NO854444L - Bakterielyserende enzymprodukt av streptomyceter, fremgangsmaate til dets fremstilling og dertil egnet stamme. - Google Patents

Description

Fremstillingen av et bakterielyserende enzymprodukt av Streptomyceter er kjent, og eksempelvis omtalt i de tyske Offenlegungsskrifter 20 11 935, 20 40 440 og 21 46 597. De kjente fremgangsmåter er meget omstendelige, fremfor alt med henblikk på utbyttet av bakterielyserende enzymprodukt.

Dannelsen av et bakterielyserende enzymprodukt av Streptomyceter av arten coelicolor er tidligere ikke omtalt. Egne undersøkelser, eksempelvis på typestammen DSM 40 233, var uten resultat.

Overraskende ble det nå funnet at av en stamme av arten Streptomyces coelicolor produseres et meget virksomt bakterielyserende enzymprodukt i høye utbytter. Denne stamme ble deponert ved DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)

under nr. DSM 3030. Denne stamme, dens mutanter og varianter, hvis den danner et bakterielyserende enzymprodukt,

er oppfinnelsens gjenstand. Ytterligere aspekter av oppfinnelsen og foretrukkede utførelser er gjengitt i det følgende resp. angitt i patentkravene.

Stammen ifølge oppfinnelsen ble isolert fra jordprøver. Seleksjonstrekk var ekskresjon av et enzymprodukt, som er

i stand til ved pH 3-7 å lysere bakterier.

Stammen ifølge oppfinnelsen vokser i vanlige kulturmedier, hvori den avgir det bakterielyserende enzymprodukt.

Etter adskillelse av cellene forblir det.bakterielyserende enzymprodukt i den overstående kultur, hvorfra den kan isoleres ved vanlige metoder av proteinanrikning og -rensning som alkoholfelling, ioneutvekslerkromatografi, ultrafiltrering og gelfiltrering.

En fordel av fremstillingen ifølge oppfinnelsen av det bakterielyserende enzymprodukt er å se deri at i . enkelt sammensatte kulturmedier er oppnåelig høye utbytter av bakterielyserende enzymprodukt. Spesielt har det vist seg egnet en tilsetning av sukkerroemelasse i en mengde fra 5-50 g, fortrinnsvis 10-20 g pr. liter kulturmedium.

En ytterligere utbytteøkning oppnås når man til kulturmediet setter kalsiumioner i form av lett oppløselige, ugiftige kalsiumsalter, fortrinnsvis i form av det billige kalsiumklorid. Fordelaktig er en 0,05-1 molar kalsiumionekonsentrasjon, spesielt foretrukket er konsentrasjoner fra 100-500 mmol, eksempelvis i form av en tilsetning av 0,2-0,5 vekt-% av kalsiumklorid-dihydrat.

Det ifølge oppfinnelsen oppnådde bakterielyserende enzymprodukt er stabilt og virksomt i et pH-område fra under 3

til over 9. Etter 16 timers inkubasjon ved værelsestempera-tur i bufferblandinger var den maksimale aktivitet oppnådd i området fra pH 3-9, dessuten til minst 80%.

Temperatur-optimumet for aktiviteten av det bakterielyserende enzymprodukt ligger i området fra 50-60°C. Over dette området oppnås minst 90% av den maksimale aktivitet. Ved lavere temperaturer øker aktiviteten langsomt: Ved værelses-temperatur er den ca. 10%, ved 30°C ca. 30%, ved 40°C ca. 60% av den maksimale aktivitet. Ved høyere temperaturer faller aktiviteten hurtig: Ved 65°C er den enda ca. 30%, ved 70°C 10% av den maksimale aktivitet.

pH-optimumet for virkningen av det bakterielyserende enzymprodukt ligger ved 4,5-5, 80% av aktiviteten ligger i pH-området fra ca. 4,25-5,5. Ved pH 4 er det enda ca. 65%,

ved pH 3,5 25%, ved pH 5,5 ca. 75% og ved pH 6 ca. 40% av den maksimale virkning.

Det bakterielyserende enzymprodukt ifølge oppfinnelsen

virker meget godt på gram-positive og gram-negative bakterier. Det kan derfor (som handelsvanlige lysozymer) anvendes ved en konservering av næringsmidler, til hindring av infeksjoner og til protoplastfremstilling.

I følgende eksempler forklares oppfinnelsen nærmere. Prosentangivelsene refererer seg til vekt, hvis det ikke er gjort andre angivelser.

Eksempel_l: Kultivering av S. coelicolor

Skråbunn-agarmedium, som inneholder 2% soyamel, 2% mannit og 1,5% agar (pH 7,5), podes med Streptomyces coelicolor DSM 3030 og kultiveres 10 dager ved 30°C. Skråkulturen ble blandet med 10 ml av en steril oppløsning av 0,9% NaCl og 0,01% av et ikke-ionogent tensid og sporene avsvømt. 0,2 ml av sporesuspensjonen ble anvendt som podningsmaterial for ryste-kulturer av 100 ml kulturmedium i 300 ml kulturkolber.

De i tabell 1 oppførte kulturmedier nr. 1-3 ble ansatt,

podet og rystet ved 30°C og en frekvens på 160 opm. Ette2

2, 4 og 6 dager ble det uttatt prøver, cellene frasentrifu-gert og aktiviteten av det bakterielyserende enzymprodukt i overstående kultur bestemt (tabell 2).

De høyeste utbytter av bakterielyserende enzymprodukt

ble oppnådd med næringsoppløsning 3, som ved siden av glukose og kaseinpepton inneholdt 2% sukkerroemelasse.

Eksemp_el_2: Utbytteøkning ved kalsiumtilsetning Streptomyces coelicolor DSM 3030 ble kultivert på den i eksempel 1 omtalte måte på en næringsbunn, som inneholdt 1% glukose, 2% melasse, 0,5% soyamel, 0,5% kaseinpepton og 0,5% CaCl2x 2 H20. Ved tilsetning av CaCl2ble det oppnådd en vesentlig økning av utbyttet av bakterielyserende enzymprodukt i den overstående kultur etter 2, 4 og 6 dager på 768 U/ml, 2462 U/ml og 4715 U/ml.

Eksemp_el_3: Fermentas jon

10 ml av en sporesuspensjon av Streptomyces coelicolor DSM

3030 ifølge eksempel 1 ble anvendt som podningsmaterial for en fermentering med 5 1 kulturmedium i en 8 1 fermenterer.

Fermenteringsbetingelser:

Etter 4 dagers fermentasjonsvarighet var sakkarose-konsen-trasjonen (fra melassen) sunket til ca. null. Cellene ble adskilt ved sentrifugering og av den overstående kultur isolert det bakterielyserende enzymprodukt ved alkoholfelling, ioneutvekslerkromatografi, ultrafiltrering og gelfiltrering.

I følgende tabell 3 ble den:.i den overstående kultur funnede aktivitet av bakterielyserende enzymprodukt satt lik 100% utbytte. De i spalte "Utbytte" angitte prosenttall refererer seg således til den del som gjenvinnes med den i første spalte oppførte isoleringsfremgangsmåte.

I spalten "fremgangsmåte" betyr:

0 = ingen isolering (den overstående kulturs aKtivitet)

1 = etanolfelling og oppløsning av utfellingen i buffer

2 = kationutvekslerkromatografi

3 = ultrafiltrering

4 = gelfiltrering

Aktivitetsbestemmelse av bakterielyserende enzymprodukt: Til 2,8 ml av en suspensjon av 0,2 mg Micrococcus leuteus ATCC 4698 (Boehringer Mannheim) pr. ml 0,1 M natriumacetatpuffer (pH 5,0) pipetteres 0,2 ml bakterielyserende enzym-produktholdig prøver og ved 25°C bestemmes nedgangen av uklarhet ved måling av ekstinksjonen ved 450 nm. Som 1 U defineres ekstinksjonsnedgangen på 0,001 pr. minutt.

Proteinbestemmelse:

Metode ifølge Lowry, Rosenbrough, Farr og Randall, J. Biol. Chem. 193, 265 (1951).

Eksempel_4: Lysevirkning

De i tabell 5 nevnte mikroorganismer kultiveres 24 timer, cellene frasentrifugeres (5 minutter ved 1500 g), vaskes to ganger med 0,1 N natriumacetatpuffer (pH 5,0) og suspen-deres godt i denne acetatpuffer. I denne suspensjonen gjennomføres den ovenfor nevnte aktivitetsbestemmelse av bakterielyserende enzymprodukt. I tabell 5a er det oppført gram-positive, i tabell 5b gram-negative bakterier. Som sammenligning tjente respektivt egg-lysozym.

Eksemp_el_5: Lysevirkning i melk

Som praksisnært prøvesystem ble 1 ml 24 timer gamle kulturer av de i tabell 6 nevnte bakterier blandet med 9 ml pasteuri-sert helmelk og 1 ml oppløsning med 400 U bakterielyserende enzymprodukt og med en gang etter 1 time og etter 20 timer uttatt prøver og deri bestemt det levende kimtall. Som sammenligningsverdi anvendes i prøvesystemet i stedet for oppløsninger med bakterielyserende enzymprodukt 1 ml sterilt vann.

Sammen li ingseksemp_elj_

Stammen DSM 3030 ble sammenlignet med i det tyske Offen-legungsschrift 21 46 597 nevnte S. globisporium ATCC 21553 med hensyn til utbyttet av bakterielyserende enzymprodukt.

I tabell 7 betyr "medium A" det i eksempel 2 definerte "medium B" det i "referanseeksempel 1" i det tyske Offen-legungsschrift 21 46 597 nevnte flytende medium:

Claims (6)

1. Bakterielyserende enzymprodukt oppnådd ved fermentering av Streptomyces coelicolor DSM 3030.

2. Fremgangsmåte til fremstilling av et bakterielyserende enzymprodukt ved fermentering av Streptomyceter, karakterisert ved at det anvendes stammen Streptomyces coelicolor DSM 3030.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at fermenteringsmediet inneholder sukkerroemelasse.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2 eller 3, karakterisert ved at fermenteringsmediet inneholder kalsiumioner.

5. Anvendelse av det bakterielyserende enzymprodukt ifølge krav 1 resp. det ifølge krav 2-4 oppnådde bakterielyserende enzymprodukt til konservering av næringsmidler, hindring av infeksjoner og protoplastfremstilling.

6. Streptomyces coelicolor DSM 3030 og dets mutanter og varianter, så vidt de danner et bakterielyserende enzymprodukt.