NO871071L - Vaksiner. - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av nye vaksiner og anvendelsen av slike vaksiner. Nærmere bestemt vedrører denne oppfinnelse vaksiner omfattende minst to komponenter, hvorav én immunologisk tilsvarer en T-celle-, og B-celle-determinantdel av et antigen, den andre tjener som et hjelpestoff.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av nye vaksiner og bruken av slike vaksiner. Nærmere bestemt vedrører denne oppfinnelse vaksiner omfattende minst to komponenter hvorav én immunologisk tilsvarer en T-celle og B-celle determinant del av et antigen, den andre tjener som et hjelpemiddel.

Til nå ble en vaksine fremstilt ved å innføre en drept eller svekket organisme i verten for å igangsette den normale immunreaksjon i organismen mens det var ønskelig å unngå de patogene virkninger av organismen i verten.

Infeksjonsorganisme/antigenet som vaksinen ifølge oppfinnelsen er effektiv mot kan velges fra alle klasser infeksjonsorganismer, f.eks. bakterier såsom E.coli, Corynebacterium diphtheriae, Salmonella typhi, Streptococcus pneumoniae,

Vibrio cholerae, Mycobacteriae, viruser såsom hepatitt-, tetanus-, influensa-, polio-, papilloma-, munn og klov-, rhino-

, rubella-, mesling-, kusma-, rabies-, varicella-, pertussis-, koppe-, encefalomyocarditis- eller retroviruser, protozoer såsom trypanosomer og plasmodia, helminter, sopp og andre parasittiske organismer i verten som vaksinen er ment for.

Virus hepatitt fortsetter å rangere som én av de viktigste ubeseierede sykdommer hos mennesker. Den generelle betegnelse, virus hepatitt, refererer hovedsakelig til hepatitt B (serum hepatitt), selv om andre kjente viruser og cytomegaloviruser kan forårsake hepatitt hos mennesket. Hepatitt er spesielt kjent for sitt fokuserte angrep på leveren, men sykdommen påvirker også andre organer.

I 1965 oppdaget Blomber et antigen som sirkulerer i blodet til visse menneskelige vesener [J. Am. Med. Assoc., 191, 541

(1965) og Ann. Int. Med., 66, 924 (1967)]. Denne substansen ble senere funnet av Prince å være overflateantigenet til hepatitt B-virus (HBsAg) som fremstilles rikelig av individer som er kronisk infisert med reagensen [Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 60 , 814 (1968)] .

Det er et påtrengende behov for en hepatitt B-vaksine for grupper som befinner seg iøket risiko for å få denne infeksjonen. Disse grupper innbefatter helse- og laboratorie-personell, og personer som krever (1) opprettholdt hemodialyse;

(2) gjentatte blodoverføringer eller administrering av blod- produkter; (3) behandling med immun-undertrykkende eller cytotoksiske legemidler og (4) behandling for ondartede kreftsykdommer og forstyrrelser i forbindelse med depresjon av immunreaksjonen. I tillegg kreves en vaksine for personer som lever i visse tropiske områder hvor hepatitt B-infeksjon er dominerende.

Nåværende vaksiner for HBV består av subvirale komponenter fra virusoverflatekappen (HBsAg) renset fra plasmaet til kronisk HBV-infiserte givere og er inaktivert [McAuliffe et al., Rev. Infect. Dis. 2, 470 (1980)]. Kliniske forsøk har vist sikker-heten og virkningsgraden av nåværende HBsAg-vaksiner, men slike vaksiner foreligger i begrenset mengde og er realtivt dyre, spesielt for slike land med den høyeste hyppighet av HBV-sykdom.

Oppfinnelsen vedrører forbedringer i og i forbindelse med vaksiner.

Malaria er en alvorlig sterkt utbredt sykdom som det til tross for år med utstrakt forskning ikke er utviklet vaksine mot. Se f.eks. Science, bind 226, s. 679 (9. nov. 1984). Eksperimentelt er pattedyr innbefattet mennesker blitt beskyttet mot infeksjon ved det etiologiske middel for malaria, Plasmodium, ved vaksinasjon med bestrålte sporozoitter. Clyde et al., Am.

J. Trop. Med. Hyg., 24, 397 (1975) og Rieckman et al., Bull,

WHO, 57 (Supp. 1), 261 (1979). Yoshida et al., Science, 207,

71 (1980) rapporterer at en slik beskyttelse i det minste delvis oppnås ved antistoffer rettet mot et protein på overflaten til sporozoitten, circumsporo-zoitt (CS)-proteinet; monoklonale antistoffer dannet mot CS-proteiner nøytraliserer infeksjon in vitro og beskytter dyr in vivo. CS-proteinet viser seg å være sterkt evolusjonært konservert innenfor arter, men er temmelig variert på tvers av arter.

Forskjellige arter av Plasmodium er kjent å infisere mennesket. Disse er P. falciparum, P. vivax P. yoelii, P. ovale P. malariae, de siste to opptrer med meget lavere hyppighet. Andre arter av vitenskapelig interesse er P. berghei og P. knowlesi, idet verten for disse arter henholdsvis er rottedyr og aper.

Det er for tiden stort håp om at en form for menneske-malariavaksine snart vil være under utprøving, men det vil sannsynligvis gå betydelig tid før et spesielt antigen eller selv et enkelt trinn kommer ut som det første alternativ (McGregor I. Parasitology Today; 1, 1-33 (1985)). Rhinoviruser er RNA-viruser og ifølge den konvensjonelle klassifisering av viruser danner de en slekt innenfor familien Picorna-virusene.

De er sterkt utbredte, angriper den øvre åndedrettskanal hos mennesker og bevirker akutte infeksjoner som fører til forkjøl-eleser, hoste, heshet o.s.v., og kalles generelt forkjølelser. Infeksjoner som forårsakes av rhinovirus er blant menneskers vanligste sykdommer. Selv om forløpet av disse sykdommer i alminnelighet er harmløst, fører forkjølelser til en forbigående svekkelse av organismen. Dette kan gi opphav til sekundære infeksjoner forårsaket av andre viruser eller bakterier som under visse omstendigheter kan føre til alvorlig sykdom. I tillegg er den økonomiske skaden rhinoviruser forårsaker betydelig. Det er beregnet at i USA forårsaker rhinovirus-infeksjoner årlig tap av mer enn 200 millioner arbeidsdager eller skoledager. I tillegg har det i senere år vært en betydelig økning i rhinovirus-inf eks joner i store byområder. Mens de fleste andre infeksjons-sykdommer gir en permanent eller langvarig immunitet mot det aktuelle patogen, kan infeksjoner forårsaket av rhinovirus forekomme igjen og igjen. Grunnen til at det ikke er noen langvarig immunitet er det store antall typer rhinoviruser.

Hittil er over 100 rhinovirus-stammer blitt isolert som ikke viser noen eller meget få immunologiske kryss-reaksjoner med hverandre. Etter at infeksjonen har vært kan antistoffer mot den spesielle virus-stamme påvises, men disse gir ingen beskyttelse mot andre rhinovirus-stammer. På grunn av det store antall stammer som sirkulerer i befolkningen, er gjentatte infeksjoner av rhinovirus mulig.

Ett mål for EPA 0 192 175 var derfor å fremstille midler som gir beskyttelse mot infeksjoner forårsaket av rhinoviruser.

Disse kan så brukes til å stimulere en immunreaksjon rettet mot intakte viruser. Undersøkelser av bruken av oligopeptider for stimulering av en immunreaksjon rettet mot polioviruser er blitt publisert (Emini, E.A., Jameson, B.A. og Wimmer, E., Nature (London), 30, 699-703, (1983); lignende undersøkelser er også blitt utført i tilfellet munn og klov-virus (Bittle, J.L., Houghton, R.A., Alexander, H., Shinnick, T.M., Sutcliffe, J.G., Lerner, R.A., Rowlands, D.J. og Brown, F., Nature (London), 298, 30-33, (1982); Pfaff, E., Mussgay, M., Bohm, H.O., Schulz, G.E. og Schaller, H., EMBO J. 1, 869-874, (1982)).

Mange fordøyelsessykdommer hos mennesker og dyr, f.eks. dem som forårsakes av Escherichia Coli og lignende bakterier, er generelt resultatet av toksinproduksjon som virker ved å bryte væskebalansen i fordøyelseskanalen. Resultatet er for stor produksjon av væsker og elektrolytter fra de epitele celler i fordøyelseskanalen. (Moon, J.W., Adv. Vet. Sei. and Compt. Med., 18:179-211 (1974)). Som eksempel forårsaker visse stammer av E.coli kolera-lignende sykdommer hos mennesker og unge gårdsdyr, hvilket kan stamme fra virkning av ett av to toksiner som er blitt isolert og identifisert som ST, hvilket er varmestabilt, og LT som er varmelabilt. (Kohler, E.M., Am.

J. Vet. Res., 29:2263-2274, (1968); Gyles, CL. & Barnum, D.A., J. Inf. Dis. 120:419-426 (1968)).

Nyere undersøkelser har vist at for at patogener med hell skal kolonisere deler av legemet, er det nødvendig at patogenet har evne til å hefte til celleoverflater slik at de kan formere seg. Etter kolonidannelse produserer patogenene reagenser såsom toksiner som forårsaker de uønskede symptomer. (Science 209:1103-1106, sept. 1980). Adhesinene som er nødvendige for denne hefting er gjerne strukturer kalt pili. som er tråd-lignende fremspring på bakteriecelleoverflåtene og gjerne er nødvendige hvis patogenet skal forårsake sykdom.

Det er blitt fastslått at immunitet mot patogener kan oppnås ved å immunisere mot toksinene de produserer; Dobrescu, L. og

Huygelen, C., Zpl. Det. Med. B, 23:79-88 (1976), og ved å immunisere mot adhesinfaktoren, Jones, G.W. og Rutter, J.M., Am. J. of. Clinical Nutrition, 27:1441-1449, (des. 1974); Nagy, B., Infect. Immun., 27:21-24, (jan. 1980). Vaksiner som gir slike immuniteter er blitt fremstilt med drepte patogener som i seg selv inneholdt gener for produksjon av forsvarssubstanser. I tillegg er vaksiner fremstilt ved å bruke selve det rene adhesin.

Mange forsøk er under utvikling på å fremstille vaksiner for tilegnet immunsvikt-syndrom. Nylig beskrev Capon et al., molekylarte klonede tilegnede immunsvikt-syndrom-polypeptider og en vaksine mot dette syndrom som gir motstandsevne mot infeksjon av tilegnet immunosvikt-syndrom tilhørende retroviruser

(EPA 01 87 041) .

Det er velkjent på vaksineområdet at administrering av slike antigener ofte fører til realativt liten immunitet med mindre en videre komponent kjent som et hjelpestoff også er til stede i vaksineblandingen.

Vaksinene som oppfinnelsen vedrører er primært slike som omfatter et antigen som effektivt fremskynder spesifikk immunitet mot en infeksjonsorganisme eller mot enhver biologisk aktiv substans hvis aktivitet skal kontrolleres (f.eks. et hormon).

Mange vaksiner er komplekse og inneholder ikke bare antigen-determinanten av interesse, men mange beslektede og ubeslektede skadelige materialer hvorav alle hos noen eller alle personer igangsetter en uønsket reaksjon hos verten.

Tidligere er antigener oppnådd ved flere metoder som omfatter avledning fra naturlige materialer, kobling av et hapten til en bærer og ved rekombinant-DNA-teknologi. Sela et al., [Proe. Nat. Acad. Sei. (USA), 68, 1450 (1971); Science, 166, 1365

(1969); og Adv. Immun., 5, 129 (1966)] har også beskrevet visse syntetiske antigener.

Visse "syntetiske" antigener er blitt fremstilt ved å koble små molekyler (f.eks. dinitrofenol) til bærere (såsom bovin-serum-albumin) og således danne antigener som bevirker produksjon av antistoff til det koblede lille molekyl. Bærermolekyl er ofte nødvendig fordi selve det lille molekyl ikke behøver å "gjen-kjennes" av immunsystemet til dyret som det injiseres i. Denne teknikk har også vært anvendt i isolerte tilfeller for å fremstille anti-gener ved kobling av polypeptidfragmenter av kjente proteiner til bærere som beskrevet i de ovenfor nevnte Sela et al. artikler.

Kjemisk syntetiserte polypeptider gir betydelige fordeler med hensyn til kostnader og sikkerhet ved vaksinasjonsprogrammer.

Det er kjent at antisera mot syntetisk polypeptid fra nukleotidsekvensen til forskjellige områder av S-genet av HBV reagerer med naturlig HBsAg ved radioimmunopresipitering [Lerner et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 78, 3403 (1981)] og kommersielle fastfase-radioimmunologiske målinger for anti-HBsAg

[Gerin et al., Viral Hepatitis, Szumess et al., (utg.), 49-55

(1982)] .

Før syntetiske vaksiner ble et alternativ til de konvensjonelle, måtte det finnes måter å øke styrken og varigheten av immuniteten de gir. Fordelen ved svekkede virus er at de opprettholder formering og således gir stadig mer antigen til immunsystemet og derved øker antistoffmengden. Et syntetisk peptid såsom en drept virus replikerer ikke, og således må substanser kalt hjelpestoffer settes til vaksinen for å øke graden og varigheten av immunitet.

Noen sterkt effektive hjelpestoffer er blitt identifisert

i dyreforsøk såsom Freund's Complete Adjuvant, dipeptidet kjent som MDP, saponin, aluminiumhydroksyd og Bordetella pertussis. Imidlertid er slike materialer ikke bevist å være effektive, såsom Freund's Complete Adjuvant og saponin har tendens til å bevirke mer eller mindre alvorlig sårdannelse på injeksjons-stedet, eller andre alvorlige bivirkninger, og er ikke akseptable for human farmakologi.

En av de sterkeste av disse Freund's adjuvant er en emulsjon av mineralolje og vann blandet med drepte bakterier (mycobakterier, en klasse som innbefatter årsaken til tuberkulose). Nøyaktig hvordan den virker er ikke kjent. Sterke hjelpestoffer såsom Freund1 adjuvant kan ikke gis til menneskelige vesener,

men i stedet inngår alum eller aluminiumhydroksyd normalt sammen med en dø virus-vaksine. Antigenet absorberes på aluminiumhydroksyd-partiklene og frigis langsomt etter injeksjon. I noen tilfeller viser det seg at alum vil virke godt nok ved syntetiske vaksiner, men de fleste vaksiner vil kreve noe bedre. Mange forsøk tar for tiden sikte på å utvikle sikre og effektive hjelpestoffer. Noen håpefulle resultater i denne retning har vært rapportert av Francois Audibert og Louis Chedid ved Pasteur-instituttet og Ruth Arnon og Michael Sela

ved Weizmann Institute of Science, som nylig utviklet antistoffer som gir passiv immunitet mot difteri-toksinet. De syntetiserte tre peptider som tilsvarte områder av toksinmolekylet. Før injeksjon må et syntetisk peptid kobles til et bærermolekyl. I noen eksperimenter var bæreren nøkkelhull-limpet hemocyanin, et åndedretts-pigment fra en mollusk, som ofte

brukes for dette formål. Pasteur-Weizmann-gruppen anga en bærer-hjelpestoff-kombinasjon. De koblet sine difteritoksin-peptider til en bærer som var blitt bundet til et enkelt derivat av celle-membran-derivatet til cellemembranen av mycobakterier; membran-derivatet tjener åpenbart som et hjelpemiddel som i betydelig gradøker peptidenes immunitetsevne.

Fra det ovenfor nevnte er det tydelig at det foreligger et behov for et vaksinehjelpestoff som er i stand til å forsterke immunreaksjonen som induseres av et antigen uten de uønskede bivirkningene til mange kjente hjelpestoffer.

Det er nå funnet at interferon er en effektiv komponent som forsterker immunreaksjon og derved virker som et hjelpestoff. Således er ett aspekt av foreliggende oppfinnelse IFN for bruk som et vaksinehjelpestoff. Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse er en vaksine omfattende et effektivt antigen til å frembringe spesifikk immunitet mot en infeksjonsorganisme eller mot enhver biologisk aktiv substans hvis aktivitet skal kontrolleres (f.eks. et hormon) og som hjelpestoff en effektiv mengde av interferon.

I ett aspekt er oppfinnelsen en vaksine mot infeksjon av en infeksjonsorganisme omfattende en effektiv mengde av et antigen og immunogen fremstilling av en infeksjonsorganisme, f.eks. bakterier, virus, protozo, helmint, sopp eller annen parasittisk organisme i verten som vaksinen er ment for, et hjelpestoff, f.eks. interferon a, 3 eller gamma-type og en fysiologisk tolererbar bærer og/eller fortynningsmiddel om nødvendig, hvilken vaksine, når den innføres i en vert, har evne til å indusere dannelse av antistoffer og stimulere B- og/eller T-celler i verten, hvilke antistoffer immunreagerer med infeksjons-organismene og vaksinen beskytter verten mot infeksjon.

I ett aspekt er oppfinnelsen en vaksine mot infeksjon ved slike virus som hepatitt-, stivkrampe-, influensa-, polio-, papilloma-, munn og klov-, rhino-, rubella-, mesling-, kusma-, rabies-, varicella-, pertussis-, koppe-, encefalomyocarditis-eller retrovirus omfattende en effektiv mengde av et polypeptid som immunologisk tilsvarer hovedsakelig deler av viruset, som hjelpestoff interferon, f.eks. a, p- eller gamma-type og en fysiologisk tolererbar bærer og/eller fortynningsmiddel om nødvendig, hvilken vaksine, når den innføres i en vert, har evne til å indusere produksjon av antistoffer og stimulere B- og/eller T-celler i verten, hvilke antistoffer immunreagerer med virusen og hvilken vaksine beskytter verten mot virusinfeksjonen.

Ett aspekt av oppfinnelsen er en vaksine mot infeksjon av protozoer såsom trypanosomer eller plasmodia omfattende en effektiv mengde av et antigen- eller immunogen-preparat av infeksjonsorganismen, som hjelpestoff et interferon, f.eks. a, p-eller gamma-type og en fysiologisk tolererbar bærer og/eller fortynningsmiddel om nødvendig, hvilken vaksine ved innføring i en vert er i stand til å indusere produksjon av antistoffer og stimulere B- og/eller T-celler hos verten, hvilke antistoffer immunreagerer med protozone og hvilken vaksine beskytter verten mot protozo-infeksjon.

Ett aspekt av oppfinnelsen er en vaksine mot infeksjon ved bakterier såsom E.coli, Corynebacterium diphtheriae, Salmonella typhi, Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae, Mycobacteriae omfattende en effektiv mengde av et antigen- og immunogen-preparat av infeksjonsorganismen, som hjelpestoff et interferon, f.eks. a, 3- eller gamma-type og en fysiologisk tolererbar bærer og/eller fortynningsmiddel om nødvendig, hvilken vaksine ved innføring i en vert er i stand til å indusere produksjon av antistoffer og stimulere B- og/eller T-celler hos verten, hvilke antistoffer immunreagerer med bakteriene og hvilken vaksine beskytter verten mot bakterieinfeksjon.

Oppfinnelsen omfatter videre fremgangsmåter for fremstilling av vaksiner ifølge oppfinnelsen og sett for vaksinene.

For bruk i en vaksine ment gitt til mennesker, er interferonet helst human-interferon produsert ved rekombinante DNA-teknikker, og slike materialer er nå å få kjøpt, f.eks. fra Boehringer Ingelheim. For veterinærbruk er interferonet fortrinnsvis mer eller mindre nært beslektet med interferonet som finnes naturlig hos de arter vaksinen er ment for, selv om den igjen generelt vil være av rekombinant opprinnelse.

Infeksjonsorganismen eller antigenet kan videre renses såsom ved tilsetning av et selektivt fellingsmiddel etterfulgt av et avsluttende kromatografitrinn såsom ionebytter-kromatografi eller revers-fase HPLC.

I vaksinen ifølge oppfinnelsen kan en vandig løsning av infeksjonsorganismen, fortrinnsvis pufret til fysiologisk pH, brukes direkte. Alternativt kan polypeptidet innkapsles i mikro-partiklene såsom liposomer. Det er også mulig å bruke kombina-sjoner av forskjellige infeksjonsorganismer i én vaksine.

Mengden av antigen som foreligger i hver vaksinedose er valgt som en mengde som induserer en immunobeskyttende reaksjon uten nevneverdige uheldige bivirkninger i typiske vaksiner. En slik mengde vil variere avhengig av hvilket spesifikt antigen som anvendes, og om eller ikke vaksinen har ytterligere hjelpestoff. Generelt forventes det at dosen vil omfatte 1 - 1000 pg antigen, fortrinnsvis 10 - 200 gg. En optimal mengde for en spesiell vaksine kan fastlegges ved standardundersøkelser som medfører observasjon av antistoffmengder og andre reaksjoner hos pasienter.

Hjelpestoff-interferonet kan f.eks. være av a, 3 eller gamma-typen, man har funnet en spesielt sterk hjelpestoffvirkning ved gamma-interferon. Mengden av interferon som kreves for å produsere denønskede hjelpestoffvirkning skulle finnes ved eksperimenter, men kan typisk ligge i området 100 - 50.000 enheter, f.eks. 1.000 - 10.000 enheter pr. dose vaksine. Det foretrekkes at interferonet inngår i vaksineblandingen. Alternativt kan interferon og antigen gis separat, fortrinnsvis på samme sted, på en slik måte at denønskede hjelpestoffvirkning oppnås. For dette formål kan antigen og hjelpestoffet formuleres i en to-delt pakning, f.eks. i separate ampuller eller lignende. Det antas at hjelpestoffvirkningen til interferonet er spesielt verdifull i tilfellet av den første dose vaksine som skal gis.

Vaksinefremstilling er generelt beskrevet i New Trends and Developments in Vaccines, utgitt av Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A., 1978. Innkapsling i liposomer er f.eks. beskrevet av Fullerton, U.S.-patent 4.235.877. Vaksiner ifølge oppfinnelsen kan formuleres på vanlig måte, f.eks. med sterile fysiologisk fordragelig bærere såsom saltløsning, fyllstoffer, andre hjelpestoffer, preserver-ingsmidler, stabiliseringsmidler og lignende. Injiserbare preparater vil normalt formuleres så de er hovedsakelig isotone. Vaksiner kan foreligge i væskeform, eller kan foreligge i tørr form for oppløsning i en steril bærer før bruk. Vaksiner kan være én-dose-preparater, eller kan foreligge i andre former såsom fler-dose-flasker for bruk i masse-vaksinasjonsprogrammer. Effektive preparater ved subkutan administrering vil ofte foretrekkes fordi de er lette å bruke, selv om andre administreringsveier såsom intravenøs, intramuskulær og intradermal også er tenkelige.

Når hjelpestoffet er a- eller (3-interferon, kan orale vaksiner i noen tilfeller formuleres effektivt, da disse inter-feroner er syrestabile.

Om nødvendig vil pasienter etter første vaksinasjon fortrinnsvis få en oppfriskning etter ca. 4 uker etterfulgt av gjentatte oppfriskninger hver sjette måned så lenge risikoen for infeksjon foreligger. Infeksjonsorganismen som vaksinen er virksom mot kan velges fra enhver klasse infeksjonsorganismer. En infeksjonsorganisme av spesiell interesse og viktighet er Plasmodium-type, f. eks. human-malariaparasitten P. falciparum

og den dødelige rotte-parasitt P. yoelii. I forsøk med vaksiner for sistnevnte organisme hos mus er det vist som påvist i forsøkene nedenunder at IFN-gamma ikke bare gir en sterk hjelpestoffvirkning som til og med er bedre enn den man får av B. pertussis, men påskynder en raskere immunologisk reaksjon mot infeksjon, slik at en aparasitt-anemisk tilstand oppnås langt raskere enn ved bruk av det kjente hjelpestoff.

Da det for tiden ikke foreligger noen lett måte å rense antigener på ved hjelp av deres T-celle-stimulerende egenskaper, har man valgt den alternative strategi og først fremstille et meget beskyttende løselig antigenpreparat og deretter prøve den beskyttende virkning av de enkelte komponenter uten referanse til deres reaktivitet med antistoffer. Så snart et antigen er isolert, kan dets reaktivitet med både T- og B-celler måles og korrelasjoner med beskyttelsesevne søkes etter. I den foreliggende oppfinnelse beskrives en enkel og pålitelig løselig vaksine som gir effektiv beskyttelse mot den sterkt virulente YM-stamme P. yoelii. Gitt intraperitonealt med saponin er den noe mindre effektiv enn en formalin-fiksert parasittvaksine som gis intravenøst med B.pertussis, hvilket bare krever én i stedet for to injeksjoner (Playfair et al., Immunology, 33, 507-515 (1977)). Imidlertid er den løselige vaksine også temmelig effektiv når den gis subkutant eller intramuskulært, hvilket er av åpenbar betydning for vaksinasjon av mennesker. Videre tyder en sammenligning av dose-reaksjonssammenhengen som er gitt i tabell 1 med den som ble funnet for det 230.000 MV rensede P.yoelii-protein (Freeman & Holder, Clin. exp. Immunol., 54, 609-616 (1983)) hvorav begge begynner å tape full beskyttelsesevne i 1-2,5 pg-området på at 230.000 MV-proteinet ikke er det eneste beskyttende antigen i foreliggende lysat.

Et oppmuntrende trekk i disse eksperimenter har vært styrken av rekombinant IFN-gamma som et hjelpestoff for subkutan anvendelse; dette viser seg å være den første rapport om IFN's evne til å virke som et hjelpestoff ved å forsterke priming. I dette henseende synes IFN å stimulere immunologisk hukommelse, d.v.s. å bruke det konsepsjonelle rammeverk i kloningsseleksjons-teorien (Burnet, F.M., The Clonal Selection Theory of Acquired Immunity. Nashville Tn.; Vanderbilt University Press, 1959), og denne virkning kunne forklares som om jomfruelige T-og B-celler stimuleres av IFN til å formere seg og differensiere i hukommelses-celler. Derfor står uttrykket hjelpestoff ifølge oppfinnelsen bare for beskrivelse av en virkning som kunne forklares som om immunologisk hukommelse forsterkes, men hverken denne forklaring eller uttrykket hjelpestoff bør på

noen måte brukes til å begrense foreliggende oppfinnelse.

For å lette beskrivelsen av beskyttelsesgraden i 250 mus er det anvendt karakter for beskyttelse med vaksiner som "tidlig" eller "sent", da de angrepne mus i den eksperimentelle modell enten kommer seg på dagene 8-10 (tidlig) eller mellom 15 - 20 (sent). Tabell 1 viser alle beskyttelsesdataene. Vaksinerte mus gitt antigen (lysat) alene viste bare leilighetsvis sen beskyttelse, idet den subkutane vei er noe bedre enn den intraperitoneale. Som tidligere beskrevet (Playfair & De Souza, Parasite Immunol., 8 409 (1986)) beskyttet antigen i.p. pluss saponin alle musene nesten uavhengig på den 10. dag.

Hjelpestoffvirkningen av gamma-IFN var bare litt dårligere enn saponin's. Ved 5.000 E, dosen som ble brukt i de fleste eksperimenter, ble over 90% av musene beskyttet innbefattende over 70% som kom seg tidlig: de intraperitoneale og subkutane veier var like effektive. Intradermal og intramuskulær injeksjon var også effektiv, men noe mindre. I en liten serie eksperimenter var også doser av IFN ned til 200 enheter effektive.

En viktig betraktning med alle rekombinante materialer er om virkningene skyldes medfølgende endotoksin, spesielt da lipopoly-sakkarid (LPS) er kjent å ha hjelpestoffaktivitet.

Man tror ikke at virkningene som her er rapportert skyldes LPS, da endotoksin-innholdet (ved Limulus-måling) av IFN'et var mindre enn 0,25 EU/mg protein, hvilket er ekvivalent med mindre enn 0,1 pg pr. 5000 enheter gamma-IFN. Som tabell 1 viser hadde doser av LPS godt over dette område bare svak hjelpestoffvirkning i foreliggende modell og induserte aldri sterk tidlig beskyttelse. Saponin og gamma-IFN alene var ikke beskyttende, slik at det er usannsynlig at gamma-IFN'et virker direkte i blodstadiet-parasittene, som det nylig er vist for leverstadiet (Ferreira et al., Science, 232, 881 (1986)).

Skjønt oppfinnelsen og alle foretrukne utførelsesformer derav er fullstendig beskrevet ovenfor, er det ikke meningen at oppfinnelsen skal være begrenset til de spesielt beskrevne utførelsesformer, men tvert imot innbefatte alle modifikasjoner derav som kommer innenfor rammen av de følgende krav.

Gjennom denne oppfinnelse brukes uttrykkene "peptid" og "polypeptid" om hverandre. Slik det her brukes betyr uttrykket "syntetisk polypeptid" en kjemisk oppbygning.

Gjennom beskrivelsen brukes frasen "immunologisk tilsvarer hovedsakelig" i forbindelse med antigener i den betydning at antigenet induserer produksjon av antistoffer som binder seg til antigenet og (a) binder seg til antigen-determinanten til den naturlige infeksjonsorganisme eller (b) induserer T-celle-formering. Således fungerer antigenene i denne oppfinnelse immunologisk i likhet med den tilsvarende infeksjonsorganisme, men er også i stand til å indusere produksjon av antistoffer mot seg selv.

Ordet "antigen" er historisk blitt brukt til å betegne en enhet som er bundet av et antistoff og til å betegne enheten som induserer produksjon av antistoffet. Nyere bruk begrenser betydningen av antigen til den enhet som er bundet av et antistoff, mens ordet "immunogen" brukes for enheten som induserer antistoff-produksjon. I noen tilfeller er antigenet og immunogenet den samme enhet. Når en enhet som er omtalt her er både immunogen og antigen, vil den generelt kalles et antigen, infeksjonsorganisme eller biologisk aktiv substans.

Forklaring av figurene:

Figur 1 viser de totale IFA-mengder 10 dager etter angrep. Mus vaksinert med antigen alene hadde mengder på 1/256-1/1000, mens både saponin og gamma-IFN forsterket disse 8-16 ganger. Intraperitoneal injeksjon syntes marginalt bedre. Figur 2 viser at mus vaksinert med antigen alene ga DTH-reaksjoner som ikke var større enn ikke-vaksinerte mus, men at både saponin og gamma-IFN gitt subkutant induserte sterk priming for DTH. Saponin i. p. (den mest beskyttende kombinasjon) induserte det sterkeste DTH, men overraskende induserte gamma-IFN ad denne vei ikke signifikant DTH. Figur 3 viser at både saponin og gamma-IFN utmerket induserte T-hjelper-priming. I dette tilfelle var gamma-IFN like effektiv ad de subkutane og intraperitoneale veier.

Den følgende utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er gitt som eksempel og illustrasjon.

Mus

(C57 Bl x Balb/c) Fl mus av begge kjønn ble brukt på 10-14 ukers alderstrinnet.

Parasitter

Den virulente YM-linje av P.yoelii (A.A. Holder og

R.R. Freeman, Nature 294, 361-364) ble opprettholdt ved ukentlig blodpassasje. Mus ble infisert ved i.v. injeksjon av IO<4>parasittiserte røde celler. Parasittemier ble tellet på Giemsa-farvede haleblodfilmer.

Fremstilling av vaksiner

Givermus infisert i.v. med IO<7>parasittiserte røde blodceller ble blodtappet 4 dager senere i heparinisert fosfat-bufret saltvann (PBS), når deres parasittemier nådde 100%, idet 90% av parasittene er schizonter. Etter tre vasker i PBS ble det parasitt-holdige blod lyset på 0,01% saponin ved 37°C i 30 minutter og vasket tre ganger eller inntil supernatanten var fri for synlig hemoglobin. Klumpen ble gjenoppslemmet i ekstraksjonsbuffer (se nedenunder) ved et forhold på 1 volum klump til 5 volumdeler buffer. Løseliggjøring ble utført ved 4°C i 3 timer ved hvirvelrøring i intervaller. Celleavfall og uløselig materiale ble fjernet ved mikrofuging i 10 minutter. Supernatanten ble så dialysert natten over mot PBS før den ble brukt til å immunisere mus som beskrevet ovenfor.

Ekstraksjonsbuffer

Triton-X-100 ble brukt ved 0,5% fylt opp i 50 mM tris-HCl ved pH 8,0 med 5 mM EDTA, 20 mM jodacetamid, 5 mM PMSF, 1 ug/ml

pepstatin (alle fra Sigma) og 5 pl/ml Trasylol som beskrevet av Deans et al., (Clin. Exp. Immunol. 49, 297-309 (1982)), ved tilsetning av 2 pg/ml leupeptin (Calbiochem).

Vaksinasjon og hjelpestoff

Mus ble vaksinert med to intraperitoneale injeksjoner av

25 pg lysat-protein ved 2 ukers intervaller, enten med eller uten hjelpestoff (kontroll) eller med Bordetella pertussis

(IO<8>organisme) eller musedyr-IFN-gamma (sats 3209-14 og 3209-33, spesifikk aktivitet 1,5 x IO<7>E/mg, renhet > 99%, endotoksininnhold < 0.25 EU/mg) levert av Boehringer Ingelheim. Det ble også undersøkt andre injeksjonsveier, nemlig subkutan, intramuskulaer og intradermal.

Musene ble infisert 3 uker senere med IO<4>parasitter i.v. Resultatene er vist i tabell II.

Mønstre for rekreasjon hos vaksinerte mus

Alle ikke-vaksinerte mus var døde den 9. dag. Vaksinerte mus falt i to klare grupper: slike som kom seg 7-10 dag og slike som kom seg rundt 17-20 dag. Den siste gruppen viste alltid et fall i parasittemi, men beholdt ikke dette. I forbindelse med foreliggende undersøkelse ble derfor beskyttelsen med vaksiner klassifisert som "tidlig" hvis parasittemi ble permanent overvunnet på eller før 10. dag, og "sen" hvis dette foregikk senere. Faktisk opptrådte "sen" rekreasjon i disse eksperimenter alltid mellom dag 17 og 25.

Man vil se at IFN-gamma som hjelpestoff ga utmerket beskyttelse, spesielt ved den ønskelige s.c. vei. Videre kom 15 av 19 mus i denne gruppen seg tidlig, mens i det tilsvarende forsøk med B. pertussis hjelpestoff kom 4 mus seg tidlig, 4 kom seg sent og 2 døde. Uten hjelpestoff døde 17 av 20 mus. Videre forsøk (resultater ikke vist) tydet på at hjelpestoff alene ikke ga noen beskyttelse.

Måling av T- hjelp

Mus ble vaksinert som beskrevet ovenfor, og 3 uker etter den siste dose vaksine ble de injisert intravenøst med IO<3>røde blodceller med P.yoelii som parasitter, belagt med hapten trinitrofenol (TNP) ved inkubasjon med 2,4,6-trinitrobenzen-sulfonsyre (Playfair, De Souza & Cottrell, Immunology, 32, 681

(1977)) (TNP-PY), eller med TNP-belagte normale røde museblod-celler (TNP-MRBC). 4 dager senere ble miltene deres undersøkt etter direkte anti-TNP plaque-dannende celler (PFC) i Cunningham-kammeret (Playfair et al., Immunology 32, 681 (1977)). Fordi det forut var vist at T-hjelpeceller-priming er maksimal ved små doser vaksine, brukte man rutinemessig en enkel injeksjon på 1 ug antigen.

Måling av forsinket hypersensitivitet

Mus ble vaksinert som beskrevet ovenfor, og 3 uker etter den siste dose vaksine ble de injisert i øremuslingen på høyre side med 3 x IO<6>røde blodceller med P.yoelii som parasitt i 10 ul fosfat-bufret saltvann (PBS) og i venstre (kontroll) øre med bare PBS. 1 dag senere ble de injisert intravenøst med IO<7><31>Cr-merkede normale syngeniske benmargceller, og etter ytterligere 24 timer ble de avlivet,ørene deres ble skåret av og deres radioaktivitet ble målt på en LKB gamma-teller (Cottrell, Playfair & De Souza, Clin. exp. Immunol., 34, 147 (1978)). Resultatene som er vist i fig. 2 er den prosentdel av de totale injiserte benmargceller som spesifikt holder til i det antigen-infiserte øre beregnet som:

Antistoff

Antistoffreaksjoner etter infeksjon ble målt ved indirekte fluorescens (IFA) ved bruk av objektglass-metoden til Voller & 0'Neil Bulletin of the World Health Organization, 45, 524

(1971). Hos vaksinerte mus påviser denne måling overveiende IgG-antistoff (Playfair & De Souza, Parasite Immunol. 1, 197

(1979)).

Claims (21)

1. Vaksine mot infeksjon av en infeksjonsorganismeparasitt i verten eller mot enhver biologisk aktiv substans hvis aktivitet skal kontrolleres omfattende en effektiv mengde av et antigen-og immunogen-preparat av infeksjonsorganismen eller av den biologisk aktive substans, interferon som et hjelpestoff og en fysiologisk tolererbar bærer og/eller fortynningsmiddel, hvilken vaksine, når den innfø res i verten, er i stand til å indusere produksjon av antistoffer og stimulere B- og/eller T-celler hos verten, hvilke antistoffer immunreagerer med infeksjonsorganismen eller med den biologisk aktive substans og hvilken vaksine beskytter verten mot infeksjon.

2. Vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at infeksjonsorganismen er en virus.

3. Vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at infeksjonsorganismen er en protozo.

4. Vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at infeksjonsorganismen er en bakterie.

5. Vaksine ifølge krav 2 mot infeksjon av hepatitt B-virus omfattende en effektiv mengde av et polypeptid som immunologisk hovedsakelig tilsvarer deler av hepatitt B-virus-overflateantigenet, interferon som et hjelpestoff og en fysiologisk tolererbar bærer og/eller fortynningsmiddel, hvilken vaksine, når den innføres i en vert, er i stand til å indusere produksjonen av antistoffer og stimulere B- og/eller T-celler i verten, hvilke antistoffer immunreagerer med hepatitt B-virusen og hvilken vaksine beskytter verten mot hepatitt B-virusinfeksjon.

6. Vaksine ifølge krav 2 mot infeksjon av tetanus-virus omfattende en effektiv mengde av et antigen- og immunogenpreparat av tetanus-virusen, interferon som et hjelpestoff og en fysiologisk tolererbar bærer og/eller fortynningsmiddel, hvilken vaksine, når den innføres i en vert, er i stand til å indusere produksjonen av antistoffer og stimulere B- og/eller T-celler i verten, hvilke antistoffer immunreagerer med tetanus-virusen og hvilken vaksine beskytter verten mot tetanus-virusinfeksjon.

7. Vaksine ifølge krav 2 mot infeksjon av influensavirus omfattende en effektiv mengde av et polypeptid som immunologisk hovedsakelig tilsvarer deler av influensavirusen, interferon som et hjelpestoff og en fysiologisk tolererbar bærer og/eller fortynningsmiddel, hvilken vaksine når den innføres i en vert er i stand til å indusere produksjonen av antistoffer og stimulere B- og/eller T-celler i verten, hvilke antistoffer immunreagerer med influensavirusen og hvilken vaksine beskytter verten mot influensa-virusinfeksjon.

8. Vaksine ifølge krav 2 mot infeksjon av rhinovirus omfattende en effektiv mengde av et polypeptid som immunologisk tilsvarer hovedsakelig deler av rhinovirusen, interferon som et hjelpestoff og en fysiologisk tolererbar bærer og/eller fortynningsmiddel, hvilken vaksine når den innfø res i en vert er i stand til å indusere produksjonen av antistoffer og stimulere B- og/eller T-celler i verten, hvilke antistoffer immunreagerer med rhinovirusen og hvilken vaksine beskytter verten mot rhino-virusinfeksjon.

9. Vaksine ifølge krav 2 mot infeksjon av poliovirus omfattende en effektiv mengde av et polypeptid som immunologisk tilsvarer i det vesentlige deler av poliovirusen, interferon som et hjelpestoff og en fysiologisk tolererbar bærer og/eller fortynningsmiddel, hvilken vaksine, når den innfø res i en vert, er i stand til å indusere produksjonen av antistoffer og stimulere B- og/eller T-celler i verten, hvilke antistoffer immunreagerer med poliovirusen og hvilken vaksine beskytter verten mot polio-virusinfeksjon.

10. Vaksine ifølge krav 2 mot infeksjon av papillomavirus omfattende en effektiv mengde av et polypeptid som immunologisk tilsvarer hovedsakelige deler av papillomavirusen, interferon som et hjelpestoff og en fysiologisk tolererbar bærer og/eller fortynningsmiddel, hvilken vaksine, når den innfø res i en vert, er i stand til å indusere produksjonen av antistoffer og stimulere B- og/eller T-celler i verten, hvilke antistoffer immunreagerer med papillomavirusen og hvilken vaksine beskytter verten mot papilloma-virusinfeksjon.

11. Vaksine ifølge krav 2 mot infeksjon av retroviruser omfattende en effektiv mengde av et polypeptid som immunologisk hovedsakelig tilsvarer deler av retrovirusen, interferon som et hjelpestoff og en fysiologisk tolererbar bærer og/eller fortynningsmiddel, hvilken vaksine, når den innfø res i en vert, er i stand til å indusere produksjon av antistoffer og stimulere B- og/eller T-celler i verten, hvilke antistoffer immunreagerer med retrovirusene og hvilken vaksine beskytter verten mot retro-virusinfeksjon.

12. Vaksine ifølge krav 3 mot infeksjon av Plasmodium sporozoitter omfattende en effektiv mengde av et antigen- og immunogenpreparat av Plasmodium-organismen, interferon som et hjelpestoff og en fysiologisk tolererbar bærer og/eller fortynninsgmiddel, hvilken vaksine, når den innføres i en vert, er i stand til å indusere produksjonen av antistoffer og stimulere B- og/eller T-celler i verten, hvilke antistoffer immunreagerer med Plasmodium-sporozoittene og hvilken vaksine beskytter verten mot hepatitt B-virusinfeksjon.

13. Vaksine ifølge krav 3 mot infeksjon av trypanosomer omfattende en effektiv mengde av et antigen- og immunogenpreparat av trypanosom-organismen, interferon som et hjelpestoff og en fysiologisk tolererbar bærer og/eller fortynningsmiddel, hvilken vaksine, når den innføres i en vert, er i stand til å indusere produksjonen av antistoffer og stimulere B- og/eller T-celler i verten, hvilke antistoffer immunreagerer med trypanosomene, og hvilken vaksine beskytter verten mot trypanosom-virusinfeksjon.

14. Vaksine ifølge krav 4 mot fordøyelsessykdom omfattende en effektiv mengde av et antigen- og immunogenpreparat av den patogene organisme, interferon som et hjelpestoff og en fysiologisk tolererbar bærer og/eller fortynningsmiddel, hvilken vaksine, når den innføres i en vert, er i stand til å indusere produksjonen av antistoffer og stimulere B- og/eller T-celler i verten, hvilke antistoffer immunreagerer med den patogene organisme, og hvilken vaksine beskytter verten mot fordø yeIseskanalsykdom.

15. Vaksine ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at interferonet er av oc-typen.

16. Vaksine ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at interferonet er av |3-typen.

17. Vaksine ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at interferonet er av gamma-typen.

18. Fremgangsmåte ved fremstilling av en vaksine ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at man tilveiebringer en effektiv mengde av et antigen- og immunogen-preparat av infeksjonsorganismen og interferon som et hjelpestoff og opplø ser eller dispergerer en effektiv mengde av komponentene i en fysiologisk tolererbar bærer og/eller fortynningsmiddel.

19. Fremgangsmåte ved fremstilling av en vaksine ifølge krav 18, karakterisert ved at den effektive mengde av antigen- og immunogenpreparatet av infeksjonsorganismen og den effektive mengde av interferon som et hjelpestoff oppløses separat eller dispergeres i en effektiv mengde av en fysiologisk tolererbar bærer og/eller fortynningsmiddel, og begge komponenter blandes rett før injeksjon eller inn separat.

20. Anvendelse av interferon for fremstilling av vaksiner for beskyttelse av verter mot infeksjoner av infeksjonsorganismer ifølge et av kravene 1 til 17, hvilke vaksiner omfatter minst to komponenter hvorav én er et antigen- og immunogenpreparat av infeksjonsorganismen og den andre er interferon som et hjelpestoff .

21. Sett for vaksiner ifølge et av kravene 1 til 17 omfattende ampuller eller lignende med a. en effektiv mengde av et antigen- og immunogenpreparat av en infeksjonsorganisme, f.eks. bakterier, virus, protozoer, helminter, sopper og andre parasittiske organismer i verten, b. en effektiv mengde av interferon som virker som et hjelpestoff og c. en fysiologisk tolererbar bærer og/eller fortynningsmiddel for opplø sning eller dispergering av komponentene fra a.) og b.).