NO853461L - Nye alfa-glukosidaseinhibitor, fremgangsmaate til dens fremstilling, dens anvendelse og farmasoeytiske preparater. - Google Patents

Abstract

Pseudooligosakkarid med formel I. og dets fysiologisk tålbare salter med syrer. Det omtales fremgangsmåte til dets fremstilling samt farmasøytiske preparater samt anvendelsen. Forbindelsen hår aglukosidasehemmende virkning.

Description

Oppfinnelsen vedrører et nytt biologisk aktivt pseudooligosakkarid og dets fysiologisk tålbare salter. Det har a-glukosidase-, dvs. f.eks. a-amylase- og disakkaridasehemmende egenskaper og kan derfor anvendes i human- og veterinærmedisin, i dyrenæring samt i stivelsens bioteknologi.

Pseudooligosakkaridet ifølge oppfinnelsen har følgende

formel I

Det har basisk karakter samt reduserende egenskaper og til-svarer summeformel C^H^^O^ Q, har en molekylvekt på 1110. Dette pseudooligosakkarid betegnes i det følgende også som inhibitor AI-5662. Oppfinnelsen vedrører inhibitoren Al-

5662 samt dets fysiologisk tålbare salter med syrer.

Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte til fremstilling av pseudooligosakkaridet med formel I, farmasøy-

tiske preparater inneholdende en forbindelse med formel I

samt anvendelsen som legemiddel, diganostikum og raegens.

Fremgangsmåten til fremstilling av pseudooligosakkaridet

med formel I erkarakterisert vedat den Streptomycet som frembringer pseudooligosakkaridet med med formel I, kultiveres i et fermenteringsmedium i submersfremgangsmåten, inhibitoren isoleres fra mycelet eller kulturfiltratet på

i og for seg kjent måte og renses. Av Streptomyceter er Streptomyces nov. spee. FH 1717 egnet. Denne stamme er deponert ved Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM)

under registreringsnummer DSM 3006. Det kan imidlertid også anvendes varianter og mutanter av denne stamme til fremstilling av inhibitoren AI-5662.

De taksonomiske egenskaper av Streptomyces FH 1717, DSM 3006, kan ikke tilnordnes noe beskrivelse av en Streptomycet ifølge Bergly's Manual of Determinative Bacterilogy, 8. opplag, Verlag Williams&Wilkins Corp. Baltimore, 1974, eller annen litteraturkjent beskrivelse. Forskjeller til de beskrevne stammer består i det vesentlig av fysiologiske trekk. Følg-ende tabell 1 viser morfologiske kriterier og resultater av fysiologiske undersøkelser.

Temperaturområde

+ Vekst eller positiv reaksjon, (+) svak vekst, I meget svak vekst, - negativ reaksjon.

Streptomyces-typene som gjengitt i tabell 1, er enda ikke omtalt i lutteraturen. Følgelig er Streptomyces FH 1717 ny. Oppfinnelsen vedrører derfor også Streptomyces novo species

FH 1717, DSM 3006.

Ved fremstillingen av inhibitoren AI-5662 går man hensiktsmessig frem som følger: Streptomyces novo spee. FH 1717 dyrkes i et vandig nærings-medium under submerse og fortrinnsvis av aerobe betingelser inntil man får en tilstrekkelig konsentrasjon av inhibitoren AI-5662. Næringsmediet inneholder på den ene side karbon-kilder, som eksempelvis kullhydrater, på den annen side næringssalter og nitrogenkilder, hvortil egnede nitorgen-forbindelser hører, f.eks. proteinholdige materialer. Foretrukkede karbonleverende forbindelser er glukose, sakka-rose, glycerol, maltekstrakt, stivelse, olje, fett og lign-ende. Foretrukne nitrogenleverende stoffer er eksempelvis maissvellevann, gjærekstrakter, soyamel, fiskemel, mager-melkepulver, påfordøyet kasein eller kjøttekstrakt. Det kan også anvendes såkalte "syntetiske" næringsoppløsninger.

Det kan videre være nyttig til fermenteringsmediet å sette sporelementer, som f.eks. zink, magnesium, jern, kobolt eller mangan.

Fermenteringen som fører tild annelse av inhibitoren AI-

5662, kan gjennomføres i et vidt temperaturområde.

Eksempelvis gjennomføres den ved temperaturer mellom 10 og 40°C, fortrinnsvis mellom omtrent 20 og 35°C. Mediets pH- verdi holder man likeledes ved verdier, hvor mikroorganismens vekst er befordret, eksempelvis ved pH-verdier mellom 4,0

og 10,0, fortrinnsvis mellom 6,0 9g 9,5. I avhengighet av næringsmidlet som f.eks. dets kvalitative og kvantitative sammensetning og fermenteringsbetingelsene, som f.eks. luft-ilngsgrad, temperatur eller pH-verdi, foregår dannelsen av AI-5662 i kulturoppløsningen, vanligvis etter ca. 1-10 dager.

Inhibitoren AI-5662 befinner seg så vel i mycel som også i kulturfiltratet fra fermenteringen. Hovedmengden av AI-5662

er vanligvis å finne i kulturfiltratet. Derfor adskilles fortrinnsvis den vandige fase fra mycelet, eksempelvis ved filtrering eller sentrifugering, og pseudooligosakkaridet fra de respektive faser isoleres på i og for seg kjente fremgangsmåter og renses;. Hertil egner det seg et stort antall fremgangsmåter, som eksempelvis kromatografi på uorganiske bærere som A^O^ eller kiselgel samt adskillelse på ioneutvekslere, molekylsikter eller adsorpsjonsharpikser, oppløsningsmiddel- resp. saltfellinger, ultrafiltrering, Carig-fordeling o.l.

En foretrukket fremgangsmåte til fremstilling av AI-5662 består i at man adsorberer inhibitoren fra kulturfiltratet på en egnet harpiks, f.eks. på polystyrenbasis, adskiller denne oppladede harpiks, og isolerer inhibitoren AI-5662

ved eluering med egnet pufferoppløsninger som f.eks. fostat-eller Na-acetat-pufferoppløsning eller med eventuelt vann-holdige organiske bppløsningsmidler, som f.eks. metanol, etanol, aceton, fortrinnsvis imidlertid med vandig isopropanol. De inhibitorholdige eluater konsentreres ved ultrafiltrering på kjent måte, idet det samtidig foretas en avsalting. Den ionefattige vandige oppløsning av AI-5662 oppdeles deretter på en ioneutvekslersøyle kromatografisk på i og for seg kjent måte. Fortrinnsvis anvender man sterkt eller svakt sure kationutvekslere,f.eks. på styren-divinyl-benzen-kopolymerisatbasis, som som funksjonelle grupper har -SO^H eller -COOH-grupper ("Dowex 50", "Amber-lite CG 120") eller på basis av modifisert sulfopropyl-

cellulose (SP-"Sephadex") som ioneutveksler, brukbart er imidlertid også et stort antall andre handelsvanlige kation-utvekslere. Det neste trinn av rensing er anvendelsen av en molekylsikt, som f.eks. på polyakrylamidgelbasis ("Biogel P-6") eller på basis av modifisert cellulose ("Sephadex G-25"). Ved samling av molekylområdet rundt 1100 Da, får man «-araylase-hemstoffet AI-5662. Det kan imidlertid forekomme at det etter den nevnte fremgangsmåte fremstilte stoff dessuten inneholder mindre forurensninger. Det er i slike tilfeller nyttig som etterrensing å gjennomføre en ytterligere adskillelse på kiselgel. Som elueringsmiddel tjener hensiktsmessig en blanding av n-propanol-etylacetat-vann-iseddik i mengdeforhold 6:1:3:0,5. De inhibitorholdige eluater forenes, inndampes i vakuum og frysetørkes. Den spesifikke aktivitet av et slxkt produkt utgjør 4 x 10 4<«->amylase-inhibitorenheter pr. mg.

Den rene inhibitor AI-5662 er et fargeløst, amorft pseudooligosakkarid. Det inneholder nitrogen og har svak basisk karakter. Således vandrer inhibitor AI-5662 i høyspennings-elektroforese i sure puffere, som f.eks. vandig maursyre/ eddiksyre-blandinger som kation i retning katode. Stoffet ifølge oppfinnelsen omfatter glukose i bundet form: ved den sure hydrolyse oppstår glukose ved siden av andre, for det meste nitrogenholdige spaltingsprodukter. Det er videre karakteriserende for inhibitoren AI-5662 at det har reduserende egenskaper, som, som vanlig i sukkerkjemien,f.eks. på-vise med trifenyltetrazoliumklorid (TTC). Forbindelsen ifølge oppfinnelsen har nå ovennevnte formel. Stoffet er lett oppløselig i vann. Adsorpsjonspektrum av ultrafiolett lys målt fra 400-210 nm i vandig oppløsning, viser en slutt-adsorpsjon ved den lave bølgelengde. Infrarødt spektrum (opptatt i Br) er gjengitt på tegningsfiguren.

I litteraturen er det allerede omtalt flere a-glukosidase-inhibitorer med pseudooligosakkaridkarakter E. Truscheit et al., Angew. Chem. 93, s. 738-755 (1981), T. Tajiri et al., Agric. Biol. Chem. 47, s. 671-679 (1983), K. Yokose et al.,

J. Antibiotics, 36, s. 1157-1175 (1983).

Ved dens strukturformel I men også delvis ved den reduserende egenskap adskiller inhibitoren ifølge oppfinnelsen ved fra alle kjente a-glukosidase-inhibitorer, således foreligger her et nytt stoff som kan fremstilles mikrobiologisk i gode utbytter.

De a-amylase- og disakkaridasehemmende egenskaper av inhibitoren AI-5662 ifølge oppfinnelsen er interessante med hensyn til anvendelsen som terapeutikum -mot Diabetes og Prediabetes samt Adipositas og undertøttelse av diett.

På grunn av dets egenskaper er det også verdifullt som

reagens for diagnostiske formål.

Stivelsesholdige nærings- og nytelsesmidler fører hos dyr

og mennesker til en økning av blodsukker og derved også

til en øket insulinsekresjon av Pankreas. Hyperglykemi kommer i stand ved oppspalting av stivelse i fordøyelses-kanalen under innvirkning av amylase og maltase til glukose.

Ved diabetikere er hyperglykemi spesielt utpreget og lang-varig .

Den alimentære hyperglykemi samt hyperinsulinemi etter stivelsesopptak lar seg minske ved a-glukosidase-inhiboren AI-5662 ifølge oppfinnelsen. Denne virkning er dosisav-hengig. Amylase-inhibitoren ifølge oppfinnelsen lar seg derofro anvende som terapeutikum ved Diabetes, Prediabetes og Adipositas samt til understøttelse av diett. For dette formål egner det seg en oral administrering, spesielt til måltidene. Doseringen som skal rette seg etter pasientens vekt samt det individuelle behov, utgjør ca. 5-300 mg pr.

dose, som hensiktsmessig tas til hvert måltid. Doseringen kan imidlertid i begrunnede enkelttilfeller også ligge høyere eller lavere.

a-glukosidase-inhibitoren ifølge oppfinnelsen egner seg spesielt til oral administrering. Den kan anvendes som rent stoff, som fyiologisk tålbart salt med syrer, men også i form av en farmasøytisk tilberedning under anvendelse av de vanlige hjelpe- og bærerstoffer. Også en kombinert anvendelse med andre legemidler som blodsukkersenkende eller lipidsenkende stoffer kan være av fordel. Da høyeremolekylære sakkarider som sådanne ikke eller ikke nevneverdig resorberes fra for-døyelseskanalen, er det av stoffet ifølge oppfinnelsen ikke å vente noen toksikologisk betenkelige bivirkninger.

Følgelig kunne det etter oral administrering også av høyere doser av ct-glukosid -inhibitor AI-5662 på forsøksdyr ikke erkjennes noen påfallende symptomer. For undersøkelse av den farmakologiske virkning av AI-5662 fikk fastene, hann-Wistar-rotter med en vekt mellom 200 og 250 g hemstoffet AI-5662 ifølge oppfinnelsen samtidig med 2 g stivelse pr. kg legemsvekt administrert oralt. Ved bestemmelse blodsukker-konsentrasjoner i blodprøver, som ble tatt før, under og etter applikasjonen av a-amylase-inhibitoren, bevises pre-paratets virkning. Ved siden av blodglukoseregulering kan polypeptidene ifølge oppfinnelsen også anvendes til hemming av spytt-a-amylase. Denne enzym bevirker fordøyelse og stivelse i munnen, og det således dannede sukker befordrer kariesangrep av tennene. Forbindelsen ifølge oppfinnelsen kan derfor anvendes til å hindre eller nedsette dannelsen av karies.

Videre kan de anvendes som biokjemiske reagenser samt som diagnostisk middel.

En amylase-inhibitorenhet (AIE) er definert som den inhibitor-mengde, som under prøvebetingelsene formår å hemme to amylase-enhter (AE) til 50%. En amylaseenhet er ifølge internasjonal overenskomst den enzymmengde, som i et minutt spalter 1 \ i ekvivalent glukosidiske bindinger i stivelsen. De uval spaltede glukosidiske bindinger bestemmes som (aval reduser ende sukker fotometrisk med dinitrosalizylsyre. Angivelsene er beregnet som (imol maltose som fastslås ved hjelp av en maltosejusteringslinje.

Prøvene gjennomføres som følger:

a-amylase fra svinepankreas og oppløsningene som skal under-søkes forinkuberes sammen i 1,0 ml 20 mM fosfatpuffer, pH

6,9, + 10 mM NaCl 10-20 ved 37°C. Den enzymatiske reaksjon startes ved tilsetning av 1,0 ml oppløselig stivelse (0,25%

i den angitte puffer) ifølge Zulkowski. Etter nøyaktig 10 minutter stoppes reaksjonen med 2,0 ml dinitrosalizylsyre-fargereagens (ifølge Boehringer Mannheim: Biochemica-Information II) og oppvarmes til fargefremkalling 5 minutter

i kokende vannbad. Etter avkjølingen måles ekstinksjonen ved 546 nm mot reagensblindverdi. Den 50%-ige hemming bestemmes sammenlignet til uhemmet enzynreaksjon ved anvendelse av forskjellige inhibitormengder grafisk ved hjelp av sannsynlighetsoppføring.

Eksemp<e>l_l

Til fremstilling av AI-5662 foregikk podningstoffdyrking (dyrking av mikroorganismen), som vanlig i mikrobilogiske praksis, fra en frysetørket permanentform av organismen Streptomyces novo species FH 1717, DSM 3006, over enkelt-kolonipassasje og skrårør. Den for fermenteringen nødven-dige masseproduksjon av sporer ble likeledes gjennomført på fåst næringsbunn i Roux-flasker.

^2§£m§^iHm_£2£_Ei§t§£i_§!S£å£2£_22_52y2 zt. ilsker:

40 g havrefnokker ble finmalt, blandet med 950 ml spring-

vann og homogenisert 5 minutter i en Ultra-Turrax.

Deretter tilsatte man 18 g agar og steriliserte 20 minutter ved 120°C.

Det podede rør og Roux-flaskene ble dyrket 5 dager ved 28°C

og deretter holdt ved 4°C. Porene ble avsvømmet med 10 ml sterilisert Aqua destillert eller fysiologisk koksaltoppløs-ning fra den faste næringsbunn. 5 ml av suspensjonen tjente til poding av en 2000 ml Erlenmeyer-kolbe, som var fylt med 500 ml sterilisert vandig næringsoppløsning med en pH-verdi på 7,3 og hadde følgende sammensetning (angivelser i vekt-%)

1,00% glukose

0,40% kaseinpepton.

0,40% kjøttekstrakt

0,25% NaCl

0,05% gjærekstrakt

0,05% leverpulver

Kolben ble rystet ved 220 opm 24 timer ved 28°C på en rystemaskin. Deretter overføres denne forkultur i en 12 liters Braun-fermenterer, som var fylt med 9 liter sterilisert vandig næringsoppløsning og hadde en pH-verdi på 7,4. Næringsoppløsningens sammensetning for hovedkulturen var følgende (angivelser i vekt-%)

2,0% kjøttekstrakt

2,0% maltekstrakt

1,0% kalsiumkarbonat

0,1% skumdemper \

ad 100 % vann

Hovedkulturen ble omrørt ved 28°C i 4 dager med 500 opm, lufttilførselen utgjorde 120 liter pr. time. Etter 24, 48,

60, 72, 84 og 96 timer ble innholdet av a-glukosidase-inhibitoren bestemt etter forskriftene fra R.Bender et al., Anal. Biochem., 137, 307-312 (1984). Stammen Str. nov.

spee. FH 1717 ga under de omtalte forsøks- og kulturbeting-eiser gjennomsnittlig 3 x 10 3 AEl/ml ved en slutt-pH på

8,8.

Eksemgel_2

8 liter fermenteringsoppløsning ifølge eksempel 1 ble ved hjelp av en sentrifuge befridd for cellemassen og den klare flytende fase ble innstilt på pH 9,5. Deretter påførte man oppløsningen på en søyle som omfattet 0,8 liter polystyren-adsorpsjonsharpiks ("Diaion" HP-20), ettervasket med 1,5 liter vann og eluert med vann, hvortil det var satt økende mengder isopropanol. Blandingen, som inneholdt 5% isopropanol, oppløste inhibitor AI-5662 fra søylen. Disse aktive eluater

.(1, 5 liter) ble konsentrert ved hjelp av ultrafiltrering og under varmetilsetning samt ytterligere ultrafiltrering avsaltet så lenge inntil reternatet ikke mer inneholdt på-viselig salt. Det resulterende konsentrat (0,2 liter) skilte man på sulfopropyl modifisert cellulose ("SP-Sephadex"), som var overført i syreform (H+-form). Ved anlegg av en ammonium-acetatgradient, pH 5 (0-1 molar) ble de fraksjoner som inneholdt den a-amylasehemmende aktivitet eluert. De tilsvar-ende fraksjoner ble konsentrert i ultrafiltreringsceller

("Amicon") og avsaltet. Det frysetørkede, aktive stoff ble deretter påført på en med kiselgel fylt søyle (3 x 35 cm) og eluert med en blanding av n-propanol-etylacetat-vann-iseddik (6:1:3:0,5) under trykkanvendelse. Det aktive eluat ble vakuumbefridd for oppløsningsmiddel og deretter opptatt i vann, innstilt på pH 9 og biogel P-6 underkastet slutt-rensing. Søylestrømningsmidlet var herved rent vann. Det fremstilte aktive material ble frysetørket: Det fremkom 0,8 g av et hvitt, amoft pulver med en a-amylasehemmende virkning på 4 x IO4 AIE pr. mg. På figuren er det gjengitt IR-spekteret i KBr av dette AI-5662. Elementæranalysen

ga 47,6% karbon, 6,7% hydrogen, 2,5% nitrogen og 43,2% oksygen.

Eksemp<e>l_3

200 mg av den ifølge eksempel 2 fremstilte inhibitor ble oppløst i 1 ml vann og i isbad innstilt med svovelsyre på pH 2. Deretter ble oppløsningen oppfylt med aceton til 10 ml og hensatt 30 minutter, den dannede utfelling samlet

man ved filtrering. Den i vann oppløste og deretter fryse-tørkede utfelling ga 204 mg av AI-5662-sulfatet.

Claims (8)

1. Pseudooligosakkarid med formel I

og dets fysiologisk tålbare salter med syrer.

2. Fremgangsmåte til fremstilling av pseudooligosakkaridet ifølge krav 1 samt fysiologisk tålbare salter herav, karakterisert ved at en Streptomycet som frembringer pseudooligosakkarider med formel I, kultiveres i et fermenteringsmedium i submersfremgangsmåten, psuedo-oligosakkaridet isoleres fra mycelet og kulturfiltratet på i og for seg kjent måte og renses og overføres eventuelt med en syre til et fysiologisk tålbart salt.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at Streptomyces nov. sepc. FH 1717 kultiveres og fra kulturfiltatet isoleres og renses pseudooligosakkaridet.

4. Farmasøytisk preparat inneholdende pseudooligosakkaridet ifølge krav 1 eller et fysiologisk tålbart salt herav.

5. Anvendelse av pseudooligosakkaridet ifølge krav 1 eller et fysiologisk tålbart salt herav til hemming av a-glukosidase.

6. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 til behand-ling av Diabetes, Prediabetes og Adipositas.

7. Anvendelse av forbindelser ifølge krav 1 som diagnostikum, reagens eller profylaktikum mot karies.

8. Streptomyces nov. spee. FH 1717, DSM 3006.