NO862537L

NO862537L - Ny analyse for, og rensing av, amyloidkomponenter og anvendelser derav.

Info

Publication number: NO862537L
Application number: NO862537A
Authority: NO
Inventors: Dan Serban; Christiane Rordorf
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1985-06-25
Filing date: 1986-06-24
Publication date: 1986-12-29
Also published as: ES556534A0; GB8516081D0; FI862595A0; JPS622161A; IL79199A0; DK297086D0; GR861603B; US4782014A; ES8802197A1; NO862537D0; ES8802618A1; EP0206302A3; AU5915186A; ES557795A0; ZA864698B; FI862595A7; DK297086A; EP0206302A2; FI862595L

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en ny fremgangsmåte for immunologisk analyse med hensyn på serumamyloid-A-protein (SAA) og serumamyloid-P-komponent (SAP), analysesett for formålet og en fremgangsmåte for rensing av SAA og SAP.

Som en følge av de fleste former for vevsskade, infeksjon eller betennelse, øker konsentrasjonen av et antall plasmaproteiner, og returnerer deretter til normale verdier når heling eller rekonvalesens finner sted. Denne prosessen er kjent som akuttfase-responsen. Hos individer med kronisk betennelse kan høye nivåer av noen akuttfase-proteiner vedvares.

Eksempler på akuttfase-reaktanter er C-reaktivt protein (CRP) og serumamyloid-A-protein (SAA). SAA er et oq-globulin bestående av en enkelt polypeptidkjede med molekylvekt mellom 11 500 og 14 000 Dalton. Dets plasmakonsentrasjon, som normalt er rundt 1 jig/ml eller lavere i friske individer, øker betydelig i løpet av få dager etter vevsskade eller eksponering mot betennelsesstimuli. Beslektet med den akuttfase-reak-tanten CRP er serumamyloid-P-komponenten (SAP), et 9,5S oq-glyko-protein av molekylvekt 235 000 Dalton. Mens muser-SAP-konsentrasjonen øker betydelig ved inflammasjon, er humant-SAP ikke en viktig akuttfase -reaktant, selv om nivået kan forøkes moderat ved noen kroniske betennelsessykdommer og ondartede tilstander [M.B. Pepys, "Clinics in Immunology and Allergy", bind 1, side 77-101 (1981)].

SAP og SAA syntetiseres av hepatocyter etter stimuli fra aktiverte makrofager. Den SAA- og SAP-induserende faktoren er vist å være lik, om ikke identisk med, det monokine interleukin-1.

SAA og SAP er immunologisk identiske med henholdsvis amyloid A-fibriler og amyloid P-komponent, funnet som bestanddeler av alle amyloiddegenerasjonsavsetninger. Amyloiddegenerasjon er en sykdom som finner sted sekundært til en kronisk betennelse.

Endringer i konsentrasjon og forhold mellom akutt fase-proteiner, f.eks. CRP og SAA, og av SAP er viktige for diagnose og behandlingsformål når det gjelder en rekke akutte og kroniske betennelsesykdommer så som reumatiske tilstander, f.eks. rheumatoid arthritt, ungdomspolyarthritt, ankylotisk spondylitt, Reiter's syndron, psoriatisk arthritt eller reumatisk feber, vasculitiske syndromer, Chron's sykdom, autoimmuniseringstilstand-er, f.eks. systemisk lupus erythematosus eller polymyositis, ondartede tilstander, avvisning av transplantater o.l.

Det vanlige forsøket for måling av endringer i akuttfase- og beslektede proteiner har inntil nylig vært erythrocytt-sedimentasjonshastigheten. Dette forsøket er billig og lett å utføre, men som en indirekte fremgangsmåte er det ikke svært nøyaktig og reproduserbart. Med utviklingen av antisera rettet mot disse proteinene er det nå mulig å måle indivi-duelle komponenter av akuttfase-responsen og oppnå verdifull informasjon for diagnostiske formål. CRP har vært, og er fremdeles, den akuttfase-reaktanten som har vært målt i størst grad. Men senere resultater tyder på at SAA er en mer følsom indikasjon på betennelse enn CRP [R.E. Chambers et al., Annals of the Rheumatic Diseases, 42j_ 665 (1983)]. Det er også blitt klart at ikke alle akuttfase-proteinene dyrkes i parallell og at ytterligere verdifull informasjon kan oppnås fra fastleggelsen av SAP-nivået i plasma.

De kjente teknikkene for kvantitativ bestemmelse av SAA er radioimmunoanalyser (RIA) og enzym-bundet immunosorbentanalyser (ELISA)

[G. Marhaug, Scand. J. Immunol. 18^329 (1983)]. Disse analysene er i sin nårværende form ikke svært følsomme og mangler høy reproduserbarhet. Det foreligger et behov for en mer følsom og pålitelig analyse som tillater bestemmelse av SAA i minimal mengde i serum med enkle og sikre reagenser i hele konsentrasjonsområdet fra 0,1 jjg/ml opptil 2000 ug/ml.

SAP måles vanligvis ved "rocket" immunoelektroforese, ved indirekte kompetitiv ELISA (som krever store mengder renset SAP) eller ved kompetitiv RIA (som krever fremstilling og behandling av radioaktivt materiale). Alle disse teknikkene mangler tilstrekkelig følsomhet og krever store mengder serum hvilket gjør rutineanalyser vanskelige. En følsom metode er derfor påkrevet som tillater måling av SAP i en liten mengde serum på en sikker og reproduserbar måte i et konsentrasjons-område fra 1 ug/ml til 100 ug/ml i serum.

Det er overraskende funnet at serumamyloid-P-komponent (SAP) bindes til en plastoverflate i nærvær av kalsiumioner og beslektede toverdige ioner så som sink og kobberioner, og, mer effektivt, til organiske eller uorganiske bærere som inneholder nitrerte fenylgrupper i nærvær av kalsiumioner eller beslektede toverdige ioner. Videre er det funnet at serumamyloid-A-protein (SAA) bindes til en plastoverflate og, mer effektivt, til organiske eller uorganiske bærere som inneholder nitrerte fenylgrupper, eventuelt uten eller i nærvær av kalsium-, sink- eller beslektede toverdige ioner. Denne foretrukne binding av SAA og SAP til en plastoverflate eller til en bærer som inneholder nitrerte fenylgrupper, også i nærvær av et stort overskudd av proteiner som ikke er av betyd-ning for bindingen, danner grunnlaget for fremgangsmåten for immunologisk analyse med hensyn på SAA og SAP ifølge foreliggende oppfinnelse.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for immunologisk analyse med hensyn på serumamyloid-A-protein (SAA) og/eller serumamyloid-P-komponent (SAP), kjennetegnet ved at SAA og SAP er bundet til en plastoverflate av en bærer eller til en bærer som inneholder nitrerte fenylgrupper, hvorved kalsium eller beslektede toverdige ioner må være tilstede for SAP-binding.

Spesielt vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for immunologisk analyse hvorved plastoverflaten av en egnet bærer, f.eks. av en mikrotiterplate, et forsøksrør, et lag, en perle eller lignende, inkuberes med en oppløsning inneholdende SAA og/eller SAP i nærvær av kalsiumioner eller beslektede toverdige ioner så som sink- og kobbe r (II) ioner, eller med en oppløsning inneholdende SAA uten ytterligere ioner, og SAA og SAP bundet til plastoverflaten detekteres og kvantifiseres ved hjelp av en hvilken som helst av de vanlige teknikkene innenfor immunoanalyse som er kjente per se. Bæreren kan være enten ren plast eller et hvilket som helst materiale belagt med plast. Plasten kan være av naturlig, men er spesielt av syntetisk, opphav, f.eks. et harpiksholdig polymert organisk stoff så som polystyren, polypropylen, polyetylen, polyvinylklorid, polyvinylacetat og lignende. Binding av SAA og SAP til plastoverflaten finner sted også i nærvær av et irrelevant protein tilsatt i overskudd, f.eks. i nærvær av overskudd bovinserumalbumin tilsatt for å mette den gjenværende bindingskapasiteten av plastoverflaten.

Oppfinnelsen vedrører spesielt en fremgangsmåte for immunologisk analyse hvori en egnet bærer, f.eks. plastoverflaten av en titerplate eller av et forsøksrør, f.eks. av polystyren, polypropylen eller polyvinylklorid, glass-eller plastperler, filterpapir eller dekstran, celluloseacetat eller nitrocelluloselag eller lignende, belegges med en forbindelse som inneholder nitrerte fenylgrupper, deretter inkuberes med en oppløsning inneholdende SAA og/eller SAp i nærvær av kalsiumioner, eller med en oppløsning inneholdende SAA uten kalsiumioner, og SAA og SAP bundet til bæreren detekteres og kvantifiseres ved en hvilken som helst av de vanlige teknikkene for immunoanalyser som er kjente per se. Forbindelsen som inneholder nitrerte fenylgrupper kan være et polypeptid, f.eks. albumin, så som bovinserumalbumin, "keyhole limpef-hemocyanin, casein, globulin eller lignende, et polysakkarid, f.eks. dekstran, stivelse, gelatin eller cellulose, eller en syntetisk polymer, f.eks. polyakrylhydrazid. En nitrert fenylgruppe er en o-, m- eller p-nitrofenylgruppe, en dinitrofenylgruppe, f.eks. en 2,4- eller en 3,5-dinitrofenylgruppe, eller en trinitrofenylgruppe, f.eks. en 2,4,6-trinitrofenylgruppe.

Spesielt foretrukket i fremgangsmåten for immunologisk analyse er en bærer belagt med en forbindelse som inneholder trinitrofenylgrupper, f.eks. 2,4,6-trinitrofenylgrupper, spesielt "keyhole limpet"-hemocyanin som inneholder 2,4,6-trinitrofenylgrupper. Effektiv binding til denne foretrukne bæreren observers også i overskudd av irrelevant protein.

Fremstillingen av forbindelser som inneholder nitrerte fenylgrupper er velkjent innen teknikken. Forbindelsen som inneholder nitrerte fenylgrupper belegges på bæreren ved enkel adsorpsjon eller eventuelt etter aktivering av bæreren, f.eks. med glutaraldehyd.

Immunologiske teknikker for å detektere og kvantifisere SAA eller SAP bundet til en bærer er velkjente innen teknikken og er f.eks. de teknikkene som typisk anvendes i enzymimmunoanalyser, radioimmunoanalyser eller immunofluorescensanalyser. Speiselt behandles bæreren hvortil det er bundet SAA og/eller SAP med et antiserum eller et monoklonalt antistoff som er spesifikt for SAA eller spesifikt for SAP. Dette monoklonale antistoffet eller de polyklonale antistoffene av antiserumet kan være merket på egnet måte, f.eks. med en radioisotop, et enzym eller en fluorescerende forbindelse, og måles direkte eller etter utvikling med et egnet enzymsubstrat. Ellers detekteres det umerkede antiserumet eller det monoklonale antistoffet med et egnet merket andre antistoff, fortrinnsvis polyklonalt antiserum mot immunoglubuliner av dyrespesies hvorfra det første antiserumet eller det monoklonale antistoffet er avledet. Mange variasjoner av disse prinsippene for immunologisk analyse er kjente innen teknikken, og oppfinnelsen dekker også analysefrem-gangsmåter hvor det anvendes en annen fremgangsmåte for deteksjon av en spesifikk forbindelse.

Den foretrukne fremgangsmåten for immunologisk analyse er en enzym-bundet immunoadsorbert analyse (ELISA), hvori en bærer belegges med et polypeptid, polysakkarid eller en syntetisk organisk polymer som inneholder nitrerte fenylgrupper, fortrinnsvis trinitrofenylgrupper, deretter inkuberes med en oppløsning inneholdende SAA og/eller SAP i nærvær av kalsiumioner, eller med en oppløsning inneholdende SAA uten kalsiumioner, etterfulgt av et spesifikt antiserum eller en oppløsning av monoklonale antistoffer som bindes til SAA eller til SAP. De bundne monoklonale antistoffene eller polyklonale antistoffene av antiserumet detekteres ved hjelp av et andre antistoff som finnes i et polyklonalt antiserum mot immunoglobuliner fra det dyrespesies hvorfra det første antiserumet eller monoklonale antistoffet er avledet, hvori dette andre antistoffet er konjugert med et enzym. Mengden av det andre, enzym-konjugerte antistoffet som er bundet gjøres synlig og måles ved utvikling med et enzymsubstrat. Isteden for enzym-merkede antistoffer er det også mulig å anvende antistoff-biotin konjugater sammen med avidin-enzym-konjugater.

Eksempler på enzymer som er nyttige ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er pepperrotperoksidase, alkalisk fosfatase,3-D-galaktosidase, glukoseoksidase, glukoamylase, karbonisk anhydrase, acetylkolinesterase, lysozym, malatdehydrogenase, glukose-6-fosfatdehydrogenase eller urease. Foretrukne enzymer er pepperrotperoksydase som kan utvikles f.eks. med enzymsubstratene 5-aminosalicylsyre, o-fenylendiamin, 3,3'-dimetoksy-benzidin, 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin, 2,2'-azino-bis-(3-etylbenzotiazolin- 6-sulfonsyre) eller lignende og hydrogenperoksyd, og alkalisk fosfatase som f.eks. frigir p-nitrofenyl fra enzymsubstratet p-nitrofenylfosfat.

I en foretrukket radioimmunoanalyse eller en foretrukket immunofluorescensanalyse ifølge oppfinnelsen, utføres de samme trinnene som beskrevet ovenfor for en foretrukket ELISA, med det unntaket at det andre antistoffet er radiomerket, f.eks. med<125>jteller konjugert til en fluorescerende forbindelse, f.eks. til fluorescein, og at utviklingen med enzymsubstratet utelates.

Immunoanalysene beskrevet ovenfor kan anvendes for å bestemme mengden av SAA og/eller SAP i serum, spesilt humant serum, på en rutinemessig basis ved anvendelse av bare små mengder serum fremstilt fra 0,1 ml eller mindre helt blod, dette letter diagnosen og overvåkning-en av den terapeutiske behandlingen av akutte og kroniske betennelsessykdommer.

Oppfinnelsen vedrører også analysesett for kvalitativ og kvantitativ bestemmelse av SAA og/eller SAP inneholdende bærere og reagenser som er egnet for en immunoanalyse som beskrevet ovenfor.

Forsøkssettene ifølge oppfinnelsen for en ELISA inneholder f.eks. en egnet bærer, f.eks. en bærer som en plastoverflate eller en bærer belagt med et polypeptid, polysakkarid eller syntetisk organisk polymer som inneholder nitrofenylgrupper, fortrinnsvis trinitrofenylgrupper, eventuelt oppløsninger av en forbindelse som inneholder nitrofenylgruper, fortrinnsvis trinitrofenylgrupper, oppløsninger av et monoklonalt eller av polyklonale antistoffer som binder SAA eller SAP og, dersom de første antistoffene ikke er merket med et enzym, oppløsninger av polyklonale, enzym-konjugerte andre antistoffer som bindes til de første antistoffene, enzymsubstrater i fast eller oppløst form, standard oppløsninger av SAA og/eller SAP, bufferoppløsninger og eventuelt kalsiumsalter eller beslektede toverdige salter så som sink- og kobber(II)salter i fast eller oppløst form, og eventuelt pipetter, reaksjonsbeholdere, kalibreringskurver, tabeller over fargeintensitet og lignende. Oppløsningene kan være i konsentrert form eller frysetørket slik at de krever fortynning med vann eller bufferoppløsning før bruk.

Foretrukne analysesett inneholder en bærer belagt med et polypeptid som inneholder trinitrofenylgrupper, f.eks. en bærer belagt med "keyhole limpet"-hemocyanin som inneholder 2,4,6-trinitrofenylgrupper.

Analysesett ifølge oppfinnelsen for en radioimmunoanalyse eller en immunofluorescensanalyse kan inneholde de samme bærerne, reagensene og utstyret som beskrevet ovenfor, men henholdsvis radiomerkede antistoffer eller antistoffer konjugert med fluorescerende forbindelser, som erstatter de enzym-konjugerte antistoffene og enzymsubstratet.

Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte for rensing av SAA og/eller SAP ved affinitetskromatografi på faste bærere som inneholder nitrerte fenylgrupper.

Et bærermateriale på en uorganisk eller organisk basis, f.eks. silikater, kryssbundet agarose, dekstsran, polyakrylamid eller polyakrylhydrazid i egnet funksjonalisert form, omsettes på i og for seg kjent måte med en reagens som innfører nitrerte fenylgrupper, fortrinnsvis trinitrofenylgrupper. F.eks. behandles et bærermateriale inneholdende reaktive karbonylhydrazidfunksjoner med 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre som innfører trinitrofenylgrupper, eller med 2,4-dinitrofluorbenzen som innfører dinitrofenylgrupper. Forøvrig behandles et bærermateriale som inneholder reaktive esterfunksjoner, f.eks. N-hydroksysuccinimidester-grupper, med p-nitrofenylhydrazin eller p-nitroanilin som innfører nitrofenylgrupper.

Foretrukket bærermateriale består av kryssbundet agarose som inneholder trinitrofenylgrupper, f.eks. 2,4,6-trinitrofenylgrupper.

En slik bærer som inneholder nitrerte fenylgrupper suspenderes i et egnet vandig oppløsningsmiddel inneholdende kalsiumioner eller beslektede toverdige ioner, så som sink-, eller kobberioner, f.eks. saltvann inneholdende kalsiumklorid, eller en bufferoppløsning inneholdende kalsiumklorid, f.eks. tris(tris[hydroksymetyl]aminometan)-buffret saltvann og kalsiumklorid. Oppløsningen inneholdende SAP, f.eks. serum eller andre bio-logiske væsker, behandles med et kalsiumsalt, f.eks. kalsiumklorid, eller et salt som inneholder et beslektet toverdig ion, bringes deretter i kontakt med bæreren som inneholder nitrerte fenylgrupper, f.eks. ved å helle den på toppen av en kolonne inneholdende bæreren og la den flyte gjennom bæreren ved hjelp av tyngdekraften eller ytre trykk. SAP holdes tilbake på bæreren, mens ubundne proteiner og andre forurensninger vaskes bort med vandige oppløsninger som inneholder kalsiumioner eller lignende toverdige ioner, f.eks. tris-buffret saltvann inneholdende kalsiumklorid. SAP elueres med egnede vandige oppløsninger inneholdende ione-chelateringsmidler, f.eks. saltvann eller tris-buffret saltvann inneholdende etylendiamintetraeddiksyre eller beslektede chelaterende forbindelser, vandige syrer eller bufferoppløsninger i et pH-område under pH 5, f.eks. rundt pH 3, eller bufferoppløsninger som inneholder p-nitrofenylarsonsyre.

For rensing av SAA behandles bæreren som inneholder nitrerte fenylgrupper fortrinnsvis med et sinksalt, f.eks. sinkklorid, og vaskes deretter med en bufferoppløsning før den SAA-holdige oppløsningen, f.eks. serum, påføres. SAA holdes tilbake på bæreren, mens andre proteiner og forurensninger vaskes bort med vandige saltoppløsninger, f.eks. buffere, så som tris-buffret saltvannsoppløsning. SAA elueres med vandige oppløs-ninger som inneholder rensemidler, f.eks. tris-buffret saltvannsoppløsning inneholdende 0,01 til 2% av en polyetylenglykolfettalkoholeter, av en polyetylenglykolalkylfenoleter, av en polyoksyetylensorbitanfettsyreester eller av et ionisk rensemiddel så som natriumdodecylsulfat, eller med vandige syrer eller bufferoppløsninger i et pH-område under pH 5, f.eks. rundt pH 3.

Eventuelt kan rensefremgangsmåten forbedres ved forbehandling av oppløsningen som inneholder SAA og/eller SAP på en fast bærer som inneholder nitrerte fenylgrupper, men i fravær av kalsium-, sink- eller beslektede toverdige ioner, eller for- eller etterbehandling med immuno-adsorbentbærere som inneholder antistoffer som er spesifikke for for-urensning, f.eks. spesifikke for immunoglobuliner.

SAA og SAP isoleres fra de rensede oppløsningene ved fremgangsmåter som i og for seg er kjente, f.eks. kromatografi over "Sephadex", dialyse, elektroforetisk konsentrasjon og lignende.

Følgende eksempeler illustrerer oppfinnelsen uten på noen måte å begrense dens omfang.

Forkortelser

BSA bovint serumalbumin

DNP dinitrofenyl

EDTA etylendiamin-N,N,N\N'-tetraeddiksyre

EGTA l,2-di(2-aminoetoksy)etan-N,N,N',N'-tetraeddiksyre

ELISA enzym-bundet immunosorbentanalyse

FSC fluoresceinyl

lg immunoglobulin

KLH "keyhole limpet"-hemocyanin

PAH polyakrylhydrazid

PC fosforylkolin

SAA serumamyloid-A-protein

SAP serumamyloid-P-komponent

TBS tris-buffret saltvannsoppløsning

TNP trinitrofenyl

Tris tri (hydroksymetyl) aminometan

Eksempel 1: TNP- derivatiserte polypeptider

11 ml av en KLH-oppslemming i 65% ammoniumsulfat (18 mg/ml, Calbiochem-Behring, La Jolla CA, USA) fortynnes med 4 ml vann, dialyseres mot 0,15 M NaCl/25 mM NaHCC^, sentrifugeres deretter ved 2000 x g i 10 minutter. Supernatanten fortynnes til 25 ml med 0,1 M NaHCO^, og halvparten (12,5 ml, 8 mg KLH pr. ml) blandes med en oppløsning av 12 mg 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre (Fluka, Buchs, Sveits) i 1 ml 0,3 M NaHCC"3. Etter 4 timer i mørke ved 37"C dialyseres blandingen mot saltvannsoppløsning inneholdende 25 mM NaHCO^og filtreres gjennom et 0,45 um filter ("Millex-HA"-filter, Millipore). Det resulterende konjugatet inneholder 43 TNP-rester pr. 100 000 Dalton KLH og kan oppbevares i frossen tilstand i lengre tidsrom uten nedbrytning.

Tilsvarende fremstilles TNP-BSA fra BSA (Merck, Darmstadt, Vest-Tyskland) og 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre slik at man får et konjugat med 15 TNP-rester pr. BSA-molekyl.

Eksempel 2: ELISA for SAP

Brønnene av flatbunnede polystyrenmikrotiterplater ("Immulon", Dynatech, Zug, Sveits) eller polyvinylkloridmikrotiterplater ("Microtest III", Becton Dickinson, Oxnard, CA, USA) inkuberes med enten 100 jjI 0,3 M NaHCC*3 alene, 100 ul KLH 2 ug/ml i 0,3 M NaHC03, eller 100 ul TNP-KLH (eksempel 1) 2 ug/ml i 0,3 M NaHCO^i en time eller mer ved romtemperatur. Platene belagt med TNP-KLH kan lagres ved romtemperatur etter tørking med en varmluftsvifte uten tap av bindingskapasitet. Platene vaskes med 5 mM CaCP), deretter inkuberes hver med 100 ul humane SAP-holdige prøver (standard oppløsninger av serumfortynninger i ELISA-buffer) i 2 timer ved20°C. ELISA-buffer består av TBS (20 mM tris-HCl, pH 7,8, 0,14 m NaCl) som inneholder 0,5% BSA, 0,05% mertiolat ("Thimerosal") og 5 mM CaC^. Platene vaskes med 5 mM CaC^, inkuberes i 2 timer ved 20 °C med 100 jjI kaninantiserum til humant SAP (Calbiochem) fortynnet 1:10^ med ELISA-buffer, vaskes igjen med 5 mM CaCP), og inkuberes over natten i en vannmettet atmosfære ved 20 °C med 100 jjI pepperrotperoksidasekonjugert eselanti-kanin-Ig-antiserum (Amersham Int., Amersham, UK) fortynnet 1:5000 med ELISA-buffer. Platene vaskes, utvikles deretter med 100 jjI pr. brønn av buffret o-fenylendiamin (100 mg i 48,6 ml 0,1 M sitronsyre og 51,4 ml 0,2 M Na2HP04, pH 5,0) som inneholder 0,03% H202i mørke ved 20 °C i 15 minutter. Reaksjonen stoppes ved tilsats av 25 jjI 2,5 M H2SO4og den optiske tettheten og fargen som er utviklet ved enzymreaksjonen bestemmes ved 492 nm ved anvendelse av et "Titertek"-multisveipspektro-fotometer (Flow Laboratories).

Den samme fremgangsmåten kan benyttes for deteksjon av muse-SAP, dersom det tilsvarende antiserum til muse-SAP anvendes.

SAP bindes til polystyren og polyvinylkloridoverflate etter behandling med Ca2+ _ioner. Mer effektiv binding oppnås ved å belegge plastoverflaten med trinitrofenylerte makromolekyler, f.eks. TNP-KLH (tabell 1).

Nærværet av 0,25 mN eller mer CaCP?i alle inkuberingsoppløsningene og vaskeoppløsningene er viktig. En skarp reduksjon av SAP-binding observeres med 0,12 mM CaCP?, og ingen SAP bindes ved 0,06 mM eller lavere konsentrasjoner av CaC^.

Figur 1 viser at med TNP-KLH-belagte polystyrenplater oppnås en lineær avhengighet mellom optisk tetthet og SAP-konsentrasjon i området fra 0,5 til 10 ng/ml. Følsomheten av analysen tillater derfor pålitelig deteksjon av SAP i normalt humant serum ned til en fortynning på 1 til 2 x 10<4>. 1 den foretrukne utgaven av ELISA for SAP anvendes polystyrenmikrotiterplater belagt med TNP-KLH.

Eksempel 3: Analysesett for SAP- ELISA

Et analysesett for en enzym-bundne immunoanalyse beskrevet i eksempel 2 inneholder:

polystyrenmikrotiterplater

20 ml TNP-KLH (eksempel 1), 2 ug/ml i 0,3 M NaHC03, eller polystyrenmikrotiterplater belagt med TNP-KLH (eksempel 2)

1 ml SAP-standardoppløsning 50 ng/ml i ELISA-buffer

20 ml kanin-antiserum til humant SAP fortynnet 1:10<4>

20 ml pepperrotperoksidasekonjugert eselanti-kanin-Ig-antiserum fortynnet 1:5 000

20 ml o-fenylendiamin (10 mg/ml) i citrat/fosfatbuffer, pH 5,0

1 ml H202, 3%

200 ml 5 mM kalsiumklorid

Eksempel 4: Inhibering av binding av SAP til TNP- KLH- belagt polystyren

Fremgangsmåten fra eksempel 2 følges ved anvendelse av polystyrenmikrotiterplater belagt med TNP-KLH. Prøvene som inneholder 40 ng/ml humant SAP får inkuberes med fortynning av forbindelsen som skal undersøkes som en inhibitor i 2 timer ved 20 °C. Prosent reduksjon av SAP-binding til TNP-KLH beregnes sammenlignet med SAP-bindingen i fravær av en inhibitor. Konsentrasjonen av inhibitoren som resulterer i halvparten av den maksimale (50%) inhiberingen av SAP-binding er angitt i tabell 2.

Bindingen av SAP til en TNP-KLH-belagt bærer krever -ioner som beskrevet ovenfor. Det er derfor rimelig at EDTA og EGTA, effektive kalsiumchelateringsmidler, er inhibitorer for SAP-binding ved konsentrasjoner som er like store eller større enn -konsentrasjonen anvendt i analysef r emgangsmåten.

Som ventet konkurrerer trinitrofenylerte polymerer så som TNP-BSA, TNP-PAH og TNP-KLH, og i mindre grad også trinitrofenol (pikrinsyre), effektivt for SAP i en analyse basert på binding til TNP-KLH-belagt polystyren. Bindingen av SAP til dinitrofenol og dinitrofenylerte polymerer er klart svakere, og disse forbindelsene er ikke inhibitorer i foreliggende analyse. Inhiberende egenskaper observeres videre med p-amino- og p-nitrofenylarsonsyre, flavinsyre, pektinsyre, og KLH uten trinitrofenylfunksjoner. To ikke-ioniske rensemidler som er undersøkt ("Brij 35" og "Tween 20") har ingen virkning på SAP-binding til TNP-KLH.

Eksempel 5: Eluering av SAP bundet til TNP- KLH- belagt polystyren

Polystyrenmikrotiterplater belagt med TNP-KLH som beskrevet i eksempel 2 inkuberes med 20 ng humant SAP pr. brønn i 100 jjI ELISA-buffer. Etter vasking med 5 mM CaCl2, inkuberes platene med fortynninger av inhibitorene oppført i tabell 2 i 100 ul ELISA-buffer i 2 timer ved 20 "C. Mikrotiterplatene bearbeides som beskrevet i eksempel 2, og prosent eluering beregnes relativt til en SAP-prøve behandlet med bare ELISA-buffer. Betydelig eluering ble funnet bare med EDTA (100% ved 10 mM), p-nitrofenylarsonsyre (90% ved 10 mM, 45% ved 2 mM) og arsanilinsyre (28% ved 10 mM).

Eksempel 6: Rensing av humant SAP på en TNP- sefarosekolonne

70 g "Sepharose 4B" (Pharmacia, Uppsala, Sverige) aktiveres i 10 minutter ved pH 11,2 med 7 g BrCN (Fluka) og omsettes over natten ved 4"C med 870 mg adipindihydrazid (Fluka). 40 ml av denne ADH-sefarosen resuspenderes i 50 ml 0,1 N NaHCC"3 som inneholder 630 mg 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre og inkuberes ved 20 "C over natten. TNP-sefarosen vaskes med vann, 1 M NaCl, 0,5 M eddiksyre og vann, og holdes ved 4°C i 0,1% vandig NaN3. Et tilsvarende produkt kan oppnås når den aktiverte "Sepharose 4B" behandles med 70 mg PAH i steden for adipindihydrazid. 5 ml normalt humant serum påføres på en kolonne som inneholder 5 ml av TNP-sefarosen ovenfor bragt til likevekt med TBS. Kolonnen elueres med TBS, og fraksjonene som inneholder protein samles. SAP holdes ikke tilbake på TNP-sefarose i fravær av -ioner. Fast CaCl2tilsettes til de samlede fraksjonene slik at man får en 50 mM oppløsning og denne påføres på en andre TNP-sefarosekolonne (5 ml) bragt til likevekt med TBS som inneholder 50 mM CaC^. Kolonnen vaskes med 50 mM CaCl2/TBS, og SAP eluert med TBS inneholdende 100 mM EDTA, pH 7, ved 0,5 M eddiksyre, eller ved TBS inneholdende 10 mM p-nitrofenylarsonsyre.

Fra en samlet mengde på 200 pg SAP som er innført, gjenvinnes 189 ug i det endelige EDTA-eluatet (som målt i ELISA ifølge eksempel 2). Den eneste forurensningen som detekteres er normalt immunoglobulin, som fjernes ved affinitetskromatografi på kolonner med uoppløseliggjort protein A eller anti-humant immunoglobulinantistoff.

Dersom ubehandlet sefarose anvendes isteden for TNP-sefarose, utvaskes 112 ug av 200 ug SAP med 50 mM CaC^/TBS, og det endelige EDTA-eluatet inneholder bare 82 ug SAP.

Eksempel 7: ELISA for SAA

Brønnene av polystyrenmikrotiterplater ble belagt med KLH, TNP-KLH eller forble ubelagt som beskrevet i eksempel 2, deretter vasket med 5 mM CaCl2og inkubert med 100 pl hver av humant SAA inneholdende prøver oppnådd ved trinnvise fortynninger av en pasients serum. Etter 2 timer ved 20 °C ble platene vasket med 5 mM CaCV), inkubert med 100 pl av et kaninantiserum til humant SAA (Calbiochem) fortynnet 1:2500 i ELISA-buffer, og utviklet med anti-kaninserum konjugert til pepperrotperoksidase som beskrevet i eksempel 2. Humant SAA bindes meget effektivt til polystyren belagt med TNP-KLH. Betydelig binding observeres også til KLH-belagt polystyren og også til polystyren alene (tabell 3). Ca<2+>kan utelates uten tap av bindingseffektivitet til TNP-KLH-belagt polystyren.

Dersom et rensemiddel så som "Brij 35" tilsettes til bufferen som anvendes for fremstilling av SAA-prøver og vaskeoppløsningene, reduseres den optiske tettheten til en tiendedel eller mindre for en gitt SAA-konsentrasjon.

I en foretrukket utgave av ELISA for SAA benyttes det polystyrenmikrotiterplater belagt med TNP-KLH.

Eksempel 8: Analysesett for SAA- ELISA

Et analysesett for den enzym-bundne enzymimmunoanalysen beskrevet i eksempel 7 inneholder:

polystyrenmikrotiterplater

20 ml TNP-KLH (eksempel 1), 2 ug/ml i 0,3 M NaHC03, eller polystyrenmikrotiterplater belagt med TNP-KLH (eksempel 2) 1 ml samlet serum fra pasienter med rheumatoid arthritis fortynnet til ca. 10 jjg/ml SAA

20 ml kaninantiserum til humant SAA fortynnet 1:2500

20 ml pepperrotperoksidasekonjugert eselanti-kanin-Ig-antiserum fortynnet 1:5000

20 ml o-fenylendiamin (10 mg/ml) i citrat/fosfatbuffer, pH 5,0

1 ml H202, 3%

200 ml TBS

Eksempel 9: Rensing av humant SAA pa en TNP- sefarosekolonne

6 ml serum, fra pasienter med reumatisk arthritis, rikt på SAA påføres på en kolonne inneholdende 5 ml TNP-sefarose (eksempel 6) forbehandlet med en oppløsning av sinkklorid, deretter vaskes og bragt til likevekt med TBS. Etter vasking med TBS elueres SAA med TBS som inneholder 0,2% "Brij 35".

Eksempel 10: Bestemmelse av SAA og SAP i humant serum

Humane sera fra forskjellige kilder analyseres med hensyn på SAP og SAA ved anvendelse av ELISA beskrevet i eksempel 2 og eksempel 7 på polystyrenmikrotiterplater belagt med TNP-KLH. Følgende resultater oppnås (tabell 4):

a) Kilde for det humane serumet 417-530 (tall med tre siffer): friske frivillige personer

HF: pasienter med lungebetennelse

SW: pasienter med en sykdom forbundet med systemisk lupus

erythematosus

M: pasienter med amyloiddegenerasjon

89-65 til 92-41 (tall med fire siffer): pasienter med systemisk lupus

erythematosus

P: pasienter på intensiv overvåkning etter bilulykker

b) Rent humant SAA er ikke tilgjengelig. 1 enhet tilsvarer (maksimalt) 7 ng SAA. Standarden som anvendes er en pasients serum som

inneholder ca. 1 mg/ml SAA, tilfeldig satt til 140 000 enheter/ml.

Resultatene angitt i tabell 4 viser at immunoanalysene ifølge oppfinnelsen er nyttige for bestemmelse av SAP og SAA i sera fra friske mennesker og i sera fra pasienter med betennelsestilstander innbefattende systemisk lupus erythematosus. Det ble ikke funnet noe serum hvori SAP- eller SAA-nivåene var for lave til kunne måles pålitelig ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ved rutinemessig analyse.

Claims

1. Fremgangsmåte for immunologisk analyse for serumamyloid-A-protein (SAA) og/eller serumamyloid-P-komponent (SAP), karakterisert ved at proteinene er bundet til en plastoverflate av en bærer eller til en bærer som inneholder nitrerte fenylgrupper, hvorved kalsiumioner eller beslektede toverdige ioner må være tilstede for SAP-binding.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at plastoverflaten av en egnet bærer inkuberes med en oppløsning inneholdende SAA og/eller SAP i nærvær av kalsiumioner eller beslektede toverdige ioner så som sink- og kobberioner, eller med en oppløsning inneholdende SAA uten ytterligere ioner, og SAA og SAP bundet til plastoverflaten detekteres og mengdebestemmes.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at plastoverflaten av bæreren består av et harpiksholdig polymert organisk stoff.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at plastoverflaten av bæreren består av et harpiksholdig polymert stoff valgt fra gruppen bestående av polystyren, polypropylen, poly etylen, polyvinylklorid, eller polyvinylacetat.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at en egnet bærer belegges med en forbindelse som inneholder nitrerte fenylgrupper, og deretter inkuberes med en oppløsning inneholdende SAA og/eller SAP i nærvær av kalsiumioner, eller med en oppløsning inneholdende SAA uten kalsiumioner, og SAA og SAP bundet til bæreren detekteres og mengdebestemmes.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 5, karakterisert ved at bæreren belagt med nitrerte fenylgrupper er valgt fra gruppen bestående av en titerplate eller forsøksrør av polystyren, polypropylen eller polyvinylklorid, glass- eller plastperler, filterpapir, eller dekstran, celluloseacetat eller nitrocelluloselag.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at forbindelsen som inneholder nitrerte fenylgrupper er et polypeptid, et polysakkarid eller en syntetisk polymer som inneholder nitrerte fenylgrupper.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at forbindelsen som inneholder nitrerte fenylgrupper er et polypeptid som inneholder nitrerte fenylgrupper.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 5 eller 7, karakterisert ved at den nitrerte fenylgruppen er en nitrofenylgruppe, en dinitrofenylgruppe eller en trinitrofenylgruppe.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 5 eller 7, karakterisert ved at den nitrerte fenylgruppen er en 2,4,6-trinitrofenylgruppe.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 5 eller 7, karakterisert ved at forbindelsen som inneholder nitrerte fenylgrupper er "keyhole limpet"-hemocyanin som inneholder 2,4,6-trinitrofenylgrupper.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 2 eller 5, karakterisert ved at proteinene bundet til bæreren detekteres og mengdebestemmes ved inkubering med et antiserum eller med et monoklonalt antistoff som er spesifikt for SAA eller SAP, hvori antistoffene i antiserumet eller det monoklonale antistoffet er merket eller er inkubert med et antiserum som inneholder merkede antistoffer som er spesifikke for de første antistoffene i antiserumet eller det monoklonale antistoffet, og ved måling av mengden merket antistoff som til sist er bundet til bæreren.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at merket er et enzym målt ved en enzym/substratreaksjon.

14. Analysesett for kvalitativ og kvantitativ bestemmelse av SAA og/eller SAP, karakterisert ved at de inneholder bærere og reagenser som er egnet for en fremgangsmåte for immunologisk analyse ifølge krav 1.

15. Analysesett ifølge krav 14, karakterisert ved at de inneholder en bærer som har en plastoverflate eller en bærer belagt med en forbindelse som inneholder nitrofenylgrupper, eventuelt oppløsninger av en forbindelse som inneholder nitrofenylgrupper, oppløsninger av et monoklonalt eller av polyklonale antistoffer som binder SAA eller SAP og, dersom de første antistoffene ikke er merket med et enzym, oppløs-ninger av polyklonale, enzym-konjugerte andre antistoffer som bindes til de nevnte første antistoffene, enzymsubstrater i fast eller oppløst form, standard oppløsninger av SAA og/eller SAP, bufferoppløsninger og eventuelt kalsiumsalter eller beslektede toverdige salter så som sink-eller kobbersalter i fast eller oppløst form, og eventuelt pipetter, reaksjonskar, kalibreringskurver, tabeller og fargeintensitet og lignende.

16. Analysesett ifølge krav 15, karakterisert ved at de inneholder en bærer belagt med "keyhole limpet"-hemocyanin som inneholder 2,4,6-trinitrofenylgrupper.

17. Fremgangsmåte for rensing av SAA og/eller SAP, karakterisert ved at oppløsningene som inneholder proteinene underkastes affinitetskromatografi på faste bærere som inneholder nitrerte fenyl-gruppper.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at oppløsningene som inneholder SAP behandles med et kalsiumsalt, bringes i kontakt med bæreren som inneholder nitrerte fenylgrupper, ubundne proteiner og andre forurensninger vaskes bort med vandige oppløsninger som inneholder kalsiumioner og SAP elueres med vandige oppløsninger som inneholder kalsium -chelateringsmidler, med vandige syrer eller bufferoppløsnigner i et pH-område under pH 5, eller med bufferoppløs-ninger som inneholder p-nitrofenylarsonsyre.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at oppløsningene som inneholder SAA bringes i kontakt med bæreren som inneholder nitrerte fenylgrupper forbehandlet med et sinksalt, utbundne proteiner og andre forurensninger vaskes bort med vandige saltoppløs-ninger og SAA elueres med vandige oppløsninger som inneholder et rensemiddel, med vandige syrer eller med bufferoppløsninger i et pH-område under pH 5.