppet i ombundne kanin-ileumsløyfer.

Rottestudier

( i) i. p./ p. o.- immunisering

Rotter mottok primærimmunisering med 200 AU (antigen-enheter; se materialer og metoder, avsnitt D) av vaksine gitt i.p. med Freunds fullstendige adjuvans (FCA) etterfulgt av to p.o.-boostere hver på 1000 AU. Denne dose ble valgt på grunn av at denne var blitt vist (avsnitt C, supra) å være den minimale mengde som var nødvendig for å tilveiebringe signifikant (P mindre enn 0,001) beskyttelse mot utfordring med levedyktige stammer som produserer den ene aller andre toxinform. Denne immunisering fremkalte 4-doble økninger i serum, og minst 6-dobbel økning i mucosale antitoxintitere overfor hver toxinkomponent av vaksinen (tabell 6 i det etterfølgende) og ga beskyttelsesindeksverdier (PI) på 3,4 mot utfordring med LT og 4,0 mot utfordring med ST (fig. 15).

(ii) Andre immuniseringsområder

For å bestemme effektiviteten av andre parenterale administreringsformer, adjuvans og p.o.-utleveringssystemer ble ytterligere grupper på 4 rotter hver gitt primærimmunisering med 400 AU vaksine ved subcutan (s.c.) administrering under anvendelse av alum som adjuvans, fremstilt som tidligere beskrevet for LT [Klipstein et al., Infect. Immun., 37:1086-1092 (1982)]; og dette ble etterfulgt av to p.o.-boostere, hver på 1000 AU, gitt enten 2 timer etter p.o.-administrering av cimetidin eller i form av pH-avhengige mikro-kuler uten forbehandling med cimetidin. Utfordret med LT /ST<+>stamme Tx 452 ga hver av disse alternative immuniser-ingsmåter den samme signifikante (P mindre enn 0,001) grad av redusert sekresjon som den som ble omtalt under anvendelse av i.p.-administrering med FCA etterfulgt av p.o.-boostere gitt etter cimetidin. Disse resultater er vist i etterfølgende tabell 7.

Kaninstudier

(i) i. m./ p. o.- immunisering

4 kaniner mottok primærimmunisering med 500 AU vaksine gitt intramuskulært (i.m.) med FCA, etterfulgt av to p.o.-boostere på 1000 AU hver. Denne fremkalte mer enn en 5-dobbel økning i serum, og 4-dobbel økning i mucosale antitoxintitere overfor hver komponent av vaksinen. PI-verdier var mer enn 9 mot utfordring med enten LT eller ST. Disse data er vist i fig. 16 i etterfølgende tabell 8.

(ii) p. o ./ p . o .- immunisering

4 kaniner mottok immunisering med 1000 AU vaksine gitt p.o. i 3 tilfeller. Dette fremkalte en 4-dobbel økning i mucosal-, men ikke i serum-, antitoxintitere og ga en sterk beskyttelse, med PI-verdier på mer enn 8 mot utfordring med den ene eller andre toxinform. Disse data er også vist i den ovenfor angitte tabell 8.

Toksisitet av vaksinen

Tidligere undersøkelser (avsnitt III C) har vist at toksisiteten av ST-komponenten av vaksinen er redusert til 0,15% av usvekket toxin. En dose på 1000 AU vaksine vil således inneholde ekvivalenten av 1,7^ug av usvekket ST

(0,15% ganger 50% ST-komponenten av 2,2^ug). Toksisiteten av denne dose av vaksinen og av større mengder usvekket ST ble bestemt i uimmuniserte dyr. (i) p.o.-administrering av 1000 AU av vaksine til 8 kaniner og 20 rotter fremkalte ingen ugunstig effekt slik som diaré, og drypp av denne dose av vaksine i 4 ombundne ileumsløyfer i 2 kaniner fremkalte ikke noen væskerespons. (ii) p.o.-administrering av 2 50^ug av

usvekket ST til 2 kaniner og rotter fremkalte ikke diaré. Drypp av 25^ug usvekket ST fremkalte ikke noen væskesekresjon

i ombundne ileumsløyfer på 4 kaniner, og en dose på 5Cyug var nødvendig for å gi et positivt væske/lengdeforhold på

1,1 - 0,3 (middel - SEM).

Resultatene av den ovenfor angitte undersøkelse fastslår effektiviteten ved immunisering med en vaksine fremstilt under anvendelse av et syntetisk ST ifølge oppfinnelsen i en eksperimentell dyremodell på kaniner i tillegg til rotter. Beskyttelse ved begge dyremodeller ble vist ved anvendelse av den ombundne ileumsløyfe-teknikk. Anvendeligheten av denne teknikk når det gjelder beskyttelse under betingelser hvori hele den intakte tarm virkelig er kolonisert med enterotoxigene stammer av E. coli, er blitt fastslått i rotter immunisert med LT [Klipstein et al., Infect. Immun., 28:163-170 (1980)].

Den samme p.o. dose av vaksine (1000 AU), gitt etter primær parenteral immunisering, resulterte i en betydelig sterkere grad av beskyttelse som fastslått ved PI-verdier,

i kaniner enn i rotter. Denne forskjell kan delvis tilskrives det lengre intervall mellom immuniseringer anvendt for kaniner (14 dager mot 4 dager på rotter), og muligens forskjeller i sensibiliteten overfor toxinutfordring. Dette indikerer også muligens at kaniner er mere i stand til å gi respons overfor immunisering med vaksinen enn rotter. Den anvendte dose var den minimale som ble funnet å være nødvendig for å oppnå signifikant beskyttelse mot levedyktige enterotoxigene stammer i rotter (avsnitt C, supra).

Det faktum at denne dose også var effektiv når det gjaldt å gi sterk beskyttelse i større forsøksdyr, viser anvendeligheten i husdyr og mennesker. Dette er også antydet av de observasjoner som ble foretatt av Svennerholm et al.

som fant at en p,o.-immuniseringsdose på 500^ug av kolera-toxin B-subenhet er tilstrekkelig til å fremkalle en signifikant intestinal IgA antitoxinrespons i mennesker [Lancet, 1: 305-308 (1982)] .

Resultatene av foreliggende studium indikerer at utelukkende p.o.-immunisering av kaniner med den syntetiske ST-B- vaksine ga samme sterke grad av beskyttelse som den som ble oppnådd med p.o.-booster-immunisering etter parenteral primærimmunisering .

Ytterligere detaljer vedrørende undersøkelsene diskutert i dette avsnitt (III D), kan finnes i Klipstein et al., Infect. Immun., 40:888-893 (1983).

E. Kryssreaktivitet med Klebsiella ST en terotoxin

Diaréepidémier blant spebarn har implisert Klebsiella pneumoniae som det forårsakende middel. Enterotoksigenisi-teten av flere Klebsiella-stammer er blitt fastslått ved undersøkelse av cellefrie kulturfiltrater i ileumsløyfer på kaniner, i Yl adrenale celleutprøvninger eller ovarievev-dyrkningsbestemmelser av kinesiske hamstere med hensyn til varmelabilt toxin (LT) og ved den diegivende museundersøkelse, supra, for det varmestabile toxin (ST). Klebsiella LT og ST enterotoxiner identifisert i disse utprøvninger, er ikke blitt renset, og deres forbindelse med lignende toxiner fremstilt av E. coli, er ukjent.

Klipstein et al., J. Infect. Dis., 42:838-841 (1983) har vedrørende rensing av Klebsiella ST toxin angitt det å være tilsynelatende homogent, og har også beskrevet dets immunologiske slektskap med E. coli ST.

Naturlige enterotoxiner ble erholdt fra Klebsiella stamme ST 9 (serotype 19) og ble isolert fra tynntarmen fra en pasient fra Puerto Rico med tropisk silose hvis dyrknings-filtrat på forhånd var blitt vist å fremkalle en positiv respons ved den diegivende museutprøvning, og ble også erholdt fra E. coli stamme 18 D (042:H47), en bare ST-produserende stamme isolert fra avføringen fra et barn med akutt diaré. Toxinene ble renset ved de metoder som er beskrevet av Staples et al., J. Biol. Chem., 255:4716-4721 (1980) for rensing av humant ST fra E. coli stamme 18 D.

Etter 3 påfølgende kromatografiske separasjonsprosedyrer anvendt for rensing, var det resulterende toxin blitt renset med en faktor på 148 i forhold til det opprinnelig erholdte materiale, og tynnskiktskromatografi av det rensede materiale viste et enkelt bånd. Det rensede Klebsiella ST var like kraftig som E. coli ST ved den diegivende museutprøvning innen grensene for den eksperimentelle variasjon for denne

-4 utprøvning. Behandling av Klebsiella ST med 5x10 molar dithiothreitol i 60 minutter opphevet i tillegg dens sekretoriske aktivitet ved den diegivende museutprøvning slik som fant sted med E. coli ST. Under anvendelse av en dobbelt lagdelt ELISA som diskutert i avsnitt III A, IV A i det etter-følgende og i Klipstein et al., Infect. Immun. 39:117-121

(1983), ble antigenisiteten av Klebsiella ST funnet å være

69% av den av E. coli ST.

På grunn av de funksjonelle likheter mellom E. coli ST og Klebsiella ST var det av interesse å bestemme hvorvidt en vaksine som var effektiv overfor E. coli ST også ville gi beskyttelse mot Klebsiella ST. Vaksinen inneholdende et konjugat av E. coli LT B-subenhet og syntetisk ST som er beskrevet i avsnitt III D, ble anvendt for disse immuniseringer.

Sprague-Dawley-rotter som veide mellom 150 og 175 g,

ble gitt primærimmunisering med vaksinen inneholdende 200 antigenenheter av både ST og LT B-subenhet ved intraperitoneal administrering med Freunds fullstendige adjuvans. Dette ble fulgt ved 4 dagers intervaller av 2 perorale booster-immuniseringer på 1000 antigenenheter hver, gitt 2 timer etter peroral administrering av cimetidin (Tagamet tilgjengelig fra Smith Kline and French Laboratories, Carolina, Puerto Rico) i en dose på 50 mg pr. kg kroppsvekt for å fjerne mavesyresekresjon.

Uimmuniserte kontrollrotter og immuniserte rotter ble

4 til 6 dager etter den sluttelige booster-immunisering utfordret ved drypp av graderte doser av ST-toxin i ombundne ileumsløyfer i 18 timer som beskrevet i avsnitt III D, avsnitt IV D og i Klipstein et al., Infect. Immun., 40:888-893 (1983). Hvert nullpunkt for væskesekresjon (presentert som gjennomsnittet standardfeil av gjennomsnittet) ble utledet ut fra utfordring i 4 eller 5 immuniserte rotter og 5 kontrollrotter. Beskyttelsesindekset (PI) ble bestemt ved å dividere den dose av toxin i immuniserte dyr som ga samme sekresjon som den 50% effektive dose (ED^q) i uimmuniserte dyr med verdien for

uimmuniserte dyr.

Resultatene av denne bestemmelse er vist grafisk i

fig. 18 hvori dataene for utfordringen med E. coli ST i immuniserte rotter er den som er vist i den nedre del av kurvene på fig. 15, mens dataene som vedrører utfordring med Klebsiella ST, er de som er dannet ved denne studie. Som det fremgår, var beskyttelsesindekset (PI) mot utfordring med E. coli ST 4,0, mens den motKlebsiella ST var 2,6. Resultatene vist i kurven på fig. 18, illustrerer at en vaksine inneholdende et konjugert syntetisk ST ifølge oppfinnelsen også gir en viss beskyttelse mot ST-enterotoxinet dannet av Klebsiella pneumoniae.

IV. Materialer og metoder fo r monomert ST

Avsnitt A

Enterotoxinproduksjon

Den fullstendige prosedyre for syntese og rensing av det syntetiske ST anvendt her og i hvert etterfølgende avsnitt,

er beskrevet i detalj i avsnitt II.

Biologisk ST ble renset til homogenitet ut fra dyrk-ningsfiltrater av stamme 18D ved en modifikasjon av [Klipstein et al., Infect. Immun., 37:550-557 (1982)] av de metoder som er beskrevet av Staples et al., supra. Mengdene av toxin var basert på deres proteinkonsentrasjon bestemt ved metoden ifølge Lowry et al., J. Biol. Chem., 193:265-275

(1951) .

Undersøkelse av sekretorisk styrke

Graderte doser av toxinenes evne til å fremkalle sekresjon ble testet ved den diegivende musebestemmelse og ombundne rotte-ileumsløyfebestemmelse under anvendelse av produserte metoder [Gianella, Infect. Immun., 14:95-99 (1976) og Klipstein et al., Infect. Immun., 34:637-639 (1981)]. 1 rause-enhet (MU) i den diegivende musebestemmelse er definert som den mengde av toxin som gir et intestinalt (tarm):helkropp-vektforhold på minst 0,083.

P roduksjon av hyperimmunt antise rum

Hyperimmunt antiserum ble dannet i geiter og kaniner overfor biologisk ST som tidligere beskrevet [Klipstein et al., Infect. Immun., 37:550-557 (1982)]. Syntetisk ST ble koplet til svine-immunoglobulin G (PIG) ved å blande ST til PIG i et molarforhold på 100:1, under anvendelse av et vektforhold mellom 1-ethy1-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid og totalt konjugatprotein på 2:1, i 0,1 molar fosfatbuffer,

pH 7,0 i 18 timer ved 4°C. Dette konjugat inneholdt 4 7% ST

på vektbasis og 98% ST på molbasis. Det konjugerte ST bibeholdt 73% av dets antigenisitet, bestemt ved enzym-kjedet immunosorbentutprøvning (ELISA) under anvendelse av hyperimmune geite- og kanin-antisera overfor biologisk ST i en tidligere beskrevet dobbelt lagdelt teknikk [Klipstein et al., Infect. Immun., 37:550-557 (1982)]. Konjugatet inneholdt således

343 antigenenheter (utledet ved å multiplisere prosenten av tilstedeværende ST med vekten ganger prosenten av dets antigenisitet) pr. mg protein. Dyr ble immunisert intramuskulært med Freunds fullstendige adjuvans (FCA) for primærimmunisering og Freunds ufullstendige adjuvans for booster-immuniseringen som ble gitt 1 måned senere. Geiter mottok 1.100 etterfulgt av 2.300 ST antigenenheter, og kaniner mottok 300 etterfulgt av 500 ST-antigenenheter.

Immunisering og utfordring av rotter

Nettopp avvente Sprague-Dawley-rotter ble immunisert

med syntetisk ST-PIG-konjugat ved hjelp av intraperitoneal primærimmunisering av 350 ST-antigenenheter gitt med Freunds fullstendige adjuvans etterfulgt med 4-dagers intervaller av 2 perorale booster-immuniseringer inneholdende 700 ST-antigen-enheter hver, hvilke ble gitt 2 timer etter peroral administrering av cimetidin for å fjerne mavesyre. De ble utfordret 5 dager etter den sluttelige booster ved tildrypping i

18 timer i en enkelt ombundet ileumsløyfe av konsentrasjoner som fremkalte maksimal sekresjon i uimmuniserte rotter: 5 ng av enten syntetisk eller biologisk ST og 0,1 ml av en dyrkningskraft inneholdende 10 9 levedyktige organismer pr. ml av

ST-produserende human E. coli stamme Tx 452 (078-.H12).

5 uimmuniserte og 3 immuniserte rotter ble utfordret hver med testmateriale. Verdiene er uttrykt som gjennomsnitt standardfeil av den gjennomsnittlige prosentvise reduserte sekresjon i immuniserte rotter sammenlignet med den i uimmuniserte kontroller, og i hvert tilfelle representerer mer enn 50% redusert sekresjon en signifikant forskjell (P mindre enn 0,001) mellom de to grupper som bestemt ved Student<1>s t-test for to uavhengige midler.

Antitoxinrespons overfor immunisering

På utfordringstidspunktet ble serum og mucosale vaske-væskerbearbeidet som tidligere beskrevet [Klipstein et al., Infect. Immun., 37:1086-1092 (1982)] og undersøkt ved en dobbelt lagdelt ELISA hvori geite-hyperimmunt antiserum overfor syntetisk ST ble anvendt for den faste fase og syntetisk ST ble anvendt som antigenet. Klipstein et al., Infect. Immun., 37:1086-1092 (1982) fant at i rotter på lignende måte immunisert med LT kan kun serum-antitoxin av immunoglobulin G (IgG) og mucosalt antitoxin av immunoglobulin A- (IgA)klasse påvises hvorfor antitoxin overfor syntetisk ST ble bestemt bare for disse to immunoglobulinklasser under anvendelse av kanin anti-rotte IgG sammen med geite-anti-kanin-antiserum konjugert til alkalisk fosfatase for serumprøver og geite-anti-rottesekretorisk IgA sammen med kanin-anti-geite-antiserum konjugert til alkalisk fosfatase (Miles Research Laboratories, Elkhart, Indiana) for mucosale prøver. De angitte verdier er for den geometriske midlere titer i 9 immuniserte og 5 uimmuniserte kontrollrotter.

Avsnitt B

Enterotoxinpreparater

Renset LT-holotoxin ble fremstilt ved de metoder som er beskrevet av elements og Finkelstein, Infect. Immun., 24:760-769 (1979) fra E. coli stamme 711 (FILT), et K-12 derivat som bærer LT-gener fra Ent-plasmidet fra svinestamme P307. B-subenheten ble separert fra LT-holotoxinet ved de kromato-

grafiske teknikker som er beskrevet av elements et al.,

Infect. Immun., 29:91-97 (1980). Homogeniteten av LT-toxinet og dets B-subenhet ble fastslått ved polyacrylamidgel-elektroforese som beskrevet av elements og Finkelstein, supra.

Biologisk ST erholdt ved vekst av human E. coli

stamme 18D (042:H47), ble renset ved de metoder som er beskrevet av Staples et al, supra, med den modifikasjon at den endelige rensing til homogenitet ble oppnådd ved eluering fra tynnskiktskromatografi som beskrevet av Klipstein et al., Infect. Immun., 37:550-557 (1982). Syntetisk ST bestående av den samme sekvens av 18 aminosyrer som beskrevet av Chan et al., supra, for rent ST erholdt ved vekst av stamme 18D, ble fremstilt under anvendelse av en Beckman peptidsyntetiserer modell 990 B (Beckman Instruments Co., Irvine, CA) ved de metoder som er rapportert i avsnitt II. Det syntetiske toxin ble vist å være hovedsakelig identisk med det som ble erholdt ved dyrkningsteknikker (biologisk ST) når det gjelder sekretorisk styrke ved den diegivende musebestemmelse, og antigenisitet som bestemt ved den enzymkjedede immunoadsorbent-utprøvning (ELISA) og ved seronøytralisering av sekretorisk aktivitet ved den diegivende museutprøvning med hyperimmunt antiserum overfor enten det syntetiske eller biologiske toxin i avsnitt III i det foregående.

Mengden av anvendt toxin, angitt som vekt, var basert på proteinkonsentrasjoner bestemt ved metoden ifølge Lowry et al., supra. Molare ekvivalenter ble utledet fra publiserte verdier for en molekylvekt på 91.4 50 dalton for LT ifølge Clements et al., Infect. Immun., 29:91-97 (1980), 57.400 for den polymere 5 B-subenhet ifølge Gill et al., Infect. Immun., 33:677-682 (1981) og 1.972 dalton for ST ifølge Staples et al., supra.

Radiojodering av ST

Syntetisk ST ble radiojodert ved kloramin-T-metoden ifølge Hunter, Proe. oc. Exp. Biol. Med., 133:989-992 (1970) under anvenelse av de prosedyrer som tidligere er beskrevet

for rent biologisk ST av Klipstein et al., Infect. Immun.,

37:550-557 (1982). Det radiomerkede toxin inneholdt 3 x 10^ slag pr. min. og 71 museenheter pr. mikrogram (mot 175 museenheter pr. mikrogram for umerket toxin) som bestemt ved den diegivende museutprøvning hvori én museenhet er definert som den mengde som gir et intestinalt vekt:skrott-vektforhold på minst 0,083.

Konjugasjon

ST ble konjugert enten til LT eller til B-subenheten ved tilsetning av l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDAC) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) til blandinger av toxinene i 0,1 molar fosfatbuffer ved pH 7,0 i 18 timer ved 4°C. Konjugatet ble deretter grundig dialysert mot vann i 48 timer ved 4°C under anvendelse av en 12.000 molekylvekts avbrytnings-dialysepose som bibeholdt alt av LT (eller B-subenheten) og konjugert ST, men ikke ukonjugert ST eller EDAC. Gjentatte bestemmelser viste at dialyse mot vann av enten LT eller B-subenheten alene resulterte i et 10% tap på grunn av utfelling. Derfor ble mengden av konjugert ST basert på den trinnvise økning i Lowry-protein tilstedeværende i dialysanden som var i overskudd av 90% av mengden av den opprinnelig tilsatte LT eller B-subenhet. Mengden av konjugert radiojodert ST ble fastslått ved å sammenligne radioaktiviteten av de sluttelige konjugater og den som i begynnelsen ble tilsatt under anvendelse av en auto-gamma-teller solgt under varemerket "Prias" PGD av Packard Instruments Co., Downers Grove,

IL.

Egenskaper av konjugatet

Med mindre annet er angitt, ble konsentrasjonen av hvert konjugat justert til å representere 100% av det spesifikke toxin testet i studiene som sammenlignet egenskapene av konjugerte toxiner og de av usvekket toxin. LT-toksisiteten ble sammenlignet ved å utprøve serie 2-doble fortynninger av LT alene og i konjugert form i Yl adrenal-celle-utprøvningen ifølge Sack et al., Infect. Immun., 11:334-336

(1975). ST-toksisitet ble sammenlignet ved å fastslå den minimale effektive dose av seriefortynninger av syntetisk ST alene eller i konjugert form ved den diegivende museutprøv-ning ifølge Klipstein et al., Infect. Immun., 37:550-557

(1982) .

Antigenisitet ble bestemt ved hjelp av ELISA. Monospesifikt geite-hyperimmunt antiserum overfor enten LT eller B-subenheten av kolera [Clements et al., Infect. Immun., 29:91-97 (1980)] ble anvendt med kanin-anti-geite-antiserum konjugert til alkalisk fosfatase (Miles Research Laboratories, Elkhart, Ind.). For ST ble hyperimmunt antiserum overfor rent biologisk ST dannet i geiter og kaniner som tidligere beskrevet [Klipstein et al., Infect. Immun., 37:550-557 (1982)] anvendt

i en dobbelt lagdelt teknikk sammen med kanin-anti-geite-antiserum konjugert til alkalisk fosfatase, og verdier for konjugatene ble sammenlignet med verdiene for syntetisk ST i denne utprøvning. Ved å starte ved lO^ug ble doble seriefortynninger foretatt på konjugatene og egnet toxin. Den konsentrasjon ved hvilken disse preparater ga en adsorbans på 0,600 ved 410 nm, ble anvendt for å sammenligne antigenisiteten av toxinet i konjugert og usvekket form.

Immuniseringsprosedyrer

Rotter ble gitt primærimmunisering intraperitonealt (i.p) under anvendelse av Freunds fullstendige adjuvans etterfulgt

av to perorale (p.o.) boostere med 4 dagers intervaller. Peroral immunisering ble gitt via en intragastrisk slange 2 timer etter p.o.-administrering av cimetidin (solgt under varemerket 'Tagamet" av Smith, Kline and French Laboratories, Carolina, Puerto Rico), i en dose på 50 mg/kg kroppsvekt for å stanse mavesyresekresjon.

Utfordringsprosedyrer

Rotter ble utfordret 1 uke etter den sluttelige booster ved drypp av testmateriale i en enkelt 10 cm ombundet sløyfe av distal-ileum i 18 timer som tidligere beskrevet [Klipstein et al., Infect. Immun., 31:144-150 (1981) og 32:1100-1104

(1981)]. Tidligere studier har fastslått en korrelasjon mellom signifikant beskyttelse i dette utprøvningssystem og det som oppnåes i immuniserte rotter utfordret ved intestinal smit-ning av den intakte tarm [Klipstein et al., Infect. Immun., 28:163-170 (1980)]. Utfordringsdoser var de som fremkalte maksimal sekresjon i uimmuniserte dyr: 0,5 ng LT, 5 ng av enten syntetisk eller biologisk ST, og 0,1 ml av en kulturkraft inneholdende 10 9 levedyktige organismer pr. ml av LT<+>/ST<+>stamme PB-258 (015:H~), LT<+>/ST<+>stamme H-10407 (078:H11), og LT~/ST<+>stamme Tx 452 (078:H12). Hvert nullpunkt ble bestemt i fra 3 til 5 immuniserte rotter, og de angitte verdier er gjennomsnittet - standardfeil av den midlere grad (SEM) av redusert sekresjon i immuniserte dyr sammenlignet med verdien i 5 på lignende måte utfordrede uimmuniserte rotter. Redusert sekresjon på 50% var signifikant for hvert utfordrende materiale til en P-verdi på mindre enn 0,001 som bestemt ved Student's t-test for to uavhengige midler.

Antitoxinresponser

Serum og mucosale antitoxintitere overfor syntetisk ST pg B-subenhetkomponenter av vaksinen ble bestemt i serum og mucosale vaskeløsninger av immuniserte rotter med ELISA under anvendelse av de teknikker som er beskrevet i tidligere studier som viste at antitoxinresponsen av rotter immunisert med LT ved det parenterale/perorale system er begrenset til det forbundet med serum IgG og mucosal IgA [Klipstein et al., Infect. Immun., 37:1086-1092 (1982)]. Av denne grunn ble bare antitoxiner av disse immunoglobulinklasser undersøkt i foreliggende studium. For antitoxium overfor B-subenhet ble B-subenheten anvendt som den faste fase; for antitoxin overfor syntetisk ST ble hyperimmunt antiserum overfor syntetisk ST utviklet i en geit anvendt som den faste fase, og syntetisk ST ble anvendt som antigenet i en dobbelt lagdelt teknikk. For serumprøver ble kanin-anti-rotte IgG og geite-anti-kanin-antiserum konjugert til alkalisk fosfatase tilsatt; for mucosale vaskeløsninger ble geite-anti-rottesekretorisk IgA og kanin-anti-geite-antiserum konjugert til alkalisk fosfatase (Miles Research Laboratories, Elkhart, Inc.) anvendt. De angitte verdier er for økningen i den resiproke verdi av den geometriske midlere titer i prøver fra 5 immuniserte i forhold til de fra 5 uimmuniserte kontrollrotter. Antitoxintitere i kontroUdyrene var 1:2 mot enten ST eller B-subenhet i alle prøver bortsett fra at serumtiteren mot ST var 1:4.

Avsnitt C

Fremstilling av vaksinen

Renset LT-holotoxin ble fremstilt fra E. coli stamme 711 (FILT), et omformet K-12 derivat som bærer LT-gener av Ent-plasmidet fra svinestamme P307, og ble separert i dets subenheter ved kromatografiske teknikker som diskutert i avsnitt B. Homogeniteten av LT-holotoxinet og dets B-subenhet ble fastslått ved polyacrylamidgel-elektroforese slik som diskutert i avsnitt B. Syntetisk ST bestående av den samme primærstruktur av 18 aminosyrer som beskrevet av Chan et al., supra, for rent ST erholdt ved rensing av kulturer av stamme 18D, ble fremstilt som beskrevet i avsnitt II, supra.

Mengden av anvendt toxin var basert på deres proteinkonsentrasjoner bestemt ved metoden ifølge Lowry et al., supra, og deres molare ekvivalenter ble utledet fra publiserte verdier av en molekylvekt på 57.400 dalton for den polymere form av 5 B-subenheter og 1.972 dalton for ST som diskutert i avsnitt B ovenfor.

ST ble konjugert til B-subenheten ved tilsetning av 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) i et vektforhold på 1,5:1 til det totale protein av blandinger av varierende molarforhold av toxinene

i 0,1 M fosfatbuffer ved pH 7,0 i 18 timer ved 4°C, og konjugatet ble deretter grundig dialysert mot vann og bearbeidet som tidligere beskrevet i avsnitt B.

Egenskaper av vaksinen

Antigenisiteten av komponenttoxinene i vaksinen ble bestemt ved hjelp av enzymkjedet immunosorbentbestemmelse (ELISA) som beskrevet ovenfor i avsnitt B. For B-subenheten ble monospesifikt geite-hyperimmunt antiserum overfor B-subenheten av humant LT anvendt sammen med kanin-anti-geite- antiserum konjugert til alkalisk fosfatase (Miles Research Laboratories, Elkhart, Ind.). For ST ble hyperimmunt antiserum overfor syntetisk ST dannet i geiter og kaniner (avsnitt IV, A) anvendt i en dobbelt lagdelt teknikk sammen med kanin-anti-geite-antiserum konjugert til alkalisk fosfatase. Ved å starte ved lCyug ble doble seriefortynninger foretatt på konjugatene og det angjeldende toxin. De konsentrasjoner ved hvilke konjugatet og toxinet ga en adsorbans på 0,600 ved 410 nm ble sammenlignet, og verdien for konjugatet ble uttrykt som en prosent av den for usvekket toxin. Den prosentvise antigenisitet ganger 1000 ga verdien for antigen-enheter pr. mg i vaksinen.

Resttoksisitet i vaksinen ble bestemt ved å sammenligne verdiene for ST og vaksinen ved (i) den minimale effektive dose ved den diegivende museutprøvning hvori en museenhet er definert som den mengde som gir et intestinalvekt/skrottvekt— forhold på minst 0,083, og (ii) ED^Q (den dose som gir den halve maksimale sekresjon) i ombundne ileumsløyfer i uimmuniserte rotter.

S T- konjugasjon

I de tilfeller hvor rotter ble immunisert med syntetisk ST alene, ble toxinet koplet til svine-immunoglobulin G (PIG) i et molarforhold mellom toxin og PIG på 100:1, og et carbodiimid/totalt konjugat-proteinforhold på 1:1 på vektbasis. Dette konjugat inneholdt 46% ST på vektbasis og hadde 470 ST-antigenenheter pr. mg.

Immuniseringsprosedyrer

Med mindre annet er angitt, ble rotter gitt primærimmunisering intraperitonealt (i.p.) under anvendelse av Freunds fullstendige adjuvans etterfulgt av to perorale (p.o.) boostere med 4 dagers intervaller. Peroral immunisering ble gitt via en intragastrisk slange 2 timer etter p.o.-administrering av cimetidin (solgt under varemerket'^Tagamet!' av Smith, Kline and French Laboratories, Carolina, Puerto Rico) i en dose på 50 mg/kg kroppsvekt for å stanse mavesyresekresjon.

Utfordringsprosedyrer

Rotter ble utfordret 4 til 6 dager etter den sluttelige booster ved drypp i en enkel 10 cm ombundet sløyfe av det distale ileum i 18 timer med 0,1 ml dyrkningskraft inneholdende 10 9levedyktige organismer pr. ml. Hvert nullpunkt ble bestemt i 3 til 5 immuniserte rotter, og de angitte verdier er for gjennomsnittet - standardfeil av den gjennomsnittlige grad av redusert sekresjon i immuniserte rotter sammenlignet med 5 uimmuniserte rotter utfordret med samme organisme. Redusert sekresjon på mer enn 50% angis som en sterk beskyttelse da denne var signifikant i hvert tilfelle til en P-verdi på mindre enn 0,001 som bestemt ved Student's t-test for to uavhengige midler.

Antitoxinrespons

Serum og mucosale antitoxintitere ble bestemt ved ELISA ved de teknikker som er beskrevet i avsnitt B. For antitoxin overfor B-subenheten ble B-subenheten anvendt som den faste fase, for antitoxin overfor ST ble geite-hyperimmunt antiserum overfor syntetisk ST anvendt som den faste fase, og syntetisk ST ble anvendt som antigenet i en dobbelt lagdelt teknikk. Da tidligere studier har vist at immunisering med LT gitt ved i.p./p.o.-systemet bare fremkalte serum IgG og mucosale IgA-antitoxintitere [Klipstein et al., Infect. Immun.,

37:1086-1092 (1982)], ble bare antitoxin for disse immunoglobulinklasser bestemt. For serumprøver ble kanin-anti-

rotte IgG og geite-anti-kanin-antiserum konjugert til alkalisk fosfatase tilsatt, og for mucosale vaskeløsninger ble geite-anti-rotte-sekretorisk IgA og kanin-anti-geite-antiserum konjugert til alkalisk fosfatase (Miles Research Laboratories, Elkhart, Ind.) anvendt. De angitte verdier er for økningen i den resiproke verdi av den geometriske gjennomsnittlige titer i 5 immuniserte dyr i forhold til 5 uimmuniserte kontrollrotter.

Avsnitt D

F remstilling av vaksinen

Renset LT holotoxin ble fremstilt fra E. coli stamme 711 (FILT), et omdannet D-12-derivat som bærer LT-gener av Ent- plasmidet fra svinestamme P307, og ble separert i dets subenheter ved kromatografiske teknikker som diskutert i av-

snitt B. Homogeniteten av LT-holotoxinet og dets B-subenhet ble også fastslått ved polyacrylamidgel-elektroforese som diskutert i avsnitt B. Syntetisk ST, bestående av den samme primærstruktur av 18 aminosyrer som polypeptidet beskrevet av Chan et al., supra, inneholdt 3 intramolekylære cystin-disulf idbindinger . Det syntetiske ST var det materiale hvis spesifikke fremstilling er angitt i avsnitt II. Den anvendte konjugasjonsprosedyre var den samme som den som er diskutert i avsnitt III C, med det unntak at molarforholdet mellom syntetisk ST og B-subenhet var 70:1.

E genskaper av vaksinen

Vaksineegenskapene ble bestemt som diskutert i avsnitt III C. De konsentrasjoner ved hvilke vaksinen og usvekket ST og B-subenhet ga en adsorbans på 0,600 ved 410 nm, ble sammenlignet, og verdien for hver komponent av vaksinen ble uttrykt som en prosent av den av samme toxin i usvekket form. Den prosentvise antigenisitet ganger 1000 ga verdien for antigen-enheter (AU) pr. mg i vaksinen. Den anvendte vaksine inneholdt 4 50 AU av hvert komponenttoxin pr. mg protein, og immuniserings-doser beskrevet som 1000 AU, inneholdt denne mengde antigenisitet for hver toxinkomponent i 2,2 mg vaksine.

Immuniseringsprosedyrer

Med mindre annet er angitt, ble rotter gitt primærimmunisering intraperitonealt (i.p.) under anvendelse av Freunds fullstendige adjuvans (FCA) etterfulgt 4 dager senere av 2 p.o.-boostere gitt ved 4 dagers intervaller. Peroral immunisering ble gitt via en intragastrisk slange 2 timer etter p.o,-administrering av cimetidin (solgt under varemerket 'Tagamet" av Smith, Kline and French Laboratories, Carolina, Puerto Rico), i en dose på 50 mg/kg kroppsvekt for å stanse mavesyresekresjon. Gitt p.o. i mikrokuleform ble 1000 AU av vaksinen innkapslet ved kjente teknikker under anvendelse av hydroxypropylmethylcellulosefthalat (Compound HP-50, Sinetsu Chemical, Tokyo, Japan) som det pH-følsomme belegg.

Kaniner ble gitt primærimmunisering enten ved intra-muskulær (i.m.) administrering under anvendelse av FCA, eller ved p.o. administrering under anvendelse av en intragastrisk slange, og dette ble fulgt 2 uker senere av 2 p.o. boostere gitt med 2 ukers intervaller. 2 timer forut for p.o.-immun-iseringene ble det gitt en i.m.-injeksjon av 30 mg cimetidin.

Antitoxinrespons

Ved utfordringstidspunktet ble serum og mucosale vaske-løsninger fra utfordringssløyfene bearbeidet [Klipstein et al., Infect. Immun., 37:1086-1092 (1982)], og antitoxintitere ble bestemt ved ELISA under anvendelse av de teknikker som er diskutert i avsnitt B. For antitoxin overfor B-subenheten ble B-subenheten anvendt som den faste fase, for antitoxin overfor ST ble geite-hyperimmunt antiserum overfor syntetisk ST anvendt som den faste fase, og syntetisk ST ble anvendt som antigenet i en dobbelt lagdelt teknikk. Da tidligere studier under anvendelse av LT som antigenet hadde vist at immunisering ved i.p./p.o.-systemet bare dannet serum-immunoglobulin G(IgG) og mucosale IgA antitoxintitere [Klipstein et al., Infect. Immun., 37:1086-1092 (1982)], ble bare antitoxin av disse immunoglobulinklasser bestemt. De angitte verdier er for økningen i den resiproke verdi av den geometriske midlere titer i 4 eller flere immuniserte dyr i forhold til 5 uimmuniserte kontrolldyr, bortsett fra kaninsera hvor pre- og post-immuniseringsprøver fra samme dyr ble sammenlignet.

Utfordringsprosedyr er

Immuniserte dyr ble utfordret 4 til 7 dager etter den sluttelige booster-immunisering ved drypp av graderte doser av enten ST eller LT i ombundne ileumsløyfer i 18 timer som

tidligere beskrevet [Klipstein et al., Infect. Immun., 31:144-150 (1981); Sack, Infect. Immun., 8:641-648 (1973)]. Toxinet ble tildryppet i 0,5 ml normalt saltvann til en enkel sløyfe i hver rotte og i 1,0 ml Trypticase soyakraft (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD) i opptil 10 sløyfer i hver kanin. De angitte verdier for hvert nullpunkt av væskesekresjon er gjennomsnittet - standardfeil av gjennomsnittet

(SEM) i fra 3 til 5 kontrolldyr og immuniserte dyr og i sløyfer i 6 kontrollkaniner og 4 kaniner i hver immuniser-ingsgruppe. Beskyttelsesindekset (PI) ble bestemt ved å dividere den dose av toxin i immuniserte dyr som ga den samme sekresjon som den 50% effektive dose (ED5Q) i uimmuniserte dyr med verdien for uimmuniserte dyr.

Rotter ble også utfordret med 0,1 ml av en kulturkraft inneholdende 10 levedyktige organismer av LT /ST stamme Tx 452 (078-.H12) pr. ml. Resultatene er uttrykt som middelverdien - SEM prosentvis redusert sekresjon i immuniserte rotter sammenlignet med verdien i 5 på lignende måte utfordrede uimmuniserte kontrolldyr. Den statistiske forskjell mellom sekresjon i de immuniserte og kontrollgrupper ble sammenlignet ved Student's t-test for to uavhengige midler.

V. Anvendelse av multimert ST

Multimere ST—molekyler fremstilt som tidligere diskutert, ble kjedet til et bærermolekyl ved bestemmelser som også ble utført under ledelse av dr. Frederick A. Klipstein,

■supra. Resultatene av disse bestemmelser er de som er diskutert i det etterfølgende.

A. Vaksiner inneholdende monomere og multimere ST-molekyler 3 vaksiner ble fremstilt. Den første inneholdt monomert syntetisk ST (heretter enkelte ganger angitt som M-ST), den andre inneholdt hode-til-hale-multimer dimer ST , enkelte ganger angitt her som ST/ST, mens den tredje vaksine inneholdt den polymere ST hvis repeterende enheter er kjedet sammen med intramolekylære, interpolypeptidcystin-disulfidbindinger som enkelte ganger her er angitt som P-ST. Syntesen av hvert av de ovenfor angitte materialer er blitt beskrevet i avsnitt II. Hvert av ST-molekylene var bundet til B-subenheten av E. coli varmelabilt toxin (LT) som diskutert i avsnitt VI A.

Egenskaper av syntetiske ST- preparater

Testet ved den tidligere beskrevne ELISA-teknikk under anvendelse av hyperimmune antisera overfor et M-ST-konjugat, var antigenisiteten av ikke-konjugert ST/ST 3,5 ganger større, og antigenisiteten av ikke-konjugert P-ST var 15 ganger større enn antigenisiteten av ikke-konjugert M-ST. Resultatene av disse antigenisiteter for disse bestemmelser er illustrert i kurvene på fig. 19.

Når graderte mengder av hvert ST-preparat ble testet ved den diegivende museutprøvning, var verdiene for en museenhet 5,7 ng for M-ST, 4 5 ng for ST/ST og 18,2 ng for P-ST. Det frie ST/ST hadde således 1,3% av den sekretoriske styrke av M-ST, mens P-ST hadde 31% av den sekretoriske styrke av M-ST.

Konjugasjon med B- subenheten

Hvert av de tre syntetiske ST-preparater ble tverrbundet til LT B-subenheten under anvendelse av varierende be-gynnelsesmolarf orhold mellom ST og B-subenhet. Antigenisitetene av de således fremstilte konjugater er illustrert i tre kurver på fig. 20 som en funksjon av toxinprosenten påVektbasis og også av begynnelsesmolarforholdet mellom de to toxiner i konjugatet. Det skal forståes at "tverrbinding"

av et toxin til en bærer er forskjellig fra "tverrbinding" av et polypeptid ved interpolypeptidcystin-disulfidbindinger.

Konjugater som inneholdt like vektdeler ST og B-subenheter, ble erholdt fra reaksjoner hvori begynnelsesmolarforholdet mellom ST og B-subenhet var 45:1 for M-ST og 40:1 for ST/ST. Tilstrekkelig store forhold mellom P-ST og B-subenhet ble ikke anvendt for å gi et slikt konjugat.

Antigenisiteten av toxinene ble ikke påvirket av tverrbindingsreaksjon slik at M-ST—B-subenhetkonjugatet som inneholdt like mengder av hver toxinkomponent på vektbasis, hadde 500 antigenenheter av hver komponent. Derimot inneholdt konjugater av de hyperantigeniske ST-preparater (ST/ST og P-ST) med tilnærmet like mengder av antigenenheter av hver toxinkomponent bare 25 vekt% ST/ST og 9 vekt% P-ST.

Da mengden på vektbasis av B-subenheten ble resiprokt større ettersom vekten av ST avtok, var mengden av B-antigen-enheter størst i de konjugater som inneholdt minst mengde av ST. Blant konjugater inneholdende like mengder av antigen- enheter av hver toxinkomponent hadde M-ST-vaksinen 500 antigenenheter pr. mg, ST/ST-vaksinen inneholdt 725 antigen-enheter pr. mg, og P-ST-vaksinen hadde 900 antigenenheter pr. mg av hver toxinkomponent.

Resttoksisiteten av vaksiner fremstilt fra de to multimere ST-preparater, var 10 ganger mindre enn den av vaksinen fremstilt med M-ST. Dette tilskrives i første rekke det faktum at disse vaksiner inneholdt mindre mengder av ST.

Selv om de multimere ST-preparater var mindre toksiske

i begynnelsen enn M-ST, ble også deres toksisiteter mindre sterkt svekket ved den tverrbindende konjugasjonsreaksjon. Således ble toksisiteten av hvert ST-preparat sammenlignet med dets opprinnelige verdi, og toksisiteten av M-ST ble redusert 727 ganger ved tverrbindingsreaksjonen, toksisiteten av P-ST ble redusert med 256 ganger, og toksisiteten av ST/ST ble redusert med bare 44 ganger. Flere av egenskapene av disse vaksiner er vist i tabell 9 i det etterfølgende.

Immunisering av rotter med ST-- B- subenhetvaksiner

Grupper av rotter ble immunisert med 2 vaksiner:

(i) M-ST tverrbundet ved et begynnelsesmolarforhold på 70:1 til B-subenhet ved den tidligere beskrevne carbodiimidreaksjon, og som beskrevet i avsnitt IV B, under dannelse av et konjugat som inneholdt 51 vekt% M-ST og 4 9 vekt% B-subenhet, og som hadde 4 50 antigenenheter av hver toxinkomponent pr. mg; og (ii) P-ST tverrbundet i et begynnelsesmolarforhold på 10:1 til B-subenhet ved glutaraldehydreaksjonen (diskutert i avsnitt VI A) under dannelse av et konjugat som inneholdt 9 vekt% P-ST og 91 vekt% B-subenhet, og som inneholdt 1300 M-ST og 917 B-subenhet-antigenenheter pr. mg. De anvendte doser var basert på mengden av M-ST-antigenenheter pr. mg av hver vaksine. Alle rotter mottok parenteral primærimmunisering med 200 M—ST-antigenenheter og varierende doser av perorale

(p.o.) booster-immuniseringer slik at de totale p.o.-doser varierte mellom 500 og 3.000 M-ST-antigenenheter.

Responsen overfor de M-ST og P-ST konjugatholdige vaksiner var identisk når den totale p.o.-immunisering totalt ble uttrykt i M-ST-antigenenheter, hvilket fremgår ved undersøk-else av fig. 21 A. Uttrykt som totale p.o.-immuniseringer dannet hver vaksine en lik dose-avhengig økning i den mucosale IgA M-ST-antitoxinrespons, og en lik grad av beskyttelse mot en utfordring med en levedyktig LT /ST<+>av E. coli ble observert.

Det var imidlertid en slående forskjell når p.o.-dosene ble uttrykt på basis av mengden av ST gitt på vektbasis. Således vil en undersøkelse av fig. 21 B vise at P-ST var markert mer effektiv, dvs. den p.o.-dose av konjugert P-ST

som var nødvendig for å gi en 50% redusert sekresjon i utfordrede rotter, var 70^ug, som er 15 ganger mindre enn den på 1050^ug av konjugert M-ST som var nødvendig for å oppnå dette resultat.

De ovenfor angitte resultater vist i tabell 9 og i

fig. 21, illustrerer flere trekk ved foreliggende oppfinnelse. For det første hadde begge de multimere ST-preparater en

forbedret antigenisitet på vektbasis i forhold til monomert ST. I tillegg utviste begge preparater redusert toksisitet ved den diegivende museutprøvning som frie molekyler og som konjugater med LT B-subenheten. Det sterkt antigeniske P-ST-preparat ga en vaksine med større antigenisk styrke, men med hovedsakelig identisk toksisitet med vaksinen utledet fra ST/ST. Denne P-ST—B-subenhetvaksine hadde praktisk talt den doble antigeniske styrke av begge toxinkomponenter (ST og B-subenhet), men bare 1/10 av rest-ST-toksisiteten av M-ST—B-subenhet-vaksinen. Ennvidere var mengden (380<y>Ug) av P-ST som var nød-vendig for å fremstille en vaksine inneholdende 1.000 antigen-enheter av hver toxinkomponent, ca. 1/4 av mengden

(1.4 90yUg) av det nødvendige M-ST for å fremstille en slik vaksine.

Det er også viktig å merke seg at antigenisiteten av

de multimere ST—preparater som bestemt ved ELISA, korrelerte med deres immunogenisitet som bestemt ved deres effektivitet når det gjelder å danne en antitoxinrespons og å tilveiebringe beskyttelse mot utfordringen i immuniserte forsøksdyr. Da antigenisiteten av ST i konjugater er en funksjon både av mengden av ST i dette konjugat og den grad til hvilken dets antigenisitet måtte gå på akkord med den tverrbindende konjugasjonsreaksjon, vil en uttrykkelse av dosen av konjugatet på vektbasis ikke gi en meningsfylt informasjon med mindre antigenisiteten direkte måles. Når antigenisiteten av ST bestemmes ved en direkte utprøvning av konjugatet under anvendelse av en ELISA-teknikk, og uttrykkes i antigenenheter,

vil immunisering med M-ST konjugert enten til B-subenheten eller til en immunologisk ikke-spesifikk proteinbærer gi en dose-avhengig respons av mucosale antitoxinnivåer og en grad av beskyttelse mot utfordring med levedyktige toxin-produserte stammer [Klipstein et al., Infect. Immun., 40:924-929 (1983)].

De ovenfor angitte resultater viser ennvidere at immunisering med enten M-ST- eller P-ST-vaksinen dannet en identisk respons når dosene ble uttrykt som M-ST-antigen-enheter. Disse observasjoner bekrefter også korrelasjonen mellom antigenisitet og immunogenisitet ved at P-ST var 15 ganger mer antigenisk enn M-ST som bestemt ved ELISA, og 15 ganger mer immunogenisk på vektbasis enn M-ST i immuniserte rotter.

De ovenfor angitte studier innarbeidet også to modifikasjoner som ikke finnes i tidligere publiserte rapporter. Den første var at B-subenheten ble erholdt direkte fra en E. coli K-12 stamme som var blitt modifisert ved rekombinante teknikker for å produsere bare human B-subenhet istedenfor å oppnå denne subenhet ved dissosiasjonsprosedyrer fra svine LT-holotoxinet, hvilket er blitt gjort tidligere. Den andre modifikasjon var at glutaraldehyd ble anvendt istedenfor et carbodiimid som et tverrbindende reagens.

Kopling under anvendelse av glutaraldehyd har utallige fordeler sammenlignet med koplinger under anvendelse av carbodiimider. For det første gir det en effektiv tverrbinding av ST til B-subenheten uten å påvirke antigenisiteten av det ene eller andre toxin. For det annet gir det en mer effektiv kopling av ST til B-subenheten slik at vaksiner inneholdende like antigeniske mengder av ST og B-subenhet kan dannes fra lavere begynnelsesmolarforhold mellom ST og B-subenhet, slik at mengden av ST som er nødvendig for å fremstille vaksinen, derved kan signifikant reduseres. Ulik carbodiimider finnes det for det tredje betydelig erfaring for sikkerheten ved administrering av glutaraldehydkonjugater til mennesker. [Se Cockroft et al., J. Allerg. Clin. Immunol., 60:56-62 (1977); Levine et al., Infect. Immun., 21:158-162

(1978); og Relyveld, Prog. Clin. Biol. Res., 47:51-76 (1980)].

B. Ytterligere vaksiner inneholdende monomere og poly-m ere ST- molekyler

Ytterligere konjugater av to av de tidligere beskrevne tre syntetiske ST-preparater, M-ST og P-ST, ble fremstilt med LT B-subenheten. Effekten av varierende begynnelses-molarforhold mellom ST og B-subenhet, basert på molekylvekten av monomert syntetisk ST (M-ST), ble undersøkt slik som varierende koplingsmidler. De anvendte koplingsmidler i denne studie var 1-ethy1-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDAC), dimethyl-suberimidat (DMS) og glutaraldehyd (GA).

Resultater fra enkelte av disse studier er vist i kurvene på fig. 22 for P-ST koplet med enten DMS eller EDAC. Resultatene erholdt ved anvendelse av GA, er vist på høyre felt av fig. 20 (felt C). Som det sees, ga både DMC og GA større ST-antigenisiteter (antigenenheter pr. mg) ved lavere begynnelsesmolarforhold mellom P-ST og B-subenhet enn hva som ble erholdt under anvendelse av EDAC. Data for bestemte konjugater er vist i etterfølgende tabell 10.

De ovenfor angitte data illustrerer overlegenheten av polymert syntetisk ST (P-ST) i forhold til det monomere syntetiske ST (M-ST) på vektbasis. Denne overlegenhet synes ikke å være avhengig av det anvendte koplingsmiddel selv om de forskjellige koplingsmidler riktignok utviste en viss effekt. Således syntes glutaraladehyd (GA) og dimethyl-suberimidat (DMA) å gi bedre konjugater av både P-ST og M-ST til B-subenheten sammenlignet med carbodiimidet (EDAC).

Forsøksdetaljer vedrørende de ovenfor angitte studier,

i tillegg til de som allerede er angitt, finnes i etterfølg-ende avsnitt VI B.

C. Immunogenisitet av ikke— konjugert polymert ST

Hvert av de ovenfor beskrevne ST-preparater er blitt vist å være antigene, og hvert er definert som å ha minst 10% av antigenisiteten av det naturlige, biologiske ST på vektbasis. Disse antigenisiteter er illustrert ved ELISA-bestemmelser. Når i tillegg de ovenfor angitte ST-preparater koples til en proteinbærer slik som LT B-subenheten eller svine-immunoglobulin G, har disse vist seg å være immunogene i både rotter og kaniner. Såvidt man kjenner til, er de monomere ST- (M-ST) preparater imidlertid hapteniske og ikke immunogene når de anvendes alene uten en koplet bærer.

Immunisering med ST som et konjugat som et bærerprotein hvis bærer ikke er et aktivt immunogen, er sløsing av midler da endel av konjugatet ikke er immunolgisk aktivt. B-sub-enhetdelen av ST—B-subenhetkonjugatene er selvsagt delvis immunogene og fremkaller produksjonen av antistoffer. Imidlertid er tilstrekkelige mengder av holotoxinet eller av B-enheten ikke lett tilgjengelige for å tilveiebringe en økonomisk egnet vaksine, og når slike preparater av slike bærerproteiner fremstilles ved genetiske spleiseteknikker, kan de også inneholde uønskede proteinforurensninger.

Det ville derfor være meget fordelaktig hvis et fullstendig syntetisk immunogen kunne fremstilles for en vaksine hvori hovedsakelig hele konjugatet var immunologisk aktivt. Det polymere ST-preparat, P-ST, synes på grunn av sin høye midlere molekylvekt, oppløselighet, antigenisitet og vel-lykkethet ved anvendelse som et koplet immunogen i et konjugat å være en slik immunogenisk aktiv bærer for et syntetisk polypeptid svarende i aminosyre-restsekvens til en immunogenisk og antigenisk determinantregion av LT B-subenheten, slik som de sekvenser som er angitt i tabell 2, supra. Immunogenisitetsstudier ble derfor foretatt under anvendelse av et ikke-konjugert P-ST—preparat som et første skritt mot produksjonen av et slik P-ST—LT B-polypeptidkonjugat.

Kaniner ble immunisert med ikke-konjugert P—ST, etterfulgt av to boostere med P-ST. ELlSA-bestemmelser fastslo at sera erholdt fra disse immuniser inger, hadde høye titere mot syntetisk monomert ST (M-ST) som et antigen. En serumtiter på 1:2500 ga halvparten av den maksimale metning av M-ST-antigenet.

De erholdte titere er tilstrekkelige til å indikere at en bærer ikke behøves for å immunisere og beskytte mot utfordring med ikke-konjugert P-ST. Disse titere er også tilstrekkelige for å anta at P-ST i seg selv kan anvendes som en bærer for konjugasjon av et immunogenisk, syntetisk LT B-subenhet-polypeptid under dannelse av et fullstendig syntetisk immunogen hvor hovedsakelig alt er immunogenisk aktivt, og som gir beskyttelse mot både ST- og LT-produserende patogener. Det antaes at M-ST administrert under samme prosedyre som anvendt i disse studier, dvs. ikke-konjugert til en bærer,

vil fremkalle hovedsakelig ingen anti-ST-antistoffer.

Prosedyrene anvendt for å oppnå disse resultater, er diskutert i etterfølgende avsnitt VI C.

VI. M aterialer og metoder for multimert ST

A- Vaksiner_in neholden de M- ST, jT/ST o g P- ST Enterotoxinpreparater

3 syntetisk fremstilte ST-preparater ble anvendt. Det monomere syntetiske ST (M-ST) anvendt i disse preparater, er det materiale som inneholder den samme sekvens av 18 aminosyrerester som den som er beskrevet for naturlig humant ST Ib av Chan et al., J. Biol. Chem., 256:7744-7746 (1981), hvis biologiske og antigeniske egenskaper er hovedsakelig identiske med de for naturlig ST. Fremstillingen og egenskapene av M-ST er blitt diskutert i avsnitt II og III. Det anvendte ST/ST-preparat er det 3 6 aminosyreholdige polypeptid som er hode-til-hale-dimeren av det 18 aminosyre-restholdige humane ST Ib hvis fremstilling er blitt diskutert i avsnitt II. Det polymere ST (P-ST) er det materiale hvis flertall av ST-repeterende enheter er kjedet ved intramolekylære, interpolypeptidcystin-disulf idbindinger. Fremstilling av P-ST er også blitt beskrevet i avsnitt II. ST/ST- og P—ST-preparatene ble renset ved at de ble ført gjennom en Sephadex® G-50 kromatografikolonne, ble lyofilisert og deretter anvendt uten ytterligere rensning.

B-subenheten ble erholdt fra kulturer av E. coli stamme pDF 87, et omformet K-12-derivat som bærer B-subenhetplasmidet av human E. coli stamme H 10407 [Clément et al., Infect. Immun., 40:653-658 (1983)], og som ble renset ved de kromatografiske teknikker som er beskrevet i elements et al., Infect. Immun., 29:91-97 (1980). Mengden av anvendte toxiner var basert på deres proteinkonsentrasjoner bestemt ved metoden ifølge Lowry et al., J. Biol. Chem., 193:265-275 (1951), og molarekvivalentene var utledet fra publiserte verdier for naturlig B-subenhet (57.400 dalton for den polymere 5 subenhet) og naturlig ST (1.972 dalton) som tidligere diskutert og som angitt i Gill et al., Infect. Immun., 33:677-682

(1981) og Staples et al., J. Biol. Chem., 255:4716-4721

(1980).

K onj ugatbet i nge1s er

3 forskjellige syntetiske ST-preparater ble tverrbundet til LT B-subenheten ved å blande varierende begynnelses-molarforhold mellom disse toxiner i nærvær av Sigma glutaraldehyd kvalitet I (GA) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Forholdet mellom GA og totalt protein av toxinblandingen ble variert i hver reaksjon slik at GA/B-subenhetforholdet ble holdt konstant på 700:1 på molarbasis. Denne konsentrasjon av GA ble funnet å gi effektiv tverrbinding uten svekkelse av B—subenhet-antigenisiteten. Etter 2 timers reaksjon ved rom temperatur ble konjugatene grundig dialysert mot TEAN-buffer (tris, EDTA, natriumazid, natriumklorid) ved 4°C og ble deretter bearbeidet som tidligere beskrevet og som beskrevet i Klipstein et al., J. Infect. Dis., 147:318-326 (1983).

E genskaper av konjugatene

Antigenisiteten av de syntetiske ST-preparater, enten alene eller i konjugert form, ble bestemt ved dobbelt lagdelt enzym-kjedet immunosorbantbestemmelse (ELISA) under anvendelse av geite- og kanin-hyperimmunt antisera overfor syntetisk M-ST som beskrevet i Klipstein et al., J. Infect. Dis., 147:318-326 (1983) og Klipstein et al., Infect. Immun., 39:117-121 (1983). Antigenisiteten av B-subenheten i konjugatene ble bestemt ved ELISA under anvendelse av geite-hyperimmunt antiserum overfor humane B-subenheter. Antigenisiteten av hver toxinkomponent i konjugatet er uttrykt som en prosent av den av samtidig bestemt usvekket toxin, idet den prosentvise antigenisitet av hver toxinkomponent ganger 1000 gir antall antigenenheter pr. mg av vaksinen. Antigenisiteten av to multimere ST-preparater i konjugater uttrykkes i M-ST-antigenenheter .

Rest ST-toksisitet i vaksinene ble bestemt som tidligere beskrevet av Klipstein et al,, Infect. Immun., 37:550-557

(1983) ved å sammenligne verdiene for usvekket ST. For hver vaksine ble den minimale effektive dose bestemt i den diegivende museprøvning, hvori en museenhet er definert som den mengde som gir et intenstinalt/skrott-vektforhold på minst 0,083.

Immuniseringsprosedyrer

150-175 g's Sprague-Dawley rotter ble gitt primærimmunisering intraperitonealt (i.p.) under anvendelse av Freunds fullstendige adjuvans etterfulgt av to boostere gitt peroralt (p.o) med 4 dagers intervaller. Immunisering p.o. ble gitt via en intragastrisk slange 2 timer etter p.o.-administrering av cimetidin ("Tagamet" tilgjengelig fra Smith Kline & French Laboratories, Carolina, Puerto Rico) i doser på 50 mg pr. kg kroppsvekt for å stanse mavesyresekresjon.

Utfordringsprosedyrer

Rottene ble utfordret 4 til 6 dager etter den sluttelige booster ved drypp av 0,1 ml av en kulturkraft inneholdende 10 levedyktige organismer pr. ml av E. coli LT /ST stamme Tx 452 (078:H12) i en 10 cm enkel ombundet sløyfe av distal-ileum i 18 timer, som tidligere beskrevet og som beskrevet i Klipstein et al., Infect. Immun., 34:637-639

(1981) og i Klipstein et al., Infect. Immun., 40:924-929

(1983) . Hvert nullpunkt ble bestemt i 4 til 6 immuniserte rotter, og de angitte resultater er for den gjennomsnittlige (pluss eller minus standardfeil av gjennomsnittet) prosentvise reduserte sekresjon i immuniserte rotter sammenlignet med verdien i 5 uimmuniserte kontrollrotter som ble utfordret på lignende måte. En redusert sekresjon på mer enn 50% representerte en signifikant (P er mindre enn 0,001) forskjell, som bestemt ved Student's t—test for to uavhengige midler, mellom verdiene i immuniserte og kontrolldyr.

Antitoxinrespons

Mucosale IgA antitoxin- (mucosal AT) titere overfor M-ST og overfor B-subenheten ble bestemt ved ELISA som tidligere beskrevet, og som beskrevet i Klipstein et al., Infect. Immun., 37:550-557 (1983) og i Klipstein et al., Infect. Immun., 40:924-929 (1983). Antitoxintitere i dyr immunisert med P-ST-vaksine, ble bestemt ved en dobbelt lagdelt teknikk hvori geite-hyperimmunt antiserum overfor M-ST ble anvendt som den faste fase og M-ST var antigenet. Disse resultater er uttrykt som M—ST-verdier. De angitte verdier er den midlere ganger økning, avrundet til nærmeste hele tall, i titerne for immuniserte rotter i forhold til de i uimmuniserte kontrollrotter. Antitoxintitere i kontrollrottene var 1:2 mot begge toxinkomponenter slik at en titer på 1:64 i immuniserte dyr representerer en 6-dobbelt økning.

B. Ytterligere vaksinekonjugater inneholdende monomere og polymere ST- molekyler

Det monomere syntetiske ST- (M-ST) preparat og det polymere syntetiske ST- (P-ST) preparat anvendt i disse konjugater, var de hvis fremstilling og anvendelse er blitt diskutert tidligere i avsnitt II, III og VI A. LT B-subenheten var det materiale som ble diskutert i avsnitt VI A.

Kopling av M-ST og P-ST til B-subenheten under anvendelse av l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDAC) ble utført som diskutert i avsnitt IV for M-ST. Således var mengdene av både M-ST og P-ST basert på at begge materialer var monomere.

Koplinger under anvendelse av glutaraldehyd (GA), ble utført som beskrevet i avsnitt VI A med det unntak at den anvendte mengde av GA er uttrykt som et vektforhold mellom GA og totalt protein i konjugatet på 0,5:1 eller 0,6:1 istedenfor det molare forhold på 700:1 mellom GA og B-subenhet som ble anvendt i avsnitt VI A.

Koplinger under anvendelse av dimethyl—suberimidat (DMS) ble utført ved et DMS/totalt protein-vektforhold på 1:1. Prosedyrer for slike koplinger kan finnes i Carpenter et al., J. Biol. Chem., 247:5580-5586 (1972) og i Hillel et al., Biochemistry, 16:3334-3342 (1977).

Antigenisiteter av konjugatene, antall antigen-enheter (AU) pr. mg av konjugat, mengden av den konjugatholdige vaksine som anvendes for å gi 1000 AU av toxinene og mengden av ST-preparater i en slik vaksine ble bestemt som diskutert i avsnitt VI A. Den sekretoriske styrke av konjugatene ble bestemt under anvendelse av den tidligere beskrevne diegivende musebestemmelse.

C- I mmunogenisitet av ik ke- konjugert polymert ST

Det polymere syntetiske ST (P-ST) anvendt i disse bestemmelser, var det rensede materiale som diskutert i avsnitt II og VI A. De anvendte immuniserings- og ELISA-systerner er som følger.

Kaniner ble injisert intramuskulært (i.m.) på dag 0 med en vaksine som inneholdt 200yug P-ST dispergert i 1,5 ml Freunds fullstendige adjuvans (CFA) og 1,0 ml fosfatbufret saltvann (PBS) som hadde en pH-verdi på 7,2. Dyrene mottok intraperitoneale booster-injeksjoner (i.p.) av en vaksine som inneholdt den samme mengde av P-ST inneholdt i 1,0 ml av Freunds ufullstendige adjuvans pluss 1,0 ml PBS på dag 14, etterfulgt av en andre booster-injeksjon av en vaksine som inneholdt den samme mengde av P-ST sorbert på alum, pluss 1,5 ml PBS på dag 27. Serumprøver fra de immuniserte kaniner ble erholdt fra ørevenen på dag 34 etter den første immunisering.

Det 18-mer monomere syntetiske ST (M-ST) hvis syntese og egenskaper er diskutert i avsnitt II, III og IV, og som hadde aminosyre-restsekvensen av ST Ib, supra, ble anvendt som antigenet i ELISA-bestemmelsene for antiserumtitere. Antigenet ble oppløst i PBS til pH 7,2 under dannelse av en lagerløsning inneholdende 1 mg pr. ml. Denne lagerløsning ble deretter fortynnet med en 0,1 molar natriumacetatbuffer med en pH-verdi på 9,6 under dannelse av en andre lagerløs-ning inneholdende M-ST i en konsentrasjon på 0,5^ug pr. ml.

50yUl av den andre lagerløsning ble anbrakt i brønnene på en mikrotiterplate under dannelse av 25 ng av M-ST-antigenet til hver brønn. Platen ble deretter inkubert i et fuktig kammer i et tidsrom på 2 timer ved en temperatur på 37°C.

Brønnene ble deretter vasket 3 ganger med en PBS-løs-ning som inneholdt 0,07% polysorbat 20 (Tween<®>20, ICI USA, Inc., Wilmington, DE), etterfulgt av to vaskinger av destillert vann. lOOyUl 1% okseserumalbumin (BSA) i PBS ble deretter tilsatt til hver brønn for å blokkere seter med ikke-spesifikk binding, og de BSA-holdige løsninger ble inkubert i brønnene i 1 time ved 3 7°C.

Løsninger inneholdende ubundet BSA, ble rystet fra platen. Uten først å tørke platen ble 90^ ul PBS tilsatt til hver brønn av topprekken av brønner, mens 50^,ul PBS ble tilsatt til hver brønn i resten av platen. Deretter ble lO^ul antiserum tilsatt til hver av topprekken av brønner, og den således fremstilte blanding ble blandet, 50^,ul antiserum-holdig løsning fra hver brønn ble deretter tilsatt og blandet med de 50yul PBS i brønnen nedenunder under dannelse av ytterligere doble fortynninger. En lignende serie av doble fortynninger ble fortsatt for de gjenværende brønner i platen. Etter at alle fortynningene var foretatt, ble de fortynnede antiserumholdige brønner inkubert ved 37°C i 1 time.

Geite-anti-kaninserum merket med peroxydase ble fortynnet 1:3000 på volumbasis med PBS, også inneholdende 1% BSA, og 50^ul av den resulterende løsning ble tilsatt til hver brønn, bortsett fra brønnene i topprekken som ikke ble ana-lysert. De således fremstilte brønner ble inkubert i et tidsrom på 1 time ved 37°C og ble deretter vasket som ovenfor beskrevet.

En løsning av ortho-fenylendiamin (OPD) ble fremstilt ved å oppløse en tablett av OPD-substrat (Pittman-Moore, Inc., Washington Crossing, NJ) i 6 ml destillert vann til hvilket 1 dråpe 3% hydrogenperoxyd også var tilsatt. 80yul av den resulterende løsning ble tilsatt til hver av mikrotiter-platebrønnene. Farveutvikling i brønnene ble stoppet etter 20 minutter ved tilsetning av 50yUl 4 normal svovelsyre til hver brønn. Mengden av farge tilstedeværende i hver brønn, ble bestemt ved å måle den optiske densitet av væsken ved 492 nm.

Mengden av antistoff i kaninserumet som var nødvendig for å mette halvparten av M-ST-antigenet på platen, ble deretter beregnet under anvendelse av standardteknikker. Som et resultat av disse beregninger ble det funnet at det var tilstrekkelig antistoff overfor M^ST tilstede i det immuniserte kaninserum for å mette halvparten av det tilførte M-ST-antigen når dette serum var fortynnet 1:2500. Således ble en antiserumtiter på 1:2500 erholdt ved denne doble lagdelte ELISA-bestemmelse.

VII. D iagnoser

De ovenfor diskuterte resultater illustrerer at de syntetiske ST-preparater ifølge oppfinnelsen er antigeniske. Eksempelvis er det monomere, syntetiske ST blitt vist å ha en antigenisitet på 40 til 260% av biologisk ST når det bestemmes under anvendelse av antistoffer overfor biologisk ST, og en antigenisitet på 10 til 100% når det måles under anvendelse av antistoffer dannet mot et bestemt syntetisk ST-preparat, dvs. det rensede produkt (3) ifølge tabell 2. På lignende måte er den multimere dimer ST/ST blitt vist å ha en antigenisitet som er 300-350% av den av monomert ST (M-ST), mens det polymere ST (P-ST) er blitt vist å ha 900-1500% av antigenisiteten av M-ST.

De syntetiske ST-molekyler ifølge oppfinnelsen, og i særdeleshet de multimere ST-former, kan derfor være anvendbare som diagnostiske reagenser eller som endel av et diagnostisk system som anvendes for å identifisere dyr, innbefattet mennesker, som er infisert med bakterier slik som E. coli og Klebsiella pneumoniae som danner ST-toxiner. Antistoffer dannet mot ST-molekyler ifølge oppfinnelsen, kan også være anvendbare ved slike diagnoser.

Immunobestemmelser er særlig foretrukne diagnostiske metoder for utnyttelse av ST-molekyler. De tidligere diskuterte ELISA-bestemmelser er eksempler på slike immunobestemmelser. I tillegg vil anvendbare immunobestemmelser innbefatte radioimmunbestemmelser og fluorescensimmunbestemmelser og lignende.

En utførelsesform av dette diagnostiske system er særlig anvendbar ved konkurransebestemmelser og innbefatter et første reagens og et andre reagens i separate beholdere. Et første reagens omfatter et syntetisk antigenisk ST-polypeptid ifølge oppfinnelsen slik som M-ST eller P-ST som antigenet. Det andre reagens omfatter reseptorer slik som de antistoffer som immunoreagerer med M-ST eller P-ST og også immunoreagerer med biologisk ST, slik som de som tidligere er diskutert. Et middel for å indikere nærvær av en immunoreaksjon mellom antigenet og reseptorer, signaliseres av ytterligere, anti-reseptor, reseptorer kjedet til et merke slik som et radio-125

aktivt element slik som I, et fluorescent farvestoff slik som fluorescein eller et enzym slik som peroxydase. Det indikerende middel innbefattes enten i en separat beholder slik som i fosfatase-kjedet geite-anti-kanin-antistoffer med en annen separat beholder for dets substrat, eller sammen med antistoffene slik som hvor radioaktive elementer er bundet til antistoffene. De indikerende midler kan også tilføres

separat.

Blanding av på forhånd bestemte mengder av det første

og andre reagens i nærvær av en på forhånd bestemt mengde av en prøve som skal undersøkes, slik som en avføringsprøve eller en bakteriekultur fra en avføringsprøve, gir en mengde på immunoreaksjonen som signaliseres av de indikerende midler. Graden av immunoreaksjon er forskjellig fra en kjent grad av immunoreaksjon når et ST er tilstede i den undersøkte prøve.

I vanlig praksis preinkuberes bakteriekulturen med anti-stoffet, og denne sammensetning inkuberes deretter med P-ST som er bundet til veggene i en ELISA-brønn. Skylling av brønnen for å fjerne ethvert antistoff-naturlig, biologisk ST-kompleks (immunoreaktant) etterlater et immunkompleks av P-ST og antistoff hvis nærvær og grad kan signaliseres av de indikerende midler.

Anvendelse av hele, intakte, biologisk aktive antistoffer er ikke nødvendig i mange diagnostiske systemer slik som den ovenfor diskuterte konkurransebestemmelse. Bare den biologisk aktive idiotype-holdige amiddel av antistoffmolekylet som bindes til det antigeniske ST, kan være nødvendig. Eksempler på idiotype-holdige polyamiddeler er de som er kjent som Fab og F(ab')2antistoffdeler som fremstilles ved velkjente enzymatiske reaksjoner på typisk hele antistoffer.

Hele, intakte antistoffer, Fab, F(ab')2~deler og ligne-ende som inneholder antistoffenes idiotypiske regioner, an-gies her som reseptorer. Uttrykket "reseptor" som anvendt ovenfor og i de etterfølgende krav, omfatter den gruppe av slike molekyler som er anvendbare i diagnostiske produkter eller teknikker. Selv om Fab eller F(ab')2~antistoffdelene kan anvendes som reseptoren i en diagnostisk teknikk eller et produkt, er anvendelse av det hele, intakte antistoff van-ligvis foretrukket når fremstilling av en Fab eller F(ab')2~del av et antistoff krever ytterligere reaksjon og rensing av sera.

Den foregående beskrivelse er gitt av illustrative grunner og begrenser ikke oppfinnelsen. Utallige variasjoner og modifikasjoner kan utføres uten å avvike fra oppfinnelsens ramme.

Claims (36)

1. Syntetisk polypeptid med minst 10% av antigenisiteten av biologisk varmestabilt enterotoxin av Escherichia coli, karakterisert ved at det omfatter aminosyre-restsekvensen, tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden av formelen:

hvori de 3 spesifikke aminosyrerester i parentes hver er et alternativ til den umiddelbart foregående aminosyrerest i angitte sekvens; a-f og g-1 er hele tall som hvert har en verdi på 0 eller 1, forutsatt at hvis verdien av en hvilken som helst av 1—6 7~12 a-f eller g-1 er 0, er den tilsvarende R c ~ eller R , - 1-6 a_f g_1 gruppe fraværende, og når en R -.-gruppe er fraværende, fraværende, R a f-gruppe fraværende,1-6 danner svovelatomet av Cys-resten som har en fraværende Ra _f~ gruppe, en cystin-disulfidbinding, mens når verdien av angitte 1 — 6 7—12 a-f eller g-1 er 1, er den tilsvarende R c- eller R , - 3 a-f g-1 gruppe tilstede; 1 —6 og hvor angitte R a _ x.-.-grupper tatt individuelt, er like eller forskjellige grupper bundet til svovelatomet på Cys-resten og er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, en alkylgruppe inneholdende 1 til 4 carbonatomer, en substituert alkylgruppe inneholdende 2 til 20 carbonatomer, en acylgruppe inneholdende 1 til 8 carbonatomer, og en substituert acylgruppe inneholdende 2 til 10 carbonatomer;

7-12 angitte Rg_^ -grupper er like eller forskjellige alternative aminosyrerester til hver umiddelbart foregående Cys-restv minst to av a-f og to av g-1 er 0 og to Cys-rester er tilstede, forutsatt at angitte syntetiske polypeptid inneholder minst 1 intramolekylær cystin-disulfidbinding dannet fra minst 2 tilstedeværende Cys-rester; og "m" er et helt tall med verdien 0 eller 1, forutsatt 13 at hvis "m" er 0, er R fraværende, og hvis "m" er 1, er 13 m Rm valgt fra gruppen bestående av en kjede inneholdende 1 til 54 aminosyrerester, en kjedende gruppe, og acyldelen av en carboxylsyre inneholdende 1 til 20 carbonatomer som danner en amidbinding med aminet i den amino-terminale rest.

2. Syntetisk polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at "e" er 0 når "a" er 0, "d" er 0 når "b" er 0, og "f" er 0 når "c" er 0; hver av "g" og "k" er 0 når "a" er 0, hver av "h" og "j" er 0 når "b" er 0, og hver av "i" og "1" er 0 når "c" er 0, og en intrapolypeptidcystin-disulfidbinding er tilstede mellom Cys-restene vist i angitte formel som bundet til R^ og R5 eller R? og R^ eller R3 og R~. e b r d c ^ f

3. Syntetisk polypeptid ifølge krav 2, karakterisert ved at "a", "b" og "c" er 0 og 3 intrapolypeptidcystin-disulfidbindinger er tilstede mellom Cys-restene vist i angitte formel som bundet til R^ og R^, R^ og R^, og R3 og R^ .

4. Syntetisk polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at angitte intramolekylære cystin-disulfidbinding er en interpolypeptidbinding, og at angitte polypeptid er et av et flertall av repeterende enheter av en multimer.

5. Syntetisk polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at "m" har verdien 1, 13 og at angitte Rra er en kjede inneholdende 4 aminosyrerester med sekvensen, tatt fra venstre til høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden av formelen Asn(Ser)Thr(Ser)Phe(Asn)Tyr, hvori aminosyrerestene i parentes hver er et alternativ til den umiddelbart foregående aminosyrerest .

6. Syntetisk polypeptid med minst 10% av antigenisiteten av biologisk varmestabilt enterotoxin av Escherichia coli, karakterisert ved at det innbefatter aminosyresekvensen, tatt fra venstre mot høyre i retning fra aminoenden til carboxyenden av formel:

hvori de 6 spesifikke aminosyrerester i parentes hver er et alternativ til den umiddelbart foregående aminosyrerest» R^, R^, R3,R^ , R^ ogR ^ er like eller forskjellige grupper bundet til svovelatomet av Cys-resten; a-f er hele tall med en verdi på 0 eller 1, forutsatt at hvis verdien av en hvilken som helst av a-f er 0, er den 1—6 tilsvarende Rc.l X- -gruppe fraværende, forutsatt ennvidere at: "e" er 0 når "a" er 0, "d" er 0 når "b" er 0, og "f" er 0 når "c" er 0; forutsatt ennvidere at minst én av "a", "b" eller "c" må 1-3 være 0 slik at den tilsvarende R er fraværende slik som 4-6 a~c Rd_f hvis indeks er 0 når angitte "a", "b" eller "c" er 0, og at en intramolekylær, intrapolypeptidcystin-disulfidbinding er tilstede mellom de respektive Cys-rester for hvilke en indeksverdi på 0 krever at en annen indeksverdi skal være 0» når en verdi på a-f er 1, er angitte respektive --grupper tilstede og er individuelt valgt fra gruppen bestående av hydrogen, en alkylgruppe inneholdende 1 til 4 carbonatomer, en substituert alkylgruppe inneholdende 2 til 20 carbonatomer, en acylgruppe inneholdende 1 til 8 carbonatomer og en substituert acylgruppe inneholdende 2 til 10 carbonatomer; D7 D8 D9 _10 _11 _12 , , - c R , Rh, R ^, Rj , Rk og R^ er like eller forskjellige alternative aminosyrerester til den foregående Cys-rest, og hvori g-1 er hele tall med verdien 0 eller 1, forutsatt at når verdien av ethvert g-1 er 0, er den tilsvarende

7-12 Rg_^ -gruppe fraværende, og forutsatt at: hver av "g" og "k" er 0 når "a" er 0, hver av "h" og "j" er 0 når "b" er 0, og hver av "i" og "1" er 0 når "c" er 0; og når verdien på et hvilket som helst av g-1 er 1, er

7-12 angitte tilsvarende Rg_^ -grupper tilstede.

7. Syntetisk polypeptid ifølge krav 6, karakterisert ved at det inneholder 3 intra-polypeptidcystinrester dannet mellom parene av Cys-rester 1 5 2 vist i angitte formel som bundet til grupper R og R , R, og 4 3 6 a e £> R,, eller R og RÆ. d c i

8. Syntetisk polypeptid med minst 10% av antigenisiteten av biologisk varmestabilt enterotoxin av Escherichia coli, karakterisert ved at det innbefatter aminosyresekvensen tatt fra venstre mot høyre i retning fra aminoenden til carboxyenden av formel:

hvori linjene som sammenbinder to Cys-rester, representerer intramolekylære disulfidbindinger av cystinrester; de 6 spesifikke aminosyrerester i parentes er hver et alternativ til den umiddelbart foregående aminosyrerest; og "m" er et helt tall med verdien 0 eller 1, forutsatt 13 13 at hvis "m" er 0, er R fraværende, og hvis "m" er 1, er R m m valgt fra gruppen bestående av en kjedende gruppe og acyldelen av en carboxylsyre inneholdende 1 til 20 carbonatomer som danner en amidbinding med den amino-terminale rest.

9. Syntetisk polypeptid ifølge krav 8,

13 karakterisert ved at "m" er 0, og 3 R mer fraværende.

10. Syntetisk multimer med minst 10% av antigenisiteten av biologisk varmestabilt enterotoxin av Escherichia coli, karakterisert ved at det omfatter et flertall av polypeptid-repeterende enheter innbefattende aminosyre-restsekvensen, tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden av formelen:

hvori de 3 spesifikke aminosyrerester i parentes hver er et alternativ til den umiddelbart foregående aminosyrerest i angitte sekvens; a-f og g-1 er hele tall som hvert har en verdi på 0 eller 1, forutsatt at hvis verdien av et hvilket som helst av 1—6 7 -12 a-f eller g-1 er 0, er den tilsvarende R £- eller R , - 1-6 g gruppe fraværende, og når en Ro _,.-gruppe er fraværende, danner 1-6 svovelatomet av Cys-resten som har en fraværende R cl _X.p-gruppe, en cystin-disulfidbinding, mens hvis verdien av angitte a-f

1 — 6 7"™ 12 eller g—1 er 1, er angitte tilsvarende Ra_f~ eller Rg.^ -gruppe tilstede ; angitte R^ f-grupper er individuelt like eller for- cl X skjellige grupper bundet til svovelatomet av Cys-resten og er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, en alkylgruppe inneholdende 1 til 4 carbonatomer, en substituert alkylgruppe inneholdende 2 til 20 carbonatomer, en acylgruppe inneholdende 1 til 8 carbonatomer og en substituert acylgruppe inneholdende 2 til 10 carbonatomer? 7-12 angitte Rg_j_ -grupper er like eller forskjellige alternative aminosyrerester til hver umiddelbart foregående Cys-rest; minst to av a-f og to av g-1 er 0 og to Cys-rester er tilstede, forutsatt at angitte syntetiske polypeptid inneholder minst én intramolekylær cystin-disulfidbinding dannet fra minst to tilstedeværende Cys-rester; og "m" er et helt tall med verdien 0 eller 1, forutsatt at 13 13 hvis "m" er 0, er R^ fraværende, og hvis "m" er 1, er Rm valgt fra gruppen bestående av en kjede inneholdende 1 til 54 aminosyrerester, en kjedende gruppe, og acyldelen av en carboxylsyre inneholdende 1 til 20 carbonatomer som danner en amidbinding med aminet av den amino-terminale rest.

11. Syntetisk multimer ifølge krav 10, karakterisert ved at angitte intramolekylære cystin-disulfidbinding er en intrapolypeptid-disulfidbinding, angitte repeterende enheter er bundet sammen hode-til-hale via en amidbinding dannet mellom amingruppen av den amino-terminale rest av en første polypeptid-repeterende enhet og carboxylgruppen av den carboxy-terminale rest av en andre polypeptid-repeterende enhet.

12. Syntetisk multimer ifølge krav 10, karakterisert ved at angitte intramolekylære cystin-disulfidbinding er en interpolypeptid-disulfidbinding, angitte repeterende enheter er bundet sammen med angitte interpolypeptidcystin-disulf idbinding dannet mellom Cys-restene av angitte polypeptid-repeterende enheter.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av et syntetisk polypeptid med en antigenisk aktivitet på minst 10% av det varmestabile enterotoxin av Escherichia coli, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn:(a) tilveiebringelse av et første polypeptid innbefattende aminosyre-restsekvensen, tatt fra venstre til høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden av formelen:

hvori de 3 spesifikke aminosyrerester i parentes hver er et alternativ til den umiddelbart foregående aminsyrerest i angitte sekvens; a-f og g-1 er hele tall som hver har en verdi på 0 eller 1, forutsatt at hvis verdien av en hvilken som helst 1 — 6 av a-f eller av g-1 er 0, er den tilsvarende R f - eller 7-12 R _, -gruppe fraværende, mens hvis verdien av angitte a-f 1—6 7—12 eller g-1 er 1, er angitte tilsvarende Ra_f - eller Rg_j_ - gruppe tilstede; angitte Ra_^-grupper er individuelt like eller forskjellige grupper bundet til svovelatomet av Cys-resten og er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, en alkylgruppe inneholdende 1 til 4 carbonatomer, en substituert alkylgruppe inneholdende 2 til 20 carbonatomer, en acylgruppe inneholdende 1 til 8 carbonatomer, og en substituert acylgruppe inneholdende 2 til 10 carbonatomer;

7-12 angitte -grupper er like eller forskjellige alternative aminosyrerester til hver umiddelbart foregående Cys-rest; verdiene av minst to av a-f er 1, verdiene av minst to av g-1 er 0, og de tilsvarende R^ -grupper er hydrogen for angitte to av a-f hvis verdier er 1 slik at angitte første polypeptid inneholder minst to CysH-rester; og "m" er et helt tall som har verdien 0 eller 1, forutsatt at hvis "m" er 0, er R 13 fraværende, og hvis "m" er 1, er R_13 m m valgt fra gruppen bestående av en kjede inneholdende 1 til 54 aminosyrerester, en kjedende gruppe, og acyldelen av en carboxylsyre inneholdende 1 til 20 carbonatomer som danner en amidbinding med aminet av den amino-terminale rest, (b) oppløsning eller dispergering av angitte første polypeptid i et vandig materiale til en konsentrasjon på mindre enn 5 mg pr. ml; (c) angitte materiale bringes i kontakt med molekylært oxygen som et oxydasjonsmiddel, idet løsningen har en pH-verdi på 7,0 til 9,5 under angitte kontakttrinn; og (d) angitte kontakt opprettholdes i et tidsrom på fra

1 til 24 timer for å oxydere angitte i det minste 2 polypeptid-Cys-H-rester og danne i det oxyderte polypeptid minst én intramolekylær cystin-disulfidbinding fra angitte i det minste

2 CysH-rester tilstedeværende i angitte første polypeptid.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at verdiene av minst 4 av a-f er 1, verdiene av minst 4 av g-1 er 0, og de tilsvarende R a—r^-grupper er hydrogen for angitte 4 av a-f hvis verdier er 1 slik at angitte første polypeptid inneholder minst 4 CysH-rester, og at det oxyderte polypeptid dannet i trinn (d) inneholder minst 2 intramolekylære cystin-disulfidbindinger.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at verdiene av hver av a-f er 1, verdiene av hver av g-1 er 0, og de tilsvarendeR<a_> ^-grupper er hydrogen slik at angitte første polypeptid inneholder 6 CysH-rester, og at det oxyderte polypeptid dannet i trinn (d), inneholder 3 intramolekylære cystin-disulfidbindinger .

16. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at minst én intramolekylær cystin-disulfidbinding er en intrapolypeptid disulfidbinding.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at minst én intramolekylær cystin-disulfidbinding er en interpolypeptid-disulfidbinding.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at den innbefatter oppsamling og rensing av det oxyderte polypeptid, og oppsamling av det rensede, oxyderte polypeptid.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at det oppsamlede, rensede, oxyderte polypeptid er en multimer av angitte første polypeptid, hvilken multimer inneholder et flertall av repeterende enheter med aminosyre-restsekvensen av angitte første polypeptid, hvilke repeterende enheter er bundet sammen med intramolekylære , interpolypeptidcystin-disulfidbindinger.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at den innbefatter syntetisering av angitte første polypeptid under ikke-oxyderende betingelser, og hvori angitte første syntetiserte polypeptid inneholder et flertall av angitte repeterende enheter med en aminosyre-restsekvens som tilsvarer sekvensen representert ved angitte formel, hvilke repeterende enheter er bundet sammen med en amidbinding dannet mellom amingruppen av den amino-terminale rest av første polypeptid-repeterende enhet og carboxylgruppen i den carboxy-terminale rest av en andre polypeptid-repeterende enhet.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at "m" har en verdi på 1, 13 angitte R^ er et peptid inneholdende 4 aminosyrerester som har sekvensen, tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden av formel Asn(Ser)Thr(Ser)Phe(Asn)Tyr, hvori aminosyrerestene i parentes hver er et alternativ til den umiddelbart foregående aminosyrerest.

22. Fremgangsmåte for fremstilling av et syntetisk polypeptid med en immunologisk aktivitet på minst 10% av det varmestabile enterotoxin av E. coli, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: (a) syntetisering under ikke-oxyderende betingelser av et første polypeptid innbefattende aminosyresekvensen tatt fra venstre mot høyre i retning fra aminoenden til carboxy- enden av formel;

hvori angitte aminosyre-restsekvens uten de 3 spesifikke

7-12 aminosyrerester i parentes og R _, -gruppene tilsvarer aminosyrerestene av ST Ib-polypeptidet nummerert 5-18 fra aminoenden av angitte ST Ib-polypeptid; de 3 spesifikke aminosyrerester i parentes er hver et alternativ til den umiddelbart foregående aminosyrerest; R<7> ,R ^, R?, r\ ° , R^1 og R?"2 er like eller forskjellige alternative aminosyrerester til den foregående Cys-rest,

g-1 er hele tall som har verdien 0 eller 1 forutsatt at hvis en hvilken som helst av g-1 har en verdi på O, er den til-7-12 svarende, individuelle R _, -gruppe fraværende, forutsatt ennvidere at verdien av minst to av g-1 er 0, forutsatt ennvidere at minst ett par av ikke-tilstøtende Cys-rester fra Cys-restene som går forut for de individuelle R 7-_1, 2-grupper, g i er tilstede, er angitte ikke—tilstøtende par av Cys-rester valgt fra gruppen bestående av Cys-restene som svarer til aminosyre-reststillingene i ST Ib-polypeptidet nummerert 5 eller 6 og 9 eller 10, 5 eller 6 og 14, og 9 eller 10 og 17 fra aminoenden av angitte ST Ib-polypeptid; (b) oppløsning av angitte første polypeptid i vandig løsning til en konsentrasjon på mindre enn 2 mg pr. ml, hvilken løsning har en alkalisk pH-verdi på mindre enn 10,5; (c) angitte løsning bringes i kontakt med molekylært oxygen som et oxydasjonsmiddel, hvilken løsning har en pH-verdi på 7,0 til 9,5; og (d) opprettholdelse av angitte kontakt i et tidsrom på fra 1 til 24 timer under dannelse av minst én intramolekylær disulfidbinding mellom parene av ikke-tilstøtende Cys-rester 7—12 som går forut for Rg_]_ -gruppene vist i angitte formel og valgt fra gruppen bestående av Cys-restene svarende til amino-syrestillingene i angitte ST Ib-polypeptid nummerert 5 eller 6 og 9 eller 10, 5 eller 6 og 14, og 9 eller 10 og 17 fra aminoenden av angitte ST Ib-polypeptid.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert ved at det angitte første polypeptid ytterligere innbefatter bundet til aminoenden av angitte polypeptid aminosyresekvensen, tatt fra venstre til høyre i retning fra aminoenden mot carboxyenden, av formelen: Asn(Ser)Thr(Ser)Phe(Asn).

24. Vaksine, karakterisert ved at den omfatter (a) en syntetisk polypeptid-multimer kjedet til en bærer som et konjugat, og (b) et fysiologisk akseptabelt fortynningsraiddel for angitte konjugat, hvilken syntetiske polypeptid-multiraer har minst 10% av antigenisiteten av biologisk varmestabilt enterotoxin av Escherichia coli og inneholder et flertall av syntetiske polypeptid-repeterende enheter, hvilke syntetiske polypeptid-repeterende enheter innbefatter aminosyre-restsekvensen, tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden av formel:

hvori de 3 spesifikke aminosyrerester i parentes hver er et alternativ til den umiddelbart foregående aminosyrerest i angitte sekvens; a-f og g-1 er hele tall som hver har en verdi på 0 eller 1, forutsatt at hvis verdien av en hvilken som helst 1—6 7-12 av a-f eller g-1 er 0, er den tilsvarende R c - eller R , - 1-6 g gruppe fraværende, og når en R ^.-gruppe er fraværende, a 1—6 danner svovelatomet av Cys-resten som har en fraværende R a-f c-gruppe, en cystin-disulfidbinding, mens hvis verdien av an-1 — 6 gitte a-f eller g-1 er 1, er angitte tilsvarende R f - eller

7-12 R , -gruppe tilstede; Sl _x^-grupper skjellige grupper bundet til svovelatomet av Cys-resten og er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, en alkylgruppe inneholdende 1 til 4 carbonatomer, en substituert alkylgruppe inneholdende 2 til 20 carbonatomer, en acylgruppe inneholdende 1 til 8 carbonatomer, og en substituert acylgruppe inneholdende 2 til 10 carbonatomer;

7-12 angitte R , -grupper er like eller forskjellige alter- y i native aminosyrerester til hver umiddelbart foregående Cys-rest; minst 2 av a-f og 2 av g-1 er 0 og 2 Cys-rester er tilstede, forutsatt at angitte syntetiske polypeptid inneholder minst én intramolekylær cystin-disulfidbinding dannet fra minst 2 tilstedeværende Cys-rester; og "m" er et helt tall som har verdien 0 eller 1, forutsatt 13 13 at hvis "m" er 0, er R fraværende, og hvis "m" er 1, er R m m valgt fra gruppen bestående av en kjede inneholdende 1 til 54 aminosyrerester, en kjedende gruppe og acyldelen av en carboxylsyre inneholdende 1 til 20 carbonatomer som danner en amidbinding med aminet av den amino-terminale rest.,

25. Vaksine ifølge krav 24, karakterisert ved at angitte intramolekylære cystin-disulfidbinding er en intrapolypeptid-disulfidbinding og at angitte repeterende enheter er bundet sammen hode-til-hale gjennom en amidbinding dannet mellom amingruppen av den amino-terminale rest av en første polypeptid-repeterende enhet og carboxylgruppen av den carboxy-terminale rest av en andre polypeptid-repeterende enhet.

26. Vaksine ifølge krav 24, karakterisert ved at angitte intramolekylære cystin-disulfidbinding er en interpolypeptid-disulfidbinding og at angitte repeterende enheter er bundet sammen med angitte interpolypeptidcystin-disulfidbinding dannet mellom Cys-restene av angitte polypeptid-repeterende enheter.

27. Vaksine, karakterisert ved at den omfatter (a) en effektiv mengde av en polymer inneholdende et flertall av polypeptid-repeterende enheter, og (b) et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel, hvilke polypeptid-repeterende enheter er bundet sammen med intramolekylære, interpolypeptidcystin-disulfidbindinger, hvilke syntetiske polypeptid-repeterende enheter innbefatter aminosyre-restsekvensen, tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden, av formel:

hvori de 3 spesifikke aminosyrerester i parentes hver er et alternativ til den umiddelbart foregående aminosyrerest i angitte sekvens; a-f og g-1 er hele tall som hvert har en verdi på 0 eller 1, forutsatt at hvis verdien av hvilke som helst av a-f eller g-1 er 0, er den tilsvarende R"*" ^ —gruppe fraværende, 1-6 a og når en R ..-gruppe er fraværende, danner svovelatomet av 1-6 Cys-resten som har en fraværende R__ f-gruppe, en cystin- a r disulfidbinding, mens hvis verdien av angitte a-f eller g-1 1—6 7—12 er 1, er angitte tilsvarende Ra_f" eller Rg_]_ -gruppe tilstede; angitteR ^ <_> ^-grupper er individuelt like eller forskjellige grupper bundet til svovelatomet av Cys-resten og er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, en alkylgruppe inneholdende 1 til 4 carbonatomer, en substituert alkylgruppe inneholdende 2 til 20 carbonatomer, en acylgruppe inneholdende 1 til 8 carbonatomer, og en substituert acylgruppe inneholdende 2 til 10 carbonatomer;;7-12 angitte Rg_^ -grupper er like eller forskjellige alternative aminosyrerester til hver umiddelbart foregående Cys-rest; minst 2 av a-f og 2 av g-1 er 0 og 2 Cys-rester er tilstede, forutsatt at angitte syntetiske polypeptid inneholder minst én intramolekylær cystin-disulfidbinding dannet fra minst 2 tilstedværende Cys-rester; og "m" er et helt tall med verdien 0 eller 1, forutsatt 13 at hvis "m" er 0, er R fraværende, og hvis "m" er 1, er 13 m Rm valgt fra gruppen bestående av en kjede inneholdende 1 til 54 aminosyrerester, en kjedende gruppe og acyldelen av en carboxylsyre inneholdende 1 til 20 carbonatomer som danner en amidbinding med aminet av den amino-terminale rest.

28. Diagnostisk system, karakterisert ved at det innbefatter et første reagens og et andre reagens i separate beholdere, hvilket første reagens omfatter et syntetisk polypeptid, hvilket polypeptid har minst 10% av antigenisiteten av biologisk varmestabilt enterotoxin av Escherichia coli og som innbefatter aminosyre-restsekvensen, tatt fra venstre mot høyre og i retning fra aminoenden til carboxyenden, av formel: ;hvori de 3 spesifikke aminosyrerester i parentes hver er et alternativ til den umiddelbart foregående aminosyrerest i angitte sekvens; a-f og g-1 er hele tall som hver har en verdi på 0 eller 1, forutsatt at hvis verdien av en hvilken som helst 1 — 6 7 ~~ 12 av a-f eller g-1 er 0, er den tilsvarende R Æ- eller R , - 1-6 g gruppe fraværende, og når en R cl~~ X--gruppe er fraværende, danner svovelatomet av Cys-resten som har en fraværende 1—6 R ^-gruppe, en cystin-disulfidbinding, mens hvis verdien av angitte a-f eller g-1 er 1, er angitte tilsvarende R 1-6,-;7-12 a eller R , -gruppe tilstede; 1—6 angitte R^ ^-grupper er individuelt like eller for- a —r skjellige grupper bundet til svovelatomet av Cys-resten og er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, en alkylgruppe inneholdende 1 til 4 carbomatomer, en substituert alkylgruppe inneholdende 2 til 20 carbonatomer, en acylgruppe inneholdende 1 til 8 carbonatomer, og en substituert acylgruppe inneholdende 2 til 10 carbonatomer;;7-12 angitte R y i, -grupper er like eller forskjellige alternative aminosyrerester til hver umiddelbart foregående Cys-rest; minst 2 av a-f og 2 av g-1 er 0, og 2 Cys-rester er tilstede, forutsatt at angitte syntetiske polypeptid inneholder minst én intramolekylær cystin-disulfidbinding dannet fra minst 2 tilstedeværende Cys-rester; og "m" er et helt tall som har verdien 0 eller 1, forutsatt at hvis "m" er 0, er R"J" <3> fraværende, og hvis "m" er 1, er Rm 13 valgt fra gruppen b-estående av en kjede inneholdende 1 til 54 aminosyrerester, en kjedende gruppe og acyldelen av en carboxylsyre inneholdende 1 til 20 carbonatomer som danner en amidbinding med aminet av den amino-terminale rest; hvilket andre reagens omfatter reseptorer som immunoreagerer med angitte syntetiske polypeptid og også immunoreagerer med angitte biologisk varmestabile enterotoxin av Escherichia coli, blanding av de angitte første og andre reagenser i nærvær av en på forhånd bestemt mengde av en prøve som skal bestemmes som tilveiebringer en grad av immunoreaksjon, hvilken grad av immunoreaksjon er forskjellig fra en kjent grad av immunoreaksjon når et varmestabilt enterotoxin er tilstede i angitte prøve som skal bestemmes, hvilken grad av immunoreaksjon signaliseres ved hjelp av indikerende midler.

29. Diagnostisk system ifølge krav 28, karakterisert ved at angitte indikerende midler ytterligere omfatter reseptorer som immunoreagerer med angitte andre reagensreseptorer, og at angitte ytterligere reseptorer er kjedet til et merke.

30. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: (a) tilveiebringelse av det syntetiske polypeptid ifølge krav 1;- (b) kjeding av angitte polypeptid til en bærer under dannelse av et konjugat; og (c) opplø sning eller dispergering av en effektiv mengde av angitte konjugat i et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel.

31. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: (a) tilveiebringelse av den syntetiske multimer ifølge krav 10; (b) kjeding av angitte multimer til en bærer under dannelse av et konjugat; og (c) oppløsning eller dispergering av en effektiv mengde av angitte konjugat i et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel.

32. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: (a) tilveiebringelse av den syntetiske multimer ifølge krav 11; (b) kjeding av angitte multimer til en bærer under dannelse av et konjugat; og (c) oppløsning eller dispergering av en effektiv mengde av angitte konjugat i et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel.

33. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: (a) tilveiebringelse av den syntetiske multimer ifølge krav 12; (b) kjeding av angitte multimer til en bærer under dannelse av et konjugat; og (c) oppløsning eller dispergering av en effektiv mengde av angitte konjugat i et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel.

34. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: (a) tilveiebringelse av den syntetiske multimer ifølge krav 12; og (b) oppløsning eller dispergering av en effektiv mengde av angitte multimer i et fysiologisk akseptabelt fortynningsmiddel.

35. Syntetisk nettverkpolymer med minst 10% av antigenisiteten av varmestabilt enterotoxin av Escherichia coli, karakterisert ved at den omfatter et flertall av polypeptid-repeterende enheter innbefattende aminosyre-restsekvensen, tatt fra venstre mot høyre og i retning av aminoenden til carboxyenden av formel: ;hvori de 3 spesifikke aminosyrerester i parentes hver er et alternativ til den umiddelbart foregående aminosyrerest i angitte sekvens; a-f og g-1 er hele tall som hvert har en verdi på 0 eller 1, forutsatt at hvis verdien av en hvilken som helst av a-f eller g-1 er 0, er den tilsvarende R"*" %- eller R7 ?"2-gruppe fraværende, og når en R _^ -gruppe er fraværende, danner 1-6 svovelatomet av Cys-resten som har en fraværende R= _.p-gruppe, en cystin-disulfidbinding, mens hvis verdien av angitte a-f 1— 6 7—12 eller g-1 er 1, er angitte tilsvarende R a-f c - eller R g-1, - gruppe, tilstede; angitte Ra_f~grupper er individuelt like eller forskjellige grupper bundet til svovelatomet av Cys-resten og er valgt fra gruppen bestående av hydrogen, en alkylgruppe inneholdende 1 til 4 carbonatomer, en substituert alkylgruppe inneholdende 2 til 20 carbonatomer, en acylgruppe inneholdende 1 til 8 carbonatomer, og en substituert acylgruppe inneholdende 2 til 10 carbonatomer; angitte R 7_-1, 2-grupper er like eller forskjellige alternative aminosyrerester til hver umiddelbart foregående Cys-rest; minst 2 av a-f og 2 av g-1 er 0 og 2 Cys-rester er tilstede, forutsatt at angitte syntetiske polypeptid inneholder minst én intramolekylær cystin-disulfidbinding dannet fra minst 2 tilstedeværende Cys-rester; og "m" er et helt tall med verdien 0 eller 1, forutsatt 13 at hvis "m" er 0, er R fraværende, og hvis "m" er 1, er 13 m Rm valgt fra gruppen bestående av en kjede inneholdende 1 til 54 aminosyrerester, en kjedende gruppe og acyldelen av en carboxylsyre inneholdende 1 til 20 carbonatomer som danner en amidbinding med aminet av den amino-terminale rest; hvilket flertall av repeterende enheter er bundet sammen ved tverrbindinger tilført av intramolekylære, interpolypeptidcystin-disulf idbindinger .

36. Syntetisk nettverkpolymer ifølge krav 35, karakterisert ved at alle av angitte a-f er 0? alle av angitte g-1 er 0; angitte "m" er 1; og

13 angitte Rm er et peptid inneholdende aminosyre-restsekvensen av de 4 amino-terminale rester av ST Ib,