NO853690L - Stabilisering av enzymer brukbare ved f.eks. fremstilling av glukoson. - Google Patents

Description

Forliggende oppfinnelse angår enzymer stabilisert mot tap av aktivitet til termisk- eller sluttprodukt mediet inaktivering. Spesielt angår oppfinnelsen katalase som er stabilisert ved kryssbinding med diapimidat og pyranose-2-oksydase stabilisert ved amidinering med etylacetimidat eller homologer derav.

Katalase (EC 1.11.1.6) er et tetramert enzym med en total molekylvekt (MW) på ca. 323.000 dalton (d). Det er istand til å redusee hydrogen peroksyd til vann og molekylært oksygen i den støkiometriske reaksjon.

Dekomponeringen av hydrogen peroksyd skjer ved en totrinnsreaksjon som er katalysert ved et heme jernkompleks som tjener som aktivt sete for enzymet.

Den karakteristiske aktivitet for katalase med henblikk på å dekompo-nere hydrogen peroksyd gjør den til en verdifull komponent i et antall prosesser. F. eks. krever en prosess for fremstilling av renset oljefrø protein ifølge US-PS 4 464 296 behandling av oljefrø proteinet med tilstrekkelig peroksyd til å øke oppløseligheten for proteinet. Det oppløseliggjorte protein samles, dialyseres mot vann inneholdende katalase og dialysatet frysetørkes for derved å gi tørt, renset oljefrøprotein.

US-PS 4 460 686 beskriver oksydasjon av glukose ved bruk av et immobilisert glukoseoksydase-katalase preparat i en reaksjonsblanding ved en temperatur på 1 til 2°C. Katalaseaktiviteten i prosessen holdes på minst 1/16 del av glukose oksydase aktiviteten i preparatet. Lang reaksjonslevetid opprettholdes ved å gjennomføre oksydasjonen vedlave temperaturer.

Som beskrevet i US-PS 4 101 581 benyttes katalase i en metode for å bestemme nærværet av stoffer i fluider, spesielt biologiske fluider, som danner hydrgenperoksyd. Katalase og metanol benyttes for å produsere formaldehyd fra peroksyd. Formaldehyd reagerer med et hydroson i nærvær av jern III klorid og danner et farvestoff som kan bestemmes fotometrisk.

Katalase og glykoseoksydase bundet til en egnet bærer i umiddelbar nærhet av hverandre benyttes for å omdanne glukose til glukonsyre i h.h.t. en metode som beskrevet i US-PS 3 935 071. Peroksyd fremstilt ved glukoseoksyd mediert oksydasjon av glukose til glukonsyre blir omdannet til vann og molekylært oksygen av den bundne katalase. Koimmobilisering av de to enzymer utvider katalysatoraktiviteten ifølge patentet og minimaliserer inaktivering av glukose oksydase p.g.a. peroksyd.

Katalase benyttes også for å omdanne hydrogen peroksyd til vann og molekylært oksygen i en prosess for fremstilling av fruktose fra glukose via det mellomliggende glukoson slik som beskrevet i US-PS 4 246 347 og 4 423 149. I disse patenter omsettes glukose med enzymer istand til å omdanne hydroksylgruppen i 2-stilling i glukose til et karbonyl i nærvær av oksygen. Enzymer istand til å gjennomføre denne spesifikke omdanning inkluderer pyranose-2-oksydase (P-2-0) og og glukose-2-oksydaser (G-2-Os). Hydrogenperoksyd, fremstilt som et produkt ved den enzymatiske reaksjon mediert av P-2-0, oksyderer visse kritiske seter på P-2-0 enzymmolekylet, og skader funksjonen. Katalase tilsettes til reaksjonsoppløsningen for å fjerne hydrogenperksyd. Prosessen som beskrevet i disse patenter kan gjennomføræes innen et tempeaturområde fra ca. 15 til ca. 65 °C.

Katalase benyttes også i en prosess for å øke egenskapene til tobakk som beskrevet i US-PS 3 889 689. Ved denne prosess blir katalase og en væske inneholdende hydrogen peroksyd tvunget til å permeere mellom-rommene i tobakk der katalase og hydrogen peroksyd reagerer in situ.

En positiv fotografisk prosess som benytter sjikt inneholdende katalase er beskrevet i US-PS 3 694 207. I denne prosess reagerer katalase med hydrogen peoksyd for derved å danne et bilde av gassbobler i sjiktet, eller for å gi et fargebilde ved en fargedannende oksydasjonsreaksjon. Katalasen inaktiveres ved eksponering til lys.

Ut fra det foregående er det klart at enzymet katalase benyttes i tallrike prosesser der enzymets aktivitet må opprttholdes uten inaktivering i det minste en viss periode under prosessen. Den irreversible dissosiasjon av enzymer til underenheter er kjent å inaktivere enzymer. Katalase, et fir underenheters enzym blir således inaktivert ved dissosiasjon til underenheter. Den intramolekylære kryssbinding av enzymer ved hjelp av bi funksjonelle kryssbindingsreagense er et viktig verktøy når det gjelder enzym immobilisering og -stabilisering mot inaktivering.

Virkningen av kryssbinding på aktiviteten og enzymets karakteristika er vanskelig hvis ikke umulig å forutsi. Kryssbinding av et enzym kan gi aktivitetsforbedring mens kryssbinding av et annet enzym ikke behøver å gi noen forbedring eller sogar kan gi aktivitetstap. Således kan kryssbinding også forårsake øket aktivitet og redusert aktivitet i et enkelt bifunksjonelt enzym. F. eks. ble storfe pankreatiske ribonukleose A kryssbundet med den bifunksjonelle di-imidoester dimetyl adipimidat. Det resulterende kryssbundne monomer enzym viste en økning i spesifikk aktivitet mot cytidin 2'-3'-cyklisk fosfat og en reduksjon i aktiviteten mot RNA, se Hartman, F.C. og Wold, F. "Cross-linking of Bovine Pancreatic Ribonuclease A with Dimethyl Adipimidate". Biochemistry, 6(8):2439-2448 (1967).

Termisk inaktivering av enzymer kan skje ved forhøyede temperaturer. Medf uttrykket "forhøyede temperaturer" menes temperaturer som er signifikant høyere enn den temperatur som normalt er omgivelsestempera-tur for organismen hvorfra enzymet ble oppnådd. Termisk inaktivering er et viktig fenomen i industrielle anzymatiske prosesser av et antall grunner.

Kjemiske og enzymatiske reaksjonshastigheter øker generelt etterhvert som temperaturen øker. Hvis termisk inaktivering forhindres vil en temperaturøkning fra 25 til 70"C gi en 100 ganger økning i reaksjonshas-tigheten. Ut fra et prosessøkonomisk synspunkt er således bruken av høye temperaturer i kommersielle enzymatiske prosesser fordelaktig. Sannsynligheten for bakteriell forurensning reduseres i enzymreaktorer som arbeider ved høye temperaturer. De ugunstige virkninger av slik bakteriell forurensning er mange og inkluderer f. eks. frigjøring av enzym nedbrytende proteaser, tilstopping av filteret, produksjon av uønskede biprodukter og økede omkostninger for prosesscyklusen. P.g.a. at dette problem er meget alvorlig i næringsmiddelindustrien blir de fleste enzymatiske matvareprosesse gjennomført ved temperaturer ut over 60 °C.

Prosessproduktiviteten kan økes ved å maksimalisere konsentrasjonen av oppløst substrat i en enzymreaktor. Oppløseligheten for de fleste substrater øker med temperaturen. F. eks. blir stivelse, en polymer av glukose, gelatinisert ved temperaturer mellom 100 og 110°C.

Eksempler på industrielle prosesser som benytter forhøyede temperaturer inkluderer fremstilling av høyfruktose sirup fra glukose ved bruk av glukose isomerase, og a-amylase- og glukoamylase katalysert hydrolyse avstivelse.

Det er funnet at katalase, kryssbundet ved hjelp av visse kryssbindings-midler, har nye og uventede egenskaper sammenlignet med nativ katalase. Blant disse nye og uventede egenskaper er stabilisering av kryssbundet katalase mot termisk inaktivering, en økning av den spesifikke aktivitet for kryssbundet katalase sammenlignet med andre kryssbundne katalase, og øket ensymstabilitet i nærvær av inaktiverende stoffer, spesielt D-arabino-2-heksosulose (D-glukoson heri referert til som glukoson).

Termisk stabilitet som heri benyttes betyr enten en reduksjon i hastig-hets konstanten for termisk inaktiverng av et enzym under gitte betingelser, en økning av halveringstiden for termisk inaktivering av et enzym under gitte betingelser, eller en økning av temperaturen som er nødvendig for å nå en viss grad av termisk inaktivering av et enzym under gitte betingelser. Spesielt er det funnet at katalase som er kryssbundet under visse betingelser med dimetylsuberimidat eller dimetyl adipimidat er stabilt i nærvær av glukoson. I tillegg viser slik kryssbundet katalase øket aktivitet innen området ca. 115-120% over aktiviteten ved tid null over utstrakte tidsrom i nærvær av glukoson. I tillegg til de ovenfor gitte karakteristika for kryssbundet katalase er det funnet at katalase som er kryssbundet med dimetyl adipimidat har øket stabiliser-ingen mot termisk inaktivering og høyere aktivitet enn katalase kryssbundet med karbodiimid og dimetyl suberimidat.

Oppfinnelsen inkluderer videre en fremgangsmåte for kryssbinding av katalase hvor kryssbundet katalase har de ovenfor gitte egenskaper. Fremgangsmåten benyttes som kryssbindingsmiddel dimetyl adipimidat eller dimetyl suberimidat. Hvis dimetyl suberimidat benyttes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen vil den kryssbundne katalase ha karakterstika som øker stabilitet og aktivitet i nærvær av glukoson. Hvis dimetyl adipimidat benyttes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen vil den resulterende kryssbundne katalase ha karakteristika som øket stabilitet og aktivitet i nærvær av glukoson, øket stabilitet mot termisk inaktivering og høyere spesifikk aktivitet enn katalase kryssbundet med karbodiimid eller dimetyl suberimidat.

Med henblikk på metoden for kryssbinding av katalase ifølge oppfinnelsen krever tilfredsstillende kryssbinding av katalase ved bruk av dimetyl adipimidat eller dimetyl suberimidat kontroll når det gjelder temperaturen i katalaseoppløsningen under tilsetning av kryssbinderen, kontroll av pH verdien i katalase oppløsningen under tilsetningen av kryssbinderen og gradvis tilsetning av kryssbinderen til katalaseoppløsningen.

Når katalase kryssbindes med to vekt-% dimetyl suberimidat tilsatt alt på en gang ved pH 7, forbedres halveringstiden for katalase i nærvær av 4% glukon ved 40°C i 50 mM acetat kun med en faktor 2 (fra 50 til ca. 100 timer). Høyere mengder av kryssbinder, frem til 30 vekt-%, og gjennom-føring av reaksjonen ved høyere pH verdi, 9-10, forbedret ikke stabilite-ten for enzymet i nærvær av glukoson i venstlig grad. De kryssbundne imidinbindinger er resistente mot hydrolsye. Kryssbinderen vil imidlertid reagere med vann og danne en ester og således forhindre denne fra å kryssbinde proteinet. I en pH 10 borat buffer fremstilt med ca. 80% D2O ved romtemperatur er halveringstiden for dimetyl suberimidatet ca. 2,5 timer, målt ved hjelp av NMR.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen bør temperaturen i katalaseopplø-sningen holdes innen området mellom 0 og 10 °C og fortrinnsvis mellom 0 og 5°C. pH kontroll bør gjennomføres under tilsetningen av kryssbinderen i et område mellom 9,1 og 9,9 for å minimalisee dannelsen av estere mellom mkryssbinderen og van, noe som forhindrer kryssbinderen fra å reagere med enzymet. Fortrinnsvis vil pH-verdien holdes mellom 9,4 og 9,7. Kryssbinderen tilsettes gradvis til katalaseoppløsningen istedet for å tilsette alt på en gang. Fortrinnsvis tilsettes 20 vekt-% dimetyl suberimidat eller dimetyl adipimidat i løpet av en 5 timers periode. Med gradvis tilsetninger av kryssbindere er selvfølgelig mulige for de samme vekt-% andeler av kryssbinderen. Kortere tilsetningstider er også mulig for mindre vekt-% andeler kryssbinder. Den optimale tid vil variere avhengig av mengden kryssbinder som tilsettes og kan bestemmes eksperimentelt, men i alle tilfeller er en gradvis tilsetningstid foretrukket slik at det kun er tilstede en lav konsentrasjon av ikke omsatt kryssbinder ved tilsetning til enzymoppløsningen.

Pyranose-2-oksydase, heretter P-2-0, er et enzym som katalyserer oksydasjonen av glukose til glukoson ved en to elektronmekanisme ved bruk av oksygen som elektronakseptor. Hydrogen peroksyd dannes som biprodukt ved denne reaksjon er kjent å inaktivere P2O. Bruken av P2O

i en enzymatisk omdanning av glukose til fruktose er beskrevet i US-PS 4 446 347 oog 4 423 149. P2O fra Polyporous obtusus er en homotetra-mer med en total MW på 290.000 d. MW for underenhetene er 72.000 og enzymet inneholder fire flaviner. På samme måte som katalase er den irreversible dissosiasjon av enzymet til underenheter kjent å inaktivere enzymet. Videre og til forskjell fra katalase resulterer kryssbinding av P-2-0 med dimetyl adipimidat eller dimetyl suberimidat ikke i stabiliseing av enzymet mot termisk inaktivering eller inaktivering ved sluttprodukt glukosonet.

Det er funnet at P-2-0 som kjemisk er behandlet med et amiderende middel stabiliseres mot termisk inaktivering sammenlignet med både kryssbundet P-2-0 eller nativ P-2-0. Spesielt P-2-0 som er behandlet med etylacetimidat bibeholder mellom 75 og 98% av aktiviteten som vises av nativ P-2-0 inkubert ved 25°C. Etter 100 minutter ved 65°C bibeholder amidert P-2-0 en aktivitet på mellom 55 og 80% av den opprinnelige aktivitet mens nativ P-2-0 kun bibeholder ca. 22% av den opprinnelige aktivitet. Etter 450 minutter ved 65"C bibeholder amidinert P-2-0 fremdeles ca. 50% av sin opprinnelige aktivitet.

Det er videre funnet at amidinert P-2-0 også stabiliseres mot inaktivering ved sluttprodukt glukoson sammenlignet med nativ P-2-0. I nærværet av glukoson reduseres den enzymatiske aktivitet av P-2-0 på bifasisk kinetisk måte som vist i figur 1. I løpet av de første 48 timer reduseres aktiviteten med en åpenbar halveringstid på ca. 70 timer. Etter 48 timer har aktiviteten en halveringstid på ca. 250 timer. Som vist i figur 2 har etter amidinering P-2-0 en noe øket tilsynelatende halveringstid.

Oppfinnelsen inkluderer videre en metode for amidinering av P-2-0 hvorved amidinert P-2-0 har de karakteristika som er nevnt ovenfor. Metoden ifølge oppfinnelsen benytter amidineringsmidler slik som f. eks. acetimidat og homologer derav inkludert f. eks. etyl acetimidat. Det antas at metyl acetimidat også er effektiv ved gjennomføring av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Amidineringsmetoden ifølge oppfinnelsen omfatter imidinering av P-2-0 med et egnet amidineringsmiddel slik som f. eks. etylacetimidat. Amidiernigsmidlet tilsettes gradvis mens man holder pH verdien mellom 9 og 10,5. Fortrinnsvis er pH verdien mellom 9,5 og 10.

En gjenstand for oppfinnelsen er å tilveiebringe enzymet katalase stabilisert mot glukoson- og/eller termisk inaktivering.

En annen gjenstand for oppfinnelsen er å tilveiebringe enzymet katalase stabilisert mot glukoson- og/eller termisk inaktivering ved bruken av et kryssbindingsmiddel.

Gjenstand for oppfinnelsen er å tilveiebringe enzymet P-2-0 stabilisert mot glukosoninaktivering og termisk inaktivering.

En ytterligere gjenstand for oppfinnelsen er å tilveiebringe enzymet P-2-O stabilisert mot glukoson- og termisk inaktivering p.g.a. bruken av et amidineringsmiddel.

Det er en ytterligere gjenstand for oppfinnelsen å tilveiebringe en forbedret fremgangsmåte for enzymatisk fremstilling av glukoson ved bruk av enzymet katalase stabilisert mot glukoson eller termisk inaktivering.

Ytterligere en gjenstand for oppfinnelsen er å tilveiebringe en forbedret fremgangsmåte for enzymatisk fremstilling av glukoson ved bruk av enzymet P-2-0 stabilisert mot glukoson og termisk inaktivering.

Disse og ytterligere gjenstander ifølge oppfinnelsen vil gå tydeligere frem i de følgende eksempler som kun er ment å være ikke-begrensende eksempler, og fra de ledsagende figurer hvori

Figur 1 er et diagram over restaktiviteten for nativ renset og ikke-renset P-2-0 i nærvær av sluttprodukt glukoson; Figur 2 er et diagram over restaktiviteten for nativ og amidinert P-2-0 i nærvær av sluttprodukt glukoson; Figur 3 er et diagram over restaktiviteten for antiv og amidinert P-2-0 ved termisk inaktiveringstemperatur; Figur 4 er et diagram over restaktiviteten for nativ og kryssbundet katalase ved en termisk inaktiveringstemperatur; og Figur 5 er et diagram over restaktiviteten for katalase kryssbundet med dimetyl adipimidat eller -karbodiimid.

Eksempel 1

A. Amidinering av pyranose- 2- oksydase.

P-2-0 ble fremstilt i h.h.t. den metode som er beskrevet i US-PS 4 423 149 og ble renset ved eluering fra en DEAe ionebytte kolonne. Kolonnen ble ekvilibrert med 25 mM tris-HCl buffer ved pH 8,5 ved å pumpe bufferen gjennom kolonnen inn til innløps- og utløps pH-verdien og konduktiviteten var den samme. Før innføring i kolonnen ble P-2-0 dialysert mot 25 mM Tris-HCl ved pH 8,5 slik at pH verdien og ionestyr-ken for enzymet og utgangsbufferen var like. Det dialyserte enzym ble bragt inn i kolonnen. Denne ble eluert med en lineær saltgradient bestående av tre sjiktvolumer av samme buffer med en initial NaCl konsentrasjon på 0 og en slutt NaCl konsentrasjon på 0,2 M. Strøm-ningshastigheten ble justert til 2,5 ml/minutt. 100 ml fraksjoner av elueringsmidlet ble samlet og analysert på enzymaktivitet og proteinkon-sentrasjon.

Glukoson (9,8% glukoson, 0,3% glukose, 98% rent bestemt ved kromatog-rafi på en Aminex kolonne) ble fremstilt som beskrevet i US-PS 4 423 149. Etyl acetimidat var kommersielt tilgjengelig.

Amidinering av P-2-0 med etyl acetimidat skjedde ved to forskjellige metoder. I den første metode ble 23 mg etyl acetimidat (0,2 mmol i absoslutt etanol) tilsatt langsomt ved hjelp av en peristaltisk pumpe i løpet av en 5 timers periode til 20 ml P-2-0 ved en konsentrasjon av 6 mg/ml i 10 mM acetat. pH-verdien i reaksjonsblandingen ble holdt ved 9,5 ved tilsetning av 20 mM NaOH ved bruk av en Chemtrix pH kontroll. Alle tilsetninger ble gjennomført ved 25 °C. En time etter den siste tilsetning av etylacetimidat ble reaksjonsblandingen kromatografert på en G-25 Sephadex kolonne med fortynnet citratbuffer. Fraksjonen inneholdende amidinert P-2-0 ble holdt tilbake for aktivitetsanalyse.

I den andre metode ble en oppløsning av etyl acetimidat (115 mg i 1 ml absolutt etanol) tilsatt i 0,1 ml andeler hvert 30 minutt til 15 ml P-2-0 i en konsentrasjon av 4 mg/l i 10 mM acetat buffer ved pH 5,0. pH-verdien ble holdt som ovenfor men ved pH 10,0. 2,5 timer etter ferdig tilsetning av etyl acetimidat ble oppløsningen kromatografert som beskrevet ovenfor. Fraksjonen inneholdende det amidinerte P-2-0 ble holdt tilbake for aktivitetsanalyse.

B. Bestemmelse av amidinering av P- 2- 0 med trinitrobenzen sulfonsyre

( TNBS).

TNBS bestemmelsen av aminogrupper skjedde i h.h.t. den prosedyre som er beskrevet av Habeeb, A.F.S., Analyt. Biochem., 14382 (1966). TNBS og storfe serum albumin (BSA) ble oppnådd fra Sigma Chemical Companu i U.S.A. Mengden P-2-0 som ble benyttet ble bestemt ved -Lowery analyse. Til 1 ml P-2-0 oppløsning ved en konsentrasjon av 0,6 til 1 mg/ml ble det tilsatt 1 ml 4%-ig NaHC03ved pH 8,5 og 1 ml 0,1% TNBS. Oppløsningen ble tillatt å reagere ved 400 C i 2 timer, deretter ble 1 ml 10%-ig natrium dodecylbenzen sulfonat, SDS, tilsatt for å oppløseliggjøre proteinet og forhindre dets utfelling ved tilsetning av 0,6 ml IN HC1. Absorbansen for oppløsningen ble avlest ved 335 nm mot en blankprøve behandlet som ovenfor men med 1 ml vann (eller buffer) istedet for proteinoppløsningen. En molar extingsjons koeffisient på 1 x 10^ M~<l>cm~<l>ble benyttet for å beregne de resterende aminogrupper. BSA ble benyttet som en standard for å verfisere resultatene med P-2-0 og å sammenligne standarden med den til Habeeb supra. Resultatene for BSA lå innenfor 10% av Habeebs, imidlertid var BSA preparatene benyttet av Habeeb forskjellige fra de som her ble benyttet.

C. Analyse av P- 2- 0.

P-2-0 analyser ble gjennomført ved bruk av et koblet reaksjonssystem hvori H2O2dannet ved P-2-0 katalysert oksydasjon av glukose ble forbrukt i oksydasjonen av diortodianisidin, ODAD, for å danne et farget produkt, katalysert av pepperrot peroksidase, HRP. Tilstrekkelig HRP ble benyttet til å forsikre at den andre fargedannende reaksjon ikke var hastighetskontrollerende. Reaksjonen ble overvåket ved 460 nm; P-20 aktiviteten kunne transformeres dimensjonelt fra A^q/s til M~<l>cm~<l>, bestemt ut fra netto absorbansøkning observert når kjente mengder H2O2ble tilsatt til analyseoppløsningen i fravær av P-20. Før gjennomføring av en prøve ble en P-2-0 prøve fortynnet med fosfatbuffer (50 mM pH 6,0) til en konsentrasjon av 0,02 til 0,04 mg/ml enzym. Fordi halveringstiden for enzymet i fortynnede oppløsninger ved romtemperatur er ca. 1-2 timer ble analysene gjennomført umiddelbart etler fortynning. 0,1 ml fortynnet enzym oppløsning ble tilsatt til 0,9 rn 1 av en oppløsning som inneholdt 0,01% ODAD, 0,1 mg/ml pepperrot peroksydase og 4,2% glukose i luftmettet 50 mM fosfatbuffer ved pH 6,0. Elter 10 minutter ved 25°C ble reaksjonsblandingen quenchet ved tilsetning av 1,0 ml 2% sulfaminsyre. Absorbansen ved 460 nm ble bestemt mot en blindprøve fremstilt med buffer istedet for enzymoppløsning. Mengden hydrogen peoksyd som ble fremstilt ble bestemt ved å fremstille standard hydrogen peroksydopp-løsninger og å blande disse med ODAD-glukose-HRP oppløsning fulgt av 2% sulfaminsyre oppløsning ca. 1 minutt senere. Standarder ble målt ved forskjellige konsentrasjoner og de automatiske konsentrasjonsbestemm- eiser hentet ut av et Perkin Eimer Lamda 5 spektrofotometer ble benyttet. Standardprøvene hadde et standard avvik på mindre enn 2% mens prøver generelt hadde et standard avvik på mindre enn 5%.

D. Termodenaturering av nativ og amidinerte P- 2- 0.

En 1 ml prøve av nativ P-2-0 eller amidinert P-2-0 ved en konsentrasjon av 5 mg/ml protein i 5 mM citrat ved pH 4,9 ble overført til en 1,5 ml Eppendorf prøverør og anbragt i et 65°vannbad. På forskjellige tidspunkter ble den gjenværende aktivitet for enzymet sentifugert og analysert ved bruk av ODAD analysen som beskrevet ovenfor.

E. Inkubering med glukoson.

En 2 ml prøve av native P-2-0 eller amidinert P-2-0 i en konsentrasjon av 0,2 mg/l i 45 mM citrat buffer ved pH 4,5 og 3% glukoson, ble anbragt i et lite polypropylenrør og inkubert ved 25 °C vannbad. Kontrolloppløsningen inneholdt den samme enzymoppløsning men ingen glukoson.

F. Virkningen av glukoson på nativ P- 2- 0.

I nærvær av glukoson sank den enzymatiske aktivitet av P-2-0 ved bifasisk kinetisk metode (fig. 1). I løpet av de første 48 timer sank aktiviteten med en tilsynelatende halveringstid på 70 timer. Etter 48 timer hadde aktiviteten imidlertid en halveringstid på 250 timer.

Fordi reduksjonen i aktivitet kan skyldes nærværet av forurensende pyranose dehydratase ble to forskjellige P-2-0 preparater benyttet. Det første P-2-0 preparat hadde mesteparten av pyranose dehydratasen fjernet ved hjelp av en DEAE kolonne (0,021 enheter/minutt mg) mens den andre var et urenset enzym preparat (men med annet tall). Ingen vesentlig forskjell ble sett ved inaktiveringen av enzymet i nærvær av glukoson (fig. 1). Den bifasiske reduksjon i aktiviteten antyder at det er minst to forskjellige inaktiveringsmekanismer som forårsakes av glukoson. Resultatene antyder imidlertid at inaktiveringen av P-2-0 i nærvær av glukoson er et vesentlig problem.

G. Virkningen av glukoson på amidinert P- 2- 0.

De to forskjellige amidinerte preparater av P-2-0 som er beskrevet ovenfor hadde stabiliteter i nærvær av glukoson som er bedre enn det native P-2-0 (fig. 2). Kun 9<+->2 aminogrupper pr. P-2-0 molekyl (tetramer) av den utstrakt amidinerte P-2-0 reagerte med TNBS mens TNBS reagerte med 170+-1 aminogrupper når det gjaldt nativ P-2-0.

H. Termodenaturering av nativ, amidinert og kryssbundet P- 2- 0.

De amidinerte P-2-0 preparater viste betydelig større termostabilitet

(fig. 3) enn nativ P-2-0. Tilsynelatende øket amidineringen termostabiliteten for systemet. Den kjemiske modifikasjon av P-2-0 med høyere amidineringsnivåer resulterte i enzympreparater som var ca. 10 ganger mere termostabile enn nativ P-2-0.

Eksempel 2

Stabilise ring av katalase med diimidat.

A. Generelt

Katalase ble oppnådd fra Fermco, lott 4927. Dimetyl suberimidat, dimetyl adipimidat, TNBS og BSA ble oppnådd fra Sigma. Glukoson ble oppnådd i h.h.t. US-PS 4 423 149.

B. Analyser

Katalaseaktiviteten ble analysert ved å overvåke at absorbansen for hydrogen peroksyd ved 215 nm ble borte. En 50 pl mengde av 5 mg/ml katalaseoppløsning ble fortynnet 1 til 3 med 50 mM fosfatbuffer ved pH 7 til en sluttkonsentrasjon på 1,25 mg/ml. 50 pl av denne fortynnede enzymoppløsning ble tilsatt til 5 ml 0,003% H2O2i fosfatbuffer (50 mM pH7). Blindprøven inneholdt 50 pl fortynnet prove i 5 ml av den samme fosfatbuffer uten H2O2. Absorbsjonen ved 215 nm ble målt hvert 12 sekund i 3 minutter. Førsle ordens hasiigheiskonstant ble oppnådd ved å ta midlet av ln (Ao/At)/t eller ved å bruke cn lineær midlere kvadraters metode. Den spesifikke aktivitet U/mg protein ble oppnådd ved å dividere hastighetskonstanten med antall mg protein i peroksydoppløsnin-gen. Et standard avvik på ca. 5% ble oppånådd for en gitt prøve. Katalasen som ble anskaffet fra Fermco hadde en aktivitet på ca. 500 U/mg protein.

C. Kryssbinding av katalase diimido estre

En 20 ml prøve av katalase ved en konsentrasjon av 3 mg/ml i 10 mM citratbuffer ved pH 5 ble kjørt over en G-25 kolonne og så avkjølt til 0 -5°C. Kryssbinderen dimetyl suberimidat eller dimetyladipimidat ved en konsentrasjon av 18 mg/ml i 2 ml metanol ble tilsastt i løpet av 5 timer ved hjelp av en peristaltisk pumpe. pli verdien ble holdt mellom 9,4 og 9,7 ved hjelp av en pH kontroll som automatisk tilsatte 25 mM NaOH når pH verdien sank under 9,5. En time etter siste tilsetning av kryssbinder ble reaksjonen igjen kjørt over en G-25 kolonne (med 5-10 mM citrat, pH 5,0) for å fjerne overskytende kryssbinder og salter. Alt protein eluerte fra kolonnen.

D. Bestemmelse av aminogrupper med trinitrobcnzen sulfonsyre ( TNBS)

TNBS bestemmelsen av aminogruppene skjedde ved å folge den prosedyre som er beskrevet i Eksempel .1 bortsett fra ai alle katalaseprøver først ble kromatografert i en G-25 kolonne for å fjerne eventuell ammonium-sulfat og små peplidfragmcntcr.

E. Termodenaturering av nativ og kryssbundet katalase

Katalase eller kryssbundet katalase ved en konsentrasjon av 0,2 mg/ml i 0,01 M Nacl, 0,01 M fosfatbuffer ved en pil verdi på 6,0 ble anbragt i 300 pl polyetylen Eppcndorf prøveror og anbragt i et 81 ° C vannbad i et tidsstyrt intervall. Ampullene ble etler fjerning fra badet avkjølt hurtig og så analysert etter fortynning.

F. Termostabiliteten for kryssbundet katalase

Termostabilitetsstudier ble gjennomført ved 810 C med katalase kryssbundet med den oppløselige diimidoester som beskrevet ovenfor. Kryssbinding av enzymet med dimetyl adipimidat resulterte i en betydelilg forbedret termostabil katalase (fig. 6). Kryssbinding av enzymet med dimetyl suberimidat resulterte ikke i en katalase som var mere stabil enn det native enzym.

Eksempel 3

Termostabiliteten for adipimidat kryssbundet katalase immobilisert på DP-1 metakrylat bærer.

A. Immobilisering på DP- 1 metakrylat bærer.

Katalase, kryssbundet som beskrevet ovenfor med dimetyl adipimidat ble absorbert på Amerlite DP-1 (metakrylsyre divenylbenzen kopolymer fra Alfa, produkt lott 0/080) ionebytte harpiks som på forhånd var ekvilibrert i 0,012 M Na OAc ved en pH-verdi mellom 4,8 og 5,2 ved tilsetning av konsentrert HC1 eller NaOH etter som det var nødvendig. Dekantering, resuspensjon og ny justering av pH-verdien i ionebytte harpiksen ble fortsatt inntil pH-verdien var stabil mellom 4,8 og 5,2 etter at frisk buffer var tilsatt.

Enzym adsorbsjonen ble gjennomført etter en av to metoder. I den første ble en på forhånd veiet mengde DP-1 harpiks ristet eller slynget med et 2-3 ganger større volum katalase i 0,01 M NaOc ved pH 5 i 5-15 minutter og tillatt å avsette seg. Etter måling av enzymkonsentrasjonen i supernatanten ved spektrofotometri ble en annen mengde enzym fra en mere konsentrert lageroppløsning tilsatt og blandingen gjenopptatt. Hensikten var å fortsette tilsetningen av enzym inntil supernatant absorbansen øket proporsjonalt med tilsatt enzym. Et diagram av supernatant enzym absorbans mot mengden tilsatt enzym/masse ionebytter ga en titreringskurve, til å begynne med horisontal fordi alt eller mesteparten av proteinet ble adsorbert, og som til slutt steg lineært med en helling som indikerte protein ekstingsjonskoeffisienten. Denne metode avhenger av hurtig likevektsinnstilling mellom enzym og ionebytter.

Da det ble oppdaget at DP-1 ionebytte harpiksen langsomt kom i likevekt, på tidsskalaen timer til dager ble en andre immobiliseringsstra-tegi benyttet som følger. Rysting av DP-1 ble påbegynt med en mengde av den kryssbundne katalase som på forhånd var bestemt å være i overskudd av ionebytte kapasiteten. Supernatant spektra ble tatt i intervaller på timer til dager inntil graden av absorbansreduksjon ble neglisjerbar. Adsorbsjonskinetikken ble fulgt ved 25 °C og begerne (vanlgivis omrørt ved 100 - 200 omdreininger/minutt på et rystebord) ble omhyggelig tettet med parafilm for å minimalisere fordamping. Supernat-antprøver ble returnert etter spektralmålinger for å opprettholde et konstant volum. Finfordelte stoffer, dannet under slyngingen, ble fjernet ved å bringe prøven 5 minutter i en Eppendorf Modell 5412 mikro-sentrifuge før scanning hvis det var tegn til suspenderte stoffer. Etter at det var klart at DP-1 absorberte signifikante mengder katalase på tidsskalaen timer til dager, ble ikke-kinetiske absorbsjoner gjennom-ført uten omrøring. Flere ml dimetyladipimidat kryssbundet katalase oppløsning ble ganske enkelt tillatt å stå med et noe mindre volum harpikspartikler. Ofte skjedde adsorbsjonen med sterifiltrert (0,2 pm porestørrelse) kryssbundet katalase og DP-1 som på forhånd var autoklav-ert i et foliedekket lite glassbeger ved bruk av steril overføring for å minimalisere bakteriell forurensning. Etter at DP-1 ionebytteharpiksen bar ladet med immobilisert kryssbundet enzym ble den vasket gjentatte ganger i 0,01 M NaOAc for å fjerne enhver masse av ikkeadsorbert enzym. Spesifikk aktivitet i M~<l>s~<l>ble beregnet fra spesifikk aktivitet i minutter i~<l>g tørrvekt bærer i~<1>liter ved å dividere med 60 x/min., dividere med g våtvekt/g tørrvekt, dividere med mg enzym adsorbert/g våtvekt og multiplisere med 3,23 x 10<8>mg enzym/mol enzym.

B. Termostabiliteten for den kryssbundne katalase på en uoppløselig bærer

Adipimidat kryssbundet katalase ble immobilisert på DP-1 metakrylat harpikskuler som beskrevet ovenfor. Termostabilitetsstudier for immobilisert kryssbundet katalase skjedde ved 75 °C. Det immobiliserte enzym med kryssbundet dimetyl adipimidat resulterte i en betydelig forbedret termostabil katalase. Kryssbinding av enzymet med dimetyl suberimidat under anvendelse av den samme prosedyre som ovenfor resulterte i en mere termostabil katalase. Videre hadde adipimidat kryssbundet katalase vesentlig større spesifikk aktivitet enn karbodimid kryssbundet katalase og er vist i figur 5. Innføringen av seks karbonkjeden til adipimidat resulterte sannsynligvis i en mere stiv konfigurasjon for proteinet enn innføring av en åtte karbonkjede ved hjelp av suberimidat.

Eksempel IV

Koimmobilisering av kryssbundet katalase og amidinert P- 2- 0 og fremstilling av glukoson.

Kryssbundet katalase og amidinert P-2-0 fremstilt som beskrevet ovenfor i Eksemplene I og II kan immobiliseres på DP-1 harpiks ved bruk av den prosedyre som er beskrevet for katalase immobilisering i det foregående eksempel. Det er foretrukket at katalase tilsettes i vesentlig overskudd i forhold til mengden P-2-0. Generelt kan katalase/P-2-0 molforholdet være fra 1:1 til 10:1 og de to stabiliserte enzymer immobiliseres samtidig ved tilsetning av en mengde av de to stabiliserte enzymer i det ønskede molforhold som overskrider harpiksens fastslåtte kapasitet for bundet protein. Harpiksens kapasitet for bundet protein kan bestemmes ved supernatant protein spektra som beskrevet i Eksempel III. Supernatant protein spektra tas inntil graden av absorbansreduksjon for oppløselig protein blir neglisjerbar. Tilsetning av protein til DP-1 harpiksen følges ved 25 °C. Den belastede harpiks vaskes som beskrevet i Eksempel 1. De immobiliserte stabiliserte enzymer kan anbringes i en steril fermenter og en steril 10% glukoseoppløsning tilsettess. Steril filtrert oksygengass eller luft bobles gjennom glukoseoppløsningen. Temperaturen i fermenteren holdes ved en konstant verdi mellom 15 og 65 °C. Prøve på reaksjonsblandingen trekkes av periodisk og analyseres ved HPLC med henblikk på glukose og glukoson.

En identisk analyse kjøres ved å benytte ikke-stabilisert P-2-0 og katalase. Høyere mengder glukoson vil fremstilles i fermenteren med de stabiliserte enzymer når fermenteringstemperaturen økes.

Det vil være klart for fagmannen at katalase, stabilisert som beskrevet ovenfor, kan benyttes med fordel i tallrike anvendelser hvor dekompone ringen av hydrogen peroksyd er ønskelig. F. eks. kan den stabiliserte katalase benyttes for å utvide den effektive levetid for enzymatiske fermenteringer som krever katalase. Videre kan effektiviteten for slike enzymatiske fermenteringer økes ved å gjennomføre fermenteringen ved forhøyde temperaturer, noe som hurtig ville inaktivere nativ katalase.

Spesielt med henblikk på enzymetisk produksjon av glukoson ved bruk av stabilisert katalase vil det være klart at det stabiliserte enzym kan benyttes i prosessen immobilisert på en bærer slik som f. eks. agarose eller andre polymere bærere som vanligvis benyttes for enzym immobilisering. Alternativt kan stabilisert katalase benyttes i fremgangsmåten i oppløst form uten immobilisering til en fast bærer.

Det vil videre være klart for fagmannen at i den enzymatiske produksjon av glukoson ved bruk av stabilisert P-2-0 kan den stabiliserte P-2-0 benyttes i prosessen immobilisert til en bærer slik som f. eks. agarose eller andre polymere bærere som vanligvis benyttes for enzym immobilisering. Alternativt kan den stabiliserte P-2-0 benyttes i fremgangsmåten i oppløst form uten immobilisering til en fast bærer.

Det vil også likeledes være klart for fagmannen at i den enzymatiske produksjon av glukoson ved bruk av stabiliserte enzymer som heri beskrevet kan både katalase eller P-2-0 stabiliseres. Således kan stabilisert katalase benyttes i kombinasjon med nativ P-2-0 eller stabilisert P-2-0 benyttes i kombinasjon med nativ katalase. Ved forhøyede temperaturer vil anvendelsen av ett eller begge av de stabiliserte enzymer forventet fremstille mere glukoson enn bruken av begge enzymer i nativ form.

Andre brukbare varianter av oppfinnelsen er ansett å ligge innenfor oppfinnelsens ramme slik denne er definert av de ledsagende krav.

Claims (15)

1. Katalase, karakterisert ved at den er stabilisert mot inaktivering p.g.a. glukoson.

2. Katalase ifølge krav 1, karakterisert ved at den er kryssbundet med et kryssbindingsmiddel.

3. Katalase ifølge krav 2, karakterisert ved at kryssbind-ingsmidlet er en diimidoester.

4. Katalase ifølge krav 3, karakterisert ved at diimidoesteren er valgt blant dimetylsuberimidat og dimetyl adipimidat.

5. Katalase ifølge krav 4, karakterisert ved at den er stabilisert mot termisk inaktivering.

6. Fremgangsmåte for stabilisering av katalasen ifølge krav 1 mot inaktivering p.g.a. glukoson, karakterisert ved at den omfatter å tilveiebringe en oppløsning av katalase som skal stabiliseres, gradvis tilsetning av en diimido kryssbindingsester til katalasen slik at kun en lang konsentrasjon av kryssbinder er tilstede i oppløsningen, og å holde betingelsene slik at reaksjonen mellom kryssbinder og vann som gir esterdannelse, minimaliseres.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at pH-verdien holdes innen et område mellom 9,1 og 9,9 og temperaturen holdes mellom 0 og 10° C.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at diimidoesteren er dimetyl suberimidat eller dimetyl adipimidat, hvori katalasen er stabilisert mot termisk inaktivering.

9. Pyranose-2-oksidase, karakterisert ved at den er stabilisert mot termisk inaktivering og inaktivering ved glukoson hvori nevnte P-2-0 er amidinert med et amidineringsmiddel.

10. Pyranose-2-oksydase ifølge krav 9, karakterisert ved at amidineringsmidlet er acetimidat eller en homolog derav.

11. Fremgangsmåte for stabilisering av pyranose-2-oksydasen ifølge krav 9 mot termisk inaktivering og inaktivering p.g.a. glukoson, karakterisert ved at den omfatter å tilveiebringe en oppløsning av pyranose-2-oksydasen som skal stabiliseres, gradvis å tilsette et amidineringsmiddel til oppløsningen av pyranose-2-oksydase slik at kun en lav konsentrasjon amidineringsmiddel er tilstede i oppløsningen.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at pH-verdien holdes mellom 9,5 og 10.

13. Fremgangsmåte for omdanning av glukose til glukoson ved bruk av pyranose-2-oksydase og katalase, karakterisert ved at den omfatter å tilveiebringe den stabiliserte katalase ifølge krav 1.

14. Fremgangsmåte for omdanning av glukose til glukoson ved bruk av pyranse-2-oksydase og katalase, karakterisert ved at den omfatter å tilveiebringe den stabiliserte pyranose-2-oksydase ifølge krav 11.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at den omfatter å tilveiebringe den stabiliserte katalase ifølge krav 1.