NO860676L - Fremgangsm¨te og middel for in vitro p¨visning av cancer. - Google Patents

Description

IN VITRO BESTEMMELSE AV MAGE- OG TARM-CANCER

Foreliggende oppfinnelse vedrører først og fremst fremgangsmåte og systemer for diagnostisering av mukinøse cancere, og spesielt cancer i tarmkanalen såvel som cancer i bryst, lunge, mage, eggstokk og dets like.

Dødeligheten som skyldes cancer i tarmkanalen rangerer som nummer to etter lungecancer hos menn og brystcancer hos kvinner. Selv om mye oppmerksomhet er blitt rettet mot disse forholdene, er antall døsfall ikke blitt redusert betydelig de siste årene. Tidlig oppdagelse av kreften er viktig for å oppnå helbredelse hos dem som er angrepet. Cancerceller danner til tider stoffer som man ikke kan

oppdage eller som kun finnes i svært små konsentrasjoner i friske individer. Disse trekkene kan anvendes for å utvikle innovative diagnostiske teknikker. Tester som har det mål å påvise disse cancer-tilknyttede stoffene er til stor hjelp i differensieringen mellom individet med cancer sammenlignet med friske individer.

Carcinoembryonisk antigen (CEA) er det mest omfattende undersøkte antigen i forbindelse med tarmcancer og også det mest studerte av alle de tumor-tilknyttede antigener. Dette antigenet er tilstede i den menneskelige fetale tarmkanal,

men er ikke tilstede eller tilstede kun i svært små konsentrasjoner i den normale fullt utviklede tykktarmen.

CEA ble først påvist i forbindelse med tykktarms-cancer hos mennesker av Gold og Freedman i 1965. 9 CEA var tilstede i blodet hos slike cancer-pasienter og ble derfor først sett på som et oncofetalt antigen som ga store håp for en tidlig diagnostisering av cancer i det menneskelige fordøyelses-system. Senere har man vist at måling av CEA i blod ikke er spesifikk nok til å være verdifull nok for en tidlig diagnose av tarmcancer, fordi det ofte er forhøyet i en rekke ikke-neoplastiske tilstander som inkluderer bronkitt hos røkere og leverskader.F.eks., viser 10% av den normale befolkningen falske positive resultater, på den måten at disse individene har forhøyede konsentrasjoner av

CEA i blod, selv om de ikke har cancer eller til og med godartede tumorer. For det andre, er CEA ofte upåviselig

11-13

selv hos pasienter med heller store tumorer, dvs. at antall falske negative er betydelig (omkring 50% av pasientene med tarmcancer viser ikke økte blodkonsentrasjoner av CEA). Tross disse begrensningene, er CEA-assay fremdeles av vesentlig betydning i preoperativ vurdering og postoperativ behandling av cancer-pasienter. CEA-assays utgjør omkring 40% av aktuelle cancer-tester.

Alfa-fetoprotein (AFP) er et annet oncofetalt antigen som

er funnet i høye konsentrasjoner i fostere, men ikke hos normale voksne. Økede konsentrasjoner av AFP i blod er tilstede hos pasienter med primær levercancer, sekundære lever-tumorer, i de fleste tilfellene av noen typer testikulær cancer (teratoma); men også ved toksisk leverskade og lever-cirrhose. Tross denne tilsynelatende begrensede nytte, representerer AFP omkring 20% av aktuelle utførte cancer-tester.

Nylig er monoklonale antistoff-baserte radioimmunoassays

TM

for maling av tumor-tilknyttede antigen CA 19-9 blitt 14-19 TM

kommersielt tilgjengelig . Denne CA 19-9 assay er påstått å ha høy sensitivitet og spesifisitet for alle stadier av pankreas cancer, men med hensyn til oppdagelse av kolorektal cancer, synes denne assayen å ha lav sensitivitet.

I 1980 ble et nytt mycin glykoprotein antigen isolert fra cancer i tykktarmen.''" Denne forbindelsen er også tilstede i normal utviklet tynntarm og er derfor blitt kalt "tynntarm-mycin-antigen" (SIMA). SIMA ble vist å være et oncofetalt antigen, på grunn av at det i et 8-12 uker gammelt foster er funnet i hele mage- og tarm-kanalen, men ved fødsel er det ikke lenger ved normale forhold påvist andre steder enn i tynntarmen, men SIMA er funnet ved cancer i mange ulike deler av mage- og tarm-kanalen og andre organer. En annen mycin-forbindelse, omtalt som "tykktarm-mycin-antigen" (LIMA) er også blitt isolert fra normal tykktarm. LIMA har også vist å være et oncofetalt antigen, og dannes i varierende grad ved en rekke cancere. Eksten-sive immuno-histologiske studier har vist at LIMA er antigenisk forskjellig fra SIMA og begge er også forskjellig fra CEA. Disse tarm-tilknyttede mycine antigener er også blitt påvist i noen mage-tumorer, galleblære, lunge, bryst og eggstokk, såvel som det premaligne forhold i de ovennevnte organer. (Litt. henv. 1-8).

Resultater fra immuno-histokjemisk farging, ved anvendelse av anti-SIMA og anti-LIMA monoklonale og polyklonale antistoffer, av normalt fetal og fullt viklet vev, og cancer fra forskjellige organer er vist i tabell 1. Man har nå for første gang oppdaget, at til tross for den høye molekylvekten av disse mycinøse glykoproteinene, kan SIMA og LIMA påvises i blodserum hos en stor del av pasientene med tykktarms-cancer ved anvendelse av diagnostiske antistoff-assays. SIMA og LIMA er ikke funnet i målbare mengder eller er funnet i meget små mengder i blodserum hos friske kontroll-individer. Innledende studier med en liten gruppe har allerede vist at en kombinasjon av SIMA-og LIMA-tester kan anvendes for å påvise omkring 80% av pasienter med kolorektal cancer, hvori anvendelse av CEA-tester alene påviser bare omkring 56% av slike cancere. Disse SIMA- og LIMA-assays er altså mer sensitive enn CEA-assays for påvisning av trinn B og C (Duke's klassifisering) cancere. I tillegg kan LIMA påvises i blod hos en stor del av pasienter med ulcerøs colitt i tykktarmen. Slike pasienter utvikler vanligvis tykktarms-cancer. Likeledes kan SIMA og LIMA anvendes for å påvise tilstedeværelsen av pre-cancerøse tilstander.

Som anvendt i denne beskrivelsen, anvendes betegnelsene SIMA og LIMA ikke bare for å betegne mycin-antigenene som er beskrevet mer detaljert under, men også deler derav som er antigenisk beslektet og som kan forekomme i fysiologiske væsker, spesielt blod-serum eller plasma.

I overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse har man tilveiebragt en in vitro diagnostiserende fremgangsmåte for påvisning av tilstedeværelsen av cancer-celler eller andre celler i en pasient som danner mycin-antigener, der fremgangsmåten omfatter analysering av en prøve av en fysiologisk væske fra en pasient for å påvise nærvær eller fravær av SIMA og/eller LIMA i ovennevnte prøve.

Foretrukket omfatter ovennevnte fremgangsmåte at man bringer en prøve av en fysiologisk væske fra pasienten i kontakt med monoklonale eller polyklonale antistoffer overfor SIMA og/

eller LIMA eller fragmenter av ovennevnte antistoffer, eller ovennevnte antistoffer eller fragmenter derav merket med en

markør som er i stand til å tilveiebringe et påviselig signal, og påvisning av tilstedeværelsen av bindingen mellom ovennevnte antistoffer eller fragmenter derav, eller ovennevnte merkede antistoffer eller fragmenter derav, og deres korresponderende antigen.

Særlige foretrukne fysiologiske væsker for anvendelse ved fremgangsmåter for diagnostisering er blod, blodserum eller plasma.

På den annen side, har man tilveiebragt et in vitro diagnostisk kit eller system for påvisning av nærvær av cancerceller eller andre celler i en pasient som danner mycin antigener, hvor kittet eller systemet omfatter midler for påvisning av nærvær av SIMA og/eller LIMA i en prøve av en fysiologisk væske fra pasienten.

Spesielt i overensstemmelse med denne oppfinnelsen, har man tilveiebragt et in vitro diagnostisk kit eller system for påvisning av nærvær av SIMA og/eller LIMA i en prøve av en fysiologisk væske, som blod eller blodserum, fra pasienten, hvori kittet eller systemet omfatter monoklonale eller polyklonale antistoffer som er i stand til en immunologisk reaksjon med SIMA og/eller LIMA, eller fragmenter derav, sammen med indikator-midler for indikering av tilstedeværelsen av en immunologisk reaksjon mellom ovennevnte antistoffer og deres korresponderende antigener.

Ved en spesiell utforelsesform i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse, omfatter det diagnostiske systemet videre en forbindelse som er bundet til en bærer av faststoff, hvori ovennevnte forbindelse omfatter enten

(i) SIMA og/eller LIMA, eller (ii) ovennevnte antistoffer som er i stand til å reagere immunologisk med SIMA og/eller

LIMA.

Denne siden av den foreliggende oppfinnelsen omfatter en rekke utførelsesformer hvor man anvender ulike former for indikatormidler. Ved en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse, omfatter indikatormidlene en markør som er i stand til å tilveiebringe et påviselig signal, og hvor ovennevnte markør er bundet til ovennevnte antistoffer som er i stand til å reagere immunologisk med SIMA og/eller LIMA. Ved en annen utførelsesform, omfatter indikatormidlene imidlertid en markør som er i stand til å tilveiebringe et påviselig signal, hvori ovennevnte markør er bundet til andre antistoffer, hvori ovennevnte andre antistoff er fremkalt overfor førstnevnte antistoff og indikerer nærvær av ovennevnte immunologiske reaksjon ved binding til de førstnevnte antistoff. Videre kan indikatormidlene omfatte protein A fra stafylokokker med en markør bundet dertil. Markørene som anvendes i hvilken som helst av disse utførelsesformene kan omfatte kjente enzymer, radio-aktive elementer, fluorescerende kjemikalier eller forbindelser som biotin.

Anvendelse av immunoassays for SIMA og LIMA har muliggjort påvisning av disse mycinantigener i alle trinn ved kolorektal cancer. Disse resultatene fastslår derfor at dette systemet om mulig er mere anvendelig og verdifullt

TM

enn CA 19-9 eller CEA-assays som er beskrevet i det foregående.

Mens den foreliggende oppfinnelse i første rekke er rettet på påvisning av mycinøs cancere, vil man også verdsette at immuno-assays for SIMA og LIMA er verdifulle for påvisning av inflammatoriske tilstander slik som ulcerøs kolitt eller magesår, såvel som påvisning av pre-cancertilstander.

Som tydeliggjort i den foregående beskrivelsen, kan mycin antigenene SIMA og LIMA beskrevet heri først og fremst karakteriseres ved hjelp av kilden hvorfra de er isolert

(ved anvendelse av fremgangsmåter beskrevet detaljert under). En videre karakterisering og identifikasjon av disse antigene kan oppnås ved anvendelse av polyklonale og monoklonale anti-SIMA og anti-LIMA antistoff, og ved anvendelse av

immunohistokjemiske teknikker, "konkurrerende" immunoassay-teknikker for å påvise antigen aktivitet ved inhibering av binding mellom anti-SIMA eller anti-LIMA antisera og spesifikt mage- og tarm-vev.

Videre detaljert i den foreliggende oppfinnelsen vil bli diskutert under. Man legger forøvrig merke til, at immunoassays for SIMA og/eller LIMA i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer et meget sensitivt diagnostisk redskap for påvisning av cancerceller eller andre mycin-antigen-produserende celler i en pasient,

og i særdeleshet i den pre-operative fasen hos cancer-pasienter for å oppnå en indikasjon på omfanget av tumoren,

og for å oppnå en basis som er verdifull for post-operativ oppfølgning av pasientene som er operativ, eller ved hjelp av hvilken som helst annen modalitet (f.eks. radioterapi, kjemoterapi) for å påvise tilbakefall på behandlingstrinnet, eller for å måle behandlingens effektivitet. Ved slik anvendelse kan det diagnostiske system i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen først og fremst kombineres med immunoassays for CEA eller andre kjente tumor-assosierte antigener, som er vanlig å anvende i slike tilfeller. I tillegg, kan de SIMA/LIMA (etter fritt valg i kombinasjon med CEA) diagnostiske systemer anvendes for å screene en populasjon som er utsatt for utvikling av intestinal cancer, dvs. pasienter med ulcerøs colitt eller magesår, et område hvor de CEA-diagnostiske systemene alene har, etter innledende utprøving, vært funnet å ikke ha noen diagnostisk verdi.

Under arbeide som har ført til den foreliggende oppfinnelse, er en rekke monoklonale antistoff blitt fremstilt ved hjelp av immunisering av mus med mycin preparater ekstrahert fra tykktarmscancer. Immunohistokjemisk merking av vev ble anvendt for å klassifisere 5 av disse monoklonale antistoffene som anti-SIMA (reagerende med tykktarms-cancer og normal tynntarm) og 5 som anti-LIMA (reagerende med tykktarms-cancer og normal tykktarm). Immunokjemiske analyser viste at antistoffenes affinitet varierte med så mye som 100 ganger for hver klasse.

Følgende eksempler illustrerer fremstilling og karakterisering av mycin antigener, og alminnelig anvendte fremgangsmåter for fremstilling av polyklonale og monoklonale antistoffer overfor SIMA og LIMA, og anvendelse av disse monoklonale antistoffene i in vitro diagnostiserende fremgangsmåter for påvisning av nærvær av cancer eller andre mycin antigen-dannende celler i en pasient i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPEL 1

A. RENSING OG KARAKTERISERING AV MYCIN ANTIGENER.

Myciner ble utvunnet fra kirurgiske prøver oppnådd ved fjerning av kolorektalt cancervev. Områder med normal tykktarm langt borte fra tumoren ble oppnådd fra vev fjernet sammen med tumoren, og ble undersøkt ved hjelp av lys-mikroskopi for å bekrefte at vevet var normalt før anvendelse. Prøver fra normal tolvfingertarm, jejunum, og tykktarm, ble også oppnådd ved hjelp av autopsi fra tilfeldig utvalgte individer. Myciner ble utvunnet fra prøver fra tykktarms-cancer (LIMA og SIMA), normal tykktarm (LIMA), eller normal tolvfingertarm eller jejunum (SIMA)

ved hjelp av fremgangsmåtene som er beskrevet undet.

Mycin-preparatet som ble anvendt for å immunisere mus for fremstilling av monoklonale antistoffer og screening ble fremstilt fra en cancer-prøve som var diagnostisert histologisk som en "delvis mycinøs" adenocarcinoma fra kolon sigmoidium. Vevsprøven (omtrent 5 g) ble oppskjært i små biter, deretter homogenisert i 10 volumdeler av 4M guanidin hydroklorid inneholdende 24 mM EDTA, 10-mM N-etylmaleimid og 1 mM benzamidin HCl. Etter sentrifugering ved 20.000 xg i 20 min., ble pelleten utvunnet på nytt ved hjelp av en frisk guanidin hydroklorid. Mycinet i de kombinerte supernatantene ble deretter innstilt til en tetthet på 1,35 g/ml med cesium-klorid og sentrifugert ved 105.000 xg i 64 timer. Den resulterende gradienten ble separert i 6 like fraksjoner med tetthet fra 1,25 til 1,55 g/ml. Hver fraksjon ble dialysert mot destillert vann og analysert med hensyn på protein (modifisert Bradford-metode) og heksose 21, såvel som antigen-aktivitet ved bestemmelse av dens evne til å inhibere spesifikk immuno-fluorescent merking av mage- og tarm-vev ved hjelp av anti-SIMA og anti-LIMA antistoff, og ved hjelp av immuno-assays ved anvendelse av monoklonale antistoffer (se mere detaljert nedenfor). Fraksjonene som inneholdt den største aktivitet av antigen ble re-fraksjonert på CsCl-gradienter,

og fraksjonene ble analysert som beskrevet over.

( i) LIMA

LIMA ble funnet i bunnen av gradienten i 2. eller 3. fraksjon med en tetthet på !,34 til 1,55 g/ml. LIMA-preparatene var polydisperse og ble vanligvis funnet med høyest antigen-aktivitet ved en tetthet omkring 1,4 - 0,08. Antigen-aktivitet, heksose og proteininnhold i hver fraksjon av en typisk 3 CsCl-gradient-sentrifugering av et LIMA-preparat er vist i fig. la. Forholdet heksose/protein (wt/wt)

for fraksjonene 2 og 3 var henhv. 0,5 og 0,25. Toppene som betegner heksose, protein og antigen-aktivitet fallt ikke sammen; fraksjon 3 inneholdt det meste av antigen-aktiviteten. Det totale utbytte av LIMA fra et typisk eksperiment,

bestemt ved hjelp av enzym-bunet immunoassays (EIA) er omkring 35% av det som er tilstede i et vevs-homogenat. Den totale rensingen av LIMA er i størrelsesorden 1000 ganger. SIMA er ikke vanligvis oppdaget i LIMA-preparater fra

normal tykktarm. Den vellykkede anvendelse av LIMA-preparater i "sandwich" immunoassays (hvor det samme monoklonale antistoff må binde seg mer enn en gang til molekylet), indikerer at det antigene determinant som er gjenkjent ved hjelp av monoklonale antistoff må gjentas minst to ganger på molekylet.

Den høye molekylvekten til LIMA ble indikert ved dens manglende evne til å penetrere inn i 7% polyakrylamid elektroforese-geler. Videre studier ved anvendelse av gel-filtrering kromatografi viste at LIMA-antigenet eluert i det utkommende volumet på Sepharose 6B (som separerer globulære proteiner i det omtrentlige molekyl-vektsområde: 1 x IO4 - 4 x IO6, og dekstraner med molekylvekt: IO4 - IO<6>spesifikasjoner fra Pharmacia-katalog) og Sepharose 2B (fraksjonerer globulære proteiner i et molekylvekts-område på 7 x 10<4>4 x 10 7 og dekstraner i omradet: 10 5 -2x10<7>). Gel-kromatografi av LIMA på Sephacryl 1000 kolonne (1 cm x 65,5 cm) eluert i 10 mM fosfat-

bufret saltløsning (separerer dekstraner i et molekylvekts-område fra: 5 x 10 r - 10 Q) er vist i fig. 2a. Det meste av LIMA antigen-aktiviteten var innbefattet i denne matriksen og ble eluert som en bred topp som kan indikere polydispersitet av LIMA-preparatet. En lignende grad av polydispersitet sees for mange andre proteoglykan-molekyler og årsaken til dette kan f.eks. være struktur-variasjoner eller en aggregasjon som påvirker molekylvekten, men ikke den antigene virkning av slike molekyler.

For bedre å kunne anslå størrelsen av LIMA, ble det utført ultrasentrifugering på glyserol-gradienter (10% til 20%) på en rekke preparater for å bestemme sedimentasjons-koeffisientene (Beckman SW 50 Ti roto, 22.000 omdr. x 15 t eller 42.000 omdr. x 5 t ved 4°C). Gradientene ble fraksjonert og hver fraksjon ble analysert med hensyn på antigen-aktivitet ved hjelp av en "sandwich" assay. En typisk LIMA-gradient er vist i fig. 3a. Fra dette og andre forsøk, ble gjennomsnittlig s-verdier med hensyn på vekt bestemt i overensstemmelse med følgende ligning:

hvor^<>>er vinkelhastigheten, t er sentrifugerings-tiden (timer), Ro er rotasjonsradiusen til toppen av gradienten og Rt er gjennomsnittlig vekt -raduis hvortil toppen av antigen-aktivitet har beveget seg. Den gjennomsnittlige s-verdi beregnet ut fra en rekke forskjellige forsøk var 9,5 1,5.

LIMA ble utsatt for en rekke forskjellige fysikalske,

kjemiske og enzymatiske behandlinger for å oppnå ytterligere informasjon angående antigenets natur; dette er oppsummert i tabell 2. Antigen-aktiviteten for LIMA i en "sandwich" assay var stabil ved lagring i minst 1 måned ved 40°C og opp til 5 min. ved 100°C. Koking i 10 min. eller lengre resulterte i et 40% tap med hensyn til aktivitet. Denne stabiliteten for LIMA overfor koking antyder at dette antigenet kan være et sterkt glykosylert molekyl, og at epitopen innehar eller er beskyttet av karbohydrat. Alkalisk behandling av LIMA for å bryte 0-glykoside bindinger mellom karbohydrater og protein ble utført ved forskjellige konsentrasjoner av KOH : 0,01M, 0,05M, 0,10M, 0,25M, 0,50M (ved 4°C i 2,4 eller 16 timer) hvoretter det respektivt

forelå 85%, 70%, 70%, 55% og 45% antigen-aktivitet etter behandling. Tilsetting av en nukleofil slik som 2-merkaptoetanol (0,1M) muliggjorde at 3-eliminasjons-reaksjonen foregikk ved mildere betingelser (0,01M KOH,

ved 4°C i 4 timer), med et resulterende tap på 55% av antigen-aktivitet. I tillegg til delvise tapet av antigen-aktivitet på grunn av alkalisk behandling av LIMA, viste analyser på glyserol-gradienter en signifikant reduksjon i den gjennomsnittlige molekylvekts-verdien s (5,5) som indikerer en nedgang i molekylvekt (fig. 3a) . Forsøksvis reduksjon av LIMA (i 6M guanidin HCL, 0,5M tris pH 8,1,

0,002M EDTA, 10 mM ditiotreitol, ved 50°C i 2 timer, 4 timer eller 16 timer etterfulgt av alkylering med 0,4M jod-eddiksyre ved 4°C over natten) hadde ingen signifikant effekt på antigen-aktiviteten.

Spaltings-forsøk med en rekke meget rene enzymer ble

utført for å bestemme den kjemiske naturen av LIMA-antigen.

Etter behandling ble prøvene kokt i 5 min. eller nøytralisert (pepsin) for å inaktivere enzymene for immunoassay. Hverken pepsin eller klostripain, (utført ved en rekke enzym-konsentrasjoner inkubert med LIMA i 2,4 eller 16 timer) viste noen signifikant effekt på antigen-aktiviteten til LIMA (tabell 2). Spalting ved hjelp av papain (0,1 eller 1,0 mg/ml) av LIMA resulterte i et signifikant tap av antigen-aktivitet med kun 20% gjenblivende aktivitet etter 2,4 eller 16 timer med spalting, når aktiviteten ble målt ved hjelp av en "sandwich" assay. Når aktiviteten ble målt i en konkurrerende ELISA (hvor målingen ikke er avhengig av epitopenes multivalens på antigenet) var aktiviteten som var igjen etter 2 timers spalting med papain 75%, etter 4 timer - 65% og etter 16 timer - 35%. Dette innebærer at ved milde forhold av papain-spalting, kan LIMA bli nedbrutt til fragmenter som for det meste bare har en epitop og som derfor ikke kan påvises i en "sandvich" assay, men som påvises i en konkurrerende assay. Dette resultater viser at antigenet til en viss grad er følsomt overfor papain, mens det i alt vesentlig er motstandsdyktig overfor pepsin og klostripain.

( ii) SIMA

SIMA ble funnet i 2 eller 3 fraksjoner av gradienten med en tetthet mellom 1,29 og 1,45 g/ml. SIMA-preparatene var polydisperse, men det meste av antigen-aktiviteten ble vanligvis funnet med en tetthet på 1,38 0,05. Antigen-aktiviteten, heksose- og protein-innholdet i hver fraksjon av en typisk tredje CsCl-gradient sentrifugering av et SIMA-preparat er vist i fig. lb. Forholdene mellom heksose/ protein (wt/wt) for fraksjonene 3 og 4, hvor man finner den største antigen-aktiviteten, var henholdsvis 1,5 og 0,3. Utbyttet av SIMA fra en typisk cancerprøve fra tykktarm er omkring 40%, bestemt ved hjelp av EIA. Rensingen som oppnås ved hjelp av disse fremgangsmåtene er omkring 1000 ganger, lik rensingen av LIMA. Det meste kollorektale cancer-vevet ble funnet å inneholde betydelige mengder LIMA såvel som SIMA, mens ekstrakter fra prøver av normal tolvfingertarm og jejunum inneholdt SIMA, men ikke påviselige mengder LIMA. LIMA kunne fjernes fra "SIMA" preparater fra prøver av kolorektal cancer, ved at de blandede mycin-ekstraktene ble ført gjennom en anti-LIMA monoklonal antistoff affinitets-kolonne. Identifikasjonen av SIMA i preparatet er basert på reaksjonen med monoklonale antistoff og inhibering av immunofluorescens-merking av tynntarmen ved polyklonale og monoklonale antistoff. Som beskrevet for LIMA, indikerer anvendelsen av SIMA i en "sandwich" immunoassay tilstedeværelsen av en gjentatt epitop på antigen-molekylet.

Som det var tilfelle med LIMA, penetrerer heller ikke SIMA 7% polyakrylaruid elektroforese-geler. Men analysering ved hjelp av gel-filtrering på Sepharose 2B kolonne (1,5 cm x 7 cm), eluert i 25 mM tris pH 8,0 inneholdende 4M guanidin HC1, viste at SIMA var innbefattet i gelen og var polydispers, hvor man ved eluering fikk en rekke topper (fig. 4), og hadde en mye lavere molekylvekt enn LIMA. SIMA ble også analysert i Sephakryl 1000 kolonne, hvor man igjen ved eluering fikk en bred topp med mye lavere molekylvekt enn hele LIMA-preparatet (se fig. 2a og b).

s-verdiene ble bestemt for en rekke SIMA-preparater på 10% til 20% glycerol-gradienter som beskrevet over for LIMA.

En typisk SIMA-gradient er vist i fig. 3b. Den gjennomsnittlige s-verdien ble beregnet ut fra en rekke forsøk og var 4,8 - 1,4, som er mye lavere enn verdien for LIMA.

SIMA ble funnet å være mer stabil ved alkalisk behandling og koking enn LIMA. Ingen betydelig forandring i antigen aktivitet ble observert, ved alkalisk behandling ved forhold som er beskrevet over for LIMA. I tillegg ble SIMA antigen aktivitet ikke betydelig påvirket ved koking i 5 min., og bare 6% av aktiviteten gikk tapt etter koking i

10 min. (se tabell 2).

SIMA ble nedbrudt ved hjelp av en rekke rensede enzymer som beskrevet for LIMA (tabell 2). Klostripain hadde ingen effekt på antigen-aktiviteten hos SIMA som ble målt ved hjelp av "sandwich" EIA. Nedbryting av SIMA ved hjelp av papain i 2 timer hadde ingen effekt, mens 50% av antigen-aktiviteten gikk tapt etter 16 timers nedbrytning. Nedbrytning av SIMA ved hjelp av pepsin resulterte i et 70% tap av antigen aktivitet, i motsetning til LIMA som var resistent overfor pepsin (10 pg/ ml pepsin ved romtemperatur over natten).

En rekke foredlinger ble innført i renseprosedyren av mycin som følger: 1. Perklor-syre (IM), behandling med natrium-acetat og oppvarming til 70°C, eller koking i 5 min. kan også anvendes for å forbedre renheten av mycin-preparatene. 2. Gjentatt CsCl gradient ultrasentrifugering har også vist seg å gi en markert forbedret renhet (opp til 10

ganger) av mycin-preparater.

3. Affinitet til monoklonal antistoff-kromatografi kan også anvendes på to måter: først f.eks., ved anvendelse av anti-LIMA monoklonale for å fjerne LIMA fra et SIMA-preparat (og omvendt); og for det andre ved anvendelse av adsorbsjon og eluering av mycin (SIMA) på anti-SIMA monoklonaler for å rense SIMA fra andre kontaminerende proteiner. 4. Mycin antigener kan altså renses fra normalt og cancerholdige vev ved anvendelse av lektin kolonner, gel-elektroforese, ione-bytter- eller gel-filtrerings-kromatografi.

De ulike trinn i rensingen av mycin-preparater kontrolleres ved hjelp av konkurrerende immunohistokjemi og EIA ved anvendelse polyklonale og monoklonale antistoff for å bestemme SIMA og LIMA forbindelser i preparatene.

B. FREMSTILLING AV POLYKLONALT ANTISERA

Det polyklonale anti-SIMA antiserum som ble anvendt ved

disse undersøkelsene var det som ble fremstilt i kaniner av Ma et al (1980)"''. Polyklonalt antiserum som gjenkjenner LIMA ble fremstilt ved lignende teknikker innbefattet immuniseringen av kaniner med mycin preparater ekstrahert fra normal tykktarm i overensstemmelse med Ma et al (1980)"'".

Disse antisera, skjønt de er relativt ikke-spesifikke og kryss-reagerende, ble anvendt i begynnelsen for å kontrollere trinnene ved rensing av mycin. Polyklonale antisera fremstilt fra meget rent SIMA og LIMA kan anvendes i "to-side sandwich" immunoassays som beskrevet under.

C. FREMSTILLING AV MONOKLONALE ANTISTOFFER

Immunisering:

Balb/C mus av hunkjønn, omkring 8 uker gamle, ble immunisert med omkring 50 jag pr. mus av delvis renset cancer-mycin-preparat i 4 subkutane og 1 intraperitoneal injeksjon, først med fullstendig hjelpeforbindelse i henhold til Freund, etterfulgt omkring 4 uker senere av samme type injeksjoner i ufullstendig hjelpeforbindelse. Omtrent 12 døgn etter den andre immuniseringen, ble musene tappet for blod gjennom halevenen, og serum antistoff-titre ble bestemt ved hjelp av ELISA. Tre uker etter den andre immuniseringen, ble mus med høye serum-titre gitt nye injeksjoner for å forsterke oppnådd immunitet ved intraperitoneale injeksjoner av 10 ug cancer-mycin-preparater i PBS i fire påfølgende døgn, etterfulgt på den femte dagen av avliving av dyrene, fjerning av milten og konvensjonell cellefusjon med muse-myeloma-linjer.

Celle- fusjon, hybridoma- vekst, kloning:

En suspensjon av miltceller ble fremstilt fra milten av

en immunisert mus ved forsiktig behandling i fosfat-bufret fysiologisk løsninq (GKN). 10 gmiltceller ble sammenarbeidet med 5 x 10 7 myeloma-celler (X63 Ag 8.6.5.3) (fra T. Stahelin, Hoffman La Roche, Basel, Sveits) i overensstemmelse med standard prosedyre. Miltceller og myelomaceller ble blandet i 50% PEG-4000 (GC grad), tilsatt sakte i løpet av 60 sek. Etter henstand i 90 sek., ble cellene som var suspendert i PEG fortynnet sakte med 7 ml GKN-løsning (tilsatt over 5 min.) deretter fortynnet til omtrent 300 ml i RPMI 1640 medium inneholdende 10% fetalt kalveserum, hypoksantin, aminopterin og thymidin. Den fortynnede celle-suspensjonen ble deretter fordelt i 288 brønner på 24-brønners multiplater inneholdende 10^ peritoneale makrofager pr. brønn. Mediumet ble byttet etter omkring 7 døgn, og deretter som det var påkrevd i overensstemmelse med celle-veksten.

Etter screening ved hjelp av EIA, ble hybridomas som utskiller antistoff overfor myciner, klonet to ganger ved hjelp av begrenset fortynning i mikrotiterplater inneholdende peritoneale makrofager. For fremstilling av store mengder monoklonale antistoffer, ble hybridomas som utskiller antistoffer dyrket som væskefylte tumorer i 8-12 uker gamle mus, som 1-7 døgn før var blitt tilført 0,5 ml Pristan injisert intraperitonealt. Væske fra de ovennevnte tumorene ble samlet 2-4 uker etter injeksjon av celler og lagret ved -20°C.Immunoglobuliner ble renset fra de ovennevnte væskene, som påkrevd, ved hjelp av protein A-sepharose affinitets-kromatografi.

Hybridoma- screening.

(i) EIA. Brønner på polystyren-mikrotiter-plater ble fylt med ubehandlet cancermycin-preparater (10 ug/ml i HCO~/CO~~ buffer pH 9,6) i 3 timer ved 37°C. Brønnene ble deretter vasket fire ganger i PBS/Tween. Supernatanter fra hybridoma-kultur ble inkubert i brønnene i en time, deretter vasket fire ganger med PBS/Tween. Brønnene ble deretter inkubert med alkalisk fosfatase-bundet anti-mus immunoglobulin fra får. Etter vasking med PBS/Tween, etterfulgt av destillert vann, ble p-nitrofenyl-fosfat tilsatt som substrat og positive brønner (som indikerer supernatanter inneholdende antistoff overfor myciner) ble identifisert som dem som inneholder det gule produktet, p-nitrofenol. (ii) Fluorescent immunohistokjemi. "Positive"

hybridomas som ble identifisert ved førstegangs screening i EIA ble deretter screenet ved hjelp av immunofluorescens-teknikker for muligheten av monoklonale antistoff fremstilt for å merke spesifikke celler eller vev i de histologiske delene av normale eller cancerholdige mage- og tarm-organer. Supernatanter fra hybridoma-kulturer ble inkubert på vevs-bitrt på glassplater. Etter blokkering av ikke-spesifikke bindings-steder ved hjelp av bovin serum albumin-

løsning, ble vevene inkubert med fluorescens-

konjugert kanin anti-mus immunoglobulin. Overskudd av merket antistoff ble fjernet ved vasking, og vevet ble undersøkt ved hjelp av fluorescerende mikroskopi ved anvendelse av U-V eller nær-bånd blå eksitasjon.

Ved anvendelse av de ovennevnte teknikker, ble 5 anti-SIMA monoklonale antistoff (som reagerer med normal tynntarms-mycin og kolorektal cancermycin), og 5 anti-LIMA monoklonale antistoff (som reagerer med normal tykktarms-mycin og kolorektal cancermycin) identifisert.

Karakterisering av monoklonale antistoff.

Undergruppen av antistoff ble bestemt ved anvendelse av enzym-bundne anti-IgG og anti-IgM antistoff (CSL). Alle de monoklonale antistoff ble funnet å være av igG undergrupper.

For å kunne karakterisere de monoklonale antistoff helt, ble deres relative affinitet målt ved hjelp av to metoder. Først ble renset IgG oppnådd for hvert monoklonale antistoff ved hjelp av protein A-sepharose affinitets-kromatografi. Det rensede IgG ble deretter titrert ved hjelp av EIA, og titrer-kurver (omsetning i EIA mot protein-konsentrasjon) sammenlignet som et mål på den realtive affiniteten hos antistoffene. For det andre ble en konkurrerende EIA utviklet (se under). De relative affinitets-konstantene ble beregnet ved anvendelse av SIMA-preparater som inhibitor sammen med anti-SIMA monoklonale antistoff, og et LIMA-preparat som inhibitor for anti-LIMA monoklonale antistoff. Beregningen av de relative affinitets-konstantene ble

basert på følgende ligning:

Ved konsentrasjonen av antigen (mycin) som frembringer en 50% inhibering i en konkurrerende EIA, vil konsentrasjonen av fri og bundet antistoff være lik, dvs. (Ab) = (AbAg). Derfor den relative af f ini tets-konstanten Ka, = -7-r—r .

Ka,(Ag)Resultatene fra disse beregningene er vist i tabell 3.

Da den reelle antigen-konsentrasjonen kan være lavere (dersom preparatene ikke er 100% rene eller andre proteiner som kan forurense er tilstede), er verdiene for Ka minimum-verdier og kan virkelig være høyere.

20

Metoden etter Friguet et al (1983) ble anvendt for å bestemme om hver av anti-SIMA monoklonalene på den ene side og anti-LIMA monoklonalene på den annen side var bundet til de samme antigen-determinanter på SIMA- og LIMA-molekylene, respektivt. Ved anvendelse av begrensende mengder antigen for å dekke platen, ble hvert antistoff titret individuelt og med alle mulige kombinasjoner. Alle monoklonalene som ble fremstilt ved de aktuelle forsøkene ble funnet å binde seg til samme eller overlappende antigene determinanter på molekylet.

EKSEMPEL 2 IN VITRO DIAGNOSTISK IMMUNOASSAYS

To immunoassays som er utviklet for å påvise sirkulerende mycin i blodprøver er beskrevet under:

A. KONKURRERENDE ELISA

(i) Trinnene som inngår i dette forsøket er vist i fig. 5. Innledende forsøk indikerer at alt mycinet som er tilsatt til heparinisert- eller EDTA-behandlet eller ubehandlet-blod kan gjenvinnes og kvantiseres i fortynnet plasma eller serum. Ufortynnet plasma eller serum som tilsettes til immunoassayen forårsaker forstyrrelser, mens ingen effekt på forsøkene (f.eks. vandige buffere) ble observert ved anvendelse av plasma fortynnet -<J>q . En rekke blodprøver fra pasienter med kolorektal cancer, pasienter med ulcerøs kolitt og friske kontroller ble derfor analysert med hensyn på SIMA og LIMA ved anvendelse av konkurrerende ELISA. Plasma fra friske individer inneholdende tilsatt SIMA eller LIMA ble anvendt som standard. Høye nivåer av SIMA og/eller LIMA ble påvist i 13/23 (omkring 60%) av pasientene med varierende grad av kolorektal cancer, og høye LIMA-nivåer (men ikke SIMA) ble påvist i 4/5 tilfeller av ulcerøs kolitt. Hverken SIMA eller LIMA ble påvist i blodprøver fra syv friske kontroller ved dette forsøket. (ii) For å bestemme om mycin kunne påvises ved lavere nivåer,

planla man en fremgangsmåte for ekstrahering og

konsentrering av mycin fra plasmaprøver. Et likt volum av 2M perklor-syre (PCA) ble tilsatt til serum-eller plasma-prøvene i 15 min. ved romtemperatur. Prøvene ble sentrifugert ved 8.000 g i 2 min., supernatantene ble fjernet og pelletene ble vasket i et volum med PBS som var dobbelt så stort som det opprinnelige prøve-volumet, blandet og sentrifugert som over. PBS ble tilsatt til de kombinerte supernatantene til et endelig volum som var 10 ganger større enn det opprinnelige prøve-volumet. Prøvene ble deretter konsentrert/dialysert 10 ganger i Minicon B15 konsentrasjonsinnretning (molekylvekts-grense 15.000, Amicon Co.). Prøvene ble deretter fortynnet til 10 ganger det opprinnelige prøve-volumet og konsentrert 50 ganger. Det oppnådde PCA-ekstraktet var en femte-del av det opprinnelige prøve-volum. Denne prøven ble deretter analysert ved hjelp av konkurrerende ELISA, som beskrevet tidligere. Plasmaprøver fra-friske frivillige med ulike mycin-konsentrasjoner tilsatt og ført gjennom den ovennevnte fremgangsmåten ble anvendt som standarder. Resultatene for SIMA-analysene på prøver fra 39 pasienter med kolorektal cancer, 2 pasienter med brystcancer, 5 pasienter med ulcerøs kolitt, og 7 kontroller viste at SIMA antigen aktivitet kunne påvises ved små konsentrasjoner i noen kontroll-pasienter og ved høyere konsentrasjoner i alle med unntak av 2 av cancer-pasientene. 60% av prøvene fra pasientene med trinn B kolorektal cancer (definert som de cancere som ikke har noen åpenbar spredning til andre organer), 91% fra trinn C (definert som de cancere med påviselige metastaser i lokale lymfeknuter) og 86% fra trinn D (cancer som har spredd seg til fjerntliggende organer, slik som leveren) inneholdt forhøyede mycin-nivåer sammenlignet med kontrollene. SIMA ble også påvist i en blodprøve fra en pasient med trinn A kolorektal cancer, og 2 pasienter med brystcancer.

Analyse med hensyn på LIMA er bare blitt utført med fortynnede serum-prøver, uten trinnene som omfatter konsentrasjons/dialyse som ble anvendt i SIMA-forsøkene. Bare en liten del av pasientene med ikke langt fremskreden kolorektal cancer hadde målbar LIMA-11%

i trinn B, 29% i trinn C; men en større del (67%) av trinn D cancer-pasienter hadde forhøyede LIMA-serum-nivåer. En meget stor del (80%) av pasientene med ulcerøs kolitt viste høye nivåer av sirkulerende LIMA, til og med med denne relative lite sensitive analysen. Så denne LIMA-analysen kan være av verdi for påvisning av inflammatorisk sykdom i tykktarmen.

B. " SANDWICH" IMMUNOASSAYS

De ovennevnte beskrevne monoklonale antistoff kan også anvendes i en "sandwich" immunoassay.

Denne type immunoassay har en rekke fordeler i forbedring av sensiviteten av analysen, og i tillegg har man ferre trinn enn i den konkurrerende inhiberende analysen som er beskrevet over. Videre, "signal" i en "sandwich" immunoassay (dvs. ved anvendelse av radioaktivitet eller en enzym-merket antistoff-farge i brønnen) er direkte proporsjonal til mycin antigen konsentrasjonen, noe som i høyeste grad forenkler beregning og behandling av resultatene sammenlignet med en konkurrerende inhiberende analyse.

Analysen omfatter en fast overflate belagt med monoklonalt antistoff for å immobilisere mycin-molekylet, og det samme monoklonale antistoff merket (med<125>I eller et enzym) for å påvise nærvær av mycin bundet til det belagte antistoff

(se fig. 6) .

a. Detaljer i en SIMA eller LIMA radioimmunoassay ( RIA)

( Figur 6)

1. Brønner av millititer HA-plater (Millipore Corporation, USA) er belagt med protein A-renset monoklonalt antistoff IgG (omtrentlig 10 pg/ml) fortynnet i buffer (natrium-karbonat/bikarbonat-buf f er pH 9 , 6 , 50 pl pr. brønn). Platene inkuberes i 3-5 timer ved 37°C. 2. Til 100 pl av serum-prøvene eller standardene tilsettes 200 ul 0,2M natrium-acetat pH 5,0, og oppvarming ved

70 - 1°C i 15 min., deretter sentrifugering ved

9000 g i 10 min. Standardene inneholdt 0, 1,5, 5,0, 15, 50, 150 og 500 pl/ml av SIMA eller LIMA fremstilt i kombinert serum oppnådd fra friske frivillige.

125 3. I-merket monoklonalt antistoff fortynnet i PBS inneholdende 1% BSA tilsettes deretter til den acetat-ekstraherte supernatanten (omtrent 0,1 pCi pluss 100 pl supernatant), og inkuberes ved 37°C i 1 time.

4. Belagte brønner av millititer-plater vaskes deretter

4 ganger med PBS/Tween og platene blokkeres i 30 min. med 1% BSA i PBS ved 3 7°C. 5. Etter blokkering, vaskes platene tre ganger med PBS/Tween. Prøver (50 pl pr. brønn i to brønner) preinkubert med<125>I-merkede antistoffer og deretter tilsatt til brønnene, inkuberes over natten ved 4°C. 6. Etter inkubering over natten, vaskes brønnene 5 ganger med PBS/Tween, tørkes tørre ved hjelp av filtere,

og filterne på bunnen av hver brønn rustes ut og telles i en garnma-teller.

SIMA og LIMA nivåene uttrykkes som skjønsmessige enheter/ml, bestemt relativt til protein-innholdet i referanse-standarden for SIMA og LIMA.

En rekke forsøk er blitt utført for å vurdere påliteligheten og reproduserbarheten av "sandwich" analysen. Tabell 4 viser variasjonen oppnådd mellom bestemmelser utført in triplo i en typisk analyse av kontroll-serum. For serum-analysene av SIMA, er varierbarheten størst (cr = 10%) ved nivåer på 1,5 p/ml hvor analysene ikke betraktes å være pålitelige (derfor er alle verdier mindre enn 5 u/ml SIMA ikke gitt spesifikke verdier). For serum-nivåer på 5 til 500 U/ml SIMA er intra-assay variabiliteten 5,6% eller mindre.

b. Detaljer i en LIMA enzym- immunoassay ( EIA)

( Figur 7)

1. Polystyren mikrotiter-plater (Nunc Immunoplates) belegges med anti-LIMA monoklonalt antistoff IgG (fra hyberidoma cellelinje 2C3) i bikarbonat-buffer i 3 timer ved 37°C. Platene vaskes to ganger med vaske-buffer (PBS/Tween/natrium-azid, pH 7,2-7,6),

og deretter tørket.

2. 50 ul av en blokkerende løsning (bovint serum-albumin oppløst i PBS inneholdende natrium-azid (pH 7,4) tilsettes deretter til hver brønn på platen og inkuberes ved 37°C i 1 time.

3. Til 100 pl LIMA standard-løsning (standard LIMA

oppløst i normalt menneske-serum, inneholdende natrium-azid, for å gi en antigen-konsentrasjon på

0, 1,5, 5, 15, 50, 150 og 500 enheter pr. ml) eller serum-prøver, tilsettes 200 pl acetat ekstraksjons-buffer (0,2M natrium-acetat pH 5,0 inneholdende natrium-azid), og oppvarming ved 70 - 1°C i 15 min. Avkjøling til romtemperatur og sentrifugering ved 10.000 g i 10 min. i en utsvingende rotor.

4. Mikrotiter-plater vaskes tre ganger med vaske-buffer og tørkes. 5. 50 pl supernatant fra acetat/varme-behandlede standarder eller serum-prøver tilsettes til hver brønn (to brønner pr. prøve). Inkuber plater ved 37°C i 1 time. 6. Mikrotiter-platene vaskes syv ganger med vaske-buffer og tørkes deretter. 7. 50 pl pr. brønn av alkaliske fosfatase-konjugert anti-LIMA rrion ok 1 on a 11 antistoff, fortynnet 1:300 i fosfat-buffret saltløsning inneholdende 1% bovint serum-albumin tilsettes. Inkuber ved 37°C i 1,5 time. Vask 4 ganger i en vaske-buffer, 3 ganger i destillert vann og tørk deretter. Tilsett 100 pl pr. brønn av substrat (p-nitrofenyl-fosfat), oppløst i en konsentrasjon på 2 mg pr. ml i substrat-fortynnings-buffer (0,2 M natrium-karbonat/bikarbonat-buffer inneholdende 0,IM magnesium-klorid). Inkuber ved 37°C i 20 min. 8. Tilsett 100 pl pr. brønn av en løsning som stanser enzym-reaksjonen (0,5 M natrium-hydroksyd). 9. Avles optisk tetthet ved 405 nm i en passende mikrotiter-plate-avieser.

Evaluering av analyse- resultat

(i) Oppfør en standard-kurve ved å plotte den gjennomsnittlige optiske tetthet oppnådd for hver LIMA-standard (på Y-aksen) mot den korresponderende LIMA-konsentrasjonen (X-aksen). (ii) Ved anvendelse av den gjennomsnittlige optiske tetthet for hver serum-prøve, bestemm den korresponderende konsentrasjonen av LIMA i enheter pr. ml, fra standard-kurven.

Dersom prøven krever ytterligere fortynning (dvs. LIMA-konsentrasjon > 150 U/ml) for å gi en verdi som kan leses av på standard-kurven, må den verdien som oppnås fra standard-kurven multiplisseres med tilsvarende fortynnings-faktor for å gi LIMA-konsentras jonen i serum.

Et eksempel er vist i tabell 5 og fig. 8 er fremstilt fra data i tabell 5.

Et eksempel på reproduserbarheten av det ovennevnte LIMA EIA er indikert i tabell 6 som viser variasjonen oppnådd mellom bestemmelsene in triplo i en analyse av serum-prøver inneholdende forskjellige mengder LIMA. Variabiliteten er høyest for verdier mindre enn 2,5 U/ml (variasjonskoeffisient 10%) eller verdier større enn 150 U/ml (variasjonskoeffisient 12%) . Serumnivået utenfor disse grensene (dvs. <2 eller >150 U/ml) er derfor betraktet som upålitelig. Prøver inneholdende > 150 U/ml LIMA bør derfor fortynnes og måles på nytt.

c. Kliniske resultater

Tabell 7 under viser en oversikt over resultater fra prøver fra pasienter med ulike sykdommer og fra friske kontroller, og viser resultatene av SIMA og LIMA RIA (se som over) og CEA serum-analyser for det formål å sammenligne antall prøver som kun var positive for SIMA, kun for LIMA, kun for CEA, eller en hvilken som helst kombinasjon av disse tre markører.

C. ANDRE IMMUNOASSAY FREMGANGSMÅTER

En annen variasjon av den ovennevnte "to-side" immunoassay kan være å anvende en polyklonal anti-mycin antiserum (dvs. fremstilt i kaniner eller sau) for å belegge den faste fasen. Dette vil gjøre det mulig å anvende et umerket monoklonalt antistoff som det "andre" antistoff i analysen, etterfulgt av påvisning av det muse-monoklonale med et merket kanin eller saue anti-mus antistoff. Dette systemet (eller motsatt):monoklonalt antistoff for belegging av den faste fasen og polyklonalt antisera for påvisning) kan tilveiebringe bedre forsterkning av positive signaler enn når det monoklonale antistoff er merket direkte. Man bør også legge merke til at den foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av et enzym-substrat-inneholdende fluor slik som 4-metylumbelliferyl (4MU)-fosfat (for alkalisk fosfatase) eller 4MU-3 -D-galakside (for 3-galaktos-idase) i "sandwich"-immunoassays. Det samme enzym-bundne monoklonale antistoff kan anvendes som det i den kolorit-metriske fremgangsmåte som beskrevet over. Den ventede økning i sensitivitet vil være omkring 10 ganger. Andre kjente påvisnings-systemer, slik som protein A, avidin-biotin, osv., kan også anvendes. Der hvor man anvender merket protein A som påvisnings-system i disse "sandwich"-immunoassays, da vil antistoffet som pålegges den faste fase (enten monoklonalt eller polyklonalt) bli et F(ab)-fragment, og det påviselige antistoff et intakt molekyl inneholdende Fc segmentet. En rekke forskjellige faste faser kan anvendes med disse systemene i tillegg til mikrotiter-brønnene, slik som forskjellige typer kuler. I tillegg kan man anvende membraner som adsorberende overflater for å binde antigener.

LITTERATURHENVISNINGER

1. Ma, J., De Boer, W., Ward, H.A. 6 Nairn, R.C.

(1980) . "Another Oncofoetal Antigen in Colonic Carcinoma" Br. J. Cancer 41 325-328. 2. Pihl, E. , Nairn, R.C, Hughes, E.S.R., Cuthbertson, A.J.&Rollo, A.J. (1981)-. "Mucinous Colorectal Carcinoma: Immunopathology and Prognosis" Pathology 12 439-447. 3. De Boer, W., Ma, J., Rees, J.W. & Nayman, J.

(1981) . "Inappropriate mucin production in gall

bladder metaplasia and neoplasia - an immur.ohistological study" Histopa thol ogy 5_ 295-303 .

(1981) . 4. De Boer, W., Ma, J.&Nayman, J. (1981). "Intestine-associated antigens in ovarian tumours: An immunohistoLogicai study" Pathology 13 547-555. 5. Ma, J., De Boer, W.&Nayman, J. (19 82). "The presence of oncofoetal antigens in large bowei carcinoma". Aust. S N. Z. Journal of Surgery 5 2 30-34. 6. Ma, J. , De Boer, W.&Nayman, J. (1982). "Intestinal mucinous substances in gastric intestinal metaplasia and carcinoma studied by immunofluorescence". Cancer 49 1664-1667. 7. Ma, J., Kandley, C.J.&De Boer, W. (1983). "An ovarian tumour specific mucin antigen - immunohistological and biochemical studies" Pathology 05 385-391. 8. Nayman, J., De Boer, W.6Ma, J. (1983). "Inappropriate nmcin production in Endodermal carcinoma - one point of view". Japanese Journal of Surgery 13 317-323. 9. Gold, P. and Freedman, S.O. (1965). Specific carcino-embryonic antigens of the human digestive systera. J. Exped. Med., 122 , 467-481 . 10. Mackay, I.R. (1979). In. Immunodiagnosis of Cancer, Herberman and Mclntire (eds), Marcel Dekker, N.Y. 255. 11. Cuthbertson, A.M., Hughes, E.S.R., Nairn, R.C. Nind, A.P.P. and Pihl, E. (1981). CEA testing: Is it useful in coiorectal cancer? Med. J. Australia, 170 . 12. Cuthbertson, A.M., Hughes, E.S.R., Nairn, R.C. Nind, A.P.P. and Pihl, E. (1981). CEA testing in coiorectal cancer. Med. J. Australia, 201. 13. Pihl, E., McNaughtan, J., Ma, J., Ward, H.A. and Nairn, R.C. (1980). Immunohistological patterns of carcinoembyronic antigen in coiorectal carcinoma. Correlation with staging and blood levels.

Pathology,' 12, 7-13.

14. Herlyn, H. , Steplewskri, Z., Herlyn, D., and Koprowski, I. Coiorectal carcinoma - specific antigen: Detection by means of monoclonal antibodies. Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 76:1438, 1979.

15. Koprowski, B., Herlyn, H., Steplewski, Z.&Sears, H.F., Specific antigen in serum of patients with colon carcinoma. Science 212:53, 1981. 16. Magnani, J., Brocklaus, M., Smith, D., Ginsburg, V., Blaszcyk, M., Mitchell, D., Steplewsky, Z.&Koprowski, H. A monoclonal antibody defined antigen of colon carcinoma. Science, 212:55, 1981. 17. Devillano, B. and coil. Radioimmunometric Assay for a Monoclonal Antibody defined Tumor Markers CA 19-9™. Clin. Chem. 29 :549-552 . 1983 . 18. Sears, H., Herlyn, J., Delvillano, B., Steplewski, Z.&Koprowski, H. A clinical evaluation of patients with coiorectal cancer. Clinical immunology, 2, : 141, 1982. 19. Magnani, J., Steplewski, Z., Koprowski, H., & Ginsburg, V. Identification of the gastrointestinal and pancreatic cancer-associated antigen detected by monoclonal antibody 19-9 in the sera of patients as a mucin. Cancer Research : 43, 5489-5492, 1983. 20. Friguet, B., Djavadi-Ohaniance, L., Pages, J. , Bussaro, A., & Goldberg, M. A convenient enzyme-linked immunosorbent assay for testing whether monoclonal antibodies recognise the same antigenic site. Application to hybridomas specific for the 62-subunit of E. coli tryptophan synthase. J. Immunol. Methods. : 351-358, 1983. 21. Trerelyan, W.E. and Harrison, J.S.. Studies in yeast metabolism. I. Fractionation and microdetermination of cell carbohydrates. Biochem J. 50 : 298-303, 1952.

Claims (14)

1. Fremgangsmåte for in vitro diagnostisering til fordel for nærvær av cancerceller eller andre celler som danner mycin antigener i en pasient, karakterisert ved analysering av en prøve av en fysiologisk væske fra pasienten til påvisning av tilstedeværelse avSIMA og/eller LIMA i ovennevnte prøve.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at ovennevnte prøve er en prøve av blod, blodserum eller blodplasma fra pasienten.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at ovennevnte prøve bringes i kontakt med antistoff overfor SIMA og/eller LIMA eller fragmenter derav, og påvisning av tilstedeværelse av bindingen mellom ovennevnte antistoff eller fragmenter derav og deres tilhørende antigener.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at ovennevnte prøve bringes i kontakt med antistoff overfor SIMA og/eller LIMA eller fragmenter derav merket med en markør som er i stand til å tilveiebringe et påviselig signal, og påvisning av tilstedeværelsen av bindingen mellom ovennevnte merkede antistoff eller fragmenter derav og deres tilhørende antigener.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 3 eller 4, karakterisert ved at ovennevnte antistoff er monoklonale antistoff.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, 4 eller 5, karakterisert ved at ovennevnte antistoff eller fragmenter derav er merket med et enzym eller en radioaktiv isotop.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at: (i) antistoff overfor SIMA og/eller LIMA eller fragmenter derav bindes til en bærer av fast stoff, (ii) ovennevnte prøve bringes i kontakt med ovennevnte bærer av fast stoff, og (iii) tilstedeværelsen av korresponderende antigener i ovennevnte prøve som er bundet til ovennevnte antistoff eller fragmenter derav bundet til ovennevnte bærer av fast stoff, påvises.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7, karakterisert ved at påvisning av nærvær av tilhørende bundne antigener omfatter: (iv) bringing av ovennevnte bærer av faststoff i kontakt med med antistoff overfor SIMA og/eller LIMA, eller fragmenter derav, merket med en markør som er i stand til å tilveiebringe et påviselig signal, og (v) påvisning av bindingen mellom ovennevnte merkede antistoff eller fragmenter derav og korresponderende antigen bundet til ovennevnte bærer av faststoff.

9. Diagnostisk kit eller system til påvisning in vitro av nærvær av cancerceller eller andre celler som danner mycin antigener i en pasient, karakterisert ved at ovennevnte kit eller system omfatter midler til påvisning av nærvær av SIMA og/eller LIMA i en prøve av en fysiologisk væske fra pasienten.

10. Kit eller system som angitt i krav 9, karakterisert ved at ovennevnte kit eller system omfatter antistoff som er i stand til en immunologisk reaksjon med SIMA og/eller LIMA, eller fragmenter derav, samnen rned indikator/midler til påvisning av nærvær av en immunologisk reaksjon mellom ovennevnte antistoff eller fragmenter derav og deres tilhørende antigener.

11. Kit eller system som angitt i krav 10, karakterisert ved at ovenevnte kit eller system videre omfatter en bærer av faststoff som ovennevnte antistoff eller fragment er bundet til.

12. Kit eller system som angitt i krav 10, karakterisert ved at ovennevnte indikator-midler omfatter en markør som er i stand til å tilveiebringe et påviselig signal og hvor ovennevnte markør er bundet til ovennevnte antistoff eller fragmenter derav.

13. Kit eller system som angitt i krav 10, karakterisert ved at ovennevnte indikator-midler omfatter en markør som er i stand til å tilveiebringe et påviselig signal, og hvor ovennevnte markør er bundet til andre antistoff som er fremkalt overfor førstnevnte antistoff og som indikerer nærvær av ovennevnte immunologiske reaksjon ved binding til de førstnevnte antistoff.

14. Kit eller system som angitt i krav 12 eller 13, karakterisert ved at ovennevnte markør er et enzym eller en radioaktiv isotop.