NO852313L - Fremgangsmaate til isolering og rensing av alfa-interferoner. - Google Patents

Description

Allerede i 1956 oppdaget Isaacs og Lindemann interferon som et indirekte hemmestoff av den intracellulære virus-formering. I mellomtiden ble identifisert et stort antall forskjellige interferontyper av naturlig opprinnelse, som fremfor alt ved de forskjellige opprinnelsesceller karakteriseres:

De ved tilsvarende stimuli i de respektive celler induserte interferoner hører kjemisk til gruppen glykoproteiner, de er delvis syrestabile (pH 2) og utdolder deres fulle anti-8 9

virale virkning fra 10 - 10 IE/mg artsspesifikk. Primær-strukturen av en rekke av a-, 5- og Y-interferoner, som er oppbygd av 146-166 aminosyrer, er oppklart. Videre er det blitt kjent ikke i naturen forekommende interferoner, hvis struktur på genteknologisk måte enten ble forkortet eller i forhold til de naturlige interferoner ble endret i amino-syre sekvensen .

De yngste arbeider på området genteknologi, hvor interferon-gener i E. coli ble bragt til kjenne, har vist at den i de naturlige interferoner påviste glykosyl- resp. polysakkarid-sidekjedene ikke synes å ha noen innvirkning på proteinenes biologiske aktivitet. Dessuten kan det med antistoffer som ble frembragt med naturlig glykoprotein måles en sammenlignbar binding til ikke glykosylert interferoner fra E. coli, hvilket hentyder på den overveiende innvirkning av proteinstrukturen av interferon som anti-gendeterminanter.

På grunn av deres terapeutiske potens produseres interferoner i storteknisk målestokk enten ved høsting av kulturmedier av tilsvarende cellekulturer eller i den nyere tid ved fermentering av E.coli-stammer, hvori det på genteknologisk måte ble klonert en interferon-koderende DNA-vektor. For isolering og rensing av de utvunnede rå- 3 4 interferon-preparater (gjennomsnittlig aktivitet 10 - 10 IE/mg protein) anvendes vanligvis fremgangsmåter med affinitets- og adsorpsjonskromatografi. Disse nytter interferonets spesielle evne til å binde til immobiliserte hydrofobe ligan-der, metallioner, tioler, organiske kvikksølvforbindelser, polynukleotider, Controlled Pore Glass, samt til antistoffer med høy spesifitet. På tross av de utallige rensemetoder blir utbytter og renhet av de dermed oppnådde interferoner imidlertid utilfredsstillende, som usikkerheten over grunnen til bivirkninger ved den kliniske undersøkelse av inter-feronene på mennesker viser.

Nye, effektive isoleringsfremgangsmåter er derfor nødvendige. Denne oppgave løses ved foreliggende oppfinnelse av en fremgangsmåte til anrikning og isolering ay interferon, idet fremgangsmåten erkarakterisert vedaé interferonholdige frysetørkede råblandinger oppløses i/en vandig oppløsning av urinstoff, som inneholder et tensid som natriumdodecylsulfat (SDS) og av denne oppløsning utvinner interferonet ved ekstraktiv tofase-fordeling med en blanding av n-butanol/ iseddik/E^O. Derved anriker interferonet seg i den butan-holdige fase og kan herav isoleres etter fortynning med vann og dialyse ved etterfølgende frysetørking. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er overlegen ovenfor de kjente affinitets- og adsorpsjonsfremgangsmåter ved at den i et effektivt, entrinnet anrikningstrinn muliggjør elimineringen av mer enn 95% av alle medfølgende forurensninger fra E. coli-fermenteringen.

Oppfinnelsen vedrører således en fremgangsmåte til isolering og rensning av plasmidogene a-interferoner av genteknologisk endrede bakteriekulturer og a-interferoner fra kulturoverstående av induserte pattedyrceller, idet fremgangsmåten erkarakterisert vedat tilsvarende interferonholdige råstoffer fordeles mellom en tensidholdig vandig urinstoffoppløsning og en vannholdig n-butanol/iseddikblanding og de rensede a-interferoner isoleres fra den øvre fase.

Ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen skilles fortrinnsvis blandinger av plasmidogene a-interferoner (herav forstås i denne forbindelse også a-hybridinterferoner) og de ved dens fremstilling fra bakterieoppslutninger og fermenter-ingsvæsker dannede forurensninger.

Som tofaset organisk- vandig oppløsningsmiddelsystem egner

det seg spesielt en vandig underfase, som inneholder 1-8 mol urinstoff/1 og et aniontensid, fortrinnsvis et alkylsulfat, spesielt natriumdodecylsulfat (SDS) eksempelvis i en konsen-trasjon på 0,1-2 vekt-% og vandig organisk overfase av n-butanol/iseddik, fortrinnsvis 300-400 volumdeler n-butanol og 30-50 volumdeler iseddik, spesielt ca. 300 volumdeler n-butanol og 40 volumdeler iseddik som fortrinnsvis er mettet med vann.

Det således i overfasen ekstraherte interferon kan deretter isoleres ved fortynning med vann og avsalting ved hjelp av dialyse og frysetørking.

Skal prepareringen renses ytterligere, kan den interferonholdige overfase eksempelvis underkastes en ytterligere fordeling, fortrinnsvis mot en n-butanol og iseddikholdige organisk-vandig fase. Som spesielt egnet har det vist seg oppløs-ningsmiddelsystemer av følgende sammensetning:

Den ytterligere rensing kan eksempelvis foregå ved hjelp av en Droplet-Countercurrent-fordeling mot ovennevnte vandige system som stasjonær fase.

En ytterligere mulighet i høyrensing er kromatografi over en fordelingssøyle, som f.eks. er fylt med "Sephadex" LH 20, ekvilibrert f.eks. med n-butanol/iseddik/t^O (ca. 215:175: 2150, vol.:vol.). Dertil haes den interferonholdige overfase fra ekstraksjonen umiddelbart på fordelingssøylen og

søylen fremkalles med frisk overfase.

Spesielt fordelaktig er fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen å anvende til adskillelse av a-interferoner fra fermenteringen av genteknologisk modifiserte E. coli-stammer.

Utf<ør>elseseksemgler:

Eksempel_l

Lysatet av en 10 1 fermentering av en E. coli-stamme, som produserer plasmidogenet a-interferon, sentrifugeres. Det klare overstående frysetørkes deretter.

Utbytte 13 g.

Det ved hjelp av reduksjonen av den cytoplatiske effekt (Lin et al. J. Gen.Virol. 39. 125-130, 1978) målte interferoninnhold

g

av dette material utgjør 2 . 10 IFE/g stoff.

10 g av dette råmaterial suspenderes i 50 ml vandig 6 M urinstoffoppløsning (1% SDS) under kraftig omrøring og den uoppløselige del frasentrifugeres. Oppløsningen innstilles ved tilsetning av iseddik på ca. pH 3. Den dannede utfelling sentrifugeres etter 15 minutters omrøring ved 4°C og opptas på nytt i 50 ml 6 M urinstoffoppløsning (1% SDS). Den klare oppløsning blir oversjiktet med det samme volum av overfasen av (n-butanol/iseddik = 350:40, mettet med vann). De to faser gjennomblandes godt i 30 minutter ved 4°C og adskilles deretter igjen ved fornyet sentrifugering. Overfasen adskilles, fortynnes med vann, dialyseres og frysetørkes. Residuet (8 mg) består av a-interferon som til ca. 75% er ren og har en CPE-verdi på o 2 . 10 8 IFE/mg stoff. Dette material kan nå på vanlig måte kromatograferes, f.eks. over en affini-tetssøyle, på hvis bærermaterial det er fiksert kovalent antiinterferon-antistoffer. Renhetsgraden utgjør deretter mer enn 95%. Det således utvunnede interferon viser i SDS-gelelektroforese et enhetlig bånd.

Eksempel_2_

10 g råmateriale opparbeides som i eksempel 1 ved fordelilng mellom overfase/6 M urinstoffoppløsning (1% SDS). Den interferonholdige overfase innmates i en DCC-kromatograf (Droplet-Countercurrent, f.eks. Buchi 670). Den stasjonære fase av DCC-kromatografen består av n-butanol/iseddik/vann (215:175: i 2150 volumdeler). Fordelingen fremkalles med frisk overfase. Det interferonholdige eluat samles med en fraksjonskollektor. De tilsvarende fraksjoner forenes og interferonet isoleres som i eksempel 1 ved frysetørking.

Utbytte 12 mg interferon med et innhold på 63%.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte til isolering og rensing av plasmidogene a-interferoner fra genteknologisk endrede bakteriekulturer og a-interferoner fra kulturoverstående av induserte pattedyrceller,karakterisert vedat tilsvarende interferonholdige råstoffer fordeles mellom en tensidholdig vandig urinstoffoppløsning og en vannholdig n-butanol/iseddik-blanding og de rensede a-interferoner isoleres fra den øvre fase.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat a-interferoner fra genteknologisk endrede bakteriekulturer isoleres og renses.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert vedata~hybridinterferoner isoleres og renses.

4. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-3,karakterisert vedat den nedre fase inneholder 1-8 mol urinstoff/1.

5. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-4,karakterisert vedat den nedre fase inneholder et aniontensid.

6. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-5,karakterisert vedat den nedre fase inneholder 0,1-2% natriumdodecylsulfat.

7. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-6,karakterisert vedat den øvre fase er en vannholdig blanding av n-butanol/iseddik i volumforholdet på ca. 350:40.

8. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-7,karakterisert vedat n-butanol/iseddik-blandingen er mettet med vann.

9. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-8,karakterisert vedat den interferonholdige overfase underkastes en ytterligere fordeling mellom en n-butanol og iseddikholdig organisk-vandig fase.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert vedat denne vandige fase er en blanding av n-butanol/iseddik/vann i volumforhold på ca. 215:175:2150.