NO850895L - Fremgangsmaate ved fremstilling av des-prolin vasopressin-antagonister - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved fremstilling av sykliske peptider som har vasopressin antagonist aktivitet. Mere spesielt har disse nye kjemiske forbindelser strukturer som erkarakterisert vedmangelen på en prolylen-het i 7 posisjon til 1-Pmp-VSP antagonist struktur. M. Manning, W.H. Sawyer og medarbeidere har publisert en rekke arbeider som beskriver ulike beslektede [l-fl- merkapto-(3, 3-syklopentametylenpropion syre)-4-valin] - arginin-vasopressin som har antivasopressin aktivitet. Representa-tivt for disse er U.S. patent nr. 4,367,225 og 4,399,125.

Alle Mannings forbindelser har en tripeptid kjede festet

til enhet 6 av 6-enhet ditio ringen og er selvfølgelig nonapetider. Foreliggende forbindelser adskiller seg fra disse ved å være des-pro vasopressiner med betraktelig antagonist aktivitet.

U.S. patent nr. 4.469.679 omhandler visse beslektede oktapeptid vasopressiner som mangler 9-glyenheten, og som har sterk VSP antagonist aktivitet.

Alle de tidligere kjente forbindelser har strukturer som

har en hovedsakelig prolin-lik enhet i 7 posisjon til vasopressin strukturene. Forbindelsene av foreliggende oppfinnelse har ingen slik enhet i deres struktur og behol-

der VSP antagonist aktiviteten.

I beskrivelsen og i kravene benyttes nomenklaturen som er vanlig i peptid og vasopressin kjemien. Når ingen konfigu-rasjon nevnes, er aminosyreenheten i L, eller den naturlige opptredende form. I noen strukturformler er tiogrup. pene til Pap og Cys-enhetene tilføyet for klarhetens skyld.

Følgende peptidfaguttrykk benyttes heri: Pap, |3-merkapto-

3, 3~syklopolyalkylenpropionsyre; Pmp, 3-merkapto-|3, |3-syklopentametylenpropionsyre; Abu, CX-aminobutyrsyre;

Chg, sykloheksylglysin; Cha, sykloheksylalanin; Pba,<C*-->aminofenylbutyrsyre; Gin, Glutamin; Gly, glysin,

Tyr, tyrosin; Phe, fenylalanin; Val, valine, Ile, isoleucin; Nie, norleucin; Leu, leucin; Ala, alanin; Lys, Lysin; Arg, arginin; Asn, asparagin; Tos, tosylat; BHA, benzydrylamin; DIEA, diisopropyl - etylamin; 4-MeBzl, 4-metylbensyl; TFA, trifluoreddiksyre; DCC disykloheksy1-carbodiimid; HBT, 1-hydroksybenzotriazol; ACM, acetamidometyl; VSP eller AVP, vasopressin.

Sluttproduktet, des-Pro-VSP som fremstilles under anvendelse av fremgangsmåten av foreliggende oppfinnelse illu-streres ved følgende strukturformel:

hvori: P er Phe eller Phe (4'-Alk); X er D-Phe, D-Val, D-Nva, D-Leu, D-Ile, P-Pba D-Nle, D-Cha, D-Abu, D,Met, D-Chg, D-Tyr, L-Tyr, D-Tyr (Alk) eller L-Tyr (Alk);

Y er Val, Ile, Abu, Ala, Chg, Gin, Lys, Cha, Nie, Phe, Leu eller Gly;

Z er D-Arg, L-Arg, D-Lys eller L-Lys;

A er Gly (NH2), Gly, Gly (NHAlk), OH, NH2, NHAlk; og n er 0-2, eller en farmasøytisk akseptabel salt, "prodrug" ester eller kompleks derav.

"Alk" i formel 1 og heretter representerer en lavere alkyl med 1-4 karbonatomer som eventuelt er festet enten til et nitrogen ved A eller til oksygensubstituenten til tyrosin-enheten når sistnevnte foreligger i posisjon 2. Slike al. kylsubstituenter inkluderer metyl, etyl, n-propyl, isopro-pyl eller butyl. Fortrinnsvis betyr Alk metyl eller etyl. "Bzl" representerer benzyl.

Når uttrykket "vasopressin" benyttes, betyr det L-arginin vasopressin (AVP) hvis det ikke på annen måte er modifisert for å indikere en D-arginin, D-lysin, L-lysin eller annen vasopressin. AVP derivatene av foreliggende oppfinnelse foretrekkes. Av forbindelsene som representer-es ved formel I, er de foretrukket som har en struktur hvor A er Gly(NH2) eller NH2som VSP antagonister.

En subgenerisk gruppe med forbindelser av foreliggende oppfinnelse inneholder forbindelser med formel I hvori P er Phe, X er D -Tyr eller D-Tyr (Et); Y er Val, Gin eller Abu; A er GlyNH2eller NH2; n er 1 og Z er L-Arg eller D-Arg.

En foretrukket sammensetning av denne oppfinnelse er [1- (3-merkapto-|3, (3-syklopentamety 1-propionsyre) -2-(O-etyl-D-tyrosin)-4-valin-7-des-prolin-8 -arginin] vasopressin [Pmp<1->D-Tyr (Et)<2->Val<4->desPro<7>)-AVP].

Denne oppfinnelse inkluderer også ulike derivater av forbindelsene med formel I såsom saltene, forforbindel-ser i ester eller amidform og kompleksene. Saltene kan enten være salter med farmasøytisk akseptable katjoner såsom NH<+>4, Ca<++>, K<+>eller Na<+>ved en terminal syregrup-pe når denne foreligger eller med et farmasøytisk akseptabelt salt ved et basissenter til peptide (som i Arg-enhetene). Acetatsaltformene er spesielt nyttige da de ofte dannes ved den isolerings-renselsens fremgangsmåte som angis i eksemplene. Hydrokloriner, hydrobromider og salter med andre sterke syrer er også nyttige. Forbindelsene danner også indre salter eller zwitterioner når en terminal karboksygrupper foreligger.

Forforbindelsene er derivater av forbindelser med formel I som omdannes til de biologisk aktive grunnforbindelser in vivo. Esterformen av forforbindelsene er f.eks. lavere alkylestere til syrene med formel I som har fra 1-8 karbonatomer i alkylradikale eller aralkylestere så som ulike bensylestere. Andre latente derivater av forbindelsene med formel I vil være åpenlyse for fagfolk. "Kompleksene" inkluderer ulike solvater så som hydrater eller alko-holater eller de med støttende eller rensende harpiks, så som en "Merrifield" harpiks.

Forbindelsene med formel I fremstilles ved å syklisere et lineært oktapeptid mellomprodukt av foreliggende oppfinnelse ved hjelp av de to sulfhydryl-gruppene som befinner seg respektivt ved cysteinenheten i 6 posisjon og |3-merkapto-3, 3-syklopolalkylen-propionsyre (Pap), i posisjon 1. Sykliseringsreaksjonen utføres i nærvær av et mildt oksydasjonsmiddel som ved sterk fortynning er i stand til å oksydere intremolekulært mercaptan til disulfid.

Oksydasjon av det ovenfor nevnte lineære oktapeptid (II)

hvori P, X, Y, Z og A er definert som i formel I, men hvori Z også er en enkelbinding eller en terminal 0H-gruppe, med sulfhydryl-gruppene (-SH) med formel II som medlemmer av Pap og Cysenhetene, utfører som beskrevet generelt ovenfor. Det benyttes f.eks. et overskudd av alkalmetall ferricyanid, så som kalium eller natrium ferricyanid med det lineære mellomprodukt oppløst i et egnet ureaktivt løsningsmiddel, fortrinnsvis i et vanndig løsningsmiddel ved en nøytral pH på ca. 7-7,5, ved romtemperatur eller lavere til reaksjonen er hovedsakelig til ende. Lavere alkoholer så som metanol kan tilsettes. Fortrinnsvis skal konsentrasjonene av det lineære peptid og oksydasjonsmiddelet være lav, f.eks.

0,01 molare konsentrasjoner av oksydasjonsmiddelet i flere liter vanndig oppløsning for å cyklisere 1-5

gram av dimerkaktan (II) for å danne det sykliske disulfid (III).

Andre milde oksydasjonsmidler som har et oksydasjonspoten-sial som er omtrent ekvivalent til ferricyanid kan også benyttes for ringslutningsrealsjonen. Oksygen eller jod er alternativer. En fagmann vil selvfølgelig se at visse cykliseringsmetoder ikke er riktige hvis det foreligger et annet mulig reaksjonssted i strukturen til utgangsmaterialet med formel II. Det lineære sulfhydry1-inne-holdende utgangsmateriale kan eller kan ikke ha beskyttelsesgrupper som er vanlige i faget på de ulike aminosyre-enheter eller ved sulfhydrylposisjonene. I første tilfelle fjernes beskyttelsesgruppene etter cykliseringen. I tilfelle ACM-Sh-beskyttelsesgrupper kan både fjerningen av beskyttelsesgruppen og cykliseringen ut-føres under anvendelse av jod i vanndig metanol. Vanligvis blir dog det frie lineære peptid cyklisert.

Det ønskede cykliske des-prolinpeptid med formel I blir passende isolert ved å surgjøre den vanndige oksydasjons-blanding så som under anvendelse av iseddiksyre og å sende reaksjonsblandingen over en ioneutbytter kromato-grafikolonne, f.eks. over en svakt sur akrylharpiks-kolonne med syre eluering, eller ved gelfiltrasjon over en kuleformet gel fremstillet ved å tverrbinde dextran med epiklorhydrin.

I en alternativ reaksjonssekvens for fremstilling av forbindelsene av foreliggende oppfinnelse cykliserer som beskrevet ovenfor mellomproduktene med formel II hvori en eller begge terminale enheter mangler. Det resulterende cykliske peptid (III) kondenseres deretter i en eller to reaksjoner med de beskyttede aminosyreenheter definert som Z og A for formel I, enkeltvis eller som et dipeptid. Reaksjonsbetingelsene for tilføyning av de terminale enheter er de samme som for enhver amidfremstill-ende fremgangsmåte kjent i faget som beskrevet ovenfor, men spesielt benyttes reaksjonen der den terminale aminosyre hvis karboksylsyregruppe er beskyttet som beskrevet for 6-Cyssyre i nærvær av dicyklohexylcarbodiimid og 1-hydroksy-benzotriazol. Beskyttelsesgruppene som kan fore- ligge på en av ringens aminosyrer eller på de terminale enheter blir hvis de foreligger fjernet under anvendelse av standard-reaksjoner for å danne produktene av foreliggende oppfinnelse. Reaksjonsbetingelsene bør velges for å minimere racemiseringen av Cys-enheten som kjent i faget.

Mellomproduktene med formel II i den frie eller beskyttede form fremstilles passende under anvendelse av fastfase-metoder fra peptidsyntesene. En kommersiell benzydrylamin bærerharpiks (BHR) benyttes for å fremstille de amid-terminale produkter med formel I så som de hvori A er NH2eller Gly(NH2) og en klormetyl bærerharpiks (CMR) benyttes for å fremstille de syreterminale forbindelser med formel I så som de hvori A er Gly eller

OH.

Peptidkjeden av de lineære peptider med formel II byg-ges opp trinnvis begynnende fra enten enhet 7 eller 8

og arbeidende mot enhet 1. Hver enhet beskyttes fag-messig og som beskrevet nedenfor. Sekvensen av reak-~ sjonstrinnene utføres passende i i en "Beckman 990 B" peptid syntetiserer uten å isolere hvert mellompro-

dukt peptid. Detaljene ved fremgangsmåten presenter-

es heretter i arbeidseksemplene.

De ulike aminosyrer som tilsettes fortløpende til har-piksbærerkjede beskyttes som kjent i faget. F.eks. benyttes Boe beskyttelsesgruppe for en aminogruppe spesielt i CX alfa-posisjon; benzyltiomety1, etylcarbamoyl, adamantyl, t-butyl, acetamidomety1, trityl eller en eventuelt substituert benzyl for mercaptogruppene til Pap og Cys-enhetene; nitro, karbobenzoksy, metylen-2-sulfonyl eller tosyl for Arg-enheten og etyloksykar-bonyl eller en eventuelt subsidiert karbobenzoksy (Z)

for Tyr eller Lys-enhetene. Det mest hensiktsmessige

at beskyttelsesgruppene er de som kan fjernes med letthet, dvs. under anvendelse av syrebehandling for tert.-butyl-oksykarbonyl (Boe) gruppen, natrium-flytende ammoniak eller modifisert katalytisk hydrogenering for benzyl eller karobenzoksy grupper.

Det beskyttede lineære peptid mellomprodukt adskilles

fra den bærende harpiksmatrisse, f.eks. under anvendelse av ammoniak i et vannblandbart løsningsmiddel og deretter behandles for å fjerne beskyttelsesgruppene, så som under anvendelse av natrium-flytende ammoniak. Denne fremgangsmåte gir amid-derivatet til det lineære oktapeptid .

Mere passende kombineres de to trinn ved behandling av det harpiks festede peptid med vannfri hydrogenfluorid under anvendelse av en egnet karbonione-nedbryter, så

som anisol, for å gi desprolin-peptid mellomprodukter av formel II i et godt utbytte.

Forbindelsene av denne oppfinnelse har kraftig vasopressin antagonist-aktivitet. Vasopressin er kjent å bidra til den antidiuretiske virkningsmekanisme innen nyrene. Når virkningen av disse forbindelser motvirker de til de naturlige antidiuretiske hormoner (ADH), ut-skiller kroppen vann på grunn av en øket permabilitet i de terminale deler av nyrerøret. Vi tror virknings-mekanismene er på vasopressin reseptorene [V2~resep-torer] som er lokalisert på plasmamembranen til visse yre-epitelceller. Den mest bemerkelsesverdige farmako-dynamiske effekt til ADH antagonistene av foreliggende oppfinnelse er den vanndiuretiske heller enn den natri-uretiske så som fra tiazid.

Enhver pasient som lider av utilstrekkelig antidiure-tisk hormonsekresjon (SIADH) eller fra en uønsket øde-matøs kondisjon er et mål for forbindelsene i henhold til oppfinnelsen. Eksempler på kliniske kondisjoner indikert for forbindelsene av foreliggende oppfinnelse inkluderer hypertensjon, hepatitisk cirrhose, congestiv hjertefeil eller en komponent av enhver traumatisk kondisjon som resulterer fra alvorlig skade eller sykdom.

Den annen gruppe av vasopressin reseptor-stedet er de vaskulære pressor stedet (V-^-reseptorer) innen selve kardiovaskulære systemet. Disse kan også motarbeides noe av forbindelsene av foreliggende oppfinnelse, noe som resulterer i anti-hypertensiv aktivitet. Dysmen-orrhea er et annet anvendelsesområde for forbindelsene av foreliggende oppfinnelse når det administreres in-travenøst eller intranasalt.

Forbindelsene av foreliggende oppfinnelse anvendes der-for for å behandle ødem eller for å skille ut vann i pasienter som har behov for slik behandling ved intern administrering, spesielt parenteralt eller ved insufflasjon av en ikketoksisk men effektiv mengde av den valgte forbindelse, fortrinnsvis kombinert med farma-søytisk bærer. Dosseringsenheter av den aktive ingre-diens velges fra området fra 5^g til 1 mg/kg, fortrinnsvis 10 til 20 fJq pr. kg basert på en 70 kg's pasi. ent. Dosseringsenhetene administreres fra 1 til 5 ganger daglig.

De farmasøytiske blandinger som inneholder et aktivt in-grediens av formel I inneholder en dosseringsenhet som beskrevet ovenfor, oppløst eller suspendert i en standard flytende bærer, så som en isotonisk saltoppløs-ning som oppbevares i en ampulle eller en multrippel dose glassflaske egnet for en parenteral injeksjon så som for intravenøs, subkutan eller intremuskulær administrering. En blanding til insufflasjon kan være lignende, men administreres vanligvis i en dosserings-applikator eller inhalator. Pulveriserte blandinger kan også anvendes sammen med oljepreparater, gels, buffere for isotoniske preparater, emulsjoner eller aerosoler.

Antagonist-aktiviteten mot det naturlige antidiuretiske hormon (anti-ADH aktivitet) bestemmes in vitro i marg-vevet til svine- eller menneskenyrer og in vivo i hydropene rotter. In vitro forsøksprosedyrene for vasopressin stimulert adenylat aktivisering eller vasopressin bindeaktiviteten beskrives av [F. Stassen, et al.,

J. Pharmacology and experimental therapeutics 22 3, 50-54 (1982)].

Forsøket for anti-ADH aktivitet er den hydropene rotte-protokoll som beskrevet nedenfor: Mat og vann fjernes fra hannrotter ca. 18 timer før forsøket. Fire dyr holdes pr. metabolismebur. Ved 0-tiden administrerer intraperitonalt til forsøksgruppen og ekvivalent volum av bærer administeres til begge kon-trollgrupper (fastende og ikkefastende). Urinvolumet og osmolaliteten måles hver time i fire timer. Forsøksre-sultatene føres opp som ml urin utskilt (kumulativt), mEq/rotte elektrolyttutskilt, mg pr. rotte ureautskilt og osmolalitet i milli-Osmol kg H2O. En toleransetest benyttes for å bestemme signifikansen. ED300defineres som den dose av forbindelsen tPq pr. kg) som er nødven-dig for å senke urin-osmolaliteten til 300 m-Osmol pr. kg) .

De følgende eksempler er ment å vise fremgangsmåten ved fremstillingen av forbindelsene av foreliggende oppfinnelse. Alle temperaturer er i grader celsius.

Eksempel 1

Fa stfase syntese av PmP( 4- MeBzl)- D- Tyr( Et- Phe- Val Asn- Cys-( 4MeBzl)- Arg( tos)- Gly- BHA harpiks

For fastfase-syntesen av det harpiksbårede tittelpeptid ble det som utgangsmateriale anvendt et Boc-Gly-harpiks (1.19 mmol/g av harpiks) som utgangsmaterialet. Det ble fremstillet ved å omsette desimetriske anhydrid (Boc-Gly^O med benzhydrylaminharpikset i demetylformamid i to timer. Benzhydrylharpikset som hydrokloridsalt ble forbehandlet som følger:

1) Suspendert i metylenklorid over natt.

2) Vasket med metylenklorid (4 ganger, 1 min.).

3) Nøytralisert med 7 % diidopropyletamin (DIEA)

i metylenklorid (2 ganger, 2 min.

4) Vasket med metylenklorid (6 ganger, 1 min.)

5) Vasket med forut tørket dimetylformamid (2 ganger, 1 min.) .

Det symmetriske anhydrid (Boc-Gly^O og dets harpiksform ble fremstilt som følger: Til en oppløsning av Boc-GLyOH (0.35 g, 2 mmol) i 10 ml metylenklorid ble tilsatt 1 ml (1 mmol) av disykloheksyl-karbodiimid i metylenklorid (IM oppløsning). Blandingen ble ristet på en rister i 10 min. og filtrert. Faststoffet ble vasket 3 x 1 ml med metylenklorid. Filtratet ble konsentrert i våkum (romtemperatur) til et volum på 0.5 ml.

Det ble oppløst i demetylformamid og tilsatt til BHA harpikset. Etter den fullstendige koblingen (1-2 timer), ble harpikset vasket med dimetylformamid (2x1 min), påfulgt av metylenklorid (4x1 min.). Et kvantitativt ninhydrin-forsøk og en aminosyreanalyse ble utført for å beregne den prosentvise lading av harpikset.

De formålstjenlig beskyttede aminosyrer ble i rekkefølge koblet til Boc-Gly-harpikset under anvendelse av "Beckman"

peptid-syntesizer 990 B. Programmet som ble anvendt for hver kobling bortsett fra Boc-Asn og Pmp(4-MeBzl) var som følger:

ved koblingen av Asn enheten ble 1-hydroksybenzotriazol (HOBT, 6 mmol) anvendt, 10 ml av 0,6 M i dimetylformamid. Tørr dimetylformamid ble også anvendt som løsningsmiddel når Pmp(4-MeBzl) ble koblet på peptidharpikset, under anvendelse av 4-dimetylaminopyridin (3 mmol). Fullførelsen av hver koblingsreaksjon ble kontrollert av ninhydrin-for-søket. 4-metylbenzylgruppen (4-MeBzl) ble anvendt for å beskytte tiolgruppen til Cys og pentametylen- -merka-ptopropionisk syre (Pmp) enhetene.

o

Det resulterende beskyttede peptidharpiks mellomprodukt dvs. (Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Arg (Tos)-Gly-BHA-harpikset), ble vasket godt med metylenklorid og tørket i våkum over natt for å gi 2,0 g av tittelproduk-tet. Denne fremgangsmåte anvendes også for å fremstille andre harpiksbårede linjære oktapeptid dimerkaptaner.

Eksempel 2

Fremstilling av Pmp- D- Tyr-( Et)- Phe- Val- Asn- Cys- Arg- Gly-( NH2)

Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr-(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-Gly-BHA-Harpikset, 2,0 g i 2,5 ml anisol ble omsatt med vannfritt hydrofloridsyre (40 ml) ved 0 C i 50 min.

Etter inndampning i våkum til tørrhet ble resten behandlet med vannfri eter og råpeptidet ble ekstrahert med avgasset dimetylformamid (50 ml) og 33 % eddiksyre (50 ml) til 4 1 vann. Det vandige fortynnede disulfidriloktapeptid ble syklisert under anvendelse av 0,01 M kalium ferricyanid-oppløsning ved pH 7,2 til farven bestod i 30 min. Etter fullføring av oksidasjonsreaksjonen ble pH til oppløsningen tilpasset til Ph 4,5 ved å tilsette is-eddiksyre. Denne oppløsning ble langsomt ført gjennom en svakt sur akrylhar-piks (Bio-Rex 70) kolonne (2,5 x 12 cm). Kolonnen ble eluert med pyridin-acetat buffer (30:4:66, pyridin eddiksyre/vann) Pyridin-acetatoppløsningen ble fjernet ved destillasjon i våkum og resten ble lyofilisert fra 1 % eddiksyre for å gi 420 mg (40 %) av råpeptided fra tittelen.

Rensing:

1) Motstrømsfordeling (CCD):

Prøve: 250 mg, n-butanol/eddiksyre/vann

(4:1:5), 240 gjennomløp

a) Fr. 176-189, 83 mg produkt

b) Fr. 160-166 og 190-196, 14 mg

2) Preparativ HPLC

Prøve: 50 mg (fra la) Altex ODS, 10 mm x 25 cm 5u, strømningshastighet 4 ml/min, vann/acetonitril/TFA (60:40:0.25); isokratisk, 220 nm (2,0 AUFS), injeksjon 6,25 mg/0,5 ml, 24,3 mg ren isolert prøve

Fysiske data:,

Molekulær formel: C,nH^nN,„0,nS-

48 70 12 10 2

Molekulær vekt: 1038.46

Aminosyre analyse: Asp (1.00), Gly (1.00) Cys (0.56),

Val (0.96), Tyr (0.70), Phe (0.96) og Arg (0.96) .

Kromatografiske data:

Eksempel 3

Faststoff syntese av Pmp-4(MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Y-Asn-Cys (4-MeBzl)-Arg(Tos)-BHA-Harpikset.

For faststoff-syntesen av tittelsforbindelsen harpiks-støttet peptider, ble Boe. Arg(Tos)Bha harpikset (1.34 mmol fq av harpikset) ble brukt som et start material. Det ble fremskaffet ved å reagere BOC-Arg(Tos), 3 mmol, med benzhydrylaminharpikset. Benzhydrylaminharpikset som et fritt basis ble svellet inn i metylenklorid over natt. Det ble vasket en gang med 7 % diisopropyletylamin (DIEA) i metylen klorid, sp 6x1 min. med metylenklorid, og til slutt 2x1 min. med fortørket dimetylformamid. Ladingen av BOC-Arg (Tos) på harpikset ble utført to ganger med risteren ved å bruke 1-hydroksybenzotriazol (HBT, 6 mmol), og disykloheks-lykarbodiimid (DCC, 3 mmol). Et kvantitativt ninhydrin- forsøk og aminosyre analyse ble rutinemessig utført etter lading for å bestemme den prosentvise lading av harpikset. Ladingen i dette spesielle forsøk var 53 %, i.e., bare 0.709 mmol/g av harpikset var tilgjengelig.

De tilstrekkelig beskyttede aminosyrer ble koblet etter hverandre til Boe. Arg(Tos)-harpikset brukte Beckman peptid syntesizer 990-B. Programmet som ble brukt ved hver kobling, unntatt Boc-Asn og Pmp(4-MeBzl), var som følger:

1) Vasket med metylenklorid (3 ganger, 1 min.).

2) Forvasket med 50 % trifluoreddiksyre i metylenklorid (1 gang, 1 min.) . 3) Deblokkert med 50 % trifluoreddiksyre i metylen klorid (30 min.).

4) Vasket med metylen klorid (3 ganger, 1 time).

5) Forvasket med 7 % DIEA i metylen klorid (1 gang, 1 min.). 6) Nøytralisert med 7 % DIEA i metylenklorid (1 gang, 10 min.).

7) Vasket med metylenklorid (3 ganger, 1 min.).

8) Beskyttet aminosyre (3 mmol) i metylenklorid, etter-fulgt av tillegg av DCC, 3 mmol, 10 ml av 0.3M i metylenklorid, og kobling i 2 timer.

9) Vasking med metylenklorid (3 ganger, 1 min.)

10) Vasking med etanol/metylenklorid (1:) (3 ganger, 1 min.).

11) Vasket med metylenklorid (3 ganger, 1 min.)

I tilfelle med kobling av Asn halvdel, ble det brukt 1-hydroksybenzotriazol (HBT, 6 mmol) 10 ml av 0,6 M i dimetylformamid. Tørr dimetylformamid ble også brukt som oppløsningsmiddel da Pmp (4.MeBzl) ble koblet til peptidharpikset, ved å bruke 4-dimetylaminopyridin (DAP, 3 mmol). Fullførelse av hver koblingsreaksjon ble formanet ved nin-hydrinforsøket. P-metylbenzylgruppen ble brukt til å beskytte tiolgruppene av Cys og pentametylenmerkaptopropionsyre (Pmp) halvdel.

Etter kobling til Asn aminosyre, ble det harpiksstøttede peptid splittet i to halvdeler, 0.355 mmol hver, for å slå sammen separat Boc-Abu eller Boc-Val ved posisjon 4, og sekvensen forstatte til Pmp (4-MeBzl) som indikert. Det resulterende peptidharpiks intermediater, foreksempel (Pmp (4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Y-AsnCys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-BHA harpiks) ble vasket separat med metylenklorid og tørket i våkum over natt for å gi 0,87 g (Y=Abu), 0,67 g (Y=Val). Det sistnevnte harpikset ble brukt i eksempel 4.

Forberedelse av Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Abu-Asn-CYs-Arg(NH2) : Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr-(Et)-Phe-Abu-Asn-Cys(4-MeBzl)-Arg(TOs)-BHA-harpikset, 0.87 g i 2 ml av anisol, ble reagert med vannfritt hydrogenfluorid (20 ml) ved 0^ i 50 min. Etter fordamping i våkum til tørrhet, ble det resterende behandlet med vannfritt eter, og det rå- peptid ble ekstrahert med dimetylformamid (50 ml) og 33 % eddiksyre (60-70 ml) i to liter vann. Det vann-fortynnede dimerkapto heptapeptid ble syklisert ved å bruke 0.01 M potassium ferrycyanid oppløsning ved pH 7.2 inntil farven holdt fast i 30 min.

(30 ml).Etter fullførelsen av oksidasjonsreaksjonen, ble pH av oppløsningen tilpasset til pH 4,5 ved å tilsette is-eddiksyre. Denne oppløsningen passerte sakte gjennom et svakt syre akrylisk harpiks (Bio-Rex 70) kolonne (2.5 x 13 cm). Kolonnen ble eluert med pyridin-acetat buffer (pyridin/is-eddiksyre/vann, 30:4:66) .

Pyridin-acetatoppløsningen ble fjernet ved destillasjon i våkum og det resterende ble lyofilisert fra 10 % eddiksyre for å gi 115 mg (33 %) av rå-peptided fra tittel.

Rensing

1) Fordelingskolonne, Sephadex, G-25:

Prøve: 115 mg. n-butanol/eddiksyre/vann, (4:1:5), 72,6 mg 2) Gel filtrering, G-15, 0,2M eddiksyre: 60,5 mg

3) Preparat HPLC:

Prøve: 35,0 mg (fra 2), Altex ODS, 10 mm x 25 cm, 5, strømningshastighet 4 ml/min., vann/acetonitril/trifluoreddiksyre (60:40:0,25 %), isokratisk, 229 nm (2,0 AUFS), injeksjon 4,14 mg 500 1. 28 mg ren prøve fra produktet i tittel.

Fysiske data

Molekulær formel: C.rH,CN,,OnS~

45 65 11 9 2

Molekulær vekt: 967.48

Aminosyre analyse: Asp (1.00), Abu + Cys (1,35),

Tyr (0,47), Phe (0.93), Arg (0.82) Peptid innhold: 65,6 %

Kromatografiske data

Eksempel 4

Fremstilling av Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Arg(NH2)

Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)-Arg(Tos)-BHA-harpikset, 0,67 g fra eksempel 3 i 2 ml av anisol, ble reagert med vannfritt hydrogenfluorid (20 ml), ved 0*"* i 50 min. Det ble opparbeidet i det forrige eksempel for å gi 80 mg (23 %) av rå-peptid i tittelen.

Rensing

1) Fordelingskolonne, Sephadex, G-25:

Prøve: 80 mg, n-butanol/eddiksyre/vann

(4:1:5), 75,7 mg.

2) Preparat HPLC:

Prøve: 42,7 mg (fra 1), Altex ODS, 10 mm x

25 cm, 5, strømningshastighet 4 ml/min. vann/

acetonitril/trifluoroeddiksyre

(60:40:0,25 %), isokratisk, 229 nm (2,0 AUFS), injeksjon 2,7 mg/500 1, 36,8 mg rå tittel prøve.

Fysiske data:

Kromatografiske data:

Eksempel 5

Fremstilling av Pmp-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Arg-Gly(NH2)

Det beskyttede peptid-harpiks, Pmp-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Arg-Gly-BHA-harpiks, 2,54 g, oppnådd, som beskrevet ovenfor, fra 0,72 mmol/g, amin/harpiks (N^-analyse), 0,46 mmol/g sammenslutning av Boc-Gly (AAA), ved å bruke den automat-iske peptid syntesizer, Beckman 990 B, ble reagert med 20 ml av vandig hydrogenfluorid i nærvær av 2-3 ml av anisol ved 0^ i en time. Etter fordamping av hydrogenfluorided i våkum til tørrhet, ble det resterende behandlet med vannfritt dietyleter og rå-peptided ble ekstrahert med dimetylformamid (100 ml) og 40 % eddiksyre (100 ml) i 3,5 liter av deaerert vann som hadde tidligere tilpasset til pH 4,5. Vandig fortynnet disulfhydryl oktapeptid ble oksidat-ivt syklisert ved å bruke et eksempel av 0,01M potassium ferricyanid oppløsning ved pH 7,2 til farven fastholdt i 30 min. Etter fullførelsen av oksidasjonsreaksjonen, ble pH av oppløsningen tilpasset til 4,5 ved å bruke is-eddiksyre. Denne oppløsning passerte sakte gjennom en svak syre akrylisk harpiks (Bio-Rex-70) kolonne (2,5 x 10 cm). Kolonnen var eluert med pyridin-acetat buffer (30:4:66,Pyr:HOAC: Vann). Pyridin-acetat oppløsningen ble fjernet i våkum og det resterende ble lyofilisert fra 10 % eddiksyre for å gi 560 mg (83,73 %) av rå-peptid i tittelen.

Rensing

1) Motstrømsfordeling (CCD):

Prøve: 560 mg, n-butanol/eddiksyre/vann (4:1:5), 240 overføringer

a) Rør 136-150, 115,75 mg produkt

b) Rør 128-135+151-160, 124,87 mg c) Rør 121-127+161-200, 122,00 mg

Fysiske data:

Molekulær formel: C . ,H, rN. -.0, , S„

46 65 13 11 2

Molekulær vekt: 1039.437

Aminosyre analyse: Asp (1,00), Glu (1,00), Gly (1,00), Cys (0,38), Tyr (0,73),

Phe (0,99), Arg (1,02) Peptidinnhold 87,04 % (AAA), 85,23 % (N2-analy)

Kromatografiske data:

Eksempel 6

Fremstilling av Pmp-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Arg (NF^)

Det beskyttede peptid-harpiks, Pmp-Tyr-Phe-GLn-Asn-Cys-Arg-BHA-harpiks, 2,10 g, oppnådd som beskrevet ovenfor fra 1,0 mmol/g amin/harpiks (analyse), 0,732 mmol/g sammenslutning av BOC-Arg(Tos) (AAA), ved å bruke den manuelle rister, ble reagert med 30 ml av vannfri hydrogenfluorid i nærvær av 3,0 ml av anisol ved 0^ i 60 minutter, rå-utbytte av tittelprodukt; 350 mg (48,67%).

Rensing:

1) Motstrømsfordeling (CCD):

Prøve: 350 mg, n-butanol/eddiksyre/vann

(4:1:5), 240 overføringer

a) Fr. 132-154, 122,43 mg produkt

b) Fr. 126-131+155-170 75,43 mg

2) Gel filtrering 0,2M HOAC, 85 mg brukt fra la over

a) Fr. 2 7,73 mg ren

b) Fr. 51,55 mg

Fysiske data:

Molekylær formel: ^44H62N12°10^2

Molekylær vekt: 982,416

Aminosyre analyse: Asp (1,00), Glu (1,03), Cys

(0,46), Tyr) (0,77), Phe (0,99),

Arg (0,94)

Peptidinnhold: 72,8 % (AAA), 85,52 % (N2~analy.)

Kromatografiske data:

Eksempel 7

Fremstilling av Pmp-D-Tyr-Phe-Val-Asn-Cys-Arg( NU^)

Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr-(r-Z)-Phe-Val-Asn-Cys(4-MeBzl)- Arg(Tos)- . harpiks, 4,0 g, fremstilt ved metoden fra eksempel 1, i 4,5 ml destillert anisol, er behandlet med vannfritt hydrogenfluorid (40 ml) ved 0^ i en time. Etter fordamping i våkum til tørrhet, blir det resterende behandlet med vannfri eter og ekstrahert for å gi 1,30 g av rå-peptid. Det resulterende ubeskyttede heptapeptid blir krystallisert ved å bruke 0,01M potassium ferricyanid oppløsning ved pH 7-7,5 inntil farven fastholdes i 30 min., igjen som beskrevet ovenfor. Tittelforbindelsen blir isolert og renset som beskrevet ovenfor.

Eksempel 8

Fremstilling av Pmp-D-Tyr-(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Arg

(NCH3H?)

1 2 4

En blanding av 0,1 mmol av (Pmp -D-Tyr(Et) -Val - desPro 7 desGly 9)AVP, fremstilt som beskrevet ovenfor, og 0,1 mmol av n-propylamin i 20 ml av dimetylformamid reageres med 23 mg (0,11 mmol) av DCC og 14 mg (0,11 mmol) av HBT ved romtemperatur i 2 timer. Det flyktige fordamper for å gi et produkt harpiks. Produktet renses ved å bruke (1) gel filtrering over G-10-Sephadex eluert med 0,2 N eddiksyre, (2) høytrykks væske kromatografi ved å bruke 0,05 % trifluoroeddiksyre i 39 % acetonitril i vann og , igjen (3) gel filtrering for å gi rå-produktet av tittelen.

Eksempel 9

Fremstilling av Pmp-D-Tyr-Phe-Val-Asn-Cys-Arg-Gly(NH2)

1-Pmp(4-MeBzl)-D-Tyr(Br-Z)-Phe-Val-Asn-Cys-(4-MeBzl)-Arg (Tos)-Gly-harpiks, 4,2 g, l,5mM, fremstilt ved metoden fra eksempel 1, i 4,5 ml destillert anisol, behandles med vannfritt hydrogenfluorid (40 ml) ved 0^ i en time.

Etter fordamping i våkum til tørrhet, blir det resterende behandlet med vannfri eter og ekstrahert for å gi 1,33 g av rå-peptid. Det resulterende ubeskyttede oktapeptid blir syklisert ved å bruke 0,01M potassium ferricyanid oppløsn-ing ved pH 7-7,5 inntil farven fastholdes i 30 minutter, igjen som beskrevet ovenfor i eksempel 2. Tittelforbindelsen blir isolert og renset som beskrevet ovenfor.

Eksempel 10

Fremstilling av Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Arg-Gly(NCH3H?)

1 2 4

En blanding av 0,1 mmol av (Pmp -D-Tyr(Et) -Val - desPro 7Gly)AVP, fremstilt som beskrevet ovenfor, og 0,1 mmol av n-propylamin i 20 ml av dimetylformamid reageres med 23 mg (0,11 mmol) av DCC og 14 mg (0,11 mmol) av HBT ved romtemperatur i 2 timer. Det flyktige fordampes for å gi et oljerest produkt. Produktet renses ved å bruke (1) gel filtrering over G-10-Sephadex eluert med 0,2 N eddiksyre, (2) høytrykks væske kromatografi ved å bruke 0,05 % TFA i 39 % acetonitril i vann og, igjen, (3) gel filtrering for å gi rå-peptid av tittelen.

Eksempel 11

Fremstilling av Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(OH) og dets bruk ved fremstilling av forbindelsen i eksempel 2

4,87 G (15 mmol) av BocCys (4MeBzl) ble oppløst i 30 ml av etanol og 10 ml av tilsatt vann. pH ble så tilpasset til 7,1 med en vandig oppløsning av cesium bikarbonat.

Blandingen ble konsentrert og det resterende fordampet tre ganger fra 50 ml av toluen. Dette resterende ble så plassert under høyt våkum ved passende temperatur over natt.

Saltet ble oppløst i 35 ml av dimetylformamid og 5 g av kommersiell klorometylfenyl harpiks ble tilsatt.

Blandingen ble filtrert og harpikset vasket med dimetylformamid (5 x 60 ml), DMF/Vann, 9:1, (5 x 60 ml), DMF (5 x 60 ml) og etanol (6 x 60 ml). Det ble så tørket under høyt våkum ved passende temperatur over helgen.

Peptidkjeden ble bygget opp i en Beckman syntesizer som beskrevet ovenfor ved å bruke Boe derivater av Asn, Val, Phe, D-Tyr(Et) og S-(4-MeBzl) Pmp derivatet. Harpikset ble fjernet og ristet i en manuell rister.

0,86 g av peptidharpikset ble behandlet med 1,5 ml av anisol og rørt i 60 minutter ved 0^ i 15 ml av hydrogenfluorid. Hydrogenfluorided ble så fjernet under aspirator trykk ved 0^.

Det resterende ble så vasket med 3 x 25 ml av eter (fra-skilt) og peptided eluert med dimetylformamid og 30 % eddiksyre (4 x 10 ml). Denne oppløsning ble tilsatt til 21 av gassholdig vann og pH tilpasset til 7,0 med ammonium hydroksyd.

pH ble så tilpasset til 4,5 med eddiksyre og blandingen ble rørt i 30 min. med 25 g (våt) av et svakt basisk ionebytte harpiks (Ag-3x4 IR-4S). Suspensjonen ble filtrert og harpikset ble vasket med 2 x 400 ml av eddiksyre.

Filtratet ble så passert gjennom en C^g lys-kolonne (7 x

16 mm). Kolonnen ble så vasket med vann (3 x 400mm) og peptided eluerte med acetonitril/vann/TFA, 50:50:0:25. Fraksjonene 30 36 ble kombinert, konsentrert og lyofilisert til utbytte 25 mg av fri Cys(OH) syklointermediat av ti ttelen.

FAB masse spektrum i glycerol: 827 (M+H)+, 825 (M-H)~.

Cys-syren reageres med en ekvivalent av Arg-Gly(NH2).

HC1 i nærvær av DCC og HBT i dimetylformamid for å produs-ere forbindelsen av eksempel 2. På lignende måte blir Cyssyre reagert med Arg(HCl) (OMe) for å gi syre vist i forbindelsen i eksempel 4 etter en mild hydrolyse av eter-en. Denne forbindelse blir isolert hvis ønsket slik som potassiumsal tet.

Eksempel 12

Substitusjon av en stokiometrisk kvantitet av Boc-L-Tyr(Et) for Boc-D-Tyr(t) ved 2 enheten av peptidsyntesen i eksempel 1 og 2, gir Pmp-L-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Arg-Bly(NH2).

Substitusjon i eksempel 1 og 2, G-Arg(Tos) for L-Arg(Tos ved 8 enheten, gir Pmp-D-Tyr-(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-D-Arg-Gly- (NH2 ) .

Å substituere Boc-D-Pba ved 2 enheten og Boc-Chg ved 4 enheten av den detaljerte reaksjonssekvens av eksempel 1 og 2 gir Pmp-D-Phe-Chg-Asn-Cys-Arg-Gly(NH2) .

Substitusjon, i eksempel 1 og 2, (Boc)-Lys ved 8 enheten, gir Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Lys-Gly-(NH2).

Å substituere A-(S-benzylmerkapto- -syklotetrametylen) Propionsyre for Pmp i eksempel 1 og 2, gir Tmp^-D-Tyr

2

(Et) derivatet.

Eksempel 13

Substitusjon av stokiometrisk kvantitet av Boc-L-Tyr-(Et) ved 2 enheten av peptidsyntesen av eksempel 3 og 4, gir Pmp

-L-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-D-Arg(OH).

Substitusjon av Boc-L-Phe(4-Me) for aminosyren ved 3 enheten og Boc-Nle ved 4 enheten i syntesizersekvensen, reaksjonen av eksempel 3 gir Pmp-D-Tyr(Et)-Phe(4-Me)-Nie-Asn-Cys-Arg(NH2).

Å substituere Boc-Nvl for aminosyren ved 4 enheten av eksempel 3, gir Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Nvl-Asn-Cys-Arg(NH2).

Å substituere Boc-Cha ved 4 enheten gir Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Cha-Asn-Cys-Arg(NH2).

Substitusjon av Boc-D-Pba ved 2 enheten og Boc-Chg ved 4 enheten av den detaljerte reaksjonssekvens i eksempel 3 gir Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-L-Lys(OH).

Å substitiere som ovenfor Gin ved posisjon 4 ved å bruke HBT, gir Pmp-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Arg(NH2).

Substitusjon av Jb - ( S-benzylmerkapto-J3-^S-syklotetr ame tyl en ) propionsyre (Tmp) for Pmp i eksempel 3, gir Tmp^-D-Tyr (Et)<2>derivatet.

På lignende måte ble Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-D-Arg-(NH2) fremstillet:

Fysiske data Kromatografiske data

På lignende måte ble Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Lys-(NH2) framstilt:

Fysiske data

På lignende måte ble Pmp-D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys-Arg (OH) fremstilt:

Eksempel 14

Parenteral dose enhets sammensetning

En fremstilling som inneholder 10 meg av syklopeptided i eksempel 2 som et sterilt hvitt pulver for parenteral injeksjon blir fremstilt fom følger: 10 meg av peptidamid blir oppløst i 1 ml av en vandig oppløsning av 20 mg mannitol. Oppløsningen blir filtert under sterile forhold til et 2 ml ampul og lyofilisert. Pulveret blir rekonstituert før enten intramuskulær eller intravinøs injeksjon på et objekt lidende av væskeansamling mottaglig for virkningen av anti-ADH mekanismen. Injeksjonen repeteres som nødvendig, fra 1-5 ganger daglig eller uavbrutt intravenøs medikament injeksjon. Andre peptider av denne oppfinnelsen blir framstilt og brukt på lik måte.

Nasal dose enhet sammensetning:

30 g av endelig funnet syklopeptid av denne oppfinnelse slik som produktet i eksempel 5 blir suspendert i en blanding av 75 mg av benzylalkohol og 1,395 g av et suspendert middel slik som en kommersiell blanding av semi-syntetisk glycerid av høyere fettsyrer. Suspensjonen blir plassert i en aerosol 10 ml beholder som er lukket med en måleventil og tilført aerosol drivmiddel. Innholdet innebefatter 100 enhetsdoser som er administrert intranasalt til et ødematøs objekt fra 1-6 ganger pr. dag.

Claims (12)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en forbindelse med formel (I):

hvori : P er Phe eller Phe(4'-Alk); X er D-Phe, D-Val, D-Nva, D-Leu, D-Ile, D-Pva D-Nle, D-Cha, D-Abu, D-Met, D-Chg, D-Tyr, L-Tyr, D-Tyr(Alk) eller L-Tyr(Alk); Y er Val, Ile, Abu, Ala, Chg, Lys, Cha, Nie, Phe, Gin, Leu eller Gly; Z er D-Arg, L-Arg, D-Lys eller L-Lys; A er Gly(NH2 ), Gly, Gly(NH-Alk), OH, NH2 eller NH(Alk); n er 0-2 eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller en for-forbindelse derav, karakterisert ved å syklisere en eventuelt beskyttet forbindelse med formel(II) ;

hvori: X, P, Y, Z er definert som ovenfor for I men Z videre er enten en enkeltbinding eller en terminal OH; Q 1 og Q 2 er hver hydrogen eller en utskiftbar gruppe og Pap er J3 ,J3-sykloalkylenpropionsyre med S-Q" <*> " festet i stilling og som har 5-7 metylenenheter i alkylenkjeden og hvis nødvendig deretter i enhver rekkefølge, (a) fjerner foreliggende beskyttelsesgruppe, 6 7 (b) omsetter nevnte Cys(OH) eller Z(OH) forbindelser, hvis disse foreligger med et dipeptid, Z-A eller aminosyre-ne A eller Z enten som beskyttet syre eller i amid form eller (c) danner et farmasøytisk akseptabelt salt eller en for-forbindelse derav.

2. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakter- 1 2 isert ved at Q og Q begge er hydrogen.

3. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakter- 1 2 isert ved at Q og Q begge er acetamidometyl

4. Fremgangsmåte i henhold til kravene 1 til 3, karakterisert ved en oksydativ syklisering.

5. Fremgangsmåte i henhold til krav 4, karakterisert ved at sykliseringen utføres i nærvær av i od.

6. Fremgangsmåte i henhold til krav 4, karakterisert ved at sykliseringen utføres i nærvær av ferricyanid.

7. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at en Cys(OH) forbindelse av formel I reageres med (NH^J -Z-A i nærvær av karbodiimid, eventuelt fulgt av deblokkering av beskyttelsesgruppene.

8. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at Z(OH) <7> forbindelsen av formel I reageres med Gly( NH2 ), Gly eller Gly(NH-Alk) i nærvær av karbodiimid, eventuelt fulgt av deblokkering av beskyttels esgruppene.

9. Fremgangsmåte i henhold til krav 7, karakterisert ved at Cys(OH)^ omsettes med Arg(NH2 ) eller et salt derav.

10. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at n er 1, X er D-Tyr(Et), P er Phe, Y er Val, Z er Arg og A er Nti^.

11. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at n er 1, X er D-Tyr(Et), P er Phe, Y er Val, Z er Arg og A er Gly(NH2 ).

12. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at n er 1, X er Tyr, P er Phe, Y er Gin, Z er Arg og A er NH2 .