NO851172L - Fremgangsmaate og innretning for fremstilling av varierende konsentrasjonsmoenstre av kjemisk eller biologisk aktive stoff - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte og en innretning for fremstilling av varierende konsentrasjons-mønstre av kjemisk eller biologisk aktive stoff.

Analyse av kjemisk eller biologisk aktive stoff i kroppsvæsker, f.eks. blod, væske, puss, spytt, sekresjon, blære-innhold eller urin, er meget viktig ved kontroll av terapeutisk behandling med slike stoff. Ved en slik behandling er det av kritisk betydning å oppnå terapeutiske konsentrasjoner av det angjeldende stoff og å forhindre at toksiske konsentrasjoner overskrides. Videre er det et stort behov for kvantifisering av innholdet av kjemisk eller biologisk aktive stoff i forskjellige biologiske materialer, f.eks. ekskrementer, cellekulturer, allergenekstrakter eller andre celle-ekstrakter.

En av fremgangsmåtene til kvantitativ bestemmelse av kjemisk eller biologisk aktive stoff i kroppsvæsker er den mikrobiologiske fremgangsmåten, dvs. den er basert på et aktivt stoffsevne til å fremme eller å inhibere veksten av en egnet indikatormikro-organisme. En velkjent fremgangsmåte i dette henseende er den såkalte papirskivefremgangsmåten som er beskrevet bl.a. av Jalling et al., europ. J. Clin. Pharmacol.

4, 150-157 (1972). Denne fremgangsmåten er basert på et antall papirskiver som impregneres med forskjellige mengder, som representerer forskjellige konsentrasjoner av et referansestoff, f.eks. et antibiotikum. Prøven som inneholder det samme aktive stoffet som skal analyseres

impregneres også på en papirskive av samme typen. Alle disse papirskivene som har definerte, varierende konsentrasjoner, og prøver med ukjente konsentrasjoner påføres overflaten av et kulturmedium som er inokkulert med en valgt mikro-organisme. Klare inhiberingssoner dannes rundt referanseskivene samt skivene som er impregnert med prøven. Diametrene av inhiberingssonene rundt referanseskivene av-settes som funksjon av konsentrasjonen, slik at det dannes en standardkurve. Konsentrasjonen som svarer til sone-diameteren for prøver interpoleres så fra den grafisk frem-

stilte standardkurven. Denne fremgangsmåten innbefatter visse ulemper som f.eks. et stort antall skiver som skal undersøkes på den samme forsøksplaten og at en ny standardkurve må opprettes for hver ny analyse.

Konsentrasjoner av enzymer og antigener bestemmes på en analog måte ved å benytte immodiffusjonsfremgangsmåter, disse er beskrevet bl.a. av Ouchterlony, 0. & Nilsson, L.-Å.: "Immunodiffusion and immunoelectrophoresis", I: Handbook of Experimental Immunology. Red. D.M- Weir, Blackwell, Oxford, 2. utgave (1973) og Mancini, G., Carbonara, A.O. og Heremans, J.F.: "Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion", Immunochemistry 2 (1965) side 235. Ved disse teknikkene kan diffusjonslaget f.eks. bestå av et tynt lag av agargel som inneholder et substrat som er spesifikt for enzymet som skal bestemmes, eller et antiserum eller antisoffer som er spesifikke for antigenet som skal bestemmes. Enzymet eller antigenet påføres substratet i runde hull, dvs. oppløsningene fylles i brønner som er laget i agarlaget. Enzymet eller antigenet diffunderer radielt utover fra diffusjonssenteret, dvs. brønnen som inneholder oppløsningen. Referansebrønnene inneholder definerte varierende konsentrasjoner av enzymet eller antigenet, og brønnen som inneholder prøven med en ukjent konsentrasjon undersøkes på den samme agargelplaten.

Den sirkulære sonen rundt en enzymbrønn kan bestå av en transparens i et ellers uklart gellag, f.eks. ved analyse av proteasekonsentrasjonen i en agargel som inneholder kasein. Den sirkulære sonen rundt en antigenbrønn kan bestå av en utfelling i et forøvrig klart gellag. Avlesning og tolkning av resultatene tilsvarer det som er beskrevet for det mikrobiologiske forsøksoppsettet. Diameteren (eller arealet) av sonen rundt den ukjente prøven avleses mot en standardkurve som er basert på diametrene (eller arealene) rundt referansebrønnene.

En annen immunodiffusjonsteknikk som benyttes for bestemmelse av antigener eller antistoffer er "dobbel diffusjon (Ouchterlony) utfelling". Antigener og antistoffer fylles i brønner og får diffundere mot hverandre. Der hvor disse stoffene møtes i optimale andeler i gelen vil det komme til syne en utfellingslinje. Den relative plasseringen av linjen er forbundet med den absolutte konsentrasjonen av antigenet eller antistoffet i de respektive brønnene, og dets molekyl-størrelse og diffusjonshastighet gjennom gelen.

Disse fremgangsmåtene har tilsvarende ulemper som beskrevet for den mikrobiologiske fremgangsmåten. Videre er disse forsøkene ofte tidkrevende siden de store molekylene som innbefattes diffunderer langsomt. Punktet for stasjonær ekvivalens etableres etter en lang diffusjonstid. Nøyaktig-heten av resultatene vil påvirkes av instabiliteten i konsentrasjonsgradientene med mindre avlesningene gjøres ved egnede tidspunkt.

Følsomheten av mikro-organismer, f.eks. bakterier, overfor et biologisk eller kjemisk aktivt stoff bestemmes på det nåværende tidspunkt ved å måle den minimale inhibitor-konsentrasjonen (MIC). MIC-bestemmelser ved tilgjengelige fremgangsmåter er kompliserte, tidkrevende og dyre. To forskjellige fremgangsmåter benyttes hovedsakelig i dag til bestemmelse av MIC-verdier. En av fremgangsmåtene innbefatter en serie fortynninger til det dobbelte volum av det aktive stoffet i et flytende eller fast medium. Denne fremgangsmåten har den ulempen at den gir mindre presise og nøyaktige informasjoner om følsomheten av mikro-organismen fordi den er basert på en diskontinuerlig serie fortynninger. Den andre fremgangsmåten er basert på diffusjonen av det aktive stoffet fra et definert diffusjonssentrum i et agar-lag. Konsentrasjonsgradientene for forskjellige stoff av-henger av de spesielle diffusjonsegenskapene for de enkelte-stoffene. Derfor må det for hvert stoff etableres en regeresjonslinje som korrelerer logaritmen av MIC-verdiene (bestemt ved fortynningsfremgangsmåten) til inhiberingssone- diametrene rundt en skive som inneholder en definert mengde av stoffet for forskjellige grupper bakterier (Ericsson,

H.M. & Sherris, J.C., Antibiotic Sensitivity Testing, Acta Path. & Microbiol. Scand., Section B 1971, Supplement No. 217).

Ulempene ved de ovenfor nevnte fremgangsmåtene kan elimineres ved foreliggende oppfinnelse hvorved stoffet eller stoffene hvorav aktiviteten mot mikro-organismer eller biologiske celler, eller konsentrasjonen, skal måles, påføres i definerte mengder på et rektangulært område av overflaten av et medium som inneholder kjemisk eller biologisk materiale som reagerer med stoffet eller stoffene, på en slik måte at stoffet eller stoffene i hele området eller i deler av området er tilstede i et forhåndsbestemt konsentrasjonsmønster, som har minst ett konsentrasjonsmaksimum og ett konsentrasjonsminimum, og at minst ett av disse minima/maksima fortrinnsvis er plassert ved utkanten av det nevnte rektangulære området.

Ifølge foreligggende oppfinnelse kan mediet være et kulturmedium, f.eks. et lag av agar eller en annen polymer som inneholder egnede vekstfaktorer når dette kreves, eller mediet kan være et diffusjonslag og/eller et reaksjonslag.

Det kjemiske eller biologiske materialet i mediet kan f.eks. være mikro-organismer, andre biologiske celler, antiserum, antistoffer eller enzymsubstrater.

De biologisk eller kjemisk aktive stoffene er f.eks. antimikrobielle stoff, mikrobiologisk aktive stoff, stoff som har en inhibitor-, letal-, toksisk- eller mutagen effekt på cellene.

Stoffet eller stoffene kan påføres slik at konsentrasjonene derav i det rektangulære området og respektivt på bæreren

er høyest i sentrum og avtar mot de to endene, eller slik

at konsentrasjonen er høyest i den ene enden av det rektangulære området og avtar mot den andre enden. Videre kan konsentrasjonen av et første stoff være uniformt fordelt

over det rektangulære området, og respektivt bæreren, mens et andre stoff er tilstede med en konsentrajsonsgradient som avtar fra én ende til den andre. Et første stoff kan også ha en konsentrasjonsgradient i det rektangulære området, og respektivt på bæreren, som avtar fra én ende til den andre, mens et andre stoff påføres med en konsentrasjonsgradient som avtar i en retning motsatt gradienten av det første stoffet. Stoffet eller stoffene kan også påføres i det rektangulære området, og respektivt på bæreren, på en slik måte at det finnes flere konsentrasjonsmaksima og minima i det nevnte området og respektivt på bæreren.

Et stoff kan også påføres på en del av det rektangulære området, og respektivt bæreren, med en konsentrasjon som avtar fra den ene enden av rektangelet til den andre, og i den delen av arealet og respektivt bæreren, som er fritt for stoff kan en prøve, hvorav konsentrasjonen skal bestemmes, påføres.

Et spesifikt konsentrasjonsmønster i et medium kan oppnås f.eks. ved å påføre en rekatangulær bærer, hvor stoffet eller stoffene finnes i det ønskede konsentrasjonsmønsteret, på overflaten av mediet eller vise-versa. Et spesifikt konsentrasjonsmønster kan også oppnås ved å påføre et antall enheter, som inneholder stoffet eller stoffene i kjente konsentrasjoner, på overflaten av et medium på en slik måte at det spesifikke konsentrasjonsmønsteret oppnås i det rektangulære området. Eksempler på bærere som er egnet for bruk ved foreliggende oppfinnelse |er tynne lag av nøytralt, porøst eller ikke-porøst materiale, f.eks. cellulose, polyakrylamid, polyester, polyamid e.l. materialer. Disse materialene kan være opake eller transparente.

Kulturmediet kan også påføres i form av et tynt lag av et dehydrert medium på bæreren, f.eks. av den typen som beskrives i den internasjonale patentsøknad PCT/US 82/00085 (publikasjon nr. WO 82/02563) .

I en utførelse av en innretning ifølge foreliggende oppfinnelse påføres stoffet over hele overflaten av bæreren,

med en konsentrasjonsgradient som avtar fra et maksimum ved den ene enden av bæreren til et minimum ved den andre enden, Stoffet kan påføres ved hjelp av en kjent fremgangsmåte,

f.eks. ved å mikropipetteres spesifikke volumer av referanse-opplysninger som har definerte avtagende konsentrasjoner på overflaten av bæreren med visse mellomrom, dette resulterer i en kontinuerlig konsentrasjonsgradient langs bæreren.

Når f.eks. konsentrasjonen av et soff i en kroppsvæske skal bestemmes pipetteres en prøve derav på en enhet som så på-føres overflaten av et kulturmedium som er inokkulert med en valgt mikro-organisme. Den rektangulære bæreren med en konsentrasjonsgradient av referansestoffet påføres samtidig den samme forsøksplaten som så inkuberes på vanlig måte.

Langs den rektangulære bæreren dannes en dråpeformet inhiberingssone hvor veksten av mikro-organismen forhindres. Bredden av sonen er størst ved den enden av bæreren hvor

den høyeste konsentrasjonen av referansestoffet finnes og skråner følgelig innover langs den avtagende konsentrasjonsgradienten mot den enden av bæreren hvor den laveste konsentrasjonen av referansestoffet finnes. En inhiberingssone \ dannes også rundt enheten som inneholder prøven. Dette er vist i figur 1.

Bredden av sonen rundt prøveenheten måles og sammenlignes

med bredden av den dråpeformede sonen langs konsentrasjonsgradienten av referansen, derved kan den ukjente konsentrasjonen interpoleres som antydet ved piler i figur 1. For å muliggjøre en direkte avlesning av konsentrasjonen er den rektangulære bæreren fortrinnsvis inndelt med en konsentra-sjonsskala.

I en annen utførelse av en innretning ifølge foreliggende oppfinnelse påføres referansestoffet på en del av bæreren med en konsentrasjonsgradient som avtar fra et maksimum ved den ene enden av bæreren. En prøve av kroppsvæsken som inneholder det stoffet som man ønsker å bestemme konsentra sjonen av påføres ved hjelp av en mikropipette på en del av den rektangulære bæreren som ikke inneholder referansestoff. Bæreren er fortrinnsvis inndelt med en skala for direkte avlesning av konsentrasjonen. Bæreren påføres, etter på-føring av den ukjente prøven, på overflaten av et kulturmedium som på forhånd er inokkulert med en valgt mikro-organisme. Forsøket utføres så på vanlig måte. En dråpeformet inhiberingssone dannes der hvor ingen vekst av mikro-organismen finner sted rundt den rektangulære bæreren, og inhiberingssonen dannes rundt bæreren der hvor prøven er påført (se figur 2). Denne formen for innretning tillater en direkte avlesning av konsentrasjonen i prøven ved en sammenligning av bredden på sonen rundt prøven med bredden av den dråpeformede sonen langs konsentrasjonsgradienten for referansen.

Disse to utførelsene kan benyttes på en analog måte for analyse av enzymer, antigener og vekst-fremmende stoff,

som f.eks. vitaminer, der hvor den dråpeformede sonen langs konsentrasjonsgradienten av referansen og sonen rundt prøven kan bestå av en transparens eller en utfelling eller vekst av mikro-organismer i motsetning til inhibering av vekst.

I en biokjemisk analyse, f.eks. av nitratinnholdet i jord-bunnen ved hjelp av enzymet nitratreduktase påføres referansestoffet på en del av bæreroverflaten med en konsentrasjonsgradient som avtar fra et maksimum ved den ene enden av bæreren. En jordprøve som inneholder nitrat, hvorav konsentrasjonen skal bestemmes, påføres ved hjelp av en mikropipette på en del av den rektangulære bæreren som ikke inneholder referansestoff. Bæreren er fortrinnsvis gradert med en skala for direkte avlesning av konsentrasjonen.

En definert mengde av det spesifikke enzymet som reagerer

med nitratet påføres uniformt over hele overflaten av bæreren. Egnede reagenser, f.eks. sulfanilsyre og N,N-dimetyl-1-naftylamin, som viser denne enzym-substratreaksjonen i form av en fargeforandring påføres over hele bæreroverflaten

eller er tilstede som en integrert del av bæreren. Intensiteten av prøvens farge sammenlignes med området av varierende fargeintensiteter langs den kalibrerte delen av bæreren som består av en konsentrasjonsgradient av referanse-substratet.

De to utførelsene beskrevet ovenfor kan fortrinnsvis benyttes bl.a. til bestemmelse av ukjente konsentrasjoner av kative stoff i forskjellige prøver.

I nok en utførelse av innretningen ifølge foreliggende oppfinnelse påføres et første stoff i en konsentrasjon som er uniformt fordelt over den rektangulære bæreren, mens et andre stoff påføres i en konsentrasjonsgradient som avtar fra den ene enden til den andre enden av bæreren.

I en ytterligere utførelse av innretningen ifølge oppfinnelsen påføres et første stoff i en konsentrasjonsgradient som varierer fra den ene enden av bæreren til den andre, mens et andre stoff påføres i en konsentrasjonsgradient som avtar i motsatt retning av gradienten av det første stoffet. Konsentrasjonen av det første stoffet er følgelig høyest der hvor konsentrasjonen av det andre stoffet er lavest og vise-versa. Denne utføreslen av innretningen kan benyttes til å studere vekselvirkningen mellom forskjellige stoff, f.eks. bindingen av antimikrobielle stoff til proteiner, den kombi-nerte virkningen av antibiotika som resulterer i additive effekter, synergisme eller antagonisme. Figurene 3-6 viser vekselvirkningen mellom to antobiotika A og B, som påføres på den samme bæreren med konsentrasjonsgradienter som avtar i motsatt renting som beskrevet ovenfor. Etter påføring av innretningen på et inokkulert medium, og etter inkuberingen, vil inhiberingssoner av forskjellige former oppnås. I figur 3 viser to dråpeformede soner på motsatte ender at stoffene A og B virker uavhengig av hverandre. I figur 4 går endene av de ellers dråpeformede sonene inn i hverandre i en felles inhiberingssone isteden for å skråne mot enden av bæreren, dette tyder på en additiv effekt. I figur 5 går endene av de ellers dråpeformede sonene inn i hverandre inn i en felles inhiberingssone som er større enn sonene på endene av bæreren, dette tyder på en synergistisk effekt. I figur 6 går kantene av den ellers dråpeformede sonen brått inn mot bærerkanten isteden for gradvis å skråne mot denne, dette tyder på en antagonistisk effekt.

De nevnte utførelsene er egnet for bruk f.eks. ved bestemmelse av konsentrasjonsområder og mengdeforhold mellom to eller flere stoff som vekselvirker på en additiv, synergistisk eller antagonistisk måte. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en enkel innretning for bestemmelse av de optimale forhold mellom to eller flere stoff som skal inntas sammen ved terapi med en kombinasjon av legemidler, f.eks. antibiotika, anti-mykose- eller cytostatiske legemidler.

Figur 7 viser en skisse av en utførelse av en innretning ifølge oppfinnelsen som innbefatter en transparent eller opak bærer 1, med en trykket skala 3, som angir konsentrasjonen av aktive stoff, eller en parameter som er forbundet med denne. På bæreren er det påført et forhåndsbestemt konsentrasjonsmønster av et aktivt stoff. 2 er et vekst-medium og/eller diffusjonslag og/eller andre reaksjonslag som er inokkulert med en mikro-organisme eller andre biologiske- eller biokjemiske indikatorer som vekselvirker med det aktive stoffet på bæreren. 4 er vekstsonen for mikro-organismen eller en annen synlig biologisk eller biokjemisk reaksjon. 5 er sonen, for inhibering eller vekst av en mikro-organisme eller sonen for reaksjons/ingen reaksjon for andre indikatorsystemer. 6 er grensen mellom sonene for vekst/inhibering for en mikro-organisme eller for synlig reaksjon/ingen reaksjon eller for to andre adskillings-reaksjoner for andre idikatorsystemer. Konsentrasjonen av det aktive stoffet eller andre parameter som er forbundet med denne som kan assosieres med vekstinhibering, f.eks.

MIC ("minimum inhibitory concentration") eller en annen karakteristisk reaksjon kan lett avleses direkte på innretningen.

For bestemmelsen av den minste inhiberende konsentrasjonen (MIC) og den minste baktericidkonsentrasjonen (MBC), hvorav sistnevnte er den laveste konsentrasjonen av et antimikrobielt stoff som hindrer synlig vekst av mikro-organismer på en irreversibel måte, dvs. dreper podestoffet under et sett definerte forsøksbetingelser, kan en rektangulær bærer av typene beskrevet ovenfor benyttes, hvorved MIC-verdien eller parametere som er forbundet med denne kan avleses direkte som vekst/inhiberings-grensen (6 i figur 7) på bæreren eller som det punktet hvor den skrånende grensen av den dråpeformede sonen langs bæreren skjærer inn mot kanten av bæreren. MBC-verdien kan deretter bestemmes ved å erstatte bæreren

som inneholder det antimikrobielle stoffet, rundt hvilket det er dannet en dråpeformet sone, med en ny bærer som inneholder et egnet inaktiverende stoff, f.eks. enzymer eller andre kjemikalier som effektivt kan inaktivere det resterende antimikrobielle stoffet i kulturmediet. Etter inkubering i et medium som er fritt for antimikrobielle stoff vil størrelsen og formen av den dråpeformede sonen, eller posisjonen av vekst/inhiberings-grensen på bæreren som i figur 7, forandres avhengig av MBC-verdien.

Fremgangsmåten og innretningen ifølge foreliggende oppfinnelse kan følgelig benyttes f.eks. til å karakterisere følsomheten eller en annen egenskap for mikro-organismer eller andre biologiske celler overfor antimikrobielle stoff, og overfor stoff som kan ha en inhiberende-, letal-, toksisk-, mutagen-eller vekstfremmende effekt på cellene. Fremgangsmåten og innretningen kan også benyttes for å kvantifisere biologisk eller biokjemisk aktive stoff og substrat-spesifikke enzymer eller enzym-spesifikke substrater, til å vurdere cancerogenet-, mutagenet- eller toksiske effekter av forskjellige stoff og til å velge mutanter av mikro-organismer eller andre biologiske celler som er resistente overfor antimikrobielle midler eller andre legemidler, eller avhengig av forskjellige vekstfaktorer.

Betegnelsen "mikro-organisme" refererer til bakterier, som f.eks. entero-bakteriene, stafylokokker, streptokokker, influensabakterier, gonokokker, bakteroider, og klostridia, mykobakterier, aktinomyses, mykoplasma, nokardia, virus og sopp, som f.eks. mugg, gjær og sopp.

Betegnelsen "biologiske celler" innbefatter kreftceller, normale menneskeceller, dyreceller og planteceller, av typen "stammeceller".

Antimikrobielle stoff er antibiotika, f. eks. aminoglykosider,' beta-laktamantibiotika, makrolide antibiotika, polymyksiner, polypeptider eller andre kjemoterapeutika som f.eks. sulfon-amider, antimyotika, f.eks. 5-fluorocytosin, amfoterisin, antivirale midler som f.eks. adeninarabinosid (Ara-A), trifluorotymidin, antituberkolosemidler, som f.eks. iso-niasid og cykloserin, og desinfiseringsmidler, antiseptiske midler og konserveringsmidler som f.eks. kloroheksidin, etanol og benzalkoniumklorid.

Stoff som har en ihiberende-, letal-, toksisk- eller mutagen effekt på celler er antikreftmidler, f.eks. antracykliner, mitomysiner, cancerogene/mutagene stoff som f.eks. dimetyl-nitrosamin; herbisider som f.eks. paraquat og pestisider og insektisider som f.eks. dikopan (DDT).

Mikrobiologisk "aktive stoff er, i tillegg til de tidligere nevnte antimikrobielle stoffene, bakteriosiner, f.eks. kolisiner, forskjellige vekstfaktorer, som f.eks. aminosyrer, vitaminer og andre næringsstoffer, forskjellige kroppsvæsker eller komponenter derav som f.eks. serum, blod og spesifikke komponenter i serum, f.eks. beta-lysin. Biologisk aktive stoff er interferoner, som f.eks. humant interferon HuIFN-beta, IF4N-beta, enzymer som f.eks. beta-laktamaser, proteaser og ureaser, enzymspesifikke substrater som f.eks. nitrater, beta-laktamantibiotika, aminoglykosider og klor-amfenikol, antigener som f.eks. immunoglobuliner, poly-sakkarider og toksiner fra mikro-organismer.

Claims (14)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av definerte varierende konsentrasjonsmønstre av kjemisk eller biologisk aktive stoff i kjemiske eller biologiske, kvalitative eller kvantitative bestemmelsesmetoder, karakterisert ved at dettinnenfor et rektangulært areal på, under eller integrert i overflaten av et medium som inneholder kjemisk eller biologisk materiale som reagerer med nevnte stoff(er), på-føres ett eller flere slike stoff på en slik måte at de er tilstede i hele det rektangulære området eller i en del av dette, i et konsentrasjonsmønster som har minst ett konsen-tras jonsmaksimum og ett konsentrasjonsminimum, og at minst ett av disse fortrinnsvis er plassert nær den ene enden av det rektangulære området.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at me/diet er et kulturmedium og/eller diffusjonslag og/eller annet reaksjonslag, og at det kjemiske eller biologiske materialet er en mikro-organisme eller en annen biologisk celle, et enzymsubstrat, et enzym, en kjemisk indikator, et antiserum, et antistoff eller et antigen.

3. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-2, karakterisert ved at minst ett stoff på-føres slik at dets konsentrasjon er størst i sentrum av det rektangulære arealet og avtar mot begge endene av mønsteret.

4 . Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-2, karakterisert ved at minst ett stoff på-føres slik at dets konsentrasjon avtar fra den ene enden av det' rektangulære området til den andre.

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-2, karakterisert ved at et første stoff på-føres i en konsentrasjon som er uniformt fordelt over hele det rektangulære arealet, og et andre stoff påfø res i en konsentrasjonsgradient som avtar fra den ene enden av det rektangulære arealet til den andre.

6 . Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-2, karakterisert ved at et første stoff på-føres i en konsentrasjonsgradient som avtar fra den ene enden av det rektangulære arealet til den andre, og et andre stoff påføres i en konsentrasjonsgradient som avtar i en retning motsatt gradienten for det første stoffet.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6, karakterisert ved at konsentrasjonsmønsteret i det rektangulære området oppnås ved at man bringer en rektangulær bærer, hvorpå stoffet eller stoffene finnes i det ønskede konsentrasjonsmønster, i kontakt med reaksjons-mediet.

8. Innretning for fremstilling av forhåndsbestemte og definerte varierende konsentrasjonsmønstere av kjemisk eller biologisk aktive stoff i kjemiske eller biologiske, kvalitative eller kvantitative bestemmelser, karaterisert ved at det innbefatter en rektangulær bærer, hvorpå ett eller flere stoff er påført på hele bæreren eller en del av denne, på en slik måte at konsentrasjonsmønstrene har minst ett konsentrasjonsmaksimum og ett konsentrasjonsminimum, og at minst ett av disse fortrinnsvis er plassert nær en av endene av bæreren.

9. Innretning ifølge krav 8, karakterisert ved at minst ett stoff påføres slik at dets konsentrasjon er størst i sentrum av bæreren og avtar mot begge endene av bæreren.

10. Innretning ifølge krav 8, karakterisert ved at minst ett stoff påføres slik at dets konsentrasjon avtar fra den ene enden av bæreren til den andre enden.

11. Innretning ifølge krav 8, karakterisert ved at et referansestoff påføres på en del av bæreren med en konsentrasjonsgradient som avtar fra et maksimum ved den ene enden av bæreren, og at en del av bæreren ikke inneholder referansestoff, en prøve som inneholder det samme stoffet, hvorav konsentrasjonen skal bestemmes, påføres.

12. Innretning ifølge krav 8, karakterisert ved at et første stoff påføres i en konsentrasjon som er uniformt fordelt over den rektangulære bæreren, og et andre stoff på-føres i en konsentrasjonsgradient som avtar fra den ene enden av bæreren til den andre.

13'. Innretning ifølge krav 8, karakterisert ved at et første stoff påføres i en konsentrasjonsgradient som avtar fra den ene enden av bæreren til den andre, og et andre stoff påføres i en konsentrasjonsgradient som avtar i motsatt retning av gradienten av det første stoffet.

14 . Innretning ifølge et hvilket som helst av kravene 8-13, karakterisert ved at bæreren består av et kulturmedium og/eller et diffusjonslag og/eller et reaksjonslag, og/eller et inert bærermateriale.