NO850070L - Fremgangsmaate for fremstilling av etanol ut fra xyloseholdig materiale - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å fremstille etanol ut fra et xyloseholdig materiale som omfatter å for-gjære materialet med en gjær. Slike fremgangsmåter er nylig blitt beskrevet i US-PS nr. 4 359 534 og 4 368 268 hvor det ved for-gjæringen benyttes gjæren Pachysolen tannophilus og gjærmutanter fra stammen Candida sp. Formålet med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte for å for-gjære xylose i et høyt utbytte.

Gjæren for anvendelse i oppfinnelsen er Pchia stipitis, Pichia segobiensis og Candida shehatae. Typestammen av P.stipitis, CBS 5773 (NNRL Y-7124, T), ble opprinnelig isolert fra en insektlarve og ble betegnet med Pignal. Standardbeskrivelsen av P. stipitis utført av Kreger-van Ri j , 1970 (The Yeasts - A Taxo-nomic Study (Lodder, J. ed.) sidene 533 - 535, North-Holland Publishing Company - Amsterdam, London) er som følger: Vekst i maltekstrakt: Etter 3 dager ved 25°C er cellene runde til ovale (2 - 7,5) x (2,5 - 7,5) ym; enkle eller i par.

Det dannes et sediment. Etter én måned ved 17°C er det tilstede et sediment og, av og til, en ring.

Vekst på maltågar: Etter 3 dager ved 25°C er cellene runde til kort-ovale, (2,5 - 4,5) x (2,5 - 6) ym; enkle eller i par.

Det kan forekomme pseudomycele-celler som er opptil 15 ym lange. Etter én måned ved 17°C er utstrykningskulturen kremfarget, av og til med et rødlig fargeskjær, blødt, jevnt eller fint rynket i midten og delvis blank. Kanten er frynset med pseudomycelium.

Preparatkulturer på potet- og maismelagar: Det dannes rike-lig med pseudomycelium. Det er mer eller mindre forgrenet og be-står av lange pseudomycele-celler med små blastosporer.

Dannelse av ascosporer: Konjugasjon mellom morcelle og knopp eller mellom to enkeltceller går forut for dannelse av ascus. Cellene kan danne utvekster av forskjellige lengder. Sporene er hatt-formede; det dannes to pr. ascus. De frigjøres lett fra ■ < ascus. Det ble iakttatt sporer hos de tre stammene som ble under-søkt på YM-, Difco maltekstrakt- og maismelagar.

Gjæring:

Assimilering av karbonforbindelser:

Spalting av arbutin: Positiv

Assimilering av kaliumnitrat: Negativ

Vekst i vitamin-fritt medium: Negativ; eller eller svært svakt

positiv.

Vekst på 50% (vekt/vekt) glukose-gjærekstrakt-agar: Negativ Vekst ved 37°C: Positiv.

I tillegg til de ovenfor nevnte for-gjærbare substratene er det uventet funnet at P. stipitis også for-gjærer D-xylose.

P. segobiensis er beskrevet i den følgende litteraturhenvisning: J. Santa Maria og G.G. Aser, An. Inst. Nac. Invest. Agrarias, Ser. General 5 (1977) 45 - 50. Det er funnet at denne gjæren for-gjærer D-xylose til etanol i en grad som er sammenlignbar med den til P-stipitis. Alle de stammene av P. stipitis som ble prøvdt - CBS 5773, CBS 5774, CBS 5775, CBS 5776, CBS 6054 og P. segobiensis stamme CBS 6857 - har dette kjennetegnet til fel-les. Alle disse stammene kommer derfor i betraktning for anvendelse i den beskrevne fremgangsmåte. Også den foreløpige (Lodder: The Yeasts (1970) s. 535, 1046, 1047) imperfekt-formen av P. stipitis (Candida shehatae) for-gjærer D-xylose til etanol og kommer derfor også i betraktning for anvendelse i den beskrevne fremgangsmåte.

Alle D-xylose-holdige substrater er egnet i den beskrevne fremgangsmåte forutsatt at de ikke inneholder noen bestanddeler som er alvorlig inhibirende for fremgangsmåten.

Ettersom tilgjengelig glukose også vil for-gjæres til etanol, er hydrolysert cellulose og hydrolysert hemi-cellulose eller blandinger derav særlig egnet som substrater i den beskrevne fremgangsmåte. Følgelig kunne et hvilket som helst lignocellu-losemateriale som inneholder cellulose og hemi-cellulose, slik som tre, gress, strå, bagasse etc, tjene som råmateriale for fremgangsmåten. Som substrater er også avfallsvæsker, slik som brukt sulfittlut, som inneholder D-xylose ved siden av eventu-elle andre sukkere, også egnet. Det er underforstått at det do-minerende monosakkaridet som finnes i hydrolysert hemi-cellulose, er D-xylose.

Den beskrevne fremgangsmåte omfatter for-gjæringen i et van-dig medium av D-xylose, og D-glukose dersom denne er tilstede, til etanol. De kjemiske og fysikalske betingelser i mediet må ellers være slik at levedyktigheten til cellene opprettholdes, slik de er kjent av fagfolk innen teknikken.

Når det kreves cellevekst, bør etanolkonsentrasjonen ikke overskride 45 g/l. Ved 30 g/l avtar veksthastigheten betydelig. Etanolutbyttet reduseres ved etanolkonsentrasjoner på eller over 3 0 g/l.

P. stipitis vokser godt ved 28 - 3 2 C. For-gjæring underhol-des i temperaturområdet 15 - 40°C. Den høyeste hastigheten iakttas mellom 30°C og 37°C, idet 32 - 34°C er optimal for fremstil-lingshastigheten for etanol.

Vekst av P. stipitis CBS 5773 oppstår i pH-intervallet 3 - 7. pH 5 gir en noe bedre vekst enn pH 4 og pH 6 gjør. Fremstil-lingshastigheten for etanol er god mellom pH 3 og pH 8, idet pH 6 er omtrent maksimal. Ettersom det er ønskelig å utføre for-gjæringen ved den lavest mulige pH for å minimalisere risikoen for infeksjon, bør det iakttas at ved pH 4 er fremstillingshas-tigheten mer enn 90% av det maksimale, og veksthastigheten er også tilfredsstillende ved denne pH.

Etanolfremstilling fortsetter i et anaerobt medium. Etanolutbyttet ved anaerob for-gjæring er omtrent lik med utbyttet ved en for-gjæring ved en begrenset lufttilførsel, selv om for-gjæ-ringshastigheten er noe lavere.

I en typisk for-gjæring av satsvis type forsynes en celle-suspensjon av P. stipitis erholdt fra en for-kultur fortrinnsvis i eksponensiell vekstfase med D-xylose. Betingelsene justeres og holdes innenfor det ovenfor definerte område. Etanolfremstilling startes derved opp og vil fortsette ved den hastigheten som bestemmes av den faktiske cellekonsentrasjon og betingelsene som ellers er fremherskende. Forutsatt at betingelsene holdes innenfor det ovenfor definerte område og at cellene holdes levedyk-tige, vil etanolfremstilling ikke stanse opp før D-xylosen er brukt opp.

I US-Patent nr. 4 3 59 534 er det beskrevet en fremgangsmåte hvor gjæren Pachysolen tannophilus brukes til å for-gjære et D-xyloseholdig materiale. Det angis at lufting er en forutsetning for forhøyet etanolfremstilling. Det høyest rapporterte utbytte 1 dette patentet er 0,3 4 g etanol/g D-xylose. I US-patent nr. 4 368 2 68 beskrives en lignende fremgangsmåte hvor en mutant-stamme av Candida sp., XF 217 brukes til å for-gjære D-xylose til etanol. Det rapporteres at oksygen må være tilgjengelig for å oppnå forhøyet etanolfremstilling fra D-xylose. Det høyeste rapporterte utbytte i dette patentet er det som er vist i fig. 1 og 2 som viser aerob for-gjæring hvorfra det kan beregnes et utbytte på 0,42 g etanol/g D-xylose.

Det er nødvendig med en liten mengde luft (oksygen) for cellevekst. Etanolutbyttet i aerob for-gjæring under anvendelse av P. stipitis med en begrenset mengde luft er omtrent det samme som i anaerob for-gjæring. Dette muliggjør en for-gjæringsfrem-gangsmåte hvor betingelser som favoriserer vekst og effektiv for-gjæring samtidig kan imøtekommes. Virkningen av en liten mengde oksygen er således dobbel; den muliggjør den nødvendige cellevekst og den øker den spesifikke etanol-produktiviteten til cellene.

Det høyest oppnådde utbytte i et enkelt for-gjæringsforsøk er 0,46 g etanol/g D-xylose. Det er vår overbevisning at 3/2 molekyler etanol dannes for hvert molekyl D-xylose.

Dette svarer til et maksimalt teoretisk utbytte på 0,46 g etanol/g forbrukt D-xylose. Utbyttet ovenfor er følgelig 100%. Vanligvis er utbyttet noe lavere, 0,43 - 0,45 g/g (= 93 - 98% av

det maksimale).

EKSEMPLER

De følgende eksempler gis for mer fullstendig å beskrive den her åpenbarte fremgangsmåte, men må ikke oppfattes som begren-sende for omfanget av oppfinnelsen definert ved kravene.

Generell forsøksfremgangsmåte

Agar-skråkulturer av Pichia stipitis, stammene CBS 5773, 5774, 5775, 5776 og 6054, Pichia segobiensis CBS 6857 og Candida shehatae, stammene CBS 5712 og 5813 ble erholdt fra Laboratorium voor Microbiologie, Technische Hogeschool Delft, Delft. Kulturene ble opprettholdt på skrå-agar ved 30°C. Skråmediet inneholdt 20 g/l D-xylose, 7 g/l gjærekstrakt og 15 g/l agar. Med mindre annet er angitt inneholdt de flytende mediene for gjærformering 7 g/l gjærekstrakt, 10 g/l D-xylose og en mineralbasis med (NH4)2S04(2,35 g/l), KH2P04(0,55 g/l), MgS04x 7 H20 (0,25 g/l), Na2HP04x 12 H20 (0,25 g/l), CaCl2x 2H20 (20 mg/l) og sporele-menter (H3B03(0,5 mg/l), MnS04x 4H20 (0,2 mg/l), ZnS04x 7H20 (0,2 mg/l), CuS04x 5H20 (0,23 mg/l), FeS04x 7H20 (1,25 mg/l), (NH4)6Mo?024x 4H20 (0,.l mg/l), H2S04 (0,5 mg/l), Co(N03)2x 6H20 (0,25 mg/l), KJ (0,05 mg/l)) (pH 5,0). I tilfeller hvor det ble brukt en annen xylosekonsentrasjon var de relative forhold av andre mediumbestanddeler de samme som ovenfor. Inkubering ble ut-ført på en roterende rystemaskin ved 30°C med mindre annet er angitt.

Med mindre det er angitt aerobe betingelser referer forgjæringen seg til betingelsen hvor gassfasen i prøvekaret besto av C02og trykkutjevningen fikk skje ved hjelp av en sprøyte gjennom gummiproppen som lukker beholderen. Den generelle forsøksfrem-gangsmåten medførte aerob formering av gjærceller i et væskemedium slik som beskrevet ovenfor, innhøstingen av cellene i eksponensiell vekstfase ved sentrifugering og resuspendering av cellene i friskt medium hvilket ga en endelig forgjæringsblanding som inneholdt (omtrent) 5 g (tørrvekt) celler/l. Fremstilt etanol ble målt ved hjelp av gasskromatografi eller høytrykks væskekromato-grafi (HPLC). D-xylose og xylitol ble kvantifisert ved hjelp av HPLC. Cellevekst (uttrykt som g/l, D.W.) ble målt som optisk tetthet ved 620 nm og den tilsvarende cellekonsentrasjon ble beregnet ved multiplikasjon med en eksperimentelt fastlagt faktor.

EKSEMPEL 1

Utbyttemålinger

Forsøket ble utført i henhold til den generelle forsøksfrem-gangsmåten, anvendt xylosekonsentrasjon var imidlertid 20 g/l. Xylosen ble fullstendig forgjæret av alle stammene som ble prøvd. Etanolutbyttet og spesifikk fermenteringshastighet er vist i tabell 1:

EKSEMPEL 2

Virkning av oksygen

I et forsøk som er typisk for P. stipitis, ble det tilsatt 2,3 g/l (tørrvekt) celler av P. stipitis stamme CBS 5776 til et medium som inneholdt 15 g/l xylose og andre bestanddeler som beskrevet ovenfor. Forgjæring ble utført i to forsiktig omrørte beholdere, hvorav den ene opprinnelig var fylt med karbondioksyd av høy renhet, og den andre opprinnelig var fylt med luft.

Gass : væske-forholdet var ca. 5 : 1. Beholderne ble forseglet med gummipakninger og trykkutjevning ble muliggjort gjennom sprøy-ter. Det ble tatt ut prøver under forgjæringen for bestemmelse av etanol, xylose, sylitol og celltetthet. Resultatene er vist i tabell 2:

Etanolutbyttet ligger nær det teoretiske utbytte (0,46 g/g) og reduseres ikke i noen betydelig grad ved anaerobe betingelser. En begrenset tilgang til luft (oksygen) under forgjæringen stimu-lerer imidlertid den spesifikke forgjæringshastigheten, reduserer xylitol-fremstillingen til null og understøtter cellevekst.

EKSEMPEL 3

Virkning av pH på forgjæringshastighet

Forsøket ble utført i henhold til den generelle forsøksfrem-gangsmåte, før inokkulering ble imidlertid pH i åtte forskjellige forgjæringsmedier justert til forskjellige verdier. Forgjæringshastigheten i begynnelsen ble beregnet ved å bestemme mengde etanol fremstilt mellom det 30. og 60. minutt. pH ble målt etter

60 minutter. Tabell 3 viser resultatene.

EKSEMPEL 4

Virkning av temperatur på veksthastighet

Temperaturinnflytelsen på veksthastighet ble undersøkt for fem P. stipitis-stammer. Rysteflasker med medium som beskrevet i den generelle forsøksfremgangsmåten ble inokkulert med 0,05 g/l celler, tildekket med bomullsfiltere for fri tilgang av luft og inkubert i en roterende rystemaskin ved 8 forskjellige temperatu-rer. Resultatene er vist i tabell 4:

EKSEMPEL 5

Virkning av temperatur på forgjæringshastighet

Forsøket ble utført i henhold til eksempel 3, pH var imidlertid 5,0 og forgjæringen ble utført ved forskjellige temperatu-rer. Tabell 5 viser resultatene:

EKSEMPEL 6

Virkning av etanol på vekst

Forsøket ble utført i henhold til eksempel 4, etanol ble imidlertid tilsatt i tre forskjellige konsentrasjoner og inkuba-sjonstemperaturen var 30°C. Tabell 6 viser resultatene:

EKSEMPEL 7

Virkning av etanol på etanolutbytte

Forsøket ble utført i henhold til den generelle forgjærings-fremgangsmåte, etanol ble imidlertid tilsatt i 4 forskjellige konsentrasjoner. Inkubasjonstemperatur var 30°C for alle P. stipitis-stammer og 2 5°C for P. segobiensis CBS 68 57. Tabell 7 viser resultatene:

EKSEMPEL 8

Brukt sulfittlut ble nøytralisert til pH med KOH, tilført gjærekstrakt og mineralnæringsstoffer slik som beskrevet i generell forsøksfremgangsmåte og inokkulert med 5 g/l P. stipitis CBS 6054.

Forgjæring ble utført i en rysteflaske med bomullspropp ved 30 C i løpet av 24 timer. Resultatet er vist i tabell 8:

Det er underforstått at forsøksbetingelsene i dette eksem-plet ikke er optimalisert med hensyn på etanolutbytte.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for å fremstille etanol fra et xyloseholdig materiale, karakterisert ved å forgjære materialet med en gjær av slekten Pichia eller dens imperfekt-former som tilhører slekten Candida, valgt fra artene Pichia stipitis og/eller Pichia segobiensis og/eller Candida shehatae, under aerobe eller anaerobe betingelser.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at etanolutbyttet er minst 0,43 g etanol/g D-xylose.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at gjæren er Pichia stipitis, en stamme er valgt fra gruppen bestående av CBS 5773, CBS 5774, CBS 5775, CBS 5776, CBS 6054.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at gjæren Pichia segobiensis er stammen CBS 6857.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at gjæren er Candida shehatae, en stamme er valgt fra gruppen bestående av CBS 5813 og CBS 5712.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at pH holdes innenfor området fra ca. 2 til 8 og temperaturen innenfor området fra ca. 15°C til 40°C.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved atpH holdes ved 4 - 7 og temperaturen ved 30 - 37°C.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at oksygenkonsentrasjonen i forgjæringsmediet holdes slik at den fører til hovedsakelig anaerobe betingelser.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det xyloseholdige materiale er et nedbrytningsprodukt av lignocellulose.