NO870175L - Polypeptidforbindelser - Google Patents

Description

Denne oppfinnelsen vedrører nye vasopressinforbindelser hvis strukturer adskiller seg ved å ha 1,6-dikarba-bro som er kombinert med en spirocyklisk alkylsubstituent i 1-stilling. Forbindelsen har in vivo og in vitro sterk vasopressin antagonist aktivitet.

Eksempler fra dithia- eller vasopressin-antagonist området er U.S. patent Nr. 4.469.679, 4.481.193, 4.481.194 og 4.491.577.

Karba-analoge av oksytocin og vasopressin som har agonist aktivitet er gjentatte ganger tidligere rapportert så som i U.S. patent nr. 3.980.631, 4.285.858, 4.482.486, 4.237.119 samt i F. Fahrenholz et al., Biochem. Biophys. Res. Com. 122, 974 (1984) og

J. Biol. Chem. 258 14861 (1983). Dicarba- aller 1,6-amino-subirinsyreanaloge av lysin- og arginin-vasopressin og oksytocin har vært rapportert å ha varierende agonistaktivitet. Disse tidligere kjente strukturer har ingen substituent på 1,6-suberin-syren og er agonister, d.v.s. de har den samme biologiske aktivitet som vasopressin (VSP) eller oksytocin (OXT).

Det er nå funnet at når 1-enheten og dithia-forbindelsen til visse vasopressinstrukturer erstattes med en 6,6-spiroalkylen-suberinsyre, har de resulterende forbindelser sterke, til og med øket antagonistaktivitet, spesielt akvaretisk aktivitet. I beskrivelsen her og i kravene anvendes den vanlige nomenklatur på området peptid- og vasopressin-kjemi. Når ingen konfigurasjon er angitt, er aminosyreenheten i L - eller naturlig forekommende form.

Enkelte av betegnelsene på peptid-området som brukes her er

de følgende: Pas, 6,6-cyclopentametylen-2-aminosuberinsyre;

Tas, 6,6-cyclotetrametylen-2-aminosuberinsyre; Pas(Bzl), Q-benzylester av Pas; Abu, a-amino-n-smørsyre; Cad, cadaverin, -NH- { CU2) 5-NH2; Chg, cyclo-heksylglycin; Cha, cycloheksylalanin; Thr, threonin; Pba, a-aminofenylsmørsyre; Gin, glutaminsyreamid eller glutamin; Pro, prolin, A Pro -prolin; Gly, glycin; Tyr, tyrosin; Tyr(Alk), lavere alkyleter av Tyr; Phe, fenylalanin;

Phe (4'-Alk), 4'alkylfenylalanin; MeAla, N-metylalanin; Val,

valin; Ile, isoleucin; Nie, norleucin; Leu, leucin; Ala, alanin; Lys, lysin; Arg, arginin; HArg, homoarginin; MeArg, N-metylarginin; MeHarg, N-metylhomoarginin; MeLys, N-metyllysin; Met, methionin; Asn, asparagin; Tos, tosylat; BHA, benzydrylamin; DMAP, 4-dimetylaminopyridin; DIEA, diisopropyletylamin; Trp, tryptofan; TFA, trifluoracetisk syre; Z, benzyloksykarbonyl; VSP, vasopressin;

HBT, hydroksybenzotriazol. I definisjonene så som MeArg ovenfor angir Me en metylgruppe som sitter på amidonitrogenet i den aktuelle peptidenhet. Betegnelsen Pas<1,6>, brukes for å angi det cykliserte peptid som beskrives senere.

"Alk" betyr en lavere alkylgruppe med 1-4 karboner. Disse kan f.eks. eventuelt være knyttet til oksygensubstituenten i en tyrosinenhet i 2-stilling av peptidet med formel I, til det N-terminale nitrogen i svansen, eller til 4'-stillingen i en Phe-enhet i stilling 2 eller 3 av peptidet med formel I. Slike alkyl-substituenter er metyl, etyl, n-propyl, isopropyl eller butyl. Etyl foretrekkes. Når utrykket "vasopressin" brukes betyr det L-argininvasopressin (AVP) med mindre ellers modifisert.

Dikarba-vasopressinforbindelsene i denne oppfinnelse er illustrert ved den følgende strukturformel:

hvor

n er 0 eller 1;

P er en enkelbinding eller en D- eller L-isomer av Pro, A-Pro, Ala, MeAla, Arg, Lys, HArg, MeArg, MeLys eller MeHArg;

A er en D- eller L-isomer av Arg, Lys, HArg, MeArg, MeLys, MeHArg eller når B er -NH-(CH2)n1-NH2 , en enkelbinding;

B er OH, NH2 , NHAlk, Gly, Gly(NH2), Gly(NHAlk) eller når A er en enkelbinding, -NH-(CH2)n<1->NH2;

Z er Phe, Phe(4'-Alk), Tyr(Alk), Ile eller Tyr;

X er en D- eller L-isomer av Phe, Phe(4'-Alk), Val, Nva, Leu, Ile, Pba, Nie, Cha, Abu, Met, Chg, Tyr, Trp eller Tyr(Alk; og

Y er Val, Ile, Abu, Ala, Chg, Gin, Lys, Cha, Nie, Thr, Phe, Leu eller Gly; og

n<1>er 2 til 6.

En undergruppe av forbindelser i denne oppfinnelse omfatter forbindelser med formel I hvori P er en enkeltbinding, Pro eller Arg, A er Arg og B er NH2 . I formelen I er n fortrinnsvis 1 og X er en D-isomer-enhet.

Innenfor denne oppfinnelse ligger også addisjons-salter, komplekser eller forstadier så som estere av forbindelsene i denne oppfinnelse når B er OH, spesielt i ikke-toksiske, farmasøytisk fordragelige syreaddisjonssalter. Syreaddisjonsaltene fremstilles på standard måte i et hensiktsmessig løsningsmiddel fra stamforbin-delsen og et overskudd av en syre så som saltsyre, hydrogenbromid, svovelsyre, fosforsyre, eddiksyre, malinsyre, ravsyre, etan-disulfonsyre eller metansulfonsyrer. Visse sluttprodukter med formel I så som Arg<7>-Arg<8>forbindelsene har to sterke basiske grupper i sine strukturer, og derfor er deres syreaddisjonssalt-derivater lette å fremstille. Esterderivatene av syreformene i sluttproduktene så som metyl, etyl eller benzylesterene fremstilles ved kjente metoder.

Sluttproduktene (I) fremstilles i følge denne oppfinnelse ved syklisering av det tilsvarende lineære peptid:

hvori X, Z, Y, P, A, B og n er som definert ovenfor og med alle kjemisk reaktive sentre beskyttet som beskrevet nedenfor. Syreaddisjonssalter inngår også som notert ovenfor for sluttfor-bindelsene med formel I. Det bør fremheves at den lineære mellomproduktstruktur II bare kan sykliseres i form av den fri base. Ingen syklisering forekommer når saltformen foreligger, men saltformen er viktige derivater for isolering og karakterisering av mellomproduktene.

Sykliseringen innbefatter dannelsen av amidbinding mellom ot-aminogruppen i X-enheten i 2-stilling og den fri Q-karboksygruppe i den 6,6-disubstituerte 2-aminosuberinsyreenhet i 6-stilling i struktur II. Alle kjemiske metoder for amid-dannelse anvendes så som omsetning ved anvendelse av di-cycloheksylkarbodiimid pluss hydroksybenzotriazol eller 4-dimetylaminopyridin, omsetning ved bruk av difenylfosforyl-azid (DPPA) og base, 1-(3-dimetylamino- propyl)-3-etylkarbodiimid (EDC) som metiodidet eller hydrokloridet; azid-derivatet av karboksylsyreen; et blandet anhydrid så som benzoyl, pivaloyl eller isovaleroyl holdig anhydrid med suberin-syren; etoksyacetylen eller N-etyl-5-fenyl-isoksazolium-3'-sulfonat. Alle disse generelle syntesemetoder er beskrevet i Peptid Synthesis, M. Bodanszky, John Wiley, 1976, side 191 og tabell 3, side 116-121. Disse koblingsreaksjoner kjøres normalt i enten vandig eller organiske løsningsmidler inntil reaksjonen er ferdig. Blandt de foretrukne løsningsmidler er dimetyl formamid, dimetylacetamid, metylenklorid, acetonitril eller kombinasjoner derav. Reaksjonene utføres normalt ved romtemperatur i fortynnet løsning for å minimalisere lineær reaksjon.

Difenylfosforylazid (DPPA) er et spesielt anvendelig sykliser-ingsmiddel. Det lineære peptid (II) behandles med et overskudd av DPPA i tørket dimetylformamid og trietylamin ved romtemperatur inntil tynnskiktkontroll viser at reaksjonen er ferdig. Det ønskede produkt isoleres ved inndampning og renses ved gelfiltrering og HPLC.

Den harpiksbårede peptidkjede av det lineære peptidet (II) bygges normalt opp trinnvis idet man går ut fra B-enheten og arbeider mot X-enheten gjennom den nye Pas eller Tas enhet i 6-stilling i det lineære produkt. Hver enhet beskyttes tilsvarende som kjent innenfor peptidområdet og som beskrevet nedenunder. Rekkefølgen av trinnreaksjonene utføres lett i en Beckman 990B peptidsyntetisator eller en ekvivalent uten å isolere hvert mellomproduktpeptid. Detaljene ved fremgangsmåten finnes i de etterfølgende arbeidseksempler.

De forskjellige aminosyrer (AA) som settes i rekkefølge til den harpiksbårede kjede beskyttes som tidligere kjent. F.eks. brukes den Boe beskyttende gruppe for en aminogruppe, spesielt i a-stillingen; en eventuelt substituert benzyl for karboksygruppen av Pas- eller Tas-enheten; tosyl for Arg-, HArg- eller MeArg-enheten; og en eventuelt substiuert karbobenzyloksy (Z) for Tyr-eller Lys-enhetene. Beskyttelsesgruppene er helst slike som ikke er lette å fjerne ved bruk av mild syrebehandling så som for fjerning av Boc-gruppen. Derimot bør man bruke HF, natrium-flytende ammoniak eller for benzyl- eller karbobenzyloksygrupper, katalytisk hydrogenering.

Ofte syntetiseres det ikke-sykliserte harpiksbårede polypeptid med formel II i et flere syntetiske sykluser for å få gode lagre av olygopeptidmellomprodukter til å variere kjeden som beskrevet ovenfor.

Det sammensatt, harpiskbårede peptid behandles med et overskudd av vannfritt hydrogenfluorid med en tilsvarende oppfangende forbindelse så som anisol, hvilket gir det lineær peptid mellomprodukt med formel II i godt utbytte.

Forbindelsene med formel I fremstilles også ved å omsette de sykliserte Pas5, Pro<7>eller Arg7<p>11er<0>karboksylsyrer eller derivater derav med en beskyttet form av PAB, AB eller A i den endestående syreester eller amidform, henholdsvis ved å anvende reaksjonsbetingelser og mellomprodukter for standardpeptidsyntese-metoder. Slike utgangsmaterialsyrer, så som den i formel I hvor P er en argininlignende enhet som definert ovenfor og A er hydroksy fremstilles som beskrevet ovenfor ved enten en harpiksbåret eller en reaksjonssekvens i løsning.

Nøkkelen til syntesen har forbindelse med formel I og oppdagelsen av deres biologiske aktivitet var tilgjengeligheten av 6,6-spirocycloalkylen-2-aminosuberinsyren som måtte være tilgjen-gelig for bruk i peptidsyntesen av mellomproduktene med formel II som er omtalt ovenfor. 2-amino- og 2,7-diaminosuberinsyrer var blitt fremstilt tidligere ved bruk av en kolbe elektrolyse som nøkkeltrinn for syntesen, R. Nutt et al., J. Org. Chem. 4J5 3078

(1980). Tilstedeværelsen av den voluminøse spirocycloalkylen substituent i 6,6-stillingen av den ønskede 2-aminosuberinsyre gjorde fremstillingen av disse mellomprodukter og sykliseringen av de lineære peptider med formel II uforutsigbare før foreliggende oppfinnelse.

Den syntetiske fremstillingen av 6,6-spirocycloalkylen-2-aminosuberinsyrer samt de tilsvarende 7,7-substituerte azelan- og 5,5-substituerte pimelin-syrer medfører (1) innsetning av en terminal umettet hydrokarbonkjede på spirokarbonet til et cycloalkankarboksylat, (2) homologisering av karboksylatet, (3) funksjonalisering av det umettede senter i sidekjeden og (4) fremstilling av aminosyren fra dette. Fremstillingsdetaljer er presentert i eksempel 1.

Spirocyc1oa1ky1en-2-aminoalkandikarboksylsyre-mellomproduktene har den følgende formel:

hvor:

m er 2-4

n er 0 eller 1;

R og R<1>er hver for seg hydrogen eller en karboksybeskyttende gruppe; og

R<2>er hydrogen eller en aminobeskyttende gruppe.

Karboksybeskyttende grupper som er anvendelige ved R og R<1>i formel III er velkjente på peptidområdet, Peptide Synthesis, foran sitert. 49-57. Representative grupper er lavere alkyl med 1 til 8 karboner, benzyler, benzhydryler, fenyler hvorav alle danner esterderivater, men som er lette å fjerne ved kjente metoder. Fortrinnsvis må selektive fjerningsmetoder være tilgjengelige

etter at det lineære peptid med formel II er blitt fremstilt.

Aminobeskyttende grupper som er anvendelige i formel III ved

R<2>er også kjente, Peptid Synthesis, foran sitert 18-48. Spesielt anvendelig er karbobenzoksy-, t-butyloksykarbonyl-, p-toluen-sulfonyl-, trifluoracetyl-, arylsulfenyl- eller formyl-grupper.

Innbefattet i formel II e'r også de optisk aktive isomere. Disse skilles fra isomere blandinger i chiral ren D- og L-isomer form ved fraksjonert krystallisering av salter med chirale baser.

Sluttproduktene fremstilt i følge oppfinnelsen har vasopressin antagonist aktivitet. Vasopressin er kjent å bidra til den anti-diuretiske virkningsmekanismen i nyren. Når virkningen av disse forbindelser antagoniserer det naturlige anti-diuretiske hormonets (ADH), utskiller kroppen vann p.g.a. den økede gjennomtrengeligheten til endedelene av nyrekanalene. Virkningsmekanismen er ved vasopressinreseptorene (V2-reseptorene) lokalisert på plasmamem-branen til visse nyre epitelceller. Den mest bemerkelsesverdige farmacodynamiske virkningen av ADH antagonistene fremstilt i følge oppfinnelsen er som vann-diuretikum i stedet for natrium-uretikum så som hydroklorothiazid.

Alle pasienter som lider av syndromet feilaktig anti-diuretisk hormonutskillelse (SIADH) eller fra en uønsket ødemtilstand er et målfor de fremstilte forbindelser. Eksempler på kliniske tilstander indikert for forbindelsen fremstilte ved denne oppfinnelse er hypertensjon, hepatisk cirrose, hyponatremi, kongenstivt hjertesvikt eller en komponent av enhver traumatisk tilstand som stammer fra alvorlig skade eller sykdom.

En andre gruppe vasopressin-reseptorpunkter er de vaskulaere pressor-punkter ( Vi-reseptorer) i selve de kardiovaskulære system. Disse blir også noe antagonisert av forbindelsene fremstilt i denne oppfinnelse, og induserer derved antipressor-eller hypotensive aktivitet.

Forbindelsene i denne oppfinnelse brukes derfor spesielt til

å indusere anti-hypertensiv eller diuretisk aktivitet i pasienter med behov for slik behandling. Dette omfatter administrering innvendig, parenteralt, i kinnet eller ved insufflasjon av en ikke-toksisk, men effektiv mengde av den valgte forbindelse, fortrinnsvis dispergert i en farmasøytisk bærer. Dose-enheter for den aktive bestanddel velges fra området 0,1 til 10 mg/kg, fortrinnsvis 0,1 til 1 mg/kg base bassert på en 70 kg pasient. Doseringsenhetene gis til mennesket eller dyret fra 1 til 5 ganger daglig.

Det farmasøytiske preparat som inneholder en aktiv antagonistisk bestanddel med formel I omfatter en dose-enhet som er oppløst eller suspendert i en standard flytende bærer, så som isotonisk saltvann, og inneholdes i en ampulle eller et flerdoseglass egnet for parenteral injeksjon så som for intravenøst, subkutan eller intramuskulær administrering. Et preparat for insufflasjon kan være lignende, men gis normalt i en utmålt dose applikator eller inhalator. Pulveriserte pulverpreparater kan også brukes sammen med oljeaktige preparat, geler, buffere for isotoniske preparater, kinnpastiller, trans-dermale lapper og emulsjoner eller aerosoler.

V2-antagonistisk aktivitet mot den naturlige anti-diuretiske hormon (anti-ADH aktivitet) måles in vitro i det medullære vev fra galte (Kb i tabell I nedenunder) eller menneskenyrer og in vivo i den hydropeniske rotte. In vitro målemetodene for vasopressin- stimulert adenylat cyclase aktivering (Ki) eller vasopressin-bindingsaktivitet Kbind er beskrevet av F. Stassen et al., J. Pharmacology and Experimental Therapeutics, 223 , 50-54 (1982). Vl-antagonistisk aktivitet måles ved fremgangsmåten som anveder rotte-toraks aortavev og plasmamembraner fra rottelever. Disse fremgangsmåter er beskrevet i den angitte Stassen publikasjonen og i en publikasjon ved the Ist International Conference on Diuretics, Miami, Florida, March (1984). Oksytocin antagonisme er bestemt som beskrevet av W. Sawyer et al., Endocrinology, 106 81

(1979).

Målingen av anti-ADH aktivitet in vivo er den hydropeniske rotteprotokoll som er beskrevet nedenfor:

Hydropenisk rotteundersøkelse

For og vann fjernes fra hannrotter ca. 18 timer før prøvingen. Dyrene huses 4 pr. metabolismebur. Ved 0 timer gis forsøksforbin-delsen intraperitoneal til forsøksgruppen og et ekvivalent volum bærer gis til begge kontrollgrupper, (fastede og ikke-fastede). Urinvolum og osmolalitet måles hver time i 4 timer. Forsøksverdier registreres som ml urin utskilt (kumultative), mEg/rotte elektrolytt utskilt, mg/rotte urea utskilt, og osmolalitet i milli-Osmol/kg H2O. Et toleranseforsøk brukes til å bestemme signifikansen.

ED300defineres som den dose forbindelse (gg/kg nødvendig for å senke urinosmolalitet til 300 m-Osmol/kg.

A. [1- ( p-merkapto-(3 , p-cyclopentametylenpropionsyre) -2- (O-etyl-D-tyrosin)-4-valin-8-arginin-9-desglycin]-vasopressin.

B . [1- ((3-mer kap to-P , p-cyclopentametylenpropionsyre) - 2- (0-etyl-D-tyrosin)-4-valin-6-D-cystein-8-arginin-9-desglycin]-vasopressin. C. [1,6-(6,6-cyclopentametylen-2-amino-L-suberinsyre)-2-(O-etyl-D-tyrosin)-4-valin-8-arginin-9-desglycin]-vasopressin. D. [1,6-(6,6-cyclopentametylen-2-amino-D-suberinsyre)-2-(0-etyl-D-tyrosin)-4-valin-8-arginin-9-desglycin]-vasopressin.

Sterokjemien av PAS-enheten i forbindelsen C og D er tillegnet på grunnlag av de biologiske aktivitetene til de to forbindelsene. De representative data i tabell I viser at Pas<1>•<6>forbindelsene har ekvivalent eller betydelig høyere biologisk aktivitet enn deres respektive tidligere kjente dithia forbindelser.

Følgende eksempler er ment å demonstrere fremstillingen og anvendelsen av denne oppfinnelse. Alle temperaturer er i °C. Betegnelser og symboler er slike som er vanlige på det kjemiske og peptidområdet.

EKSEMPEL 1

Syntese av spirocycloalkylen-2-aminoalkandiokarboksylsyrer

(A) Metyl 1-(5-pent-l-enyl)cycloheksankarboksylat

En løsning av lithium diisopropylamid ble fremstilt ved å

sette 2,7M n-butyl lithium (heksan) (37,0 ml, 100 mmol) til en løsning av diisopropylamin (15,0 ml, 109 mmol) i tørt tetrahydrofuran (170 ml) ved -78°C under argon, deretter røre den følgende blanding ved -78°C i 20 minutter. Metylcycloheksankarboksylat (13,0 ml, 91 mmol) ble satt til løsningen og reaksjonsblandingen ble rørt i 30 minutter ved -78°C. 5-jodpent-l-en (18 g, 91,8 mmol) ble tilsatt, reaksjonen fortsatte ved -78°C i 10 min., og blandingen ble så langsomt brakt til romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med vann, og surgjort (pH = 2) med 3N saltsyre og ekstrahert med eter. Eterekstrakten ble vasket med mettet natrium tiosulfat (vandig) tørket over magnesiumsulfat og inndampet ved redusert trykk og ga 16 g 1-(5-pent-l-enyl)cyclo-heksan-karboksylsyre, metylester.

(B) l-(O-tosyl)hydroksyrnetyl-1-(5-pent-l-en)cycloheksan

Metylesteren (A) (16 g, 76,0 mmol) ble satt til en løsning av

lithiumaluminiumhydrid (4,6 g, 120,9 mmol) i tetrahydrofuran (205 ml) ved romtemperatur og den resulterende blandingen ble varmet ved tilbakeløp i 3 timer. Reaksjonen ble avkjølt til 0°C, behandlet i rekkefølge med vann (5 ml), 3N natriumhydroksydløsning (5ml) og vann (15 ml), deretter filtrert. Filtratet ble tørket over magnesiumsulfat, filtrert og inndampet og ga tittelalkoholen: 1 HNMR (CDCls ) : 6,17-5,60 (m, 1H) , 5,20-4,80 (m, 2H) , 3,40 (S, 2H) og 2,43-0 ,80 (m, 17H) .

Denne alkoholen ble oppløst i pyridin (89 ml) og behandlet

med p-toluensulfonylklorid (27 g, 142,5 mmol) ved 0°C i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble heilt i vann og ekstrahert med petroleter, petroleter:etyleter (1:1) og etyleter. De sammenslåtte organiske ekstrakter ble vasket med 0,5N HC1 (vandig) mettet natriumbikarbonat (vandig) og vann, tørket over magnesiumsulfat, filtrert og inndampet og ga 30,0 g 1-(O-tosyl)hydroksymetyl-1-(5-pent-l-en)-cycloheksan:<1>HNMR (CDC13): 7,98-7,20 (m, 4H), 6,03-5,53 (m, 1H), 5,13-4,78 (m, 2H), 3,82 (S, 2H), 2,43 (S, 3H) og 2,23-0,73 (m, 16H).

(C) 1-cyanometyl-l-(5-pent-l-en)cylcoheksan

Tosylatet (B) (30 g) ble oppløst i dimetylsulfoksyd (219 ml)

med natriumcyanid (13,6 g, 279 mmol). Den resulterende blanding ble oppvarmet ved 150°C i 18 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter avkjølt, heilt på mettet ammoniumklorid (vandig) og ekstrahert med petroleter. De organiske ekstrakter ble tørket, filtrert og inndampet. R.ensing av resten ved bruk av kromatografi (kiselgel; 15% etylacetat/heksan) ga 9,9 g 1-cyanometyl-l-(5-pent-l-en)cycloheksan (57% utbytte fra metyl-cycloheksankarboksy-lat):<1>HNMR (CDCI3): 6,12-5,57 (m, 1H), 5,20-4,87 (m, 2H), 2,30 (S,2H), 2,23-1,82 (m, 2H) og 1,50 (brS, 14H).

(D) 1-cyanometyl-l-(4-butan-l-alyl)cycloheksan.

Nitrilet (C) (4,9 g, 25,6 mmol) ble oppløst i metanol

(80 ml). Den resulterende løsning ble avkjølt til -78°C og behandlet med ozon [fra en Welsbach ozongenerator] inntil restozonen var tilbake i løsningen (blå farge). Rå ozonid ble behandlet med metylsulfid (20 ml) ved -78°C og deretter langsomt oppvarmet til romtemperatur. Etter 18 timer ble løsningsmiddelet fjernet under redusert trykk, og resten ble renset ved kromatografi (kiselgel,

20% etylacetat/heksan) som ga 3,1 g (63%) 1-cyanometyl-l-(4-butan-l-alyl ) -cycloheksan : NMR (CDCI3): 9,80 (brS, 1H), 2,63-2,38 (m,

2H), 2,33 (S, 2H) og 1,47 (brS, 14H).

(E) 2-D,L-amino-5-(1-karboksyrnetylJcycloheksyl-pentansyre

Aldehydet (D) (3,1 g, 16 mmol) ble oppløst i 60% vandig

etanol (30 ml), behandlet med natriumcyanid (860 mg, 17,6 mmol) og ammoniumkarbonat (4,0 g, 41,6 mmol). Den resulterende løsning ble oppvarmet ved tilbakeløp i 18 timer. Karbonatoverskudd ble fjernet ved oppvarming av reaksjonsblandingen ved 90°C i 1 time uten en kjøler. Det gjenværende løsningsmiddel ble fjernet ved

redusert trykk. Råproduktet ble oppløst i varm etanol, filtrert og inndampet under redusert trykk, hvilket ga det rå hydantoin: MS: (M+H)<+>= 264. Det ikke-rensede hydantoin ble oppslemmet i vann med barium-hydroksydheksahydrat (12,0 g, 38 mmol) og oppvarmet i en tett bombe ved 170°C i 96 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt, fortynnet med vann og filtrert. Filtratet ble ført gjennom en BioRad AG 50W-X8 ionebytterkolonne og detønskede produkt ble deluert ut av kolonnen med IN ammoniumhydroksyd (vandig). Fordampning av ammoniumhydroksydelueringsmiddelet ga 1,1 g av tittelaminosyren (E) MS: (M+H)' = 258. Denne forbindelsen har også trivialnavnet 6,6-cyclopentametylen-2-aminosuberinsyre (Pas) . (F) 2-D,L-boc-amino-5-(1-karboksymetyl)cycloheksylpentansyre.

Aminosyren (E) ble oppløst i IN natriumhydroksydløsning

(45 ml) og tert-butanol (45 ml) og blandingen ble behandlet ved romtemperatur med di-tert-butyldikarbonat (980 mg, 4,5 mmol) i 48 timer. Reaksjonsblandingen ble vasket med heksan, surgjort med natriumbisulfat og ekstrahert med etylacetat. De samlede organiske ekstrakter ble tørket, filtrert og inndampet og ga 1,5 g av tittelforbindelsen.

(G) Metyl 2-D,L-boc-amino-5-(1-karbometoksymetyl)cycloheksyl-pentanoat

Boc-dikarboksylsyren (F) 1,5 g) ble oppløst i metylenklorid og behandlet med overskudd diazometan i eter ved 0°C. Etter destruksjon av diazometanoverskuddet med eddiksyre ble løsningen inndampet ved redusert trykk. Den rå ester ble renset ved kromatografi (kiselgel, 20% etylacetat/heksan) som gir 900 mg (56%) av tittelproduktet: 'HNMR (CDC13): 5,23-4,87 (m, 1H), 4,50-4,10 (m, 1H), 3,77 (S, 3H), 3,67 (S, 3H), 2,30 (S, 2H), 1,47 (s, 9H) og 1,42 (brS, 16H). (H) 2-D,L-boc-amino-5-(1-karbometoksymetyl)cycloheksylpentansyre.

Boc-esteren (G) 1,135 g, 2,94 mmol) ble oppløst i dioksan

(16 ml) og løsningen behandlet ved 5°C med 3,2 ml IN NaOH (vandig). Reaksjonsblandingen ble umiddelbart oppvarmet til romtemperatur og rørt i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble surgjort (pH = 2) med 3N saltsyre, deretter inndampet ved redusert trykk. Resten ble fortynnet med vann og ekstrahert med etylacetat. De kombinerte organiske ekstrakter ble tørket,

filtrert og inndampet. Resten ble renset ved kromatografi (kiselgel, 5 - 10% metanol/kloroform) som gir 836 mg (77%) av tittelproduktet. MS: (M+H)<f>= 372;<1>HNMR (CDCls): 8,02 (brS,

1H) , 5,28-5,00 (m, 1H) , 4,47-4,07 (m, 1H) , 3,65 (S, 3H) , 2,30 (S, 2H), 1,47 (S, 9H) og 2,00-1,23 (m, 16H). (I) Benzyl 2-D,L-boc-amino-5-(1-karbobenzoksymetyl)cycloheksyl-pentanoat.

Boc-dikarboksylsyren (F) (1,34 g, 3,75 mmol) i metylenklorid (30 ml) ble behandlet med benzylalkohol (1,94 ml, 18,75 mmol), dimetylaminopyridin (l,ol g, 8,25 mmol) og N,N'-dicycloheksylkarbo-diimid (1,70 g, 8,25 mmol) ved romtemperatur og blandingen ble rørt ved romtemperatur i 72 timer. Reaksjonsblandingen ble så filtrert, inndampet ved redusert trykk og resten ble oppløst i etylacetat som var vasket med 3N saltsyre, tørket over MgSoi og inndampet ved redusert trykk. Rensing av resten ved kolonne-kromatografi (kiselgel, 15% etylacetat/heksan) ga 1,27 g (63%) av (I): 'HNMR (CDCI3 ) : 7,35 (S, 10H), 5,15 (d,J = 2,4 Hz, 2H) , 5,07 (S, 2H), 5,05-4,70 (m, 1H), 4,50-4,05 (m, 1H), 2,27 (S, 2H), 1,45 (S, 9H), og 2,00-1,03 (m, 16H).

(J) 2-boc-D,L-amino-5-(1-karbobenzoksymetyl)cycloheksylpentansyre

Boc-diesteren (I) (1,27 g, 2,36 mmol) ble oppløst i dioksan (15 ml) og behandlet med 2,6 ml IN natriumhydroksydløsning ved romtemperatur under argon i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble surgjort (pH = 2) med 3N saltsyre og inndampet ved redusert trykk. Resten ble oppløst etylacetat, vasket med 3N saltsyre, tørket over MgSO-i og inndampet ved redusert trykk. Resten ble renset ved kolonne-kromatografi (kiselgel, 5% metanol/kloroform) som gir 1,03 g av tittelproduktet: MS: MH' = 448) ; 'HNMR (CDCI3): 7,33 (S,5H), 5,07 (S, 2H), 5,20-4,80 (m, 1H), 4,42-4,05 (m, 1H), 2,32 (S, 2H), 1,43 (S, 9H) og 2,08-1,07 (m, 16H).

(K) Metyl 2-D,L-boc-amino-5-(1-karboksymetyl)cycloheksylpentanoat Boc-benzylesteren (J) (4mmol) oppløses i metylenklorid og behandles med diazometan i eter ved romtemperatur. Det resterende diazometan destrueres med eddiksyre og løsningen inndampes ved redusert trykk. Den rå diester oppløses i metanol og hydrogeneres over 10% palladium-på-karbon og gir etter kolonnekromatografi (kiselgel), tittelforbindelsen.

(L) Generelt

A kjøre reaksjonssekvensene ovenfor med metylcyclopentan-karboksylat gir 2-D,L-amino-5-(1-karboksy-metyl)-cyclopentylpentan-syre og 2-D,L-boc-amino-5-(1-karbobenzoksymetyl) cyclopentylpentan-syre. Bruk av 4 jodbut-l-en eller 6-jodheks-l-en i stedet for 5-jod-pent-l-en i det første trinn av reaksjonssekvensen som er beskrevet i detalj ovenfor gir 2-D,L-amino-4-(1-karboksymetyl)-cycloheksylbutansyre, 2-D,L-amino-6-(1-karboksymetyl)cylcoheksyl-heksansyre samt deres N-boc- og 1-benzyl-esterderivater. En fagmann vil se at de to siste aminosyrer er 2-D,L-amino-spirocyclo-pentametylenpimelinsyre og azalansyre.

EKSEMPEL 2

Syntese av lineære peptid mellomprodukter

(A) 2-boc-amino-5~(1-karbobenzoksymetyl)cyclo-heksylpentanoyl-prolyl-(N-tos)arginyl-BHA-harpiks.

0,5 mmol (0,96 g) BHA-harpiks ble svellet i 25 ml metylenklorid i en 30 ml reaksjonsbeholder i en manuell peptidsyntetisator i 4 timer. Den ble deretter i rekkefølge koblet med beskyttet arginin og prolin samt 2-D,L-boc-amino-5-(1-karbobenzoksymetyl)cyclo-heksylpentansyre ved bruk av DCC og HBT eller DMAP (4-dimetylaminopyridin) som koblingsreagens i blanding av dimetylformamid og metylenklorid som løsningsmiddel.

Mengden og molforholdet av hvert reagens som brukes i dette eksperiment er som følger:

Etter koblingsyklusserien ble peptidharpiksen (A) behandlet med eddiksyre-anhydrid i 1 time ( for å acetylere alle ikke-omsatte aminogrupper). (B) Boe-(0-etyl)-D-tyrosyl)-fenylalanyl-.valya-asparagyl-(OBzl)-6,6-cyclopentametylen-2-D,L-aminosuberinsyre-prolyl-(N-Tos)arginyl-BHA-harpiks.

Tri-enhet-harpiksen (A) fra ovenfor ble videre i rekkefølge koblet i 4 sykler med Boc-Asn, Boc-Val, Boc-Phe, og Boc-D-Tyr (OEt) ved bruk av DCC/HBT som koblingsreagenser og CH2CI2/DMF som løsningsmiddel i en manuell peptidsyntetisator. Hver kobling ble kontrollert ved en kvalitativ ninhydrin-test for å undersøke om den var fullstendig. Gjentatt kobling utføres når prøven er positiv.

Mengden av reagenser som brukes er som følger:

Peptidharpiksen ble så tørket i våkum og ga tittelmellom-produktet.

(C) H2 N-D-Tyr (Et)-Phe-Vqal-Asn-D , L.-Pas-Pro-ArgNH2

Peptidharpiksen (B) ble behandlet med 20 ml vannfritt

hydrogenfluorid ved 0 °C med 1,5 ml anisol tilsatt som oppfang-ningsmiddel i 1 time for spalting av peptidet fra harpiksbæreren og samtidig fjerne beskyttelsesgruppene fra amino- og karboksy-gruppene.

HF ble avdampet under redusert trykk ved 0° C . Resten ble gnidd med eter som ble kastet, og ble grundig ekstrahert med 10 ml x 3 dimetylformamid og 10 ml x 3 30% vandig eddiksyre. Ekstraktene ble kombinert og inndampet under redusert trykk og ga en olje som ble tatt opp i 5% vandig eddiksyre og frysetørket hvilket ga 195 mg hvitt pulver.

Dette rå lineære peptid, HzN-D-Tyr (Et)-Phe-Val-Asn-D,L-Pas-Pro-ArgNHv som acetatsalt ble vist å være en blanding av to hoved-komponenter i både KPLC ("Ultrasphere ODS" kolonne, 50% vandig acetonitril med 0,1% TFA og tic (kiselgel/n-BuOH/etylacetat/eddiksyre/vann 1:1:1:1) med spor av andre komponenter.

Dette råpeptidet ble renset ved motstrømsfordeling (CCD) i BAW (butanol/eddiksyre/vann) 4:1:5 i 240 overføringer. Fraksjonene ble kontrollert ved tic og riktige fraksjoner ble slått sammen, fordampet under redusert trykk og frysetørket fra 1 % vandig eddiksyre so ga:

Isokratisk HPLC ("Ultrasphere ODS"; 40% vandig acetonitril med 0,1% TFA, strømningshastighet lik 1,5 ml/min) viste to topper med retensjonstider 5,09 og 7,80 min henholdsvis. Fraksjon I inneholdt overveiende 5,09 min. isomeren (ca. 90%), fraksjon II inneholdt en lik mengde av begge isomere og fraksjon III inneholdt for det meste 7,80 min. isomeren. FAB-massespektrum bekreftet nærværet av det ønskede peptid MH' = 1061; MH~= 1059) i alle tre fraksjoner .

Disse resultatene viser de to topper og de toønskede D- og L- isomere av det lineære tittelpeptid-mellomprodukt (C).

EKSEMPEL 3

Det lineære peptid (C) fra eksempel 2 (50 mg) ble behandlet med IN HC1 i iseddik og deretter inndampet i våkum til tørrhet. Dette ble gjentatt 3 ganger. Resten ble tatt opp i tørket dimetylformamid og inndampet i våkum. Dette ble gjentatt tre ganger. (Denne prosessen er for å overføre eddiksyresaltet ved amino- og guanidino-gruppene i det tilsvarende sterkere saltsyresalt in situ, og således unngå acetyleringsreaksjonen av a-amino-gruppen til D-Tyr ved frigjøring av eddiksyre. Denne omdannelse kan også utføres ved ionebytte-kolonnekromatografi med noe tap av materialet.

Den behandlede rest ble oppløst i 7,5 ml tørket dimetylformamid, så ble 12,5 um trietylamin tilsatt under røring etterfulgt av tilsetning av 20 pl difenylfosforyl-azid (DPPA).

Den resulterende blanding ble rørt under en argonatmosfære ved romtemperatur natten over. At syklieringen er ferdig kontrolleres ved isokratisk HPLC eller med tic.

Reaksjonblandingen ble inndampet til tørrhet og gjenoppløst

i 30% eddiksyre. Saltet ble fjernet ved en G-15 "Sephadex" gel-filtreringskolonne. Produktet ble renset videre og skilt i D- og L-isomere ved preparativ HPLC i Ci 8-kolonne ved bruk av 45% acetonitril i vann med 0,1% trifluoreddiksyre som mobil fase,

hvilket ga 8,5mg forbindelse C i tabell 1 ovenfor og 5 mg av forbindelse D.

Forbindelse C:

FAB-massespektrum (M+H)<+>= 1043, (M-H)* = 1041

HPLC enkeltopp retensjonstid = 9,72 min.

Aminosyre analyse:

Forbindelse D:

FAB-massespektrum (M+H)' = 1043, (M-H)- = 1041

HPLC enkeltopp retensjonstid = 16,24 min. Aminosyre analyse:

EKSEMPEL 4

I I

D-Tyr (Et)-Phe-Val-Asn-Pas-Arg-Arg(NH2)

Den beskyttede mellomproduktpeptid-harpiks, D-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Pas(Bzl)-Arg(Tos)-Arg(Tos)-BHA syntetiseres på 1,0 mmol benzhydrylamin-harpiks som ovenfor. HF-spaltingen og sykliseringen med DPPA utføres som beskrevet og gir det delvis rensede peptid.

EKSEMPEL 5

Fremgangsmåte for endekobling.

i i

(A) D-Tyr (Et)-Phe-Val-Asn-Pas-OCH3

Den beskyttede peptid-mellomprodukt-harpiks, d.v.s. Boc-D-Tyr

(Et)-Phe-Val-Asn-Pas-0CH2-Ce H«-harpiks-OCH3 syntetiseres manuelt på en ryster. Boc-Pas (OCH3C6H4-harpiks)OCHa fremstilles fra Pas-OCH3-cesiumsalt og klorometyIharpiks eller direkte kobling til hydroksymetylharpiks med DMAP/DCC i DMF ved substitusjonen med 0,35 mekv./g. Det beskyttede peptid-harpiks-mellomprodukt syntetiseres trinnvis ved avbeskyttelseav Boc-gruppene ved bruk av 1:1 TFA;CH2Cl2og rekkefølgekobling med de tilsvarende Boc-aminosyrer ved bruk av DCC/HBT som aktiverings- og katalyserings-reagenser på 1,0 mmol skala som gir det koblede harpiksmellom-produkt. Tittelpeptidet oppnås ved spaltning fra harpiksen ved

bruk av HF 30 ml i nærvær av 3,0 ml anisol ved 0°C i 60 min. Etter inndampning i våkum til tørrhet vaskes resten med vannfri dietyleter og ekstraheres med avgasset dimetylformamid, og 40% iseddik. Ekstraktene slås sammen, inndampes i våkum til tørrhet, og tas opp i 10% vandig eddiksyre og frysetørkes, hvilket gir det rå lineære peptid. Syklisering av dette peptidet, NH-2-D-Tyr (Et)-Phe-Val-Asn-Pas-OCH3 , ved bruk av DPPA som beskrevet ovenfor gir metylesteren av tittelforbindelsen.

En suspensjon av 0,1 mmol av metylesteren (A) ovenfor i 1:1 dioksan-10% K2 CO3 (vandig) røres ved romtemperatur i 8 timer. Reaksjonsblandingen fortynnes med vann og surgjøres til pH = 4 med iseddik. Den resulterende løsning inndampes i våkum og resten renses ved gel-kromatografi.

Metylesteren (A) ovenfor (100 mg) behandles med vannfri hydrazin i metanol ved romtemperatur og gir etter inndamping tittelforbindelsen, hydrazidet.

(D) Kondensasjon

6-Pas-syren (20 mg) fra B ovenfor omsettes med en ekvivalent

NE<->BocLys-Arg(NH2) 2HC1 i nærvær av DCC, HBT og en ekvivalent trietylamin i dimetylformamid etterfulgt av behandling med trifluor-eddiksyre som gir D-Tyr (Et)-Phe-Val-Asn-Pas1 - 6-Lys-Arg(NH2 ) .

På lignende måte fremstilles det tilsvarende 7-Arg-syre sykliserte peptid og 7-Pro-sykliserte peptidsyre-forbindelser ved å omsette acylazidet som stammer fra hydrazidet (C) ved bruk av arginin eller prolin. Begge syreforbindelser isoleres som kaliumsalt om ønsket. En ekvivalent Arg-NH22HC1 kobles med den tilsvarende 7-D-Pro-syre fremstilt som beskrevet ved bruk av DCC/HBT, som gir 7-D-Pro-Arg-NH2 .

EKSEMPEL 6

Den beskyttede peptid-mellomprodukt-harpiks, Boc-D-Tyr-(Et)-Phe-Val-Asn-Pas(Bzl)-N-MeArg(Tos)-Arg(Tos)-BHA fremstilles ved fastfase-metoden på benzhydrylamin-harpiks. På en rister brukes 0,5 mmol BHA, alle aminosyrer beskyttes som tert.-butyloksykarbonyl på nitrogen og kobles i rekkefølge ved bruk av DCC/HBT, mens Pas(Bzl) kobles ved bruk av DMAP. Peptidet spaltes fra harpiksen ved avbeskyttelse av sidekjede-beskyttelsesgruppene ved bruk av vannfritt HF (20 ml) og anisol (2 ml) ved 0°C i 60 min. Peptidet ekstraheres fra harpiksen med vandig HOAc/DMF. Etter inndampning i våkum til tørrhet, vaskes peptidresten med vannfri dietyleter og sykliseres som beskrevet med DPPA og gir tittelforbindelsen.

EKSEMPEL 7

(A) Boc-D-Tyr(Et)-Phe(4'-Et)-Val-Asn-Pas(Bzl)-Pro-Arg-(Tos)-Gly-BHA-harpiks

(3 mmol) Boc-Val-Asn-Pas(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Gly-BHA-harpiksen fremstilles som beskrevet ovenfor. Videre kobling rekkefølge av 1 mmol av denne peptidharpiks med Boc-Phe-(4'-Et) og Boc-D-Tyr(Et)

ved bruk av 3 mmol aminosyre og 3 mmol DCC og 6 mmol 1-hydroksy-benzo-triazol som katalysator. Den ferdige peptidharpiks vaskes med metylenklorid og vakumtørkes, hvilket gir tittelproduktet.

1,55 g Boc-D-Tyr(Et)-Phe(4'-Et)-Val-Asn-Pas(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Gly-BHA-harpiks fra A behandles med hydrogenfluorid og sykliseres deretter med et overskudd DPPA som beskrevet ovenfor og gir tittelforbindelsen.

EKSEMPEL 8

Til en løsning av Pro<7->syren fremstilt som beskrevet i eksempel 5, settes (0,033 mmol) og mono-Boc-1,5-diaminopentan (20,2 mg, 0,0996 mmol) i dimetylformamid (400 ul, dicycloheksyl- karbo-diimid (10,3 mg, 0,05 mmol og 1-hydroksybenzotriazolhydrat (13,4 mg, 0,1 mmol). Reaksjonsblandingen røres ved romtemperatur

i 19 timer. Dimetylformamidet fjernes deretter ved våkum. Resten behandles med trifluoreddiksyre ved 0°C i to timer. Etter denne tiden fjernes trifluoreddiksyren under våkum og resten i 1% eddiksyre røres over en BioRex 70 (H<+>) ionebyttekolonne. De basiske produkter vaskes ut av ionebyttekolonnen med pyridinbuffer (H2O/pyridin/HOAc, 66:30:4) og inndampes. Sluttrensning med preparativ HPLC (5p "Ultrasphere ODS" gir tittelforbindelsen som base eller acetatsalt.

EKSEMPEL 9

Ved å bruke syntesemetoden som er beskrevet i detalj ovenfor fremstilles de følgende spesifikke forbindelser.

A. [1,6-(6,6-cyclopentametylen-2-aminosuberinsyre)-2-(O-etyl-D-tyrosin)-4-valin-7-desprolin-8-arginin]-vasopressin;

B . [1, 6-(6,6-cyclopentametylen-2-aminosuberinsyre)-2-D-valin-3-(O-etyltyrosin)-4-valin-8-arginin]-vasopressin.

C. [1,6-(6,6-cyclopentametylen-2-aminosuberinsyre)-2-D-cycloheksylalanin-7-desprolin-8-arginin]-vasopressin D. [1, 6-(6,6-cyclopentametylen-2-aminosuberinsyre)-2-metionin-4-alanin-7-D-(N-metylalanin)-8-arginin-9-desglycin]-vasopressin E. [1,6-(6,6-cyclopentametylen-2-aminosuberinsyre)-2-(0-etyl-D- tyrosin)-4-valin-7-desprolin-8-arginin-9-desglycin]-vasopressin. F . [1,6-(6,6-cyclotetrametylen-2-aminosuberinsyre)-2-2-norleucin-3- isoleucin-4-cycloheksylglycin-8-arginin]-vasopressin G. [1,6-(6,6-cyclopentametylen-2-aminosuberinsyre)-2-(O-metyl-tyrosin)-4-valin-7-desprolin-8,9-bis-homoarginin]-vasopressin H. [1,6-(6,6-cyclopentametylen-2-aminosuberinsyre)-2-(O-etyl-D-tyrosin)-4-valin-7-desprolin-8-arginin]-vasopressin I. [1,6-(6,6-cyclopentametylen-2-aminosuberinsyre)-2-L-tyrosin)-4- valin-7-desprolin]-vasopressin.

EKSEMPEL 10

Parenterale doseringsenhetblandinger:

En fremstilling som inneholder 0,1 mg av et peptid fra eksempel 3 som et sterilt tørt pulver for parenteral injeksjon fremstilles som følger: 0,5 mg peptid oppløses i 1 ml av en vandig løsning av 20 mg mannitol. Løsningen filtreres under sterile betingelser i en 2 ml ampulle og frysetørkes. Den rekonstituerte løsning gis til en pasient med behov for vasopressin V2-antagonist-behandling om nødvendig, fra 1 til 5 ganger daglig ved injeksjon eller i en ekvivalent kontinuerlig i.v. drypp-injeksjon.

Nese- doserings- enhet blandinginer

2,5 mg. finmalt peptid fremstilt i følge denne oppfinnelse så som et produkt fra eksempel 3, oppslemmes i en blanding av 75 mg benzylalkohol og 1,395 g av et oppslemmingsmiddel så som en handelsblanding av halvsyntetiske glycerider av høyere fettsyrer. Suspensjonen plasseres i en 10 ml aerosolbeholder som er lukket med en måleventil og fylles med aerosoldrivmidler. Inneholdet omfatter 100 enhetsdoser som gis intranasal til en pasient med behov for akvaretisk terapi fra 1 til 6 ganger om dagen.

Claims (6)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en forbindelse med formelen: hvor :

n er 0 eller 1; P er en enkeltbinding eller en D- eller L-isomer av Pro, £k Pro, Ala, MeAla, Arg, Lys, HArg, MeArg, MeLys eller MeHarg; A er en D- eller L-isomer av Arg, Lys, HArd, MeArg, MeLys, MeHarg eller, når B er -NK-(CH2)n1-NH2 , en enkeltbinding; B er OH, NH2 , NHAlk, Gly(NH2 ), Gly(NHAlk) eller, når A er en enkelbinding, -NH-(CH2 ) n1-NH2 ; Z er Phe, Phe(4'-Alk), Tyr(Alk), Ile eller Tyr; X er en D- eller L-isomer av Phe, Phe(4'Alk), Val, Nva, Leu, Ile, Pba, Nie, Cha, Abu, Met, Chg, Tyr, Trp eller Tyr(Alk); Y er Val, Ile, Abu, Ala, Chg, Gin, Lys, Cha, Nie, Thr, Phe, Leu eller Gly, og n <1> er 2 til 6 eller et farmasøytisk akseptabelt salt, optisk isomer eller esterforstadium derav, karakterisert ved at man sykliserer en eventuelt beskyttet forbindelse med formelen:

hvor X, Z, Y, P, A, B og n er som definert ovenfor, og eventuelt deretter i ønsket rekkefølge, (a) fjerner alle beskyttelsesgrupper; (b) omsetter Pas(OH)-eller P(OH)-forbindelsene, når de måtte foreligge, med 'A som definert ovenfor, enten i syrebeskyttet eller amidform; og (c) danner et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

2. Fremgangsmåte i følge krav 1, ved fremstilling av forbindelser hvori X er en D-isomer, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

3. Fremgangsmåte i følge krav 1, ved fremstilling av forbindelser hvori X er en D-Tyr(Alk) og Y er Val, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

4. Fremgangsmåte i følge krav 1 ved fremstilling av forbindelser hvori X er D-Tyr(Alk), Y er Val, n er 1 og P er en enkelbinding, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituterte utgangsmaterialer.

5. Fremgangsmåte i følge krav 1 ved fremstilling av forbindelser hvor X er D-Tyr(Et), Y er Val, n er 1 og B er NH2 .

6. Fremgangsmåte ved fremstilling av en forbindelse med formelen:

hvori m er et heltall fra 2-4; n er 0 eller 1; R og R <1> er hver for seg hydrogen eller en karboksybeskyttende gruppe; og R <2> er hydrogen eller en aminobeskyttende gruppe, karakterisert ved at man innsetter en terminalt umettet hydrokarbonkjede på spirokarbonet i et cycloalkankarboksylat; homologiserer karboksylatet; funksjonaliserer det umettede senter i sidekjeden og fremstiller en aminosyre fra dette.