NO854864L - Fremstilling av en flerkopiers gjaervektor. - Google Patents
Fremstilling av en flerkopiers gjaervektor.Info
- Publication number
- NO854864L NO854864L NO854864A NO854864A NO854864L NO 854864 L NO854864 L NO 854864L NO 854864 A NO854864 A NO 854864A NO 854864 A NO854864 A NO 854864A NO 854864 L NO854864 L NO 854864L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- yeast
- plasmid
- medium
- vector
- host
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 49
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 127
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 80
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 49
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 33
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 claims description 18
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 16
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 10
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 3
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 claims 2
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 claims 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 57
- 102100037633 Centrin-3 Human genes 0.000 description 16
- 101000880522 Homo sapiens Centrin-3 Proteins 0.000 description 16
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 101150078509 ADH2 gene Proteins 0.000 description 5
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 101710084218 Master replication protein Proteins 0.000 description 3
- 101710112083 Para-Rep C1 Proteins 0.000 description 3
- 101710112078 Para-Rep C2 Proteins 0.000 description 3
- 102100022881 Rab proteins geranylgeranyltransferase component A 1 Human genes 0.000 description 3
- 102100022880 Rab proteins geranylgeranyltransferase component A 2 Human genes 0.000 description 3
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 3
- 101710119887 Trans-acting factor B Proteins 0.000 description 3
- 101710119961 Trans-acting factor C Proteins 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101000708578 Milk vetch dwarf virus (isolate N) Para-Rep C3 Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 2
- XNCSCQSQSGDGES-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]propyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)C(C)CN(CC(O)=O)CC(O)=O XNCSCQSQSGDGES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030310 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Human genes 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010033128 Glucan Endo-1,3-beta-D-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- -1 Ham Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150062179 II gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 101150085823 hsdR gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Production Of Multi-Layered Print Wiring Board (AREA)
- Metal Extraction Processes (AREA)
- Manufacturing Cores, Coils, And Magnets (AREA)
Description
Gjenstand for foreliggende oppfinnelse er en fremgangsmåte for fremstilling av rekombinante flerkopiers gjærvektorer, en fremgangsmåte for mangfoldiggjøring av disse vektorene, anvendelse av vektorene såvel som vektorene selv.
Ved den genteknologiske fremstillingen av proteiner i egnede vertsorganismer innføyes den heterologe DNA, som koder for de ønskede proteinene, vanligvis i den dobbeltstrengede DNA til en egnet kloneringsvektor, som så innføres i en egnet vertsorganisme. Re-plikas jonssystemet til vertsorganismen reproduserer så sammen med DNA-avsnittene til den opprinnelige vert de innføyede DNA-fragmentene. Forutsatt at plasmidet inneholder et egnet leseraster og promotorer, så blir ikke bare DNA kopiert, også det protein som koderes av den fremstilles. Proteinutbyttet avhenger naturligvis av effektiviteten til vertsorganismens replikasjonssystem, ikke sist, men også av den mengde fremstillbart DNA-materiale som står til disposisjon.
Mange plasmider eksisterer bare én gang pr. celle. Noen få eksisterer i mer enn én kopi pr. celle. Plasmidet ColEl eksisterer eksempelvis i 10-20 kopier pr. E. coli-kromosom. Plasmider som avledes av ColEl, lar seg mangfoldiggjøre ved tilsetning av protein-inhibitorer, betinget av dette kan det naturligvis ikke oppnås en mangfoldiggjøring av proteinet. Også ved temperatur-stigning kan mange plasmider, såkalte "runaway Plasmide", bringes til å mangfoldiggjøres.
Nå avhenger imidlertid proteinutbyttet ikke bare av antallet plasmider, men også av plasmidenes stabilitet. Ved vektorer som er egnet for gjær, er det kjent plasmider, som kan forøkes til høye kopitall, men som er ustabile. Andre er ytterst stabile, men bare til stede i lavt kopitall pr. celle.
En oppgave for foreliggende oppfinnelse bestod deri å tilveiebringe et vektorsystem som er egnet for gjær, som holder seg stabilt og lar seg anvende i tilfredsstillende kopitall.
Mange plasmider med heterolog DNA kan bare anvendes for genteknologisk fremstilling av proteiner under utvalgte betingelser, da de ikke-transformerte organismene ellers ville ta overhånd. Disse utvalgte betingelsene kan ofte bare innstilles ved anvendelse av antibiotika. Ikke bare fordyres fremstillingen ved bruk av disse midlene, men fremstillingen av de antibiotika-holdige
gjæringsvæskene byr på problemer (resistensfarer).
En annen oppgave bestod også deri, å tilveiebringe en rekombinant multi-kopiers gjærvektor som under ikke-selektive betingelser lar seg dyrke stabilt.
Disse oppgavene ble løst ved anvendelse av gjær-vert-syste-mer og elementer av gjæ£-ekspedisjons-plasmider som promotorer, centromerer og opprinnelige replikasjonselementer, som ved hjelp av genteknologiske metoder ble sammenknyttet på en egnet måte som er beskrevet i det følgende.
De litteratursteder som er sitert i den medfølgende bibliografi, belyser teknikkens stand og beskriver ytterligere detalj-er. Der det er nødvendig, siteres de ved angivelse av deres siffere.
Det finnes forskjellige arter av vektorer, som kan anvendes
for ekspresjon av heterologe gener i gjær (1). En klasse av gjær-vektorer er sammensatt av såkalte gjær-integrerende-plasmider(YIp), Som vanligvis er sammensatt av bakterielle plasmider som eksempelvis pBR 322 og fragmenter av gjær-kromosomal DNA og et seleksjon-eringsgen. Disse vektorer transformerer gjær med meget dårlig ut-bytte (1-10 transformerte celler pr. 1 g plasmid DNA). Den transformerte fenotypen oppnås ved integrasjon av Ylp-plasmidet i gjær-kromosomet (2,3).
Det er kjent at noen fragmenter fra gjær- eller andre euka-ryotiske DNA Ylp-plasmider er i stand til å reprodusere seg ekstrakromosomalt (4-8). Vektorer, som inneholder ARS-elementet (autonomously replicating sequence), ble kalt YRp (yeast replicating plasmids) eller ganske enkelt ARS-plasmider. Undersøkelser av den mitotiske stabiliteten til YRp-plasmidene har vist, at selv under selektive vekstbetingelser inneholder plasmidet bare ganske få celler (5-25 %) (4,5,7,9). Kopitallet av disse plasmidene beveget seg dog i størrelsesorden fra 20 til 50 kopier pr. celle (7,10).
Det er også kjent at nærvær av såkalte centromer-sekvenser
på en gjær-vektor ofte forbedrer dens stabilitet. Antallet av plasmid-kopier pr. celle blir imidlertid ikke forbedret ved denne centromer-funksjonen.
Den mitotiske stabiliteten til YRp-plasmidene kan nå forbed-res, idet fragmenter av gjær-DNA tilsettes, av hvilke det antas at de er de funksjonelle elementene i en centromer (CEN) (11,12).
Disse plasmidene, som kalles YCp (yeast centromere plasmid) er
til stede i 1 til 2 kopier pr. celle i ca. 80 % av de celler som har vokst under selektive betingelser (11,12).
Gjæren Saccharomyces cerevisiae inneholder et endogent DNA-plasmid, som kalles "2^-Circle". Det er mitotiskt stabilt og til stede i 20 til 50 kopier pr. celle (13). 2 p-Circle bærer sitt eget forsterkersystem som gjør det mulig for plasmidet å reprodusere seg mer enn én gang pr. cellecyklus (14,15). Mange forskjellige gjær-vektorer ble fremstilt på basis av 2 n. De fleste er mitotisk stabile opp til 60-80 % på ikkeselektivt medium med et kopitall på 20-50 pr. celle (14-16). De har også delvis mistet stabiliteten til 2 \ x.
Foreliggende oppfinnelse baserer seg på den erkjennelsen at gjær-centromer-funksjonen (CEN) kan styres ved transkripsjonen via en regulerbar gjær-promotor.
Det kunne vises at gjær-centromere DNA YRp-plasmider ikke lenger stabiliserer mitotisk, når de transkriberes av en sterk promotor (17). I foreliggende oppfinnelse ble en CEN-sekvens, fortrinnsvis en CEN3-sekvens plassert foran en regulerbar gjær-promotor, fortrinnsvis alkoholdehydrogenase-II-promotoren. Det oppnås da YCRp-plasmid-familien (yeast centromers regulated).
Ekspresjonen av gjær-alkoholdehydrogenase-II-genet (ADH2) inaktiveres i nærvær av glukose og reaktiveres i nærvær av ikke-fermenterbare karbonkilder som eksempelvis etanol (18). Det kun-
ne vises, at de 5'-flankerende sekvensene i ADH2-genet, når de på egnet måte er knyttet sammen med et annet gen, kan meddele det-, te genet glukose-inaktivering (19). Ved sammenknytning av CEN3-sekvensen foran de 5<1->flankerende regulasjonssekvensene som inneholder ADH2-promotoren (forkortet ADH2-promotor) skulle kontrollen med ekspresjonen av ADH2-CEN3-fusjonen bli mulig ved enkel utveksling av karbonkilde i mediet. Dersom den gjær som er transformert med et ADH2-CEN3-fusjonsplasmid (YCRp), dyrkes i nærvær av glukose, inaktiveres ADH2-promotoren (ADH2-AUS), og CEN3 stabiliserer YCRp-plasmid mitotisk (CEN3-AN). Ved omstilling av karbonkilden på etanol reaktiveres ADH2-promotoren
(ADH2-AN) og blokkerer ved ekspresjonen gjennom hele CEN3-regionen (CEN3-AUS). Resultat: YCRp-plasmidene er ikke lenger stabile. I dette stadium skulle YCRp-plasmidene i gjærcellene kunne forøkes til det ønskede kopitall. Etter foirøkningen kan disse
YCRp-plasmidene ved enkel omstilling av mediet fra etanol til glukose stabiliseres ved hjelp av den nå igjen funksjonelle CEN3-sekvensen.
Oppfinnelsen innskrenker seg ikke bare til CEN3-sekvensen som stabiliserende og til ADH2-genet som regulerbart element. Andre stabiliserende elementer som eksempelvis CEN6 og CEN11 er likeledes også mulige, når de på egnet måte er fusjonert med strengt regulerbare gjær-promotorer. Avhengig av promotoren kan da reguleringen oppnås ved hjelp av et antall tenkbare faktorer. Eksempelvis skal nevnes: valg av karbonkilde, varmesjokk, oksy-gen, Ham, fosfater osv.
Tegningene skal forklare oppfinnelsen nærmere.
Figur 1 viser skjematisk restriksjons- og de genetiske kart for pBC3Tl og ADH2 BS-plasmider. Dessuten vises fremstillingen av YCRp2-plasmidet. Figur 2 viser skjematisk restriksjons- og det genetiske kar-tet for JDB207-plasmidet. Dessuten vises fremstillingen av YCHp3- og YCRp4-plasmider. Figur 3 viser et forsøk på bestemmelse av kopitallet av YCRp-plasmider.
I tabell 1 er stabilitets- og kopitalldata for YCRp2-plasmidet i gjærstamme SHU 32 oppført.
I tabell 2 er stabilitets- og kopitalldata for YCRp3-plasmidet i gjærstamme SHU 32 oppført.
Alle anvendte DNA-restriksjons- og metabolisme-enzymer stam-mér fra New England Biolabs og fra Bethesda Research Laboratories. Enzymene ble anvendt under betingelser og i buffere, som ble an-gitt av produsentene. ATP og deoksynukleotid-trifosfåtene stam-met fra SIGMA; DNA-linkerne fra New England Biolabs.
Rensingen av kovalent lukket sirkulær plasmid DNA fra E.coli og transformasjonen av E.coli ble gjennomført ifølge allerede beskrevne fremgangsmåter (20,21).
"E.coli-miniscreens" ble anvendt som beskrevet (22). Også transformasjonen av gjær ble gjennomført i prinsipp ifølge allerede kjente metoder (2), dog med følgende modifikasjoner: 200 ml celler med et innhold av 2x10 7 celler/ml ble renset ved vasking med 25 ml H,,0 ved sentrif ugering. Cellene ble nehand-let med 10 ml. 1 M sorbitol, 25 mM EDTA (pH-verdi 8) og 50 mM di-
tiotreitol-løsning i 10 minutter ved 30°C og deretter vasket med 10 ml 1 M sorbitol. De pelleterte cellene ble deretter forsiktig resuspendert i 10 ml SCE (1 M sorbitol, 0,1 M natriumcit-rat pH 5,8 og 0,01 MEDTA) og behandlet ved 30°C med 1 mg zymo-lase 5000 (Kirin Brauerei). 80-prosentig "sfære-plasting" fore-gikk ved tilsetning av 100 ul av suspensjonen til 0,9 ml av en 10-prosentig SDS-løsning. Måling ble utført ved AbSg0Qunder anvendelse av en celleløsing før tilsetning av enzymet som 0 pro-sent utligning (lysen i den 10-prosentige SDS førte til en ned-gang i Abs800).
Deretter ble cellene vasket 3 ganger med 10 ml 1 M sorbitol, én gang med 1 M sorbitol, 10 mM CaCl2og 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) og deretter resuspendert i 1 ml av den samme løsningen. 5-15 ug av den rensede plasmidiske DNA ble så tilsatt og forsiktig blan-det med 100 ul av de resuspenderte celler i 15 minutter. 1 ml av en løsning, som inneholdt 20 % (vekt/volum) polyetylenglykol 4000 (Merck), 10 mM CaCl2og 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), ble tilsatt under forsiktig blanding i løpet av 15 minutter. Cellene ble så avsentrifugert og inkubert i 200 [ il SOS [(1 M sorbitol, 33,5 %
(v/v YEPD-kraft og 6,5 mM. CaCl2)] i 20 minutter ved 30°C.
100 ul av denne suspensjonen ble deretter påført på en Petri-skål, som inneholdt 20 ml "Bottom-Agar" (182 g sorbitol, 20 g glukose, 0,7 g YNB og 30 g Difco agar pr. 1 liter H20) og med 10 ml 50°C "Top-Agar" (samme sammensetning som "Bottom-Agar", men ble i tillegg tilsatt 1 ml adenin (1,2 mg/ml), 1 ml uracil
(2,4 mg/ml) og 1 ml av en "-trp drop-out mix" pr. 50 ml "Bottom-Agar" ("-trp drop-out mix" inneholdt følgende aminosyrer pr. 100 ml H_0: 0,2 g arg, 0,1 g his, 0,6 g ile, 0,6 g leu, 0,4 g lys,
z+
0,1 g met, 0,6 g phe og 0,5 g thr). Denne "Trp"-seleksjon gav 10 3 gjær-transformanter pr. ug plasmid-DNA.
Stabiliteten til plasmider i gjær ble overprøvet, ved at celler ble fortynnet etter selektiv eller ikke-selektiv vekst i vann og plattert på YPD-plater (ikke-selektiv). Etter 30 timers vekst ved 28°C ble disse platene replika-plattert på YNB+CAA-plater (TRP<+>eller LEU<+->seleksjon). Den prosentuelle plasmidstabi-liteten ble beregnet ved divisjon av antall kolonier, som var vokst selektivt med antall kolonier som var vokst ikke-selektivt, multiplisert med 100.
Bestemmelsen av kopitall av plasmider ble bestemt ved
Southern-analyse (23). Den totale DNA i SHU 32 (YCRp)-transformantene som var vokst i selektivt medium, ble fordøyet med EcoRI-restriksjonsendonuklease og elektroforese-fraksjonert med agarosegel. Etter overføring til nitrocellulose-filter ble DNA hybridisert med radioaktivt markert YIp5-plasmid DNA ved hjelp av Nick-translasjon (YIp5 er pBR322, som inneholder gjær URA3-genet (3)). Etter eksponering på røntgenfilm ble det oppdaget minst to bånd: ett viste den enkelte URA3-kromosomale kopi, den andre er YCRp-plasmidfragmenter. Som ytterligere kontroller tjen-te en DNA-prøve av en SHU 32 som er transformert med YCp-plasmidet, derved ble en direkte sammenligning mellom kopitallene til YCp og YCRp-centromere plasmider mulig. Ved noen forsøk ble det utviklet seriefortynninger av den fullstendige gjær-DNA på gelen, slik at det ble mulig å oppnå en direkte sammenligning mellom in-tensiteten av YCRp-båndene og kontrollplasmidbåndene, av hvilke det er kjent at det bare foreligger i 1-2 kopier pr. celle.
For transformasjonen av bakterier ble E.coli-stammen RRl anvendt (F , pro , leu , thi , lacy, rpsh, hsdR, hsd M) (21). Gjæren Saccharomyces cerevisiae stamme SHU 32 (leu2, trpl, ura3, vennlig stilt til disposisjon av Dr. A. Hartig, Wien Universitet) ble anvendt for gjær-transformasjonene. Ved siden av denne kan naturligvis andre gjærstammer anvendes.
Det anvendte LB-medium var som beskrevet av Miller (27),
dog under tilsetning av 30 ug/ml ampicillin (SERVA) hvoretter mediet ble autoklavert og avkjølt. Gjæren ble dyrket på følgende medier: YP (1 % gjærekstrakt, 2 % pepton og en karbonkilde som enten er 5 % glukose eller 3 % etanol), YNB+CAA (0,67 % gjær-nitrogen-base w/o aminosyrer (Difco), 0,5 % Difco kasaminosyrer (CAA) og en karbonkilde som enten er 5 % glukose eller 3 % etanol) . For TRP<+->seleksjonering ble YNB+CAA-mediet supplert med "-trp drop-out"-løsning (1 ml av en 50x løsning pr. 50 ml medium). For LEU<+->seleksjon ble det på samme måte tilsatt en "-leu drop-out "-løsning. Gjærmediet ble gjort fast ved tilsetning av 2,5 % Difco-agar.
Figur 1 viser to plasmider: pBC3Tl og ADH2BS. Henvisninger for fremstilling av disse plasmidene er offentliggjort (19,28). Plasmidet pBC3Tl inneholder en del av pBR322 (19) med ampicillin-resistens-genet (Ap R) og ColEl-replikasjonsopprinnelsen (ORI) for seleksjonering og stabil vekst i E.coli. Dessuten inneholder det
TRPl-genet på et EcoRI/EcoRI 1,4 5 kb-fragment, som stammer
fra gjær-kromosom III (30). Dette genet muliqgjør seleksjonering på trpl -gjærstammer og kan derfor benyttes, til å isolere gjær-kloner, som inneholder dette plasmidet. På det samme DNA-fragmentet befinner seg ARSl-fragmentet (autonomously replicating sequence). ARSl-elementet tillater at DNA kan reproduseres autonomt i gjær og å hevde seg som plasmid (30). pBC3Tl-plasmidet inneholder dessuten CEN3-sekvensen på et 2,0 kb Hindlll/ BamHI-fragment, som stammer fra gjær-kromosom III (31). Plasmider som inneholder CEN3-sekvensen, er mitotisk stabile og til stede i 1 til 2 kopier pr. celle.
Plasmidet ADH2BS er pBR322 med et i BamRI-snittstillingen klonert 2,0 kb BamHI/Sau3A-fragment fra gjær-kromatosomalt DNA, som inneholder ADH2-genet (28). Herved regenereres BamHI-restrik-sjonsstedet ved tilknytning mellom de "sticky" endene til BamHI og Sau3A, slik at ADH2-genet kan snittes ut ved snitt med BamHI fra ADH2S-plasmidet.
Fra den publiserte DNA-sekvensen for ADH2-genet og de 5'-flankerende regionene er kjent et gunstig EcoRV-restriksjonssted i stilling +67 (hvorved +1 er en A i ATG-codonet). Dette EcoRV-snittsted sammen med BamHI-snittstedet i stilling -102 7 "up-stream" ble anvendt, for å isolere ADH2-promotoren med alle sine 5<1->flankerende reguleringssekvenser.
Typisk ble 5 ug av ADH2BS-plasmid DNA fullstendig fordøyet medEcoRV (figur 1), renset ved fenolekstraksjon og etanolfelling, tilknyttet "blunt-end" med 2 ug fosforylert Bglll-linker (5'-CAGATCTG 3) (Biolabs) og pånytt snittet med BamHI og Bglll. Etter preparativ agarosegel-elektroforese ble det isolert et
1300 bp-fragment. Dette fragment inneholder den fullstendige ADH2-promotoren med alle reguleringssekvenser og et lite stykke av den ADH2-kodende regionen (kodende for de første 22 amino-syrene) .
5 (ag av pBC3Tl-plasmid DNA ble fullstendig fordøyet med BamHI-endonuklease, renset ved fenolekstraksjon og etanolfelling, og defosforylert med fosfatase (CIP) fra kalve-innvoller ifølge kjente fremgangsmåter (33) . Etter fornyet fenolekstraksjon og etanolfelling ble 100 ng BamHI snittet og defosforylert pBC3Tl - plasmid DNA forbundet med 200 ng av 1,3 kb-fragmentet BamHI/ Bglll fra ADH2-promotoren, eksempelvis med T4DNA-ligase. Kompe- tente RRl-celler ble derpå transformert med 1/5 av denne blandingen. Ampicillin-resistente kolonier ble overprøvet med kolo-nihybridisering, idet et 1,3 kb, med Nick-translasjon radioaktivt markert BamHI/Bglll ADH2-promotorfragment ble anvendt som prøve. Av 12 kolonier som viste seg positive, ble plasmid DNA
utvunnet og fordøyet med forskjellige restriksjonsendonukleaser, for å identifisere de kloner som oppviser en ADH2-innføring i en orientering som muliggjør en transkripsjon av ADH2-promotoren med CEN3-sekvensen. Denne klon ble isolert og plasmidet ble kalt YCRp2. Dette plasmidets restriksjonskart er vist i figur 1.
For bestemmelse av kopitallet og stabiliteten til plasmidet i gjær ble gjærstammen SHU 32 (trpl , leu2 , ura3 ) transformert med YCRp2-plasmid DNA. TRP-transformantene ble isolert og over-prøvet på stabilitet og kopitall. Dataene er oppført i tabell 1.
YCRp2-plasmidstabiliteten ble påvist, etter at transformantene hadde vokset på forskjellige karbonkilder. Dersom YCRp2-transformantene bare var dyrket på glukose-medium, beveget stabiliteten til plasmidet seg i området for andre YCp-plasmider (ca. 80 %). Kopitallet var lite (1-2 kopier pr. celle, sml. eksempel 1 og 3 i tabell 1; spalte 1 og 2 i figur 3). Dette var å vente da glukose inaktiverer ADH2-promotoren (ADH2-AUS) og lar CEN3-sekvensen arbeide normalt (CEN3-AN).
Dersom imidlertid YCRp2-transformantene ble dyrket på eta-nolholdig medium, sank stabiliteten til plasmidet ekstremt (til ca. 36 %). Antallet kopier steg imidlertid til 5-10 kopier pr. celle. YCp-plasmider var under de samme betingelser meget stabile som før og til stede i lavt kopitall (eksempel 2 og 4 i tabell 1). Dette viser hvordan transkripsjonen av den nu igjen reaktiverte ADH2-promotoren (ADH2-AN) blokkerer CEN3-sekvensen (CEN3-AUS). Som resultat forholder YCRp2-plasmidet seg nu som et YRp-plasmid: meget ustabilt, men med høyt kopitall.
Overraskende ble stabiliteten til YCRp2-plasmidet til og med høyere enn tidligere, når mediet igjen ble omstilt til glukose. Stabiliteten på dette mediet lå på ca. 95 % og kopitallet ble konstant med 5-10 kopier pr. celle (sml. eksempel 5 i tabell 1, spalte 3 i figur 3). Glukose inaktiverer altså igjen ADH2-promotoren (ADH2-AUS) og reaktiverer CEN3-funksjonen (CEN3-AN). Gjær selv kunne imidlertid under dyrkning på etanol ikke mer akkumulere kopier av YCRp2-plasmidet. Selv etter 50 generasjoner på YNB+CAA-etanolmedium oversteg kopitallet aldri mer enn 8-12 kopier pr. celle (sammenlign eksempel 6 i tabell 1, spalte 4 i figur 3).
Fremstilling av YCRp3 og YCR-plasmidene.
Fremstillingen av YCRp3- og -4-plasmidene vises skjematisk i figur 2. Henvisning til kloneringsvektoren pJDB207 er allerede publisert (16). pJDB207 inneholder et bakterielt pATl53-plasmid (34) med ampicillin-(Ap )- og tetracyclin-resistensgenene (Tet ) og ColEl-replikasjonsopprinnelsen (ORI) for seleksjon og stabil vekst i E.coli. Plasmidet inneholder dessuten et 2,7 kb EcoRI/EcoRI-fragment av 2 n DNA. På dette fragmentet er såvel
de 2 m opprinnelige replikasjonsstedene lokalisert (13), noe som gjør vektoren i stand til å reprodusere seg ekstrakromosomalt i gjær og manifistere seg, som også REP3-stedet i 2 n DNA. Dette stedet er et viktig element i 2 n-forøkningssystemet og må fore-ligge cis, for å gjøre plasmidet i stand til forøkning. Andre nødvendige elementer som REPl og REP2 innstyres med "Wildtypen"-kopier av 2 m DNA i trans-orientering (14, 15). Seleksjonsmar-møren LEU2, som stammer fra gjærkromosom III (3), ble etter noen modifikasjoner klonet i Pst I-snittstedet i det omtalte 2 n DNA-fragmentet. Dette LEU-2-d-gen muliggjør seleksjonering på leu2 - gjærmutanter og utfyller bare leu2 -mutasjonen når de foreligger i en "flerkopiers vektor" (16).
For fremstilling av YCRp3 og 4-plasmidene ble 5ug av
YCRp2 DNA fordøyet med Bglll og BamHI-restriksjonsendonuklease. Etter preparativ agarosegel-elektroforese ble det isolert et 4,2 kb-fragment Bglll/BamHI. Dette fragmentet inneholder gjær-TRPl-genet og ADH2-CEN3-fusjonen. 5 ug av pJDB207-plasmidisk DNA ble fullstendig fordøyet med BamHI og renset med fenolekstraksjon og etanol-felling og defosforylert med fosfatase fra kalveinnvoller som beskrevet (33). 100 ng av denne således oppnådde pJDB207-plasmid DNA ble deretter legert med 200 ng av 4,2 kb Bglll/BamHI YCRp2-fragmentet. E.coli RRl-celler ble transformert med 1/5 av denne blandingen og Ap -kolonier isolert. Samtlige kolonier ble overprøvet ved koloni-hybridisering under anvendelse av et Nick-translatert 4,2 kb-fragment av YCRp2 som prøve. Av de koloniene som viste seg positive, ble plasmid DNA isolert og det ble opp-stilt et restriksjonskart av.dette plasmidet. Da Bglll/BamHI-fragmentet lar seg klone i to forskjellige orienteringer i
BamHI-snittstedet i pJDB207, oppstår to plasmider: YCRp3 og
YCRp4 (figur 2).
Kopitall og stabilitet for YCRp3-plasmidet.
Det kunne fastslås at orienteringen av den klonede ADH2-CEN3-fusjonen ikke hadde noen innflytelse på stabiliteten eller kopitallet til YCRp-plasmidet i gjær. Samtlige resultater ble oppnådd med YCRp3-plasmidet, men YCRp4-plasmidet forholder seg på lignende måte.
Det skal anmerkes at YCRp3-plasmidet nå inneholder to gjær-markeringsgener: LEU2-d og TRP1. TRPl-genet komplementerer en trpl -mutasjon i gjær selv når det inneholdes i bare én kopi pr. celle, LEU-d-genet komplementerer en leu2 -mutasjon bare når det befinner seg på et "flerkopiers plasmid" (50-100 kopier pr. celle). Dette systemet gjør det mulig å overprøve kopitallet ved enkel på-føring på et selektivt medium. Alle LEU<+->celler må minst innehol-de 50 plasmidkopier pr. celle, mens TRP<+->celler minst inneholder én kopi av plasmidet. Dessuten kan det nevnes at SHU32-stammen er cir<+>, dvs. den bærer "Wild-Typ" 2 \ x DNA, hvilket forsørger YCRp3-vektoren med to ytterligere komponenter av 2 \ x forøknings-systemet: REP1 og REP2. Det full-aktive 2 [ x- forøkningssystemet krever fire steder: REP1 og REP2 i trans og REP3 og ORI i cis.
Gjærstammen SHU 32 (cir<+>, trpl , leu2 , ura3~) ble transformert med YCRp3-plasmid DNA, TRP<+->transformanter ble isolert og overprøvet på leu og ura . Alle transformanter som ble testet, var leu og ura og viste at YCRp3-plasmidet forelå i lite kopitall. Dette resultat var ikke overraskende, da bare glukose ble anvendt som karbonkilde. CEN3 skulle også være helt funksjons-dyktig. Det er bemerkelsesverdig at CEN3-funksjonen overvinner 2 M-forøkningssystemet og stabiliserer kopitallet til plasmidene på 1-2 pr. celle (eksempel 2 i tabell 2, spalte 8 i figur 3). Stabiliteten til YCRp3 i gjærstamme SHU 32 ved vekst på glukose
er likeledes karakteristisk for et YCp-plasmid (ca. 80 %).
Dersom imidlertid den med YCRp3-transformerte SHU 32 ble dyrket på selektivt -leu etanolmedium, sank stabiliteten til plasmidene, hvilket ble målt ved antallet av leu<+->kolonier, til ca.
65 %. Det antas at CEN3-sekvensen transkriberes i nærvær av etanol av den reaktiverte ADH2-promotoren, hvorved som resultat CEN3-funksjonen blokkeres. Med seleksjonen på LEU<+>og ikke-funksjonelle centromerer overtar 2 n~forøkningssystemet kontrollen og forøker YCRp3 til høyere kopitall. SHU 32-transformanter ble LEU<+>og stabiliteten til YCRp3-plasmidene er under disse betingelsene karakteristisk for et 2 n chimært plasmid (sml. eksempel 1 og 4 i tabell 2). Denne forventning ble bekreftet, etter at SHU 32-transformantene deretter ble dyrket til vekst på etanol
på glukose, og kopitallene til plasmidene ble bestemt. Fra de data som er oppført i figur 3, spalte 9-11, er det klart at kopitallene til YCRp3 tilnærmet nådde 100 pr. celle. Dessuten var plasmidet meget stabilt, til mer enn 90 %, hvilket lot seg påvi-se ved antallet av leu<+->kolonier.
Fremstillingen av plasmider med centromert regulerte funk-sjoner, slik det kunne vises for YCRp-plasmidene, er av stor nytte for mangfoldiggjøringen av såvel heterolog DNA som også for ekspresjonen av heterologe proteiner i gjær.
Dersom det eksempelvis i en flerkopiers gjærvektor ifølge oppfinnelsen på egnet måte innføres en heterolog DNA, så lar den seg ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, ved forandring av de faktorer som påvirker den regulerbare promotoren, f. eks. i tilfelle av ADH2-promotoren forandring av karbonkilden,
med vektoren mangfoldiggjøre til den ønskede konsentrasjon.
Av ennu større nytte er vektorene ifølge oppfinnelsen, når heterolog DNA med et egnet ekspresjonssystem for ekspresjonen av heterologe proteiner i korrekt orientering innbygges i vektorene.
Effektiviteten til en fermentasjonsprosess avhenger avgjør-ende av arten av det eksprimerte proteinet. Dersom det eksempelvis eksprimeres et protein, som er toksisk for vertsorganismen fra en bestemt konsentrasjon, så kan hele fermentasjonsprosessen bli ineffektiv når proteinmengden ikke kan styres direkte eller indirekte.
Ved hjelp av vektorene ifølge oppfinnelsen er man i stand
til å stabilisere kopitallet til ekspresjonsplasmidene bare ved å forandre de faktorer som innvirker på den regulerbare promotoren, for eksempel ved forandring av karbonkilden og innstille den på
en lavere, midlere eller en høyere verdi og på det aktuelle nivå. Ved hjelp av disse vektorene blir det til og med mulig å oppnå et produkt som er toksisk for vertssystemet, ved at kopitallet til ekspresjonsvektorene ved en fermentasjonssats holdes lav i flere generasjoner og de enkelte plasmidene holdes stabile. Dersom det da dannes tilstrekkelig cellemateriale, blir promotoren "omsjaltet"
eksempelvis ved å forandre karbonkilden, og antallet kopier av ekspresjonsplasmidene økes drastisk. Samtidig med dette produ-seres detønskede proteinet i mangedobbelt konsentrasjon. Proteinets toksisitet er ikke viktig på dette tidspunkt.
Vektorene ifølge oppfinnelsen gjør det overraskende mulig å velge ikke-selektive dyrkningsbetingelser. Dette er en betyde-lig fordel fremfor alt med henblikk på anvendelsen for fremstilling av proteiner på genteknologisk måte.
I den "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM)", Grisebachstrasse 8, D-3400 Gottingen ble det 28. desember 1984 deponert:
a) E. coli-stammen RRl (henvisningstegn RRI) med nummer
DSM 3178,
b) Saccharomyces cerevisiae-stammen SHU 32 (henvisningstegn SHU 32) under nummer DSM 3182, c) plasmidet: pBC3Tl transformert i E.coli RRl (henvisningstegn pBC3Tl) under nummer DSM 3180, d) plasmidet: pADH2Bs transformert iE.coli RRl (henvisningstegn pADH2Bs) under nummeret DSM 3179 og e) plasmidet: pJDB207 transformert i E.coli RRl (henvisningstegn pJDB207) under nummeret DSM 3181.
BIBLIOGRAFI
1. N. Gunge, (1983) Ann. Rev. Microbiol ._3_7 2532-2576
2. A. H. Hinnen et al. (1978) Proe .Nagl .Acad. Sei .USA 75./ 1929-1933. 3. K. Struhl et al. (1979) Proe .Nati .Acad. Sei .USA 76., 1015-1039
4. D.T. Stinchcomb et al. (1979) Nature 282, 39-43
5. C.L. Hsiao og J. Carbon, (1979) Proe.Nati.Acad.Sei.USA
76, 3829-3833.
6. C.S.M. Chan og B.K. Tye, (1980) Proe.Nati.Acad.Sei.USA 77
6329-6333. 7. B.D. Hyman et al. (1982) Proe .Nati .Acad. Sei. USA 7j), 1579-1582
8. V.A.Zakian (1981) Proe .Nati. Acad. Sei .USA 78., 3128-3132
9. M. Fitzgerald-Hayes et al. (1982) Cell 29, 235-244
10. V.A. Zakian og Kupfer
11. L. Clarke og J. Carbon, (1980) Nature 287, 504-509
12. D.T. Stinchcomb et al. (1982) J.Moi.Biol. 158,157-179
13. J.R. Broach (1981) i Molecular Biology of Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, J. Strathern,
E. Jones og J.R.Broach, eds. (Cold Spring Harbor, New York:
Cold Spring Harbor Laboratory), s. 445-470.
14. M. Jayaram et al. (1983) Cell 3±, 95-104.
15. Y. Kikuchi (1983) Cell 35., 487-493. 16. J. Beggs (1978) Nature 275, 104-109 17. L. Panzeri et al. (1983) i Abstracts of Papers presented at The Meeting the Molecular Biology of Yeast; Cold Spring
Harbor Laboratory, s.69.
18. T. Young et al (1982) i Genetic Engineering of Micro-organismes for Chemicals, A. Hollaender, R.D. DeMoss, S.
Kaplan, J Konisky, D. Savage og R.S. Wolfe, utg. (Plenum
Publishing Corporation) s.335-361
19. D.R. Beier og T. Young (1982) Nature 300, 724-728
20. L. Clarke og J. Carbon (1976) Cell 9, 91-99
21. S.L. Peacock et al (1981) Bioch. Biophys. Acta 655, 243-250 22. H.C.Birnboim og J. Doly (1979) Nucleic Acids Res. 1_,
1513-1523
23. E. Southern (1975) J.Moi.Biol. 98^, 503-517
24. A. Sledziewski og T. Young (1982) Proe.Nati.Acad.Sei.USA
99, 253-256
25. D.L.Montgomery et al (1978) Cell 14, 673-680
26. R.B. Wallace et al (1981) Nucl.Acids Res. 9_, 879-894
27. J.H.Miller (1972) i Experiments in Molecular Genetics,
s.431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, New York
28. V.M. Williamson et al (1981) Cell 2_3 605-614
29. F. Bolivar et al (1977) Gene 2 95-113
30. G. Tschumper og J. Carbon (1980) Gene 10, 157-166
31. A.C.Chinault og J. Carbon (1979) Gene 5, 111-126
32. D.W. Russel et al (1983) J.Biol.Chem. 258, 2674-2682
33. G. Chaconas og J.H. van de Sande (1980) Methods Enzymol.
65, 75-79
34. A. Twigg og D. Sherratt (1980) Nature 283, 216-218.
Claims (15)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av en rekombinant, stabil flerkopiers gjærvektor, karakterisert ved at det i en vektor, som oppviser en stabiliserende funksjon, fortrinnsvis en gjær-centromer, spesielt gjær-centromer 3, innføres en regulerbar promotor, fortrinnsvis alkoholdehydrogenase-II-promotoren, slik at den stabiliserende funksjonen kan styres ved hjelp av denne.
2. Fremgangsmåte for fremstilling av en rekombinant, stabil flerkopiers gjærvektor, karakterisert ved at det i en vektor ifølge krav 1 innføyes et forøkningssystem, fortrinnsvis det til 2 M-Circle-plasmidet, spesielt forøkningssystemet fra plasmidet pJDB207.
3. Fremgangsmåte for fremstilling av en vektor ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at gjær-centromer 3 stammer fra plasmidet pBC3Tl.
4. Fremgangsmåte for fremstilling av en vektor ifølge et av de foregående kravene, karakterisert ved at den regulerbare promotoren ADH2 stammer fra plasmidet pADH2BS.
5. Fremgangsmåte for fremstilling av en rekombinant, stabil flerkopiers gjærvektor, karakterisert ved at a) plasmidet pBC3Tl snittes med BamHI, den oppnådde, lineære DNA renses og defosforyleres,
b) plasmidet ADH2BS snittes med EcoRV, den oppnådde, lineære DNA renses og tilknyttes med en fosforylert Bglll-linker, det således oppnådde fragment snittes med BamHI og Bglll og renses deretter og
c) fragmentene fra fremgangsmåtetrinnene a) og b) tilknyttes med en DNA-ligase.
6. Fremgangsmåte for fremstilling av en rekombinant, stabil flerkopiers gjærvektor, karakterisert ved at a) plasmidet YCRp2 snittes med Bglll og BamHI, og 4,2 kb-fragmentet renses,
b) plasmidet pJDB207 snittes med BamHI, den oppnådde, lineære DNA renses og defosforyleres og
c) fragmentene fra fremgangsmåtetrinnene a) og b) tilknyttes med en DNA-ligase.
7.R ekombinant, stabil flerkopiers gjærvektor, karakterisert ved at den inneholder en stabiliserende funksjon, fortrinnsvis en gjær-centromer, spesielt gjær-centromer 3 og en regulerbar promotor, fortrinnsvis alkoholdehydrogenase-II-promotoren, ved hvilken den stabiliserende funksjonen kan styres.
8.R ekombinant- stabil fler-kopiers gjærvektor, karakterisert ved at det i en vektor ifølge krav 7 er innføyet et forøkningssystem, fortrinnsvis det til 2 n-Circle-plasmidet, spesielt forøkningssystemet fra plasmidet pJDB207.
9. Rekombinant, stabil gjærvektor ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at gjær-centromer 3 stammer fra plasmidet pBC3Tl.
10.R ekombinant, stabil gjærvektor ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at den regulerbare promotoren ADH2 stammer fra plasmidet pADH2BS.
11.R ekombinant, stabil fler-kopiers gjærvektor YCRp2,
YCRp3 eller YCRp4.
12. Anvendelse av en gjærvektor ifølge et av kravene 7 til 11 for mangfoldiggjørelse av en heterolog DNA, som koder for et ønsket heterologt protein ved at
a) en heterolog DNA, som koder for et ønsket protein, på egnet måte innføres i en vektor ifølge et av kravene 7 til 11,
b) vektoren transformeres i en egnet gjær-vertsorganisme, som inneholder "wild-type"-kopier av 2 n-Circle-plasmidet,
c) verten dyrkes først på et medium, som inaktiverer den regulerbare promotoren, fortrinnsvis i et medium, som inneholder glukose,
d) deretter dyrkes verten på et medium, som reaktiverer den regulerbare promotoren, fortrinnsvis i et medium, som inneholder etanol,
e) deretter overføres verten på nytt til det medium som inaktiverer den regulerbare promotoren og dyrkes,
f) vektorene fra cellene isoleres og renses på vanlig måte, og
g) den heterologe DNA isoleres og renses på vanlig måte fra vektorene.
13. Anvendelse av en gjærvektor ifølge et av kravene 7 til 11 hvor fremgangsmåtetrinn e) i krav 12 bortfaller.
14. Anvendelse av en gjærvektor ifølge et av kravene 7 til 11 for ekspresjon av et heterologt protein ved at
a) en heterolog DNA, som koder for det ønskede proteinet, med et ekspresjonssystem i korrekt orientering innfø res i en vektor ifølge et av kravene 7 til 11,
b) vektoren transformeres i en egnet gjær-vertsorganisme, som inneholder "wild-type"-kopier av 2 p-Circle-plasmidet,
c) verten dyrkes først på et medium, som inaktiverer den regulerbare promotoren, fortrinnsvis i et medium som inneholder glukose,
d) deretter dyrkes verten på et medium, som reaktiverer den regulerbare promotoren, fortrinnsvis i et medium som inneholder etanol,
e) deretter overføres verten på nytt til det medium som inaktiverer den regulerbare promotoren og dyrkes, og
f) det ønskede proteinet isoleres og renses på vanlig måte.
15. Fremgangsmåte for mangfoldiggjørelse av vektoren ifølge et av kravene 7 til 11, karakterisert ved at
a) vektoren transformeres i en egnet gjær-vertsorganisme, som inneholder "Wild-type"-kopier av 2 p-Circle-plasmidet,
b) verten dyrkes først på et medium, som inaktiverer den regulerbare promotoren, fortrinnsvis i et medium som inneholder glukose,
c) deretter dyrkes verten på et medium, som reaktiverer den regulerbare promotoren, fortrinnsvis i et medium som inneholder etanol og
d) deretter overfø res verten på nytt til det medium som inaktiverer den regulerbare promotoren og dyrkes.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19843444495 DE3444495A1 (de) | 1984-12-04 | 1984-12-04 | Herstellung eines multi-kopien-hefe-vektors |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO854864L true NO854864L (no) | 1986-06-05 |
Family
ID=6252051
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO854864A NO854864L (no) | 1984-12-04 | 1985-12-03 | Fremstilling av en flerkopiers gjaervektor. |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0184163A3 (no) |
| JP (1) | JPS61181385A (no) |
| AU (1) | AU5070685A (no) |
| DE (1) | DE3444495A1 (no) |
| DK (1) | DK559585A (no) |
| ES (3) | ES8800342A1 (no) |
| FI (1) | FI854781L (no) |
| GR (1) | GR852891B (no) |
| HU (1) | HU196454B (no) |
| NO (1) | NO854864L (no) |
| NZ (1) | NZ214422A (no) |
| PT (1) | PT81594B (no) |
| SU (1) | SU1364241A3 (no) |
| YU (1) | YU186985A (no) |
| ZA (1) | ZA859240B (no) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3605035A1 (de) * | 1986-02-18 | 1987-08-20 | Strahlen Umweltforsch Gmbh | Plasmid pws101, verfahren zu seiner gewinnung und seine verwendung |
| DE4420785A1 (de) * | 1994-03-25 | 1995-10-05 | Basf Ag | Riboflavin-Biosynthese in Pilzen |
| WO2016088824A1 (ja) * | 2014-12-03 | 2016-06-09 | 株式会社カネカ | セントロメアｄｎａ配列を含むベクター及びその用途 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL63035A (en) * | 1980-09-09 | 1985-05-31 | Univ California | Dnas capable of replication and stable mitotic maintenance in a host eukaryote,their preparation and eukaryotic cells comprising them |
-
1984
- 1984-12-04 DE DE19843444495 patent/DE3444495A1/de not_active Withdrawn
-
1985
- 1985-11-30 EP EP85115203A patent/EP0184163A3/de not_active Withdrawn
- 1985-12-02 YU YU01869/85A patent/YU186985A/xx unknown
- 1985-12-02 GR GR852891A patent/GR852891B/el unknown
- 1985-12-03 DK DK559585A patent/DK559585A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-12-03 PT PT81594A patent/PT81594B/pt unknown
- 1985-12-03 SU SU853991833A patent/SU1364241A3/ru active
- 1985-12-03 NZ NZ214422A patent/NZ214422A/en unknown
- 1985-12-03 NO NO854864A patent/NO854864L/no unknown
- 1985-12-03 HU HU854619A patent/HU196454B/hu not_active IP Right Cessation
- 1985-12-03 ES ES549526A patent/ES8800342A1/es not_active Expired
- 1985-12-03 FI FI854781A patent/FI854781L/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-12-03 AU AU50706/85A patent/AU5070685A/en not_active Abandoned
- 1985-12-03 ZA ZA859240A patent/ZA859240B/xx unknown
- 1985-12-04 JP JP60273181A patent/JPS61181385A/ja active Pending
-
1986
- 1986-07-23 ES ES556975A patent/ES8802075A1/es not_active Expired
- 1986-07-23 ES ES556976A patent/ES8801705A1/es not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA859240B (en) | 1987-08-26 |
| DK559585D0 (da) | 1985-12-03 |
| DK559585A (da) | 1986-06-05 |
| FI854781A0 (fi) | 1985-12-03 |
| FI854781A7 (fi) | 1986-06-05 |
| EP0184163A3 (de) | 1988-01-13 |
| NZ214422A (en) | 1988-02-12 |
| AU5070685A (en) | 1986-06-12 |
| PT81594B (de) | 1987-10-16 |
| FI854781L (fi) | 1986-06-05 |
| HUT39775A (en) | 1986-10-29 |
| DE3444495A1 (de) | 1986-06-05 |
| PT81594A (de) | 1986-01-01 |
| ES8800342A1 (es) | 1987-11-01 |
| ES8801705A1 (es) | 1988-02-16 |
| JPS61181385A (ja) | 1986-08-14 |
| ES556976A0 (es) | 1988-02-16 |
| ES549526A0 (es) | 1987-11-01 |
| ES556975A0 (es) | 1988-03-16 |
| EP0184163A2 (de) | 1986-06-11 |
| SU1364241A3 (ru) | 1987-12-30 |
| GR852891B (no) | 1986-04-03 |
| HU196454B (en) | 1988-11-28 |
| YU186985A (en) | 1988-06-30 |
| ES8802075A1 (es) | 1988-03-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Vernet et al. | A family of yeast expression vectors containing the phage f1 intergenic region1 | |
| CA1205026A (en) | Expression of polypeptides in yeast | |
| EP0286424B1 (en) | Yeast vector | |
| Hsiao et al. | High-frequency transformation of yeast by plasmids containing the cloned yeast ARG4 gene | |
| Johnstone et al. | Cloning an Aspergillus nidulans developmental gene by transformation. | |
| Broach et al. | Transformation in yeast: development of a hybrid cloning vector and isolation of the CAN1 gene | |
| KR0181179B1 (ko) | 피치아 파스토리스 산성 인산효소 유전자의 디앤에이 단편 및 이를 사용하는 방법 | |
| DE3587759T2 (de) | Erhöhte Hefetranskription unter Verwendung einer Hybridkonstruktion der Promotorregion. | |
| US5593858A (en) | Highly stable recombinant yeasts for the production of recombinant proteins | |
| Casey et al. | A convenient dominant selection marker for gene transfer in industrial strains of Saccharomyces yeast: SMRI encoded resistance to the herbicide sulfometuron methyl | |
| US4935350A (en) | Materials and methods for controlling plasmid copy number and stability | |
| CA1327330C (en) | Expression system comprising aspergillus niger pectin lyase i gene sequences | |
| Banks | Transformation of Ustilago maydis by a plasmid containing yeast 2-micron DNA | |
| US5135868A (en) | Cultures of yeast of the genus Pichia altered by site selective genomic modification | |
| Dohmen et al. | Regulated overproduction of α-amylase by transformation of the amylolytic yeast Schwanniomyces occidentalis | |
| NO302899B1 (no) | Rekombinant DNA-molekyl, transformert vertscelle, anvendelse av rekombinant DNA-molekyl og hybridvektor, og pektinlyasene PLA, PLB, PLC, PLE eller PLF i ren form | |
| US5679544A (en) | Modified Kluyveromyces yeasts, their preparation and use | |
| NO854864L (no) | Fremstilling av en flerkopiers gjaervektor. | |
| Razanamparany et al. | Non-homologous integration of transforming vectors in the fungus Podospora anserina: sequences of junctions at the integration sites | |
| Anziano et al. | Splicing-defective mutants of the yeast mitochondrial COXI gene can be corrected by transformation with a hybrid maturase gene. | |
| Hsu et al. | Construction of a new yeast cloning vector containing autonomous replication sequences from Candida utilis | |
| CA1207687A (en) | Filamentous fungi functional replicating extrachromosomal element | |
| Araki et al. | An autonomously replicating sequence of pSRI plasmid is effective in two yeast species, Zygosaccharomyces rouxii and Saccharomyces cerevisiae | |
| Sturley et al. | Genetic manipulation of commercial yeast strains | |
| US5166070A (en) | Vectors for the cloning and expression of heterologous genes in yeast and the yeast strains transformed by said vectors |