NO851468L - Forbedrede fenylalanin-hydroksylase-cdna-kloner, deres fremstilling og anvendelse - Google Patents

Description

Den foreliggende ansøkning er en delvis fortsettelse

av USA ansøkning serie nr. 484 816, inngitt 14. april 1983.

Fenylketonuri og dens populasjonsgenetikk

Fenylketonuri (PKU) er en human genetisk forskyvelse forårsaket av en medfødt feil i aromatisk aminosyremetabolisme. Det ble først oppdaget for ca. 50 år siden at pasienter med denne tilstanden hadde overskudd av fenylpyrodruesyre i urinen (Folling, A., 1934a, Nord. Med. Tiskr. 8, 1054 - 1059; Folling, A., 1934b, Zitschr. Physiol. Chem. 227, 169 - 176). Videre

ble det oppdaget at levere fra slike pasienter ikke var i stand til å omdanne fenylalanin til tyrosin som er hovedmetabolise-ringsveien for fenylalanin (Jervis, G.A., 1953, Proe. Soc.

Exp. Biol. Med. 82, 514 - 515; Udenfriend, S. og Bessman, S.P., 1953, J. Biol. Chem. 203, 961 - 966; Wallace et al, 1957, Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 94, 632 - 633; Mitorna et al, 1957, Proe. Sco. Exp. Biol. Med. 94, 634 - 635). Klassisk PKU er såledeskarakterisert veden mangel på fenylalanin-hydroksylaseaktivitet" i leveren (Kaufman, S. 1976, I: Advances in Neurochemistry,

Vol. 2, sidene 1 - 132, Agranoff, B.W. og Aprison, M.H., utg. Plenum Press, New York og London). Mangel på denne enzymatiske aktivitet forårsaker persisterende hyperfenylalaninemi og meta-bolske sideveier for fenylalanin blir overbelastet. Høye nivåer av fenylalanin og dets derivater er toksiske og forårsaker forstyrrelser i tyrosin- og tryptofanmetabolisme (Blau, K.,

1979, I: Aromatic Amino Acid Hydrokxylase and Mental Disease (Youdim, M.B.H., ed.) sidene 79 - 139, New York, Wiley). For-minsket dannelse av katekolaminer, melanin og serotonin er typisk i ubehandlede PKU-pasienter, og det kliniske symptom-

er en irreversibel svekkelse av hjernens utvikling som resulterer i alvorlig mental tilbakeståenhet av de ubehandlede barn (Folling, A., 1934a, Nord. Med. Tidskr. 8, 1054 - 1959; Folling, A., 1934b, Zitschr. Physiol. Chem. 227, 169 - 176).

Fenylalanin-hydroksylasemangel blir, uavhengig av feno-typevariasjoner, overført som et autosomalt resessivt trekk. Massiv seleksjon av over 5 nyfødte har vist at utbredelsen

av klassisk fenylketonuri blant kaukasianere varirerer fra 1/5 400 i Irland til 1/16 600 i Sveits (Thalhammer et al, 1975, Humangenetik 30, 273 - 286). Den samlede frekvens i 8 Vest-Europeiske land og De Forente Stater er omtrent 1/8 000 og

de 2% av populasjonen er heterozygote bærere av PKU-trekket.

(Bickel et al, 1973, Acta Paediat. Scand. 62, 413 - 416; Scriver, CR. og Rosenberg, L.E., 1 973, I: Amino Acid Metabolism and

Its Disorders, sidene 290 - 337, Philadelphia:Saunders, 491 pp.)

Vanlige metoder for neonatal seleksjon og behandling

Fenylketonuriske pasienter utskiller store mengder fenylpyrodruesyre i urinen, som lett kan påvises ved dets reaksjon med jernklorid og ble anvendt i 1950-årene som en seleksjons-test for diagnose av PKU-barn. En enkel masseseleksjonsmetode for en semi-kvantitativ bestemmelse av fenylalanin i små blod-prøver fra nyfødte barn ble senere utviklet av Guthrie, R.

og Susi, A., 1963, Pediatrics 32, 338 - 343. PKU-nyfødte identifisert ved denne testen kan bli behandlet med et spesielt proteinlysat med lavt fenylalanininnhold (Bickel et al, 1954, Acta Pediat. Scand. 43, 64 - 77; Armstrong, M.D. og Tyler,

F.H., 1955, J. Clin. Invest. 34, 565 - 580). Denne behandling forårsaker er redusert plasmafenylalaninnivå, forsvinning av fenylpyrodruesyre i urinen, og er assosiert med en forbedring i mental utvikling og oppførsel (Koch et al, 1971, I: Phenylketonuria and Some Other Inborn Errors of Metabolism (Bickel, H., Hudson, F.P. og Woolf, L.I., eds.) s. 20 - 25; Wamberg, 1977, I: Medico-Social Management of INherited Metabolic Disease (Raine, D.N., ed.), ed.); s. 63 - 78, MTP Press Ltd., Lancaster, England; Smith, I. og Wolff, O.H., 1974, Lancet 2, 540 - 544).

Tidlig diagnose av klassisk PKU og behandling resulterer imidlertid ikke i normale IQ-verdier og læreevne. Initiering av diett-terapi snart etter fødselen har veldige psykologiske og sosiale implikasjoner for pasientens familie (Mikkelson et al, 1974, Næringsforskning 18, 78 - 86). Diett-korreksjo-nen må gjennomføres over en lengre tidsperiode for å være effektiv, og avslutning av behandlingen i midten av det første tiår er tilsynelatende fulgt av en liten, men signifikant ned-gang i IQ-verdier (Scriver et al, 1980a, N. Eng. J. Med. 303, 1336; Scriver, et al, 1980b, N. Eng. J. Med 303, 1394). Kon-troll av denne behandlingen har vist seg å være veldig vanske-lig og kan best utføres bare ved sentere som har erfaring med slike disipliner.

Forut for vår tidligere ansøkning, serie nr. 484 816,

var det ingen prenatale diagnostiske metoder for identifisering av resessive homozygoter, og testene som var tilgjengelige for identifisering av heterozygoter, er ikke så veldig kvanti-tative Woolf et al, 1967, Nature 213, 882 - 885; Rampini, S., 1973, Schweiz Med. Wschr. 103, 537 - 546; Guttler, F. og Wamberg, E. , 1 977, Acta Paediat, Scand. 66, 339 - 344 ; Guttler, F. og Hansen, G., 1977a, Ann. Clin. Biochem. 14, 124 - 134; Guttler,

F. og Hansen, G., 1977b, Clin. Gen. 11, 137 - 146). Således

er det et desperat behov for utvikling av metoder for prenatal diagnostikk og påvisning av heterozygote voksne for forebyg-gelse, heller enn terapi, av denne arvelige forstyrrelse.

Vår tidligere ansøkning, serie nr. 484 816, åpenbarer dellengde cDNA-kloner og deres anvendelse hvorved bare opptil 75% av PKU-familiene i populasjonen kan dra fordel av den genetiske analyse. Det er sterkt ønskelig å sørge for prenatal diagnose og bærerpåvisning av den genetiske forstyrrelse for de fleste PKU-familier, og den foreliggende oppfinnelse er rettet mot dette.

Fenylalanin- hydroksylasesysternet

Fenylalanin-hydroksylasesystemet i pattedyr er komplekst: det involverer flere andre enzymer og kofaktorer i tillegg til fenylalanin-hydroksylase selv (fig. 1). I nærvær av molekylært oksygen og den aktive kofaktor tetrahydrobiopterin ok-syderer enzymet fenylalanin til tyrosin og omdanner samtidig kofaktoren til en kinonoid dihydrobiopterinform (kaufman, S., 1964, J. Biol. Chem. 248, 540). Kinonoid dihydrobiopterinet blir videre redusert til tetrahydrobiopterinformen ved dihydropteridin reduktase i nærvær av NADPH (Kaufman, S., 1976, I:<1>Advances in Neurochemistry, Vol. 2, s. 1 - 132, Agranoff, B.W. og Aprison, M.H., eds., Plenum Press, Néw York og London). Således virker pterin-kofaktoren katalytisk under fenylalanin-hydroksyleringen. Dihydrofolat reduktase trenges i utgangspunk-tet til å omdanne det naturlig forekommende 7,8-dihydrobiopterin til dens aktive tetrahydroform (Kaufman, S., 1962, I: Oxygenes (0. Hayashi, ed.) s. 129, New York, Academic Press). Dette enzymet trenges imidlertid ikke lenger etter at utgangsreduksjo-nen har forekommet fordi pterin-kofaktoren resirkulerer bare mellom tetrahydro- og kinonoid-dihydroformene (Kaufman, S., 1963, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 50, 1085).

Hele kjeden av reaksjoner forekommer i leveren som er

det eneste vevet som opprettholder signifikant fenylalanin-hydroksylaseaktivitet i mennesket.

Heterogene fenotyper av fenylalanin- hydroksylasemangel

Siden fenylalanin-hydroksylering er et slikt komplekst system, er det mulig at hyperfenylalaninemi også kan resultere fra mangler i de andre enzymatiske aktiviteter eller kofaktorer. Faktisk har varianter av former av fenylketonuri blitt beskrevet nylig, hvor en mangel i enzymet dihydropteridin reduktase er blitt demonstrert (Bartholome, K., 1974, Lancet 2:580; Smith et al, 1975, ARch. Dis. Child. 50, 864 - 870; Kaufman

et al, 1975a, New Engl. J. Med. 293, 785 - 790; Kaufman et al, 1975b, Pediat. Res. 9, 632 - 634). PKU-fenotypen kan også bli manifestert som et resultat av dihydrofolat reduktaseman-gel (Niederwieser, A., 1979, I: Folie Acid in Neurology, Psy-chiatry and Internal Medicine (Botez, M.I., Reynolds, E.H., eds.) s. 349 - 384, New York, Ravin; Danks et al, 1979, Pe-diatr. Res. 13, 1150 - 1155) og homostase av tetrahydrobiopterin koenzym (Danks, D.M., 1978, J. Inherited Met. Dis. 1, 47 - 48). Ikke desto mindre utgjør disse typer av "atypisk fenylketonuri" en relativt liten del av fenylketonuriske pasienter. En stor majoritet av dem mangler fremdeles fenylalanin hydroksylase enzymatisk aktivitet i leverbiopsiene, og hydroksylering av fenylalanin forekommer ikke selv i nærvær av tilsatt tetrahydropterin kofaktor (Grimm et al, 1975, Clin. Chim. Acta 58, 17 - 21).

Fenylalanin»hydroksylasemangel er imidlertid en hetero-gen tilstand, siden pasienter med denne tilstand kan variere fra alvorlige (klassisk PKU) til moderate (hyperfenylalanimei). Fenylalanin hydroksylase er blitt renset fra levere av rottet, ape og menneske (Kaufman, S. og Fisher, D.B., 1970, J. Biol. Chem. 245, 4745 - 4750; Gillam et al, 1974, Biochem. J. 139,

731 - 739; Choo, K.H. og Cotton, R.G.H., 1979, Biochem. J.

17, 921 - 946; Woo et al, 1974, Biochem. J. 139, 741 - 749; Choo et al, 1979a, Biochem. J. 181, 285 - 294; Choo et al, 1979b, J. Inherited Metab. Dis. 2, 79 - 84). Det er et multi-merisk enzym med en underenhets-molekylvekt på omtrent 50 000 dalton. Nylige funn har vist at underenhetene enten er iden-

tiske eller at den ene er et proteolytisk produkt av den andre (Choo et al, 1979a, Biochem. J. 181, 285 - 294; Choo et al, 1979b, J. Inherited Metab. Dis. 2, 79 - 84). Fenylalanin hydroksylase fra pasienter med klassisk fenylketonurei er blitt vist å være en strukturelt forandret form av enzymet med mindre enn 1% av normal aktivitet (Friedman et al, 1973, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 70, 552 - 556), hvilket indikerer at fenylketonuri kan være et direkte resultat av en mutasjon i selve fenylalaninhydroksylasegenet. Videre har analyse av fenylalanin-hydroksylase-aktivitet i leverbiopsier av pasienter med "hyperfenylalaninemi" vist at de inneholdt omtrent 5% av det normale aktivitetsnivå, med en variasjon på 1 - 35% (kaufman et al, 1975a, New Engl. J. Med. 293, 785 - 790; Kaufman, et al, 1975b, Pediat. Res. 9, 632 - 634; Bartholome et al., 1975, Pediat. Res, 8,. 788 - 893 (, Det er senere blitt demonstrert at de lave enzymatiske aktiviteter i tilfeller med hyperfenylalaninemi ikke har forårsaket tilstedeværelsen av 5% av det normale enzym, men heller av tilstedeværelsen av en forstyrret hydroksylase med kinetiske egenskaper som er forskjellige fra både det normale enzymet og enzymet fra pasienter med klassisk PKU (Kaufman, S., 1976, I: Advances in Neurochemistry, Vol.

2, s. 1 - 132, Agranoff, B. W. og Aprison, M.H., eds., Plenum Press, New York og London,; Kaufman, S. og Mllstein, S., 1977, Ann. Clin. Lab. Sei. 2, 178 - 185). Sammen indikerer disse studier klart tilstedeværelsen av multiple fenotyper av fenylalanin hydroksylasemangel, som kunne være forårsaket av mutasjoner på forskjellige steder i fenylalanin-hydroksylasegenet.

Fenylalanin-hydroksylase (PAH) cDNA-kloner er blitt isp-lert fra rotte og humane lever-cDNA-samlinger. I vår tidligere ansøkning serie nr. 484 816 og i Nature, Vol. 306, Nr. 5939,

s. 151 - 155, 10. november 1983, beskrev vi anvendelsen av human PAH cDNA-kloner som representerte den 3<1>halvdel av mRNA til å identifisere restrisjons-fragmentlengdepolymorfisme i PAh-lokus i mennesket. Polymorfismen ble funnet ved å anvende restriksjonsenzymene Mspl, SphI og Hindlll, og er blitt brukt til å oppspore overføringen av mutant PAH-gener i informative PKU-familier med ett eller flere affiserte barn. Disse forsøk har vist at mutant PAH-genene hadde en utskillelse i overensstemmelse med sykdomstilstanden. Frekvensene av restriksjons-

situs polymorfismene i PAH-genet påvist av disse del-lengde cDNA-klonene er slik at selv under ideelle betingelser kan bare 75% av PKU-familiene i populasjonen dra fordel av den genetiske analyse. Det ville være meget fordelaktig å identifisere tilleggsrestriksjons-fragmentlengde polymorfisme i PAH-lokus, og derved sørge for haplotype-analyse av de fleste PKU-familier for prenatal diagnose og bærerpåvisning av den genetiske forstyrrelse. I den foreliggende oppfinnelse blir dette utrettet ved isolering og anvendelse av en fullengde human PAH cDNA-klone-.

Bestemmelse av kromosomal beliggenhet av PKU- lokus

PKU-lokus i mennesket er blitt studert ved bindingsanalyse med andre polymorfe geneloki i PKU-familier med ikke-konklude-rende resultater. Den mulige påvisning av PKU-lokus på kromosom 1 ble foreslått ved moderate bindingsdata med fosfogluko-mutoselokus PGM-1 (lp3) (Berg, et al, A Linkage Study of Phenylketonuria, Clin. Genet. 6: 147 - 152, 1974) og amylaseloki Amy-1 og Amy-2 (lp1) (Kamaryt, et al, PKU Locus, Genetic Linkage with Human Amylase (Amy) Loci and Assignment to Linkage Group 1, J. Human Genet. 43: 205 - 210, 1978). Mer nylig er bindingsstudier mellom PKU-lokus og 15 kromosommarkører som inkuderte PGM-1, Amy-1 og Amy-2, ved å bruke forbedrede metoder for heterozygotbestemmelse blant r søsken i PKU-familier, blitt utført. Disse forsøk oppnådde imidlertid ikke å opprette genetiske bindinger mellom PKU-lokus og noen av markørene og er i uoverensstemmelse med den tidligere påvisning (Paul, et al, Linkage Analysis Using Heterozygote Detection in Phenylketonuria, Clin. Genet. 16. 217 - 232, 1979).

Anvendelse av rekombinante DNA-prøver i konjunksjon med humane/gnagercellehybridgrupper for å påvise spesifikke gener i det humane genom er et mektig verktøy i konstruksjonen avsdet humane genkart. Kromosale påvisninger for geneloki kan gjøres ved å bruke klonede gener som prøver i molekylær hybridisering til genom DNA isolert fra humane/gnagercellehybrider som inneholder forskjellige utsorteringer av humane kromosomer. Humane fenylalaninhydroksylase cDNA-kloner ble anvendt til å påvise tilstedeværelse av det humane fenylalaninhydroksylasegen i en klonal human/musehybridcellegruppe ved molekylær hybridisering. Sammenligning av disse data med tilstedeværelse av forskjellige humane kromosomer i hver av hybridcellelinjene har vist at det humane fenylalaninhydroksylase-genet er på kromosom 12.

Den humane fenylalaninhydroksylase cDNA-klon er blitt anvendt som en hybridiseringsprøve for å påvise eksistensen av restriksjons-fragmentlengdepolymorfisme i fenylalaninhydroksylaselokus (Woo, et al, Cloned Human Phenylalanine Hydroxy-lase Gene permits Prenatal Diagnosis and Carrier Detection of Classical Phenylketonuria, Nature 306: 151 - 155, 1983). DNA til familiemedlemmer fra familier med ett eller flere PKU-barn pluss uaffiserte søsken er blitt analysert. I alle de studerte familier er det blitt observert fullstendig overensstemmelse i utskilling mellom det mutante fenylalaninhydroksylasegen og sykdomsfenotypen. Videre var den alleliske utskillelse mellom forsøkspersonene og de uaffiserte søsken totalt uoverensstemmende. Disse resultater gir en sterk antyd-ning om at PKU er resultatet av mutasjonsforekomster i selve fenylalaninhydroksylasegenet og ikke er forårsaket av noen andre transregulatoriske mekanismer. Siden fenylalaninhydroksylasegenet er blitt påvist å være på humankromosom 12, er PKU-lokus i mennesket også på kromosom 12. I tillegg indikerer eksistensen av multiple restrikjsons-fragmentlengdepolymorfis-mer i fenylalaninhydroksylaselokus at fullengde human cDNA-klonen kan anvendes som en polymorf markør for kromosom 12

og således anvendes i bindingsanalyse mellom PKU og andre humane nabogeneloki.

Sammendrag

Følgelig er den foreliggende oppfinnelse rettet mot iso-lerte fullengde-humane fenylalaninhydroksylase cDNA-kloner, metoder for deres produksjon og anvendelse av disse kloner i prenatal diagnose av den humane genetiske forstyrrelse, PKU,

og i påvisning av bærere av fenylalaninhydroksylasemangeltrek-ket. Ved å anvende fullengde cDNA-kloner som hydrolyserings-prøve for å analysere humant genom DNA blir et totalt antall på 8 restriksjonsenzymer som gir polymorfe mønstere fra det tilsvarende kromosomale gen identifisert.

Frekvensene av restriksjonssitus polymorfismene i det humane fenylalaninhydroksylaselokus er slik at prosenten av heterozygotisitet blant kaukasianere blir estimert til å være godt over 95%, hvilket antyder at de fleste av familiene med forhistorie med klassisk fenylketonuri kan dra fordel av den genetiske analyse for prenatal diagnose og bærerpåvisning av den arvelige forstyrrelse, som tidligere nevnt.

Denne oppfinnelse er også rettet mot en metode til å bruke de humane fenylalaninhydroksylase-cDNA-kloner til å bestemme den kromosomale beliggenhet av PKU-lokus i mennesket, og isolering av det tilsvarende humane kromosomale gen.

Denne oppfinnelse er også rettet mot identifisering av PKU-affisert foster, og bærere av PKU-trekket uten testperson.

Standard, forbedret, rekombinantDNA-teknologi er med fordel blitt anvendt, og komponentene, slik som plasmidene, osv., er lett tilgjengelig på markedet. Detaljer av oppfinnelsen er fremsatt nedenfor.

Kort beskrivelse av tegningene

FIGUR 1 er et restriksjonskart av phPAH247 som er en full-lengde f enylalaninhydroksylase cDNA-klon. Den består av omtrent 2400 nukleotider innfelt i EcoRI-situs av pBR322. Det kodende område er fremhevet ved den tykke linjen og utranslaterte områder er representert ved de tynne linjene. FIGUR 2 innbefatter radioautogrammer av det humane fenylalaninhydroksylase-gen etter analyse ved Southern hybridisering ved å bruke restriksjonsenzymene som hver ga 2 polymorfe DNA-fragmenter. DNA-prøvene ble oppnådd fra lymfocytter av tilfeldige normale kaukasianere. Enzymene anvendt til DNA-spalting i gruppe A - D er EcoRV, EcoRI, XmnI, og Bglll, henholdsvis. Romertallene er allelebetegnelser som svarer til hybridiserte fragmentstørrelser. FIGUR 3 er en Southern blot-analyse av det humane fenylalaninhydroksylasegen ved enzym Mspl. Figuren på venstre side er et radioautogram av 5 enkelte DNA'er etter hybridisering med phPAH247 som viser 5 forskjellige mønstere. Figuren på høyre side er en hypotetisk skjematisk fremstilling som illustrerer den mulige opprinnelse av restriksjonsfragmentlengde polymorfismen med Mspl siti avmerket ved pilene. FIGUR 4 er en Southern blot-analyse av det humane PAH-gen ved enzymet PvuII. Figuren på venstre side er et radioautogram av 5 individers DNA etter hybridisering med phPAH247. Figuren på høyre side er en skjematisk fremstilling av en hypotetisk illustra-sjon av organiseringen av de polymorfe fragmenter. De tykke mørke linjene representerer strukturelle deler i genet som hybridiserte med DNA-prøven. Det polymorfe PvuII-situs er betegnet A og B. FIGUR 5 er en skjematisk fremstilling av de innfelte stykker i det humane DNA i fire rekombinante kosmidkloner som inneholder overlappende fragmenter av det humane kromosomale fenylalaninhydroksylasegen. Det tilnærmede genområde er vist som det skraverte feltet i den sammensatte profil under. Symboler anvendt for restriksjons-siti i klonene er Sm,

Smal; S, Sali; B, BamHI; C, Clal og X, Xhol.

I ØYEBLIKKET FORETRUKNE UTGAVER

Molekylært og biologisk grunnlag for klassisk fenylketonuri

De følgende organismer er tilgjengelige fra permanent samling av American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA.

Det deponerte er tilgjengelig for offentligheten etter bevilgning av patent fra Howard Hughes Medical Institute, som åpenbarer dem. Det bør imidlertid være forstått at tilgjenge-ligheten av et deponert materiale ikke innebærer en lisens til å praktisere den foreliggende oppfinnelse ved begrensning av patentrettigheter bevilget av offentlige myndigheter. Restriksjonsfragmentlengde-polymorfisme (RFLP) er et eksempel på human variasjon analysert på genotype-nivå. Disse polymorfismer kan brukes mye på samme måte som fenotypepolymor-fisme, dvs. elektroforetiske varianter av proteiner, for å beskrive variasjonen innen og mellom populasjoner, for å gjøre virkningsanalyser mellom en RFLP og et trekk av ukjent lokalisering og til å gjøre slektskapsanalyser av trekk som kosegre-gerer eller er tett bundet til prøven anvendt til å identifisere RFLP. Vi har identifisert mange RFLP i fenylalaninhydroksylaselokus ved å bruke et fullengde cDNA som hybridiserings-prøve. Disse polymorfismer er frekvente og antyder et høyt nivå av heterozygositet. Faktisk var hver av de 19 individer som ble analysert, heterozygote for én eller flere av RFLP'ene.

Siden fenylalaninhydroksylase finnes stort sett i leveren, er den ikke så lett tilgjengelig for nøyaktig karakterisering. Faktisk forblir mange spørsmål ubesvart når det gjelder dette enzymets biokjemi. Fenylketonuri er blitt velkarakterisertklinisk, men deffekten i fenylalaninhydroksylase er ikke blitt identifisert. Den molekylære tilnærming til studiet av denne medfødte feil i metabolisme er blitt iverksatt med kloning av cDNA for fenylalaninhydroksylase. Restriksjonsfragmentlengde-polymorfisme i det kromosomale fenylalaninhydroksylasegen er et anvendbart verktøy i studiet av PKU. Først og fremst kan forekomst av haplotyper som definert ved RFLP, assosiert med normale og PKU-gener, defineres for forskjellige populasjoner. Denne type informasjon har vært anvendbar i identifisering

av de mange forskjellige mutasjoner av /J-thalassemi, hvorav de fleste er assosiert med spesifikke haplotyper.

Det er mulig å skille de normale og mutante fenylalaninhydroksylasegener i familier med ett eller flere affiserte barn ved å koble en enkelt haplotype med hvert PKU-gen i hver familie. Segregering av haplotype med PKU-trekket i testede familier, har vist at polymorfismene kan brukes til prenatal diagnostikk i fremtidige graviditeter og til PKU-heterozygot påvisning blant søsken i familier med ett eller flere PKU-barn. Denne analysen er avhengig av at begge foreldre er haplotype heterozygote slik at deres to fenylalaninhydroksylasegener kan bli adskilt. De fremsatte tilleggspolymorfismer er anvendbare ved at det utvider prosenten av heterozygositet i populasjonen. Dette betyr at de fleste PKU-familier vil være informa tive for polymorfismer og vil være i stand til å dra fordel av prenatal diagnose og bærerpåvisning.

MATERIALER OG METODER

Rekombinant plasmid phPAH247

Plasmid phPAH247 er en rekombinant som inneholder et fullengde-humant cDNA for fenylalaninhydroksylase, som ble identifisert fra en human-lever-cDNA-samling som senere er beskrevet i detalj. Det cDNA-innfelte stykke ble subklonet inn i EcoRI-situs av pBR322 og isolert ved innledende spalting av phPAH247 DNA MED EcoRI fulgt av elektroforese i lavtsmel-tende agarosegeler. DNA ble ekstrahert og nick-translatert til en spesifikk aktivitet på 2 - 3 x 108dpm/ug ved standard-prosedyrer.

De rekombinant kosmidkloner chPAHl5, chPAHIO, chPAH14 og chPAH25

Kosmidkloner chPAH15, chPAHIO, chPAHU og chPAH2 5 er rekombinanter som inneholder forskjellige deler av det normale humane kromosomale fenylalaninhydroksylasegen, som ble identi-fiset fra en genom DNA-samling dannet ved å bruke kosmidvektor pCV107 som senere er beskrevet i detalj. Southern hybridise-ringseksperimenter viste at kloner chPAH25 og chPAHIO inneholdt 5'-delen, chPAHl4 inneholdt den midtre delen og chPAH25 inneholdt 3<1->delen av genet. Tilsammen representerer de fire klonene omtrent 130 kb av humant genom DNA som inneholder PAH-lokus.

Konstruksjon av en human lever cDNA- samling

\ gt11. Et eksemplar av en post-mortem human lever ble -

i vennlighet gitt av dr. Bill Williams (University of Texas Medical School i Houston). Human lever total polyA-inneholdende RNA og cDNA ble fremstilt som tidligere beskrevet i Chandrda, et al, (1983) Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 80, 1845 - 1848. cDNA-preparatet ble sedimentert gjennom en alkalinsk sukrosegradient (Monahan, J.J., et al, 1976 Biochemistry, 15, 223 - 233) og bare fraksjoner som inneholder cDNA-spesier på mer enn 1500 nukleotider ble samlet. cDNA-preparatet ble gjort dobbelstrenget ved å bruke revers transkriptase (Chandrda,

T., et al, 1983, Proe. Nati. Acad. Sei, USA, 80, 1845 - 1848)

og etter S1 nukleasebehandling ble de ikke sammenfallende rest-

ender i DNA-preparatet komplemettert ved å bruke Klenow-fragmentet av DNA polymerase i nærvær av alle 4 deoksyribonukleo-sid-trifosfåtene (Maniatis, T., et al, 1982 i Molecular Cloning: A Laboratory Manual eds. Maniatis, T., et al, (Cold Spring Harbor Laboratory) s. 97 - 149). Det butt-endede cDNA ble behandlet med EcoRI metylase før ligering med EcoRI-linkere ved å bruke T4 DNA ligase (Maniatis, T., et al, 1982 i Molecular Cloning: A Laboratory Manual eds. Maniatis, T., et al, (Cold Spring Harbor Laboratory) s. 97 - 149). Det ligerte DNA-preparat ble fullstendig spaltet med EcoRI, og dobbelt-strenget DNA større enn 1500 basepar i lengde fikk man ved sukrosetetthets-gradientsentrifugering under ikke denaturerende betingelser, som også fjernet alt overskudd av EcoRI-linkere (Maniatis, T., et al, 1982 i Molecular Cloning: A Laboratory Manual eds. Maniatis, T., et al, (Cold Spring Harbor Laboratory) s. 396). Fagvektor Agt1 1 og E. Coli-vertstammer Y1088 og Y1090 (Young, R. og Davis, R. 1983 Proe. Nati. Acad. Sei. USA; 80, 1194 - 1198) ble gitt av Dr. Richard Young og Ron Davis ved Stanford. Naturlig Agt 11-DNA ble ligert til lange kjeder, fullstendig spaltet med EcoRI og de 5' terminale fosfatase ble fjernet ved bakteriell alkalinsk fosfatase. Det oppsamlede human lever cDNA ble ligert med vektor DNA, emballert in vitro, og anvendt til infisering av E. Coli Y1088 som beskrevet i Young, R. og Davis, R. 1983 Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80,

1194 - 1198. Nærmere 14 millioner primære fag-plaques ble fremlagt i denne samlingen. Mer enn 90% av disse er rekombinanter som inneholder humane DNA-innfelte stykker som antydet ved deres mangel på /^-galaktosidaseaktivitet (Young, R. og Davis, R. 1983 Science 222, 778 - 782) og karakterisering av

20 tilfeldig valgte cDNA-kloner ved EcoRI-spalting fulgt av agarosegel-elektroforese. Fagpartikler ble samlet fra platene og renset ved å bruke isopykniske CsCl-gradienter og lagret i SM-buffer (Maniatis, T., et al," 1982 i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, eds. Maniatis, T., et al, (Cold Spring Harbor Laboratory) s. 75 - 97).

Seleksjon av Agt 11 cDNA- samlingen for humane fenylalaninhydroksylase cDNA- kloner

Den irekombinante /tgt1 1 cDNA-samlingen ble selektert ved

å bruke en tidligere klonet dellengde human fenylalaninhydroksylase cDNA ved metoden til Woo (Methods in Enzymology, 68,

s. 389, 1979). E. Coli-vertcellene ble dyrket ved 37°C i L-buljong og infisert med den rekombinante (\ >- fagsamlingen. De infiserte cellene ble blandet med 0,7% agar i T-buljong og platet ut på 1% agar i L-buljong. Både den T-myke agar og L-harde agar ble tilsatt 10 mmol MgS04. Platene ble inkubert ved 37°C for å tillate dannelse av fag-plaques. Sterile nitrocellulosefiltere ble dyppet i en suspensjon av E. Coli-vertcel-ler i T-buljong som inneholdt 10 mmol MgSO^. Filtrene ble etter dekking med E. Coli-celler avtørket på sterile Whatman 3MM papirer i et bioguard-deksel. De tørkede nitrocellulosefiltrene ble lagt på fag-inneholdende agarplater og lagret i kjøleskap i omtrent 30 minutter for å tillate overføring av fagpartikler. Filtrene ble videre fjernet fra den faginne-holdende agarplate og overført til friske agarplater tilsatt 10 mmol magnesiumsulfat med den siden som hadde kommet i kontakt med fagpartiklene, vendt mot luften. De friske petriskålene som inneholdt nitrocellulosefiltere, ble inkubert ved 37°C

til bakteriene som dekket, hadde vokst slik at det dannet et lag på nitrocellulosefiltrene, og fagpartiklene som var over-ført på nitrocellulosefiltrene fra orginalplaten hadde dannet plaque på bakterielaget. Nitrocellulosefiltrene ble fjernet fra agarplatene og utsatt for behandling med følgende løsninger:

(1) 0,5 N NaOH/1,5N NaCl; (2) 1,0 M Tris-HCl, ph 7,4; og (3) 0,5M Tris-HCl-ph 7,4/1,5M NaCl. Filtrene ble lufttørret, var-met i en 68°C ovn i 2 timer og dekket ved 68°C i flere timer med en løsning som inneholdt 6 x SSC og 0,2% hver av bovint serumalbumin, ficoll og polyvinylpyrrolidon i henhold til fremgangsmåten til Denhardt (Biochem. Biophys. Res. Commun., 23, 651, 1966). De dekkede filtrene ble så underkastet hybridise-32 ring med P-merket phPH72 DNA i Denhardts løsning som inneholdt 0,5% natriumdodecylsulfat. Hybridisering ble utført ved 68°C over natten med 10^ cpm hybridiseringsprøve pr. filter. Nitro-cellulosef iltrene ble vasket ved 68°C med 3 forandringer av 1 x SSC som inneholdt 0,5% SDS, avtørket ved romtemperatur og underkastet radiografi ved -20°C ved å bruke Dupont Cronex 4 røntgenfilmer i nærvær av intensiveringsgittere. Rekombinante fag-plaques identifisert ved seleksjonsprosedyren, ble plukket fra den opprinnelige hovedplaten og underkastet seleksjonsprosedyren for annen gang. Etter den andre seleksjonen fikk man enkle isolater av rekombinante fagplaques som ga hybridiseringssignaler. Rekombinante fager ble så dyrket og DNA isolert ved standard prosedyrer. Det rekombinantef\.-DNA ble fordøyet med EcoRI, og størrelsen av de innfelte humane DNA-fragmenter ble analysert ved agarosegelelektroforese fulgt av EtBr-farving. Klonen med den største DNA-innfellingen ble betegnet phPAH247 som ble valgt for videre analyse.

Southern blotting og hybridisering

Total-human-genom-DNA ble renset fra perifere leukocytter isolert som væskelaget fra fullblod som tidligere beskrevet i Woo, et al, Nature 309, 151 - 155, 1983. 5 mikrogram genom-DNA ble fullstendig spaltet med restriksjonsenzymer i passende buffere som anbefalt av forhandleren. Elektroforese og avtør-king på nitrocellulosepapir ble gjort som beskrevet i Southern, J., Molec. Biol., 98, 503 - 517, 1975. Prehybridisering og hybridisering ble gjort ved 42°C i 45% formamid, 5x Denhardts løsning, 4 x SSC, 0,1M NaP04ph 6,5, 0,1% SDS, 0,1% natrium-pyrofosfat, 250ug/ml sheared, denaturert Herring spermie DNA. Hybridisering ble gjort i nærvær av 10% dekstransulfat og 2x10 6 cpm/ml<32>p-merket prøve innfelt. Nitrocellulosepapi-ret ble vasket to ganger i 2 x SSC; 0,5% SDS for 15' ved romtemperatur, og i 0,1 x SSC, 0,1% SDS i 2 timer ved 68°C, fulgt av autoradiografi i 1 - 5 dager.

Kromosomal anvisning av PKU- lokus

Hybridcellelinjer og DNA-isolering.

Foreldrehybridcellelinjer ble laget ved å sammensmelte

A9 museceller med humane GMl44-celler (AHA), humane GM589-celler (BDA), og humane WI-38-celler (WA); eller mellom muse-L-celler og humane GM126-celler (41pt og FRY4). Subkloner av de originale hybridcellelinjene ble isolert ved fortynningsut-platning. Mus-humane hybridceller ble dyrket uten antibiotika i Q^-minimalt essensielt medium, 10% heatinaktivert fetalt bovint serum, i rundkolber. Cytogenetiske og isozymprøver ble tatt samtidig med DNA-isolering. Monolag ble vasket to ganger med saltvann og én gang med TNE (50 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM NaCl, 10 mM EDTA ved 4°C. TNE tilsatt 0,5% vekt/volum SDS

(BRL) og proteinase K (100 u/ml) ble tilsatt fulgt av inkube-ring over natten ved 37°C på en valsemølle. DNA ble ekstrahert to ganger med redestillert fenol, to ganger med kloroform-iso-amylalkohol (24:1), konsentrert i dialysekar mot PEG 8000 (Sigma, St. Louis, Mo.), og nøye dialysert mot TE (10 mM Tris-HCl,

pH 8, 1 mM EDTA) ved 4°C.

Karyotype og isozymanalyse av hybridcellelinje

Genetisk analyse av cellehybrider inkluderte G-bånddannelse av 25 - 50 metafaser og isozymanalyse. Isozymkonstitusjonen av hver hybridcellelinje ble bestemt ved stivelsegel eller cel-luloseacetatelektroforese og histokjemisk farving for følgende loki: kromosom 1 (enolase-1, E.C.4.2.1.11; fosfoglukomutase-1, E.C. - 2.7.5.1; og peptidase-C, E.C.3.4.11 *); kromosom 2 (malat dehydrogenase-1, E.C.1.1.137; og isocitrat dehydrogenase-1, E.C.-1.1.1.42); kromosom 3 (acylase-1, E.C.3.5.1.14); kromosom 4 (peptidase-S , E, C. 3 . 4 . 1 11; og f osf oglukomutase.-2 , E.C. 2.7.5.1); KROMOSOM % (heksosaminidase B, E.C.3.2.1.30); kromosom 6 (gly-oksylase-1, E.C.4.4.1.5; og malisk enzym-1, E.C. 1.1.1.40); kromosom 7 ((i-glukuronidase , E. C. 3 . 2 . 1 . 31 ; og uridin fosforylase, E.C.2.4.2.3); kromosom 8 (glutation reduktase, E.C.1.6-4.2); kromosom 9 (adenylat kinase-1, E.C.2.7.4.3; og aconitase-S, E.C.4.2.1.3); kromosom 10 (adenosin kinase-1, E.C.2.7.1.20 ; og glutamat oksaloacetat transaminase, E.C.2.6.1.1); kromosom 11 (laktat dehydrogenase-A, E.C.1.1.1.27); kromosom 12 (triose fosfat isomerase, E.C.5.3.1.1.; peptidase-B, E.C.3.4.11<*>; og laktat dehydrogenase-B, E.C.1.1.1.27); kromosom 13 (esterase-10, E.C.3.1.1.1.); kromosom -14 (nukleosid fosforylase, E.C.-<*>2.4.2.1); kromosom 15 (mannose fosfat isomerase, E.C.5.3.1.8; pyruvat kinase-3, E.C.2.7.1.40; og heksosaminidase-A, E.C.3.2.-1.30); kromosom 16 (adenosin fosforibosyl transferase, E.C.2.4.-2.7); kromosom 17 (galaktokinase, E.C.2.7.1.6); kromosom 18 (peptidase-A, E.C.3.4.1<*>); kromosom 19 (glukose fosfat isomerase, E.C.5.3.1.9); kromosom 20 (adenosin deaminase, E.C.3.5.4.4.); kromosom 21 /syoerijstd dismutase-1, E.C.1.15.1.1); kromosom 22 (aconitase-M, E.C.3.1.6.1); og X-kromosom (fosfoglycerat kinase, E.C.2.7.2.3; hypoksantin-guanin fosforibosyl transferase, E.C.2.4.2.8; og glukose-6-fosfat dehydrogenase, E.C.1.1.-1.49).

Southern blotting- analyse

Omtrent 5 - 10 ug DNA ble spaltet fullstendig med BamH1 ved 2 U/ug DNA fulgt ved elektroforese i 1% agarosegeler. DNA ble overført til et nitrocellulosefilter i henhold til Sout-herns metode (Southern, EM: Påvisning av spesifikke sekvenser blant DNA-fragmenter separert ved gel-elektroforese., J.Moi. Biol. 98: 503 - 517, 1975) og tillatt å hybridisere med det

32 innfelte . Pstl fragment av phPH72 DNA etter merking med p ved nick-translasjon (Maniatis, T., et al, Nucleotide Sequence of the Rightward Operator of Phage <\, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 72: 1184 - 1188, 1975). Betingelsene for hybridisering

og vasking var som angitt av Wahl, et al, (Wahl, et al, Effektiv overføring av store DNA fragmenter fra agarosegeler til diazo-benzyloksymetol-papir og hurtig hybridisering ved å bruke dekstransulfat, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76: 3683 - 3687, 1979). Hybridiseringsbånd ble påvist ved autoradiografi ved å bruke Fuji Medical røntgenfilmer med intensiveringsgittere ved -70°C

i opptil 3 dager.

RESULTATER

En fullengde- human fenylalanin- hydroksylase cDNA- klon

phPAH247 er et rekombinant plasmid som inneholder full-lengde human cDNA for fenylalaninhydroksylase innfelt i EcoRI-situs av pBR322. cDNA er omtrent 2,4 kb i lengde og inkluderer hele kodeområdet, 5' og 3' utranslatert sekvens, og en strekning av polyA<1>som vist i fig. 1. Southertn blot-analyse av total human genom DNA spaltet med et antall restriksjonsenzymer ved å bruke phPAH247 som hybridiseringsprøve, indikerer at det kromosomale fenylalaninhydroksylasegen er et stort gen som inneholder multiple intervenerende sekvenser. Kloning og for-beredende karakterisering av det kromosomale fenylalaninhydroksylasegen har vist at alle fragmenter påvist ved Southern analyse av genom DNA kommer fra et enkelt kopigen som er større enn 80kb i lengde.

Multiple restriksjonsfragmentlengde polymorfismer i det humane PAH- lokus

Genom DNA med høy molekylvekt isolert fra perifere leukocytter av 19 ubeslektede normale kaukasianske individer ble spaltet"med et antall restriksjonsenzymer fulgt av Southern blot-analyse ved å bruke phPAH247 som hybridiseringsprøve. Listen av enzymer anvendt til analysen inkluderer følgende: Avall, BamHI, Bell, Bglll, BstNI, EcoRI, EcoRV, Haelll, Hindi, Hindlll, Kpnl, Mspl, Pstl, Pvull, Sau96AI, ScrFI, SphI, Sstll, Taql, Sbal, og XmnI. I tillegg til SphI, Hindlll og Mspl nevnt tidligere, ble 5 tilleggsenzymer som ga restriksjonsfragment-lengdepolymorf ismer observert: EcoRV: phPAH247 hybridiserer til tre invariente fragmenter og et fjerde allelisk fragment på enten 30 kb eller 25 kb. Individer som er homozygote for 30 kb fragmentet (fig. 2A; kolonne 1), mangler det polymorfe EcoRV restriksjons-situs,

og de som er homozygote for 25 kb fragmentet (fig. 2A; kolonne 2) har det polymorfe EcoRV-situs i hver av sine fenylalaninhydroksylasegener. Heterozygoter for restriksjons-situs i sine kromosomer er også blitt påvist (fig. 2A; kolonne 3).

EcoRI: Blant de multiple EcoRI-restriksjonsfragmenter

som inneholder forskjellige deler av fenylalaninhydroksylase-genet inneholder 21 kb-fragmentet et polymorft EcoRI-restriksjonssitus. Fravær av dette situs i begge kopiene av gener resulterer i et mønster vist i fig. 2B, kolonne 1. Nærvær av dette situs i 21 kb-fragmentene resulterer i at den blir spaltet i et 12,5 kb hybridiserbart fragment, og individer som er homozygote for dette situs, har et mønster som vist i fig. 2B, kolonne 2. Dette mønsteret kompliseres ved tilstedeværelse av et tilleggsbånd som er invariabelt, men mye svakere som komigrerer med det polymorfe 21 kb-fragment som vist i fig. 2B, kolonne 2. Imidlertid har de individuelle heterozygoter for det polymorfe EcoRI-situs (fig. 2B, kolonne 3) 12,5- og 21 kb-båndene av nesten lik intensitet og kan lett skilles fra de som er homozygote for 12,5 kb-fragmentet som vist i fig. 2B, kolonne 2.

XmnI: Et to-allelisk system ble også påvist ved hjelp av dette enzym. Restriksjons-situs-polymorfisme resulterer i homozygote individer for enten et 9,4 kb-fragment vist i fig. 2C, kolonne 1, eller et 6,5 kb-fragment vist i fig. 2C, kolonne 2. Heterozygote individer for de to fragmenter er også blitt identifisert som vist i fig. 2C, kolonne 3.

Bglll: Et Bglll-situs er polymorft i fenylalaninhydroksylasegenet og resulterer i restriksjonsfragmenter på enten 3,6 eller 1,7 kb i lengde. Individer som er homozygote for 3,6 kb-fragmentet (fig. 2D, kolonne 1) eller for 1,7 kb-fragmentet (fig. 2D, kolonne 2) og de som er heterozygote for de to fragmentene (fig. 2D, kolonne 3) er blitt lett påvist i gruppen av tilfeldige individer.

Mspl: Mspl-polymorfisme i fenylalaninhydroksylasegenet påvist tidligere med del-lengde human cDNA-kloner, består av to alleler: 23 og 19 kb. Hybridisering av Mspl-spaltet genom-DNA av 19 kb genotypen med phPAH247 resulterer i identifisering av 4 kb DNA-fragmenter som tidligere ikke er påvist, som vist i fig. 3, kolonne 2, 4, 5. Det er et tilleggs Mspl-polymorft situs i 4,0 kb-fragmentet i og med at det kunne bli spaltet i 2,2 og 1,8 kb DNA-fragmenter i noen individer som vist i fig. 3, kolonne 2, 3. Som illustrert skjematisk i fig. 3 er 23 kb-allelet I og (19+4) kb allelet II dannet ved fravær eller tilstedeværelse av et internt Mspl-situs, henholdsvis. Tilleggs-sekvensen av cDNA i phPAH247 har muliggjort identifisering av et annet polymorft Smpl-situs i det indre av 4 kb-fragmentet (allel III).

PvuII: Southern-analyse av DNA spaltet med PvuII viser

fire fragmenter av variabel lengde dannet ved to polymorfe PvuII restriksjonssitus. De fire fragmenter adskiller seg

som to separate allele-sett. De to polymorfe situs, betegnet A og B, er også illustrert skjematisk i fig. 4. Tilstedeværelse av situs A resulterer i spaltning av et 19 kb-fragment til to fragmenter, hvorav bare 6 kb-fragmentet hybridiserer til phPAH247. Det andre situs B resulterer i spalting av 11,5 kb-fragmentet til et 9,1 kb hybridiserbart fragment. Det kan være et totalt antall på 10 mulige haplotype kombinasjoner mellom de to settene av alleler, og Southern-blottet i fig. 4 viser 5 slike spaltningsmønstre av PvuII-spaltet DNA. Individer som er homozygote for AII/BI, AI/BI og Al/BII-alleler er vist i kolonner 1, 3 og 5, henholdsvis, i fig. 4. En heterozygote for begge sett av alleler er vist i kolonne 2, og et individ som er homozygot for AI-allelet, men heterozygot for situs B-polymorfisme er vist i kolonne 4 på fig. 4.

Allelefrekvenser og prosent heterozygositet

Det er viktig å bestemme graden av restriksjonsfragment-lengdepolymorf isme i det humane fenylalaninhydroksylasegen for å estimere prosenten av PKU-familier i populasjonen som kan dra fordel av den genetiske analyse for prenatal diagnostikk og bærerpåvisning. Frekvensen av hvert allel, som definert ved tilstedeværelse eller fravær av et spesielt polymorft res-triks jonssitus , som vist i tabell 1. Disse frekvenser ble regnet ut fra en prøve med en størrelse på 38 kromosomer i en gruppe på 19 normale kaukasianske individer. Noe av restriksjons-situspolymorfismen når 0,5 i frekvens og vil være anvendbar i genetisk analyse. For eksempel gir EcoRV-polymorfisme alene en heterozygositet på nesten 50%. Definisjonen av et PAH-gen ved haplotype er spesielt kraftig til identifisering

av individuelle gener i PKU-familier. Idet man ikke tar muligheten for bindings-ulikevekt mellom de polymorfe restriksjons-situs i betraktning, kunne det være totalt på over 1000 mulige hapolotyper av fenylalaninhydroksylasegenet. Haplotype-hetero-zygositeten, kalkulert ved å bruke frekvensene av enkelte alleler satt opp i tabell 1, er godt i overskudd på 95%.

Igjen er disse kalkuleringer basert på antagelsen at

det er fullstendig tilfeldig forbindelse mellom de polymorfe restriksjonssitus. Hvis det faktisk eksisterer bindings-ulikevekt mellom noen av de observerte polymorfe situs, vil antallet haplotyper være mindre og prosenten heterozygositet vil også være redusert i noen grad.

Den følgende tabell 1 fremsetter allelene av det humane fenylalaninhydroksylasegen og deres frekvenser.

1. Alleler er betegnet med romertall med I som representerer det største DNA-fragment. 2. Frekvensen av hvert allel er regnet ut ved å dele det observerte tall for hvert allel med 38, som er det totale antall kromosomer analysert i en gruppe på 19 tilfeldige normale kaukasianere.

Fremgangsmåte for prenatal diagnostikk av PKU og bærerpåvisning ved RFLP- analyse

Det følgende er et sammendrag av fremgangsmåter som skal følges ved prenatal diagnostikk og bærerpåvisning av PKU, og er anvendbart bare i familier med tidligere PKU-historie. De detaljerte metodene for hvert av trinnene er som beskrevet i tidligere avsnitt av søknaden: 1. Få 5 - 10 ml venøst blod i EDTA-rør fra begge foreldre,

testpersonen og alle oppnåelige uaffiserte søsken.

2. Isoler høymolekylvekt-genom-DNA fra blodprøvene.

3. Spalt omtrent 5ug av genom-DNA-prøver fullstendig med hvert av de åtte restriksjonsenzymene satt opp i tabell 1 og separer DNA-fragmentene ved agarosegel-elektroforese. 4. Overfør DNA-fragmentene fra agarosegelen til et nitrocellulosefilter eller ekvivalente materialer ved Southern blotting. 5. Pre-inkuber filteret ved 42°C i flere timer i en prehyb-ridiseringsløsning, fulgt ved hybridisering over natten ved 42°C med 2x10 6 cpm/ml av 3 2p-merket PAH-DNA-prøve i nærvær av 10% dekstransulfat som beskrevet i "Southern blotting og hybridisering"-avsnittet av denne søknad. 6. Vask filteret ved romtemperatur to ganger med 2 x SSC som inneholder 0,5% SDS i 15 minutter, etterfulgt ved vasking 2 ganger ved 68°C med 0,1 x SSC som inneholder 0,1% SDS i 2 timer. Avtørk filteret og utsett det for radioautografi i 1 til 5 dager. 7. Fremkall røntgenfilmen og bestem RFLP-haplotyper av de fire PAH-genene i familien. Identifiser restriksjonsenzymene som ga polymorfe mønstere som ville skille de mutante PAH-gener fra de normale. 8. Få fetalcelleprøver ved amniocentese fulgt av dyrking av de amniotiske celler. Dette er rutinefremgangsmåter anvendt i hovedsykehuser for prenatal diagnostikk av en rekke genetiske anormaliteter. Alternative fetale chorioniske villi kan også anvendes som kilde til fetale celler når fremgangsmåten blir vidt anvendt. 9. Isoler fetalt genom-DNA fra de amniotiske cellene eller chorioniske villi og analyser den fetale DNA-prøve ved Southern hybridisering ved å bruke de (det) tidligere bestemte restriksjonsenzym(er). 10. Sammenlign de polymorfe mønstere dannet ved den fetale DNA-prøve med mønstrene til testpersonen og DNA-prøvene til foreldrene. Bestem om fosteret har arvet to kopier av de mutante PAH-genene fra begge foreldre. 11. Den samme analysen som bruker trinn 1 - 7 gir også metoder for identifisering av bærere av trekket i uaffiserte søsken i PKU-familier.

Kloning og karakterisering av de normale og mutante kromosomale fenylalaninhydroksylasegener

Genom-DNA isolert fra normale og affiserte individer

kan anvendes til konstruksjon av kromosomale DNA-samlinger ved å bruke enten A- eller kosmidkloningsvektorer (Lawn, et al, Cell 15, 1157, 1978; Hohn and Collins, Gene 11, 291, 1980), hvorfra DNA-kloner som inneholder forskjellige kromosomale

gener kan identifiseres ved seleksjon med de tilsvarende klonede cDNA-prøver. Høymolekylvekt-genom-DNA blir isolert ved å bruke standard fremgangsmåter fra perifere lymfocytter av et kaukasi-ansk individ med to normale fenylalanin-hydroksylase-gener som bestemt ved RFLP-haplotype-analyse. DNA ble spaltet delvis med Mbol og sedimentert gjennom en 1,25 - 5,OM NaCl-gradient ved 20°C i 3 timer ved 39000 rpm i en SW40-rotor. Saltgradi-enten ble fraksjonert, og størrélsesområdet av DNA inneholdt i hver fraksjon, ble bestemt ved agarosegel-elektroforese.

De fraksjoner som inneholdt DNA-fragmenter på 40 - 50 kb i lengde, ble oppsamlet, precipitert med etanol og gjenoppløst i et lite volum vann. Kosmidvektor pCV1067 og E. Coli ED8767-vert ble i vennlighet gitt av Dr. Y. W. Kan ved University of California i San Francisco. pCV107-DNA ble spaltet fullstendig med BamHI og 5'-fosfatgrupper ble fjernet ved behandling med bakteriell alkalinsk fosfatase som beskrevet for \gt11-vektoren i et tidligere avsnitt. Den defosforilerte lineære pCV107-DNA-vektor og genom-DNA-fraksjonene ble ligert ved å" brukeT4-ligase ved konsentrasjoner på 150 ug/ml og 75 ug/ml, henholdsvis. Ligeringsblandingen ble så emballert in vitro og brukt til transduksjon av E. Coli ED8767-celler som beskrevet i Lau og Kan, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80, 5225, 1983.

De transduserte E. Coli ED8767-celler ble selektert som kolo-nier på L-agarplater som inneholdt 50 ug/ml ampicillin. En genom-DNA-samling på omtrent 5x10 uavhengige rekombinanter ble således konstruert. Samlingen ble så selektert ved å bruke klonet human fenylalaninhydroksylase-cDNA som hybridiserings-prøve og man fikk et antall genom-DNA-kloner som inneholdt forskjellige deler av det humane kromosomale fenylalaninhydroksylasegen . Som vist i fig. 5 inneholder fire av genom-DNA-klonene, betegnet chPAH 15, chPAH 10, chPAG14 og chPAH 25, overlappende DNA-fragmenter som omfatter 130 kb av humant genom-DNA. Tidligere karakterisering av disse genom-DNA-klonene

ved Southern hybridiseringsanalyse har indikert at det humane kromosomale fenylalaninhydroksylasegen er større enn 80 kb i lengde som vist i det skraverte feltet på fig. 5.

'Genom-DNA-klonene som inneholder forskjellige deler av det humane kromosomale fenylalaninhydroksylasegen, kan bli videre strukturelt analysert ved restriksjonskartlegging, Southern hybridisering og elektronmikroskopisk kartlegging ved å bruke fremgangsmåter tidligere beskrevet av vårt laboratorium (Leicht et al, Nature 297, 655, 1982). De molekylære detaljer av genet kan fås ved å utføre DNA-sekvensanalyse. DNA-sekvenser som er introniske for fenylalaninhydroksylase-genet, kan også brukes som hybridiseringsprøver for å påvise eksistensen av tilleggspolymorfisme i genet etter identifisering og fjerning av gjentatte sekvenser. Det samme vil også gjelde for DNA

som er tilgrensende til fenylalaninhydroksylasegenet. Polymorfismer påvist ved disse tilleggs-kromosomale DNA-prøver vil være like anvendbare for prenatal diagnostikk og bærerpåvisning av klassisk PKU i affiserte familier.

Mutante fenylalaninhydroksylasegener kan bli isolert fra affiserte individer ved å bruke lignende metoder som er beskrevet ovenfor, og kan blikarakteriserti detalj ved DNA-sekvensanalyse. Sammenligning av DNA-sekvenser mellom de mutante og normale gener burde åpenbare den molekylære basis for den genetiske sykdom. Hvis en grunnleggende genetisk skade forekommer i en restriksjonsgjenkjennelsessekvens, kan det henholdsvise mutante gen bli påvist i affiserte individer og også bærere, ved å analysere deres henholdsvise genom-DNA'er ved å bruke det spesielle restriksjonsenzymet, fulgt av Southern-hybridisering med den klonete fenylalaninhydroksylase-DNA-prøve. Et eksempel på denne analysemetode er anvendelsen av Mstll i identifisering av det mutante ^-globingen som er ansvarlig for sigdcelleanemi (Orkin et al, New Engl. J. Med. 307, 27, 1982).

Hvis den molekylære skade ikke forekommer i en restriksjonsgjeri-kjennelsessekvens, kan spesifikke oligonukleotider av normale og mutante sekvenser bli syntetisert kjemisk, merket in vitro og brukes som hybridiseringsprøver for å identifisere de muterte genene i affiserte individer og også bærere. Denne analysemetode ble utviklet ved å bruke sigdcelleanemi som prototype (Conners et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80, 278, 2983) og er blitt beskrevet tidligere av oss for analyse av en annen genetisk sykdom kalt o^-L-antitrypsinmangel (Kidd et al, Nature 304,

230, 1983). Oligonukleotidprøvene eller deres videre modifika-sjoner kan også brukes til identifisering av mutante fenylalaninhydroksylasegener selv om den molekylære skade involverer en restriksjonsgjenkjennelsessekvens. Hvis det er mange multiple mutasjoner i fenylalaninhydroksylasegenene som kan resultere i sykdom, kan de forskjellige mutante fenylalaninhydroksylasegener isoleres fra et antall affiserte individer med forskjellige etniske bakgrunner og analyseres på samme måte. Identifiserin-gen av mutante sekvenser ville føre til syntese av en mengde oligonukleotider eller deres derivater som ville tillate analyse av mutante fenylalaninhydroksylasegener i populasjonen.

Denne tilnærming er spesielt viktig i lys av det faktum

at påvisning av mutante fenylalaninhydroksylasegener i den generelle populasjon kan bli utført i vilkårlige individer uten noen forhistorie med klassisk PKU. Således kan denne analysemetode potensielt utvikles til et masseseleksjonsprogram for PKU-bærere i den generelle populasjon.

Anvendelse av polymorfisme i fenylalaninhydroksylaselokus for bindingsanalyse av nabogener involvert i andre sykdommer

Det høye nivå av polymorfismer i det humane fenylalaninhydroksylaselokus som åpenbart i denne ansøkning, er en veldig anvendbare markør i det humane genom. Ved å bruke den humane fenylalaninhydroksylase-cDNA-klon som hybridiseringsprøve for å analysere en samling av humane/gnager-hybridceller som inneholder en utsortering av humane kromosomer, er fenylalaninhydroksylasegenet blitt påvist å være humankromosom 12 (Lidsky et al, American Journal of Human Genetics, Volume 36, 1984,

in press). Fenylalaninhydroksylase-DNA-klonene kan brukes som hybridiseringsprøver til å analysere stamtavler av andre genetiske sykdommer med eller uten kjente årsaker. Hvis utskil-lelsen av fenylalaninhydroksylasegenet er overensstemmende

med noen annen sykdomstilstand, kan PAH-DNA-prøver brukes til analyse av disse sykdommer som i PKU. Fenylalaninhydroksylase-DNA-klonene kan også brukes som et utgangspunkt for kromosomvandring inn i det henholdsvise sykdomslokus. En rekke DNA-prøver som er nabo til fenylalaninhydroksylasegenet på kromosom 12, vil bli tilgjengelige for polymorfismeanalyse av de henholdsvise sykdommene under kromosomvandringsprotokol-len. Denne fremgangsmåten vil til slutt lede til selve sykdoms-loki i kromosom 12, som så kunne bli anvendt som de beste prøver for analyse av den spesielle sykdom ved den samme tilnærming som er beskrevet for klassisk PKU i denne ansøkning.

Forskjellige metoder for påvisning av fenylalaninhydroksylase-genet i det humane genom

DNA-sekvensene i den humane fenylalaninhydroksylase-cDNA-klon, og også de tilsvarende genom-DNA-kloner og deres modifika-sjoner av disse, kan anvendes som hybridiseringsprøve for å påvise det tilsvarende gen for analyse av klassisk PKU etter merking ved hjelp av radioaktive metoder. I tillegg kan kjemisk modifiserte PAH-DNA-kloner brukes som hybridiseringsprøver som kan påvises senere ved hjelp av ikke-radioaktive metoder slik som fluoreserende eller kolorimetriske målinger (Langer-Safer, et al, Proe. Nati. Acad. Sei, USA, 79, 4381, 1982; Leary et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80, 4045, 1983). Den samme tilnærming for analyse av PKU ved å bruke fenylalaninhydroksylase-DNA-prøver, kan også anvendes direkte til analyse av den mildere form av sykdommen, kjent som hyperfenylalaninemi.

Anvendelse av humane fenylalaninhydroksylase- cDNA- kloner for

å bestemme den kromosomale beliggenhet av PKU- lokus

Spalting av humant genom-DNA med BamHI fulgt av Southern hybridiseringsanalyse, åpenbarte et intenst hybridiseringsbånd ved 2 0,5 kb. Analyse av totalt muse-DNA under de samme betingelser gir et intenst bånd ved 10,4 kb og et svakere signal ved 5,7 kb, hvilket antyder et nokså høyt nivå av sekvenshomo-logi mellom fenylalaninhydroksylasegenene i de to spesier. Siden fenylalaninhydroksylasegenet er en unik DNA-sekvens i

det humane genom uten synlige pseudogener, kan tilstedeværelse av det humane fenylalaninhydroksylasegen i humane/muse-hybridceller påvises pga. den distinkte fragmentstørrelse av de humane

og musegenene.

En klonal samling på 12 human/muse-hybridceller ble brukt for å lokalisere fenylalaninhydroksylasegenet på et spesielt humant kromosom. Høymolekylvekt-DNA ble isolert fra hver hybrid-cellelin je, spaltet med BamHI, og underkastet Southern hybridiseringsanalyse ved å bruke - 3 2p-merket phPH72 DNA. Hver hybrid-celle inneholdt 10,4 kb og 5,7 kb muse-DNA-bånd, og tilstedeværelsen av 20,5 kb humane DNA-fragmenter ble funnet i noen av hybridlinjene. En sammenligning av disse data med de humane kromosominnhold i hver av hybridlinjene som bestemt ved karyotype og isozymdata, har demonstrert fullstendig overensstemmelse i utskilling mellom fenylalaninhydroksylasegenet og tilstedeværelse av kromosom 12. De eneste andre humane kromosomer med relativt høy overensstemmelse i utskillelse med fenylalaninhydroksylasegenet , var 8 (88%), 10 (92%) og 20 (85%).

For videre å underbygge påvisningen av at fenylalaninhydroksylasegenet er i kromosom 12, ble en tilleggssamling på

5 hybrider analysert. DNA-prøver fra to hybridlinjer (AHA

3d2-3 og AHA 16e-3) som inneholdt kromosom 12, viste tilstedeværelse av det 20,5 kb humane DNA-fragment etter spalting med BamHI og Southern blot-analyse. Fullstendig overensstemmelse

i utskillelse er igjen observert bare med kromosom 12, og den potensielle tilknytning med de andre humane kromosomer kan utelukkes på grunnlag av deres reduserte nivåer av overensstemmelse i utskillelse med fenylalaninhydroksylasegenet. Disse resultater bekreftet den tidligere påvisning av at fenylalanin-hydroksylasegenet er i kromosom 12.

Hybridene 41pT2A, BDA 17b17, og BDAl7b17-1 inneholder

den cellulære onkogene Ki-ras DNA-sekvens som er blitt påvist å være i kromosom 12 og hver av dem er positive for TPI-1-iso-zymmarkøren som er lokalisert på 12p13 (data ikke vist). Imidlertid er de negative for PEP-B-markøren som er lokalisert på 12q21, hvilket indikerer tilstedeværelse av bare en del av kromosom 12 i disse cellene som et resultat av translokasjon. Ingen av disse tre hybrider ga noe hybridiseringsinnhold som svarte til det humane fenylalaninhydroksylasegen. (Disse resultater antyder at fenylalaninhydroksylasegenet er lokalisert på den lange armen av kromosom 12.) Denne muligheten bør bli testet direkte ved hjelp av subkromosomal lokalisering av fenyl-

alaninhydroksylasegenet ved in situ hybridisering.

Følgelig er den foreliggende oppfinnelse vel egnet til å oppnå hensiktene og de nevnte vesentlige momenter og også andre iboende momenter.

Mens nåværende foretrukne utgaver av oppfinnelsen er blitt gitt i forklaringsøyemed, kan forandringer og modifika-sjoner lages som er innen ånden av oppfinnelsen, som definert ved rammen av de vedlagte krav.

Claims (44)

1. En human fullengde-fenylalaninhydroksylase-cDNA.

2. En merket human cDNA-fullengde-fenylalaninhydroksylase-cDNA-klon.

3. E. Coli RRI (pHPAH 247) som har deponeringsnummer ATC 39644.

4. E. Coli ED 8767 (chPAH 15) som har deponeringsnummer ATC 39660.

5. E. Coli ED 8767 (chPAH 10) som har deponeringsnummer ATC 39659.

6. E. Coli ED 8767 (chPAH 14) som har deponeringsnummer ATC 39661 .

7. E. Coli ED 8767 (chPAH 25) som har deponeringsnummer ATC 39658.

8. Et rekombinant plasmid som inneholder et fullengde-humant cDNA for fenylalaninhydroksylase innfelt i en DNA-vektor.

9. En fremgangsmåte for diagnostisering av fenylalaninhydroksylasemangel i et menneske, karakterisert ved at den omfatter: genkartlegging ved å anvende én av en merket, fullengde, human fenylalaninhydroksylase cDNA-klon, et humant kromosomalt fenylalaninhydroksylasegen og fragmenter av disse som hybridiseringsprøve.

10. Kjemisk syntetiserte spesifikke oligonukleotider av de mutante sekvenser i det genome PKU-lokus av personer affisert med PKU.

11. Kjemisk syntetiserte spesifikke oligonukleotider av de normale sekvenser av det genome PKU-lokus.

12. En fremgangsmåte for identifisering av PKU-affiserte fostere og PKU-trekkbærere uten testperson, som innbefatter: geneanalyse ved å anvende syntetiske oligonukleotider eller deres derivater.

13. En fremgangsmåte for syntetisering av en fullengde human fenylalaninhydroksylaseklon fra humant levervev som innbefatter: seleksjon av en rekombinant Rgt11 human leversamling med en klonet fullengde f enylalaninhydroksylase cDNA-prøve, isolering av rekombinante fagplaques som gir resulterende hybridiseringssignaler, dyrking av de rekombinante fager og isolering av resulterende humant DNA, spalting av det resulterende rekombinante DNA og bestemmelse av størrelser av innfelte fragmenter av humant DNA og selektering av resulterende kloner som har et fullengde humant fenylalaninhydroksylaseinnfelt stykke.

14. En fremgangsmåte for bestemmelse av kromosomal beliggenhet av PKU-lokus i mennesker som innbefatter: genekartlegging ved å anvende en merket human fenylalanin-hydroksylase cDNA-klon som hybridiseringsprøve.

15. En metode for påvisning av bærere av fenylalaninhydroksy-lasemangeltrekket, som innbefatter: genekartlegging ved å anvende en merket hybridiserings-prøve valgt fra en gruppe som består av en fullengde human fenylalaninhydroksylase cDNA-klon, humant kromosomalt fenylalaninhydroksylasegen og fragmenter av disse.

16. En metode for diagnostisering av fenylketonuri prenatalt som innbefatter: spalting av fetalt DNA med enzymer, spalting av begge foreldres DNA med nevnte enzymer, spalting av DNA fra affiserte individer med nevnte enzymer , spalting av DNA fra tilgjengelige uaffiserte søsken med nevnte enzymer, og sammenligning av polymorfismen av de spaltede DNA'ene ved å anvende en fullengde fenylalaninhydroksylase cDNA-klon.

17. Et isolert humant kromosomalt fenylalaninhydroksylasegen.

18. Isolert humant kromosomalt fenylalaninhydroksylasegenfrag- menter effektive til anvendelse som hybridiseringsprøve i diagnostisering av fenylalaninhydroksylasemangel i et menneske.

19. Et polynukleotidmolekyl som inneholder en genetisk sekvens valgt fra gruppen som består av: a) en sekvens som inneholder sekvensen for humant PAH, b) en sekvens som hybridiserer med denne, og c) et sekvensdegenerat med nevnte sekvens a) eller b).

20. Molekyl av krav 19, hvor nevnte genetiske sekvens koder for humant PAH.

21. Molekyl i krav 20, hvor nevnte genetiske sekvens er et humant kromosomalt gen for PAH.

22. Molekylet i krav 19, hvor nevnte genetiske sekvens hybridiserer med en sekvens som koder for humant PAH.

23. Molekylet i krav 22, som er en dellengdesekvens av human PAH.

24. Molekylet i krav 22, som er et fragment av det humane kromosomale gen for PAH.

25. Molekylet i krav 19, 20, 21, 22, 23 eller 24, som har en påvisbar markør.

26. En kloningsbærer som inneholder et hvilket som helst av molekylene av krav 19, 20, 21, 22, 23, eller 24 som er tilstede i en klonings- eller ekspresjonsbærer.

27. En ekspresjonsbærer som inneholder et hvilket som helst av molekylene av krav 19, 20, 21, 22, 23 eller 24.

28. Et cDNA-molekyl som inneholder en genetisk sekvens valgt fra gruppen som består av: a) en sekvens som inneholder sekvensen for humant PAH, b) en sekvens som hybridiserer med denne, og c) et sekvensdegenerat med nevnte sekvens a) eller b).

29. cDNA-molekylet i krav 28, hvor nevnte sekvens koder for humant PAH.

30. cDNA-molekylet i krav 28, hvor nevnte sekvens hybridiserer med sekvenskoding for humant PAH.

31. cDNA-molekylet i krav 30, som innbefatter en dellengde sekvens av humant PAH.

32. Molekylet i et hvilket som helst av krav 28, 29, 30 eller 31 som har en påvisbar markør.

33. En kloningsbærer som inneholder et hvilket som helst av cDNA-molekylene fra krav 28, 29, 30 eller 31.

34. En ekspresjonsbærer som inneholder hvilket som helst av cDNA-molekylene av krav 28, 29, 30 eller 31.

35. Et isolert polynukleotid som innbefatter den genetiske informasjon av: A) et DNA-innfelt stykke tilstede i et plasmid valgt fra gruppen som består av: a) phPAH 247, EcoRI, situs av pBR322 tilstede i E. Coli RRI, ATCC, nummer 39644, b) chPAH 15, BamHI situs av pCV107 tilstede i E. Coli ED 8767, ATCC nummer 39660, c) chPAH 10, BamHI situs av pCV107 tilstede i E. Coli ED 8767, ATCC nummer 39659, d) chPAH 14, BamHI situs av pCV107 tilstede i E. Coli ED 8767, ATCC nummer 39661, og e) chPAH 25, BamHI situs av pCV107 tilstede i E. Coli ed 8767, ATCC nummer 39658; B) en DNA-sekvens som hybridiserer med et hvilket som helst av de foregående DNA-innfelte stykker; og C) en DNA-sekvens som er regenerat til det DNA-innelte stykke og sekvensen definert i A) og B), henholdsvis.

36. En metode for diagnostisering av PAH-mangel i mennesker som innbefatter påvisning av RFLP i det humane PAH-lokus.

37. Metoden i krav 16, hvor et polynukleotid av et hvilket som helst av krav 19, 28 eller 35 blir brukt som hybridise-ringsprøve.

38. En metode for syntetisering av en fullengde human fenylalaninhydroksylase cDNA-klon fra humant levervev som innbefatter : a) kartlegging av en rekombinant ^.gtl 1 human leversamling med en klonet dellengde fenylalaninhydroksylase cDNA-prøve, b) isolering av rekombinante fagplaques som gir resulterende hybridiseringssignaler, c) dyrking av de rekombinante fagene og isolering av resulterende humant DNA, d) spalting av det resulterende rekombinante DNA og bestemmelse av størrelser av innfelte fragmenter av humant DNA, og e) utvelgelse av en resulterende klon som har et fullengde humant fenylalaninhydroksylase cDNA-innfelt stykke.

39. En fremgangsmåte for diagnostisering av human fenylalanin-hydroksylasemangel prenatalt som innbefatter: påvisning av en RFLP i det humane fenylalaninhydroksylaselokus ved å bruke som hybridiseringsprøve polynukleotidet av et hvilket som helst av krav 19, 28 eller 35.

40. En metode for påvisning av bærere av fenylalaninhydroksylasemangel-trekket som innbefatter påvisning av en RFLP i det humane PAH-lokus ved å bruke som hybridiseringsprøve polynukleotidet av et hvilket som helst av krav 19, 28 eller 35.

41. En metode for prenatal diagnostisering og påvisning av bærere av en genetisk sykdom som har et genetisk tilknyttet lokus til humant PAH, som innbefatter: påvisning av en RFLP i det humane PAH-lokus ved å bruke som hybridiseringsprøve polynukleotidet av et hvilket som helst av krav 19, 28 eller 35.

42. Et spesifikt oligonukleotid som innbefatter en mutant-sekvens i det genome PKU-lokus.

43. Et spesifikt oligonukleotid som innbefatter en normal sekvens i det genome PAH-lokus.

44. En metode for identifisering av PKU-affiserte fostere og PKU-trekkbærere uten testperson som innbefatter: anvendelse av det spesifikke oligonukleotid av krav 23 eller 25 eller derivater av disse for geneanalyse.