NO871107L - Kombinasjonsterapi ved bruk av interleukin-2 og/eller interferon-b og tumor nekrose faktor. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en kombinasjon av interleukin-2, IL-2, og/eller interferon-g, IFN-g, og tumornekrosefaktor, TNF, og bruken av denne kombinasjon som antitumor terapeutisk middel.

Interleukin-2, et lymfokin som fremstilles av normale perifere blodlymfocyter og induserer proliferering av antigen- eller mitogenstimulerte T-celler etter eksponering til plantelecitiner , antigener eller andre stimuli, ble først beskrevet av Morgan, D.A. et. "Science" (1976), 193:1007-1008. Den gang kalt T-celle vekstfaktor på grunn av evnen til å indusere proliferering av stimulerte T lymfocyter, er det nu erkjent at i tillegg til vekstfaktoregenskapene modulerer den et antall funksjoner av immunsystemceller in vitro og in vivo og en omdøpt til interleukin-2 eller IL-2.

Interleukin-2 ble til å begynne med fremstilt ved dyrking av humane perifere blodlymfocyter, PBL, eller andre IL-2 produserende cellelinjer. Se til dette f. eks. US-PS 4 401 756. Rekombinant DNA teknologi har gitt et alternativ til PBL og og cellelinjer for fremstilling av IL-2. Taniguchl, t. et al, "Nature" (1983), 302:305-310 og Devos, R., "Nucleic Acids Research" (1983), 11:4307-4323 har angitt kloning av human IL-2 genet og eksprimering av dette i mikroorganismer.

US-PS 4 518 584 beskriver og krever muteiner av IL-2 hvori cystein som vanligvis opptrer i posisjon 125 i villtype-eller nativ molekyl er erstattet med en nøytral aminosyre slik som serin eller alanin. Et oksydasjonsresistent mutein slik som IL-2 som er biologisk aktivt kan fremstilles hvori hver meteoninrest i proteinet hvorfra muteinet er avledet, hvilket meteonin er ømfindtlig overfor kloramin T- eller peroksydoksydasjon, er erstattet med en konservativ aminosyre slik som alanin. Disse IL-2 muteiner har den biologiske aktivitet til nativ IL-2. US-PS 4 530 787 og 4 569 790 beskriver og krever metoder for rensing av rekombinant nativ IL-2 og muteiner derav såvel som rensede former av IL-2.

PCT W085/04328 beskriver et IL-2 preparat egnet for rekonstituering i en farmasøytisk akseptabel vandig bærer bestående av oksydert mikrobielt fremstilt rekombinant IL-2. Dette IL-2 er angitt som brukbart i kombinasjon med cytotoksisk kjemoterapi eller bestråling eller kirurgi ved behandling av malignøse eller pre-malignøse sykdommer I en direkte terapeutisk eller et hjelpestoffoppsett eller i kombinasjon med andre immunomodulerende medikamenter, lymfokiner (f. eks. IL-1, !L-3, CSF-1 og IFN som naturlig opptrer eller induserbare anticellulaere toksiner ved behandling av malignøse sykdommer.

Forskjellige terapeutiske applikasjoner av human IL-2 er undersøkt og angitt av S. Rosenberg og kolleger (se f. eks. Mule et al. "Science" (1984), 225:1487 og S. Rosenberg et al., "New England Journal of Medicine" (1985), 313:1485).

Interferoner, IFN, utgjør en gruppe naturlig forekommende proteiner som er kjente for å vise antivirale, antitumor. og immunoregulatorisk oppførsel. To typer IFN er identifisert basert på forskjeller i deres observerte biologiske egenskaper og molekylstrukturer: Type I og type II. p<->interferon, IFN-3, er et type I IFN som kan induseres i fibroblaster ved viralutfordring og inneholder ca. 165 aminosyrer. IFN-cx er også et type I IFN som kan induseres i leukosyter og IFN-7er et type II IFN som induseres I lymfocyter som svar på spesifikke mytogene stimuli og Inneholder 146 aminosyrer.

Human IFN-p kan fremstilles ved rekombinant DNA teknologi som f. eks. beskrevet i EP publikasjon 28 033 samt GB-PS 2 063 882. I tillegg kan IFN-p være et mutein der aminosyrene som ikke er vesentlige for den biologiske aktivitet, er utelatt eller erstattet med andre aminosyrer for å øke stabiliteten slik som beskrevet i US-PS 4 588 585. Muse IFN-p kan også fremstilles ved rekombinant DNA teknologi.

Etter at Paucker et al., "Virology", 17:324-334 (1962) viste at IFN hemmet veksthastigheten for muse L celler har mange forskere studert behandling av muse L celler med IFN og inhibering av tumorcelle proliferering med IFN, f. eks. Borden, E.C., "Ann. Intern. Med.", 91:472-479 (1979).

Tumornekrosefaktor TNF ble først beskrevet av Carswell et al., PNAS". (USA) (1975), 72:3666-3670 som en endotoksin-indusert serumfaktor som forårsaker nekrose av kjemiske transformerte tumorceller når de dyrkes i mus. Rensede preparater av murin TNF er prøvet mot murin- og humancelle-linjer in vitro, se K. Haranaka og N. Satomi, "Japan J. Exp. Med." (1981), £51:191. I motsetning til normale celler var tumorcellelinjer fra begge arter reaktive overfor den cytotoksiske aktivitet til muse TNF. Videre ble det murine TNF angitt å være toksiske mot både human- og musetransplan-terte tumorer i nakne mus, se til dette K. Haranaka et al., "Int. J. Cancer" (1984), 34:263-267. Human TNF er også kjent å være cytotoksisk mot neoplastiske celler og er fremstilt i rekombinant form, se til dette Pennica et al., "Nature"

(1984), 312:724-729; Shirai et al., Nature" (1985), 313:803-806; Wang et al., "Science", (1985), 228:149-154.

Kloning av kanin TNF er beskrevet i EP-PS 146 026 og EP-PS 148 311. Kloning av human TNF 151 og 155 aminosyrer, 2 henholdsvis 6 mindre enn den native form, er beskrevet i EP-PS 155 549 og human TNF med 155 aminosyrer er beskrevet i EP-PS 158 286 tilsvarende GB-PS 2 158 829A. Kloningen av matur TNF med 157 aminosyrer og forskjellige modifiserte former (muteiner) er beskrevet i EP-PS 168 214 og PCT US85/01921.

Kombinasjonsterapi ved bruk av to eller flere anti-cancer medikamenter for å behandle malignøse tumorer hos mennesker er idag i bruk i forskningen og i hospitaler. Anti-cancer medikamenter kan være antimetaboliter, alkyleringsmidler, antibiotika, generelle gifter osv. Kombinasjoner av medikamenter administreres i et forsøk på å oppnå en synergistisk cytotoksisk virkning mot de fleste cancere, f. eks. carcinom-er, melanomer, lumfomer og sarcomer, og for å redusere eller eliminere opptreden av medikamentresistente celler og å redusere bivirkningene for hvert medikament.

Det er kjent at type I- og type II interferoner kan kombineres for å gi en synergistisk biologisk virkning, se f. eks. Fleishmann, W.R., "Cancer Res.", (1982), 12:869-875 og DeClercq, E. et al., "Cancer Letters", (1982), 15:223-228 (muse IFN), EP-publikasjon 107 498 (human IFN -y eller I FN-a eller -p). US-PS 4 518 584 beskriver kombinasjonene av IL-2 muteiner med -y-interferon, p-celle vekstfaktor og IL-I. I tillegg er det beskrevet at IL-2 kan benyttes sammen med IFN-"Y for å behandle tumorbærende verter med synergistiske resultater (EP-publikasjon 149 551 og GP-PS 3411184) med forbedring av naturlig dreperaktivitet (Sverdsky et al., "J. Immunol." (1984), 133:714-718 og Shalaby et al., "J. Interferon Res." (1985), 5:571-581). Lopez-Botet et al. "Eur. J. Immunol." (1984), 14:1137-1141 beskriver imidlertid at IL-2 og IFN--y ikke er tilstrekkelig i kombinasjon til å indusere naturlig dreperlignende aktivitet i human T-celle kloner. Det er også kjent fra Dempsey et al., "J. Immun." (1982), 129:2504-2510 at kombinasjonen av I FN-a og IL-2 er mere effektiv enn IFN-a eller IL-2 alene med henblikk på å forårsake naturlig drepercelleaktivering. Videre har Dr. Talmadge fra Preclinicla Screening Lab., BRMP i 1986 angitt den forbedrede virkning av å bruke TNF og IFN-7ved behandling av metastatisk sykdom hos mus. EP 131 789 og EP 168 214 beskriver den synergistiske virkning av TNF og IFN-"y med henblikk på å behandle forskjellige tumorer hos mus. EP 170 843 beskriver den synergistiske virkning av TNF og IFN-a, p og/eller -y på cancer lignende vekst, spesielt for blandinger inneholdende TNF og IFN--y. Se til dette også Williamson et al., "Proe. Nati. Acad. Sei.", (1983) 50:5397-5401 for in vivo virkninger av human TNF og human IFN.

Virkningen av en kombinasjon av IL-2 og TNF alene eller sammen med IFN-p på tumorbærende dyr er ikke undersøkt. I henhold til dette tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et preparat egnet for parenteral eller subcutan administrering til pattedyrverter for terapeutisk behandling av cancer, omfattende en blanding av TNF og IL-2 og/eller IFL-p i synergistisk effektive mengder hvori TNF, IL-2 og IFN-P er fra pattedyrarter.

I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en metode for terapeutisk behandling av cancer hos pattedyrverter omfattende administrering av en synergistisk effektiv mengde av TLF og IL-2 og/eller IFN-p til verten der TNF, IL-2 og IFN-P er fra pattedyrarter, og der TNF og IL-2 administreres sekvensielt og der administreringen av TNF går foran administreringen av IL-2.

Fortrinnsvis er det benyttede TNF kanin- eller human TNF, IIL-2 er human IL-2 og IFN-p er human- eller muse IFN-p, idet alle proteiner er rekombinante, mikrobielt fremstilte proteiner.

Kombinasjonen av IL-2 og TNF er funnet å gi en overraskende synergisme i behandling av forskjellige former for cancer slik som melanom, leukemi, mastocytomer og lungekreft.

Som her benyttet henviser uttrykket "terapeutisk" behandlign til administrering til verten av TNF og IL-2 eller TNF og IFN-p, eller TNF, IFN-p og IL-2 etter at verten har kontrak-tert cancer, bestemt på en hvilken som helst måte. Behandlingen er ikke ansett å være terapeutisk hvis etter behandling en tumor opptrer eller en eksisterende tumorbyrde Ikke er redusert eller eliminert. Virkningen av dosen vil reduseres med tiden idet 5-7 dager etter at tumoren er synlig er karakteristisk den maksimale periode i hvilken behandling kan gis, hovedsakelig avhengig av typen tumor og doseringsnivå. Slik uttrykket her benyttes skal uttrykket "cancer" henvise til enhver neoplastisk mangel inkludert slike cellulære mangler som f.eks. rentalcellecancer, Kaposi's sarcom, kronisk leukemi, brystkreft, sarcom, ovariecarcinom, rektal-kreft, strupekreft, melanom, colon cancer, blærekreft, mastocytom, lungekreft og gastrointestinal- eller mavekreft. Fortrinnsvis er kreften leukemi, mastocytom, melanom og lymfom.

Som benyttet heri anvendes uttrykket "synergistisk effektiv mengde" slik det benyttes i forbindelse med IL-2 og TNF, under henvisning til den mengde av hver forbindelse av blandingen som er effektiv for vertens overlevelse og som gir et overlevelsesnivå som ikke skjærer, i en doseresponsoppfør-ing av dosen TNF mot dosen IL-2 mot vertens overlevelse, hverken dose TNF-aksen eller dose IL-2-aksen. Det samme gjelder IFN-p og TNF. Hvis IFN-p, IL-2 og TNF alle er tilstede blir tre akser benyttet for de tre forbindelser. Doseresponskurven som benyttes for å bestemme synergi i foreliggende tilfelle er mere beskrevet av Sande et al., s. 1080-1105 i A. Goodman et al., "the Pharmacological Basis of Therapeutics", MacMillan Publishing Co., Inc., New York

(1980). For synergidefinisjon defineres helbredelse som en helbredelse av verten etter 14 dager fra tumorimplanteringen i verten for Meth A tumorer og etter 60 dager for alle andre tumorer. De optimale synergistiske mengder kan bestemmes ved bruk av en 95% konf idensgrense, ved å variere faktorer slik som dosenivå, oppsett og respons, og ved å bruke en data-dannet modell som gir isobologrammer fra doseresponskurvene for forskjellige kombinasjoner av IL-2 og TNF, IFN-P og TNF eller IL-2, IFN-p og TNF. De høyeste overlevelsesgrader på doseresponskurven korrelerer med de optimale dosenivåer.

Som heri benyttet henviser uttrykket "rekombinant" til TNF, IL-2 og IFN-p som fremstilles ved rekombinante DNA teknikker der generelt genet som koder for TLF, IFN-p eller IL-2 klones ved kjent rekombinant DNA teknologi. Ved f. eks. å bruke human TNF- eller -IL-2 cDNA eller muse IFN-p cDNA som sjablon blir gener som viser komplementaritet til disse innskutt i en egnet DNA vektor slik som et bakterielt plasmid, fortrinnsvis et E. coli plasmid, for å oppnå et rekombinant plasmid, og dette benyttes for å transformere en egnet vert. Genet eksprimeres i verten for å gi det rekombinante protein. Eksempler på egnede rekombinante plasmider for dette formål omfatter p-b-r322, pCEl, pMB9 og pSCl. Den transformerte vert kan være aukariotisk eller prokariotisk, fortrinnsvis er den en prokariotisk vert.

Som heri benyttet betyr uttrykket "farmasøytisk akseterbar" et bærermedium som ikke påvirker effektiviteten til den biologiske virkning av de aktive bestanddeler og som ikke er toksisk overfor verten til hvilken forbindelsen administreres .

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen involverer administrering til en pattedyrvert, f. eks. en humanvert, av en synergistisk effektiv mengde av TNF og IL-2, av TNF og IFN-p eller av TNF, IL-2 og IFN-p. IL-2 og/eller IFN-P og TNF kan kombineres in vitro før administrering eller administreres separat til verten. IFN-P og TNF kan administreres enten simultant eller ved administrering av en komponent etter den andre idet enhver andre administrering generelt skjer innen 5 til 10 og fortrinnsvis ca. 5 minutter etter at den første administrering er ferdig. Hvis IL-2 og TNF benyttes kan de administreres enten samtidig eller ved administrering av TNF fulgt av IL-2 idet den andre generelt skjer etter at den første er ferdig. Administrering av IL-2 før TNF ga ikke synergisme og IL-2 kan redusere tumorens sensitivitet for etterfølgende TNF behandling.

Administreringen kan skje på en hvilken som helst egnet måte inkludert subkutan og parenteral administrering, fortrinnsvis er den parenteral. Eksempler på parenteral administrering inkluderer intravenøs, intraarterial, intramuskulær og intrapertoneal administrering der den intraperitoneale er foretrukket (for hensiktsmessighetens skyld) med murinmodell-er.

Dosen og doseringsplanen avhenger hovedsakelig av hvorvidt IL-2, IFN-p og TNF administreres separat eller som en blanding, typen cancer, pasienten samt dennes historie. Mengden må være effektiv til å gi en tumorreduksjon som er synergistisk. Dosene kan være enkeltdoser eller multipledoser. Hvis multipledoser benyttes, noe som er foretrukket, vil admlnistreringsf rekvensen f. eks. avhenge av vert og type cancer, dosemengde osv. For enkelte typer cancer eller cancerlinjer kan daglig administrering være effektiv mens for andre kan administrering kun hver annen eller hver tredje dag være effektiv, mens daglig administrering er ineffektiv. Den utøvende lege vil ved rutinforsøk kunne fastslå hvilken administreringsvei og admlnistreringsfrekvens som er mest effektiv I ethvert gitt tilfelle.

Den doseringsmengde som synes å være mest effektiv er en som resulterer i ingen opptreden av tumor eller total regresjon, og som ikke er toksis for verten. Det optimale nivå vil avhenge av mange faktorer, f. eks. typen vert og type cancer, administreringsvei og plan, eksisterende tumorbyrde, typen IL-2, IFN-p og TNF samt toksisitetens definisjon. Toksisitet mot verten kan defineres som den grad og type bivirkninger eller ved den mengde kroppsvekttap eller eventuell død etter et visst tidsrom. Hvis kroppsvekttapet er kriterier for toksisiteten vil karakteristisk et vekttap fra 10 til 20% tolereres mens vekttap ut over 20% anses å være toksisk virkning. Hvis kroppsveksttap på mer enn 20% ansees toksisk, hvis verten er murin, hvis administreringsveien er intraperi-toneal via en blanding fremstilt in vitro og skjer hver dag eller hver annen dag, vil doseringsnivået ved hver administrering av rekombinant, mikrobielt fremstilt TNF og IL-2 fortrinnsvis være 230 til 260 jjg TNF/kg vertsvekt (helst ca. 250 >jg) og ca. 15.000 til 15 millioner enheter IL-2/kg vertsvekt, der 1.000 enheter er 1 jjg (mere foretrukket 15.600 til 625.000 enheter).

For parenteral administrering vil IL-2, IFN-p og TNF generelt formuleres i en Injiserbar enhetsdoseform som oppløsning, suspensjon eller emulsjon, fortrinnsvis i et farmasøytisk aksepterbart bærermedium som inherent er ikke-toksisk og ikke-terapeutisk. Eksempler på slike bærere er saltoppløsn-ing, Ringers oppløsning, dekstroseoppløsning, mannitol og vanlig serumalbumin. Ikke-vandige bærere slik som fikserte oljer og etyloleat kan også benyttes. Bærermediet Inneholder mindre mengder additiver slik som stoffer som forbedrer isotonisiteten og den kjemiske stabilitet, f. eks. buffere og preservativer. IL-2, IFN-p og TNF vil karakteristisk formuleres i slike bærere i en konsentrasjon på ca. 0,1 til 100 mg/ml av hver, fortrinnsvis 0,2 til 1 mg for hver.

Alternativt kan IL-2, IFN-p og TNF omgjøres til en steril, stabil lyofilisert formulering der renset IL-2, IFN-p og TNF blandes med en vannoppløselig bærer slik som mannitol, noe som gir masse, og en tilstrekkelig mengde overflateaktivt middel slik som natrium dodecyl sulfat for å sikre oppløse-lighet av det rekombinante IL-2 eller IFN-p i vann. Formuleringen er egnet for rekonstituering i vandige injeksjoner for parenteral administrering og den er stabil og godt tolerert hos pasienter. IL-2 formuleringsmetoden er beskrevet nærmere i PCT W085/04328.

I ytterligere et alternativ kan blandingen av IL-2 og TNF administreres I en adoptiv immunoterapimetode sammen med Isolerte, lymfokinaktiverte lymfocyter i en farmasøytisk aksepterbar bærer der lymfocytene er reaktive mot tumor når de administreres sammen med TLF og IL-2 til mennesker som lider av tumoren. Denne metode er nærmere beskrevet i S. Rosenberg et al., "New England Journal of Medicine" (1985), 313:1485-1492. I ytterligere et alternativ som er beskrevet av S. Rosenberg et al., "Science", 233:1318-1321 (1986) kan tumorinfiltrerende lymfocyter, TIL, som er ekspandert i IL-2, kan adoptivt overføres for terapeutisk behandling, spesielt i kombinasjon med cyklofosfamid. Rosenberg et als TIL opplegg kan også brukes her.

Som nevnt ovenfor kan IL-2, IFN-p og TNF som her beskrives være en hvilken som helst slik fremstilt fra vevkulturer eller ved rekombinante teknikker, eller fra en hvilken som helst pattedyrkilde slik som f. eks. mus, rotte, kanin, primat, svin eller menneske. Fortrinnsvis blir TNF oppnådd fra kanin- eller humankllder, aller helst humankilder, mens IFN-p avledes fra en musekilde og IL-2 fra en humankilde. Aller helst er IL-2, IFN-p og TNF rekombinant human IL-2, rekombinant muse IFN-p og rekombinant human TNF. Den rekombinante IL-2 kan oppnås som beskrevet av Taniguchi et al., "Nature", 302:305-310 (1983) og Devos, "Nucleic Acids Research", 11:4307-4323 (1983) ved kloning av det native human IL-2 gen og eksprimering av dette i transformerte mikroorganismer. Det kan også være et IL-2 mutein som beskrevet i US-PS 4 518 584 der det systein som vanligvis opptrer i posisjon 125 av villtype- eller nativmolekylet er erstattet med en nøytral aminosyre slik som selin eller alanin, eller et IL-2 mutein der metioninet som vanligvis opptrer i posisjon 104 i villtype- eller nativmolekylet er erstattet med en nøytral aminosyre slik som alanin.

Fortrinnsvis er IL-2 et ikke-glykosylert protein som produ-seres av en mikroorganisme som er transformert med human cDNA sekvensen eller en modifisert human cDNA sekvens av IL-2 som koder et protein med en aminosyresekvens som i det minste i det vesentlige er identisk med aminosyresekvensen i nativhuman IL-2 inkludert disulfidbindingen av cysteiner i posisjonene 58 og 105, og har en biologisk aktivitet som er felles med nativ human IL-2. I det vesentlige Identitet med aminosyresekvenser betyr at sekvensene er identiske eller kun skiller seg ved en eller noen aminosyreendringer (utelatel-ser, tilføyelser, erstatninger) som ikke forårsaker noen ugunstig funksjonell ulikhet mellom det syntetiske protein og det native human IL-2.

Eksempler på IL-2 proteinet med slike egenskaper inkluderer de som er beskrevet av Taniguchi et al., "Nature" (1983), 302:305-310; Devos, "Nucleic Acids Research" (1983), 11:4307-4323, i EP-PS 91 539 og 88 195 samt i US-PS 4 518 584, såvel som IL-<2>aiaio4serl25• Aller helst er IL-2 des-ala^-IL-^serl25"muteinet hvori initialterminalalaninet er utelatt og cysteinet i posisjon 125 er erstattet med en seinrest og IL-2 der enhver kombinasjon av opptil 5 av de første 5 N-terminal-aminosyrerester er utelatt. IL-2 kan fremstilles og renses til klinisk renhet ved den metode som er beskrevet og krevet i US-PS 4 569 790.

I en alternativ formulering kan IL-2 oppløseliggjøres, ikke ved hjelp av en detergens men ved å omsette IL-2 med en aktivert polymer valgt blant polyetylenglykole homopolymerer og polyoksyetylerte polyoler slik som polyoksyetylert glycerol. Polymeren har fortrinnsvis en molekylvekt fra 300 til 100.000 dalton, aller helst 350 til 40.000 dalton. Polymeren aktiveres ved konjugering med koblingsmiddel med terminalgrupper som er reaktive både med de frie amin- eller tiolgrupper i IL-2 og hydroksylgruppene i polymeren. Eksempler på slike koblingsmidler inkluderer hydroksynitro-benzen sulfonsyreester, cyanursyreklorid samt N-hydroksysuc-cineimid. Disse modifikasjoner eliminerer nødvendigheten for å tilsette detergenser for å oppløse IL-2 ved fysiologisk pH verdi. IL-2 blir så formulert direkte med den vannoppløse-lige bærer og buffer som beskrevet ovenfor, formuleringen lyofiliseres og den lyofiliserte blanding kan rekonstitueres som beskrevet ovenfor.

Det her beskrevne IFN-P kan fremstilles naturlig av celler som er eksponert til interferonindusører slik som viruser eller dobbeltstrengede polyribonucleotider slik som beskrevet av Metz, "Adv. Drug. Res.", 10:101-156 (1975). IFN-P kan også fremstilles på rekombinant måte som beskrevet i EP-PS 28 033. Muteiner av IFN-P kan også fremstilles i henhold til US-PS 4 588 585. Spesielt er et IFN-p mutein IFN-Pserl7 som ikke er glycosilert, mangler N-terminal metioninet og har cysteinresten i posisjon 17 av nativ IFN-P erstattet med ser in ved bruk av sete-spesifikk mutagenes. IFN-P kan fremstilles og renses ved den metode som er beskrevet i US-PS 4 462 940.

I tillegg kan muse IFN-p som er det her foretrukne IFN-p, fremstilles ved kjente rekombinant teknikker.

Det rekombinante human TNF kan oppnås som beskrevet av Pennica et al., "Nature" (1984), 312:724-729; Yamada et al., "J. Biotechnology", (1985), 3:141-153; Wang et al., "Science"

(1985), 228:149-154; EP-PS 155 549, EP-PS 158 286, EP-PS 168 214 samt PCT US85/01921. Det rekombinante kanin TNF kan oppnås som beskrevet i EP-PS 146 026 og EP-PS 148 311. Fortrinnsvis er TNF et human TNF mutein der de første åtte aminosyrerester er utelatt, eller dette TNF er et cysteinfat-tig mutein fremstilt analogt med det som er beskrevet i US-PS 4 518 584.

De forskjellige trekk ved oppfinnelsen skal ytterligere beskrives ved hjelp av de følgende eksempler som imidlertid ikke er ment å begrense oppfinnelsen på noen måte. I disse eksempler er alle andeler for faststoffer på vektbasis og alle prosentandeler for væsker og gasser er på volumbasis, forutsatt at intet annet er sagt, mens alle temperaturer er gitt i "C.

EKSEMPEL I

A. Generell behandling

Mus

Hunn BDF1-, -C57B1- og -Balb/c mus og CD rotter ble benyttet i in vivo prøvene. Musene ble veiet tilpasset og vilkårlig fordelt slik at behandlingsgruppene på 5 eller 10 hadde et snitt på 20 + 3g. Alle dyrene ble holdt i karanteneobserva-sjon i 7 dager etter ankomst, holdt i mikroisolaterbur og gitt standard laboratoriedietter sammen med drikkevann ad libitum.

IL- 2

Det i dette forsøk benyttede rekombinante IL-2 var des-ala^-IL-2seri25 beskrevet av Wang et al., "Science" (1984) 224:1431-1433. Aminosyresekvensen i denne IL-2 som skiller seg fra aminosyresekvensen til nativhuman IL-2 idet den mangler Initialalaninet I nativmolekylet og idet cysteinet i posisjon 125 er byttet ut mot serin. Eksempler på E. coil som produserer dette IL-2 er deponert ved ATCC av Cetus Corporation den 26. september 1983 under aksess nr. 39.452 og den 6. mars 1984 under aksess nr. 39.626, alt i overensstem-melse med Budapestavtalen. IL-2 ble prosessert og renset som beskrevet 1 beskrivelse og tekst i PCT W085/04328 bortsett fra at oksydasjonen ble gjennomført ved bruk av kobberklorid slik som beskrevet i US-PS4 572 798 istedet for o-iodosobenzoat. Etter gjenvinning av IL-2 fra kromatografitrlnnet eller trinnene ble den lyofilisert og resuspendert i en nøytral vandig buffer Inneholdende reduksjonsmiddel, DTT, for å holde IL-2 i redusert tilstand, og et oppløseliggjøringsmlddel for å holde det i oppløsning. Renheten av den rekombinante IL-2 etter kromatografitrlnnet eller trinnene var minst ca. 95% og dette IL-2 inneholdt mindre enn ca. 0,02 ng/ml endotoksin, bestemt ved Limulus amebocytanalysen.

De rensede IL-2 (3-5 x IO<6>enheter/mg) ble fremstilt som et lyofillsert pulver i sterile ampuller og rekonstituert ved bruk av steril fosfatbufret saltoppløsning innen 4 dager før bruk og formulert til en konsentrasjon på 0,3 mg/ml med 50 mg/ml mannitol.

I en alternativ formulering blir IL-2 formulert ved omsetning med polyetylenglykol som ble konjugert ved bruk av N-hydrok-sysuccinimid. Det konjugert protein ble formulert direkte i vann og kalles heretter IL-2-PEG.

TNF

Et mutein av human TNF der de første åtte aminosyrer er utelatt fra N-terminus ble fremstilt som beskrevet av Wang et al., "Science" (1985) 228:149-153. Kort sagt ble TNF indusert fra HL-60 celler og renset og sekvensert. Deretter ble en intronløs sekvens som kodet human TNF fremstilt ved å fremstille anriket mRNA, konstruere et cDNA bibliotek, velges en probe og probing av biblioteket for å gjenvinne sekvensen. Deretter ble et ATG startcodon Innført umiddelbart foran GTC sekvensen som N-terminal valinet i det mature protein ved seterettet mutagenese. Kloner ble valgt og strenger legert inn i eksprimeringsvektorer for å oppnå prokariotisk eksprimering av muteinet. Muteinet ble så renset ved kolonnerens-ing, gjenvunnet i rensebufferen og fremstilt som et lyofillsert pulver i sterile ampuller. Til slutt ble det rekonstituert og suspendert ved bruk av steril fosfatbufret saltopp-løsning innen 4 dager før bruk og eventuelt lagret ved 4°C. Dette TNF inneholdt mindre enn 0,001 til 0,006 ng/endotoksin-/mg protein, avhengig av lottnummeret.

Cancer cellelinjer

Målcellene som ble benyttet var murintumorene L1210 (leukemi), P388 (leukemi), P815 (mastocytom) og EL-4 (lymfoma), alle oppnåelige fra ATCC, samt B16W10 (melanom) som er en subklon av Fidler line F10 (melanom murin linjen), oppnådd ved gjennomføring ti ganger in vitro og in vivo av Fidler linjen slik som beskrevet av Vinkelhake et al., "Cancer Res."

(1979) 39:3058-3064.

Alle cellelinjer ble ført to ganger i vevkultur (37<0>C, 8% C02i RPMI 1640 medium med 10% fetal bovin serum, 2 mM L-gln) fra frosne råstoffer akkurat før implantering. Alle tumorer og cellelinjer var negative med henblikk på prøver på mycoplasma og med henblikk på muse anti-viral-antistoff-produksjon.

Subcutane tumor in. 1 eks joner

Tumorcellene ble høstet fra kultursuspensjoner eller mono-sjikt. For subcutane sjikt ble celler (5 x 10<5->10<6>) injisert i det suprakapsulære område. For intraperitoneale, ip, tumorer ble 10<5>celler inokkulert til mus. For B16W10 melanom intravenøs (pulmonær, iv) metastasemodellen ble celler fjernet fra vevkulturplatene ved bruk av trypsin-EDTA, skylt to ganger i fosfatbufret saltoppløsning, og IO<4>celler ble injisert i lateralhalevenen i et volum på 0,2 ml. Hvis musene Ikke ble behandlet med noe lymfokin døde de alle innen 20 - 30 dager etter inokulering, uansett om denne skjedde ip, iv eller sq.

Forsøksmetoder

Grupper på 5 mus/dose ble benyttet bortsett fra B16W10 iv modellen der gruppestørrelsen var 10. Dyrene fikk tumorut-fordringer på dag 0 hvis ikke annet er angitt og alle behandlinger var ip, initiert på den antydede dag etter tumorutfordringen og fortsatt en gang/dag i 14 dager.

For subcutane modeller ble tumorer målt ved bruk av linear calipere i tre ortogonale retninger ved bruk av det samme mål under forsøket. Mens det er en interindividuell variabilitet når denne teknikk anvendes viste gjentagelsesmålinger utført med samme person mindre enn 5% fell. Alle studerte tumorer ble tillatt å vokse til volumer på ca. 2 cm<3>, på hvilket punkt ytterligere målinger var vanskelige og dyrene ble avlivet.

For ip tumorer ble dyrene observert daglig med henblikk på overlevelse. Da alle tumorer som ble studert er letale for mus i løpet av ca. 30 dager etter implanteringen, ble observeringen for forlengelse av levetiden gjennomført i minst 60 dager.

For iv administrert B16 modell ble dyrene avlivet 17 til 21 dager etter celleinokulering og lungekoloniene tellet.

B. Resultater

1. Tabell I antyder de resultater som ble oppnådd når TNF alene, IL-2 alene og forskjellige blandinger av TNF og IL-2 (fremstilt in vitro) ble administrert/kg musevekt intraperitonealt til fem hunn BD2F1 mus/gruppe implantert sq med 2 x 10^ P815 celler, påbegynt 1 dag etter tumorimplanteringen, dag 1, og fortsatt hver dag i 20 dager. Kontrollen ble Injisert kun med PBS daglig i 20 dager.

I tabellen angir "palp" en forkortelse for palperbare tumorer.

Resultatene antydet at den subcutane modell P815 mastocytom (som var responderende til 250 pg/kg TNF hver dag i 14 dager ip fra dag 1 og ikke-responderende til opptil 10 millioner enheter/kg av det samme område IL-2) var responderende til en 5 ganger lavere dosering av TNF når IL-2 ble administrert concomitant. I tillegg opptrådte ingen tumorer når TNF og IL-2 ble administrert sammen ved 250 jjg henholdsvis 625.000 enheter/kg.

2. Tabell II antyder de resultater som ble oppnådd når TNF alene, IL-2 alene og forskjellige blandinger av TNF og IL-2 (fremstilt in vitro) ble administrert/kg musevekt lntraperi-tonealt til 10 BDF1 hunnmus med en kroppsvekt på 24 + 3 g/gruppe Implantert subcutant med 10^ L1210 celler, ut fra

første dag etter tumorimplantering, dag 1, og fortsettende hver dag i 13 dager. Kontrollen hie injisert med PBS daglig i 13 dager.

Resultatene viste at L1210 tumoren ikke responderte på 250 jjg/kg TNF (den maksimale tolererte dose) eller opptil 5 millioner enheter/kg IL-2 når disse midler ble administrert alene. En dose på enten over ca. 260 pg/kg TNF eller 937.500 enheter/kg IL-2 resulterte 1 et kroppsvekttap på over 20%, noe som indikerte toksisitet. Administrert sammen ga IL-2-og TNF-behandling ingen tumorer bortsett fra hvis 250 jjg TNF/kg ble kombinert med kun 9.990 enheter IL-2/kg vertsvekt.

3. Tabell III antyder de resultater som ble oppnådd når TNF alene, IL-2 alene og forskjellige blandinger av TNF og IL-2 (fremstilt in vitro) ble administrert/kg musevekt, intraperl-tonealt, til fem BDF1 hunnmus/gruppe, implantert subcutant med 1 x 10^ B16 celler, fra dag 1 etter tumorimplantering og

fortsatt hver dag i 14 dager. Kontrollen ble Injisert med PBS daglig 1 14 dager.

Kombinasjonen av TNF og IL-2 forhindret tumorvekst menst IL-2 eller TNF alene ikke gjorde det. Det murine B16 melanom er meget likt humanmelanomet og derfor er mange studier gjennom-ført på denne cellelinje. Det faktum at TNF og IL-2 kombinasjonen er effektiv med henblikk på B16 celler antyder at den kan være effektiv ved behandling av humanmelanom.

Det ble funnet at murintumorene L1210, P388 og B16 prlnsipp-ielt var refraktoriske til TNF uansett om tumorene var lokalisert intraperitonealt eller subcutant. En marginal reduksjon i tumorstørrelse ble observert med L1210. Denne refraktoriske oppførsel eksisterte uansett hvorvidt TNF behandlingene skjedde 1,5 eller 10 dager etter tumorimplanteringen. 4. Dette forsøk ble gjennomført for å understøtte definisjo-nen av den optimale adminlstrerlngsplan for kombinasjonen av IL-2 og TNF. Den mest rigorøse modell ved hvilken tumorene ikke opptrådte (den siste dag etter tumorimplantering for vellykket terapi) ble bestemt. I dette forsøk ble L1210 tumorceller implantert i grupper av dyr og behandling ble startet etter 1, 3, 7, 10 eller 14 dager etter.

Tabell IV antyder de resultater som oppnås når en blanding av 250 pg/kg TNF og 39.060 enheter/kg IL-2 ble administrert intraperitonealt til 5 BDF1 hunnmus/gruppe, implantert subcutant med 5 x 10^ L1210 celler, begynnende 1, 3, 7, 10 eller 14 dager etter tumorimplantering, og fortsatt hver dag opptil 20° fra initial implanteringen. Kontrollen ble injisert med PBS daglig i 19 dager.

Gruppene 3- 5 og PBS kontrollen hadde følbare tumorer på dag 7. Oppnådde data viser at den mest rigorøse modell er enten 3- eller 5-dagers (tumorvekst kan ikke forhindres hvis behandling initieres først 7 dager etter tumorimplantering).

Tabell V antyder resultatene som oppnås når TNF alene, IL-2 alene og forskjellige blandinger av IL-2 og TNF/kg musevekt ble administrert intraperitonealt til 5 BDF1 hunnmus/gruppe, Implantert subcutant med 3 x 10^ P388 leukemiceller fra og med 1 dag etter tumorimplantering, fortsatt hver dag i 14 dager. Kontrollen ble injisert med PBS daglig i 14 dager. Alle tumorer vokste progressivt fra dag 15 og var for store og Irregulære for måling dag 21. Derfor virker den daglige dose av kombinasjonen av TNF og IL-2 ikke i P388 tumormodellen.

6. I dette forsøk ble IL-2-PEG benyttet lstedet for IL-2

og en dose hver annen dag ble administrert istedet for en daglig dose. Tabell VI gir resultatene.

Resultatene antydet at behandlingen med IL-2 og TNF på dagene 1, 3 og 7 var mest effektive mens daglig behandling ikke var effektiv.

7. Tabell VII antyder resultatene som ble oppnådd når en blanding av 12.500 enheter IL-2 og 5 pg TNF, fremstilt in vitro, ble administrert/kg musevekt intraperitonealt til 5 BDFI hunnmus/gruppe implantert subcutant med 1 x IO<6>EL-4 muse lymfomceller, ut fra dag 1 etter implantering og fortsatt hver dag i 14 dager. Kontrollen ble injisert med PBS daglig 1 14 dager.

Kombinasjonen av TNF og IL-2 forhindret tumorvekst av EL-4 lymfom mens kontrollen ikke forhindret det.

8. Tabell VIII antyder resultatene som ble oppnådd når en blanding av 12.500 enheter IL-2 og 5 pg TNF, fremstilt in vitro, administreres/kg musevekt intraperitonealt til 10 BDFI hunnmus/gruppe, implantert subcutant med 1 x 10^ B16 celler med start 1, 3, 5, 7 og 10 dager etter tumorimplantering, fortsatt hver dag i 20 dager.

Resultatene antyder at de eneste små tumorbyrder helbredes når kombinasjonsterapien ifølge oppfinnelsen benyttes.

9. Tabell IX antyder resultatet som ble oppnådd når 12.500 enheter IL-2 og 5 jjg TNF, fremstilt in vitro, administreres/kg musekroppsvekt, intraperitonealt til fem eller ti BDFI hunnmus/gruppe implantert Intraperitonealt eller Intravenøst med 1 x IO<5>B16W10 celler fra og med en dag etter tumorimplantering, fortsatt hver dag i minst 14 dager. Kontrollene ble injisert ip eller lv med PBs daglig i minst 14 dager. Etter 14 dager ble de iv injiserte dyr avlivet og deres lungekolonier tellet som sorte noduler, noe som ble antydet som ble antydet som metastaser/sett lunger.

Resultatene antyder at det for intravenøst implanterte tumorer ikke er noen kunstig pulmonær metastase. For Intraperitonealt implanterte tumorer er det en signifikant levetidsforlengelse og i forhold til kontrollen. Derfor antyder dette forsøk at administrering av IL-2 og TNF virker med tumorceller som er lokalisert et hvilket som helst sted 1 legemet, ikke bare ved subcutane lokaliseringer.

EKSEMPEL 2

Når målcellene som Implanteres 1 museverten er metylcholan-tren-indusert sarcom (Meth A) (Balb/c) (oppnådd som en ascit-passert tumor fra Dr. Lloyd Old, Memorial Sloan Kettering, frossen som lager og ført minst to ganger i ascit før bruk) ble det funnet av 50 jjg/kg musevekt TNF alene eller 15.625 enheter IL-2/kg musevekt alene, injisert ip daglig i noen dager, forårsaket total regresjon av tumorene. Imidlertid vokste i løpet av 60 dager etter implantering tumorene tilbake i 80% av musene. I motsetning til dette vokste, når en blanding av 50 jjg TNF/kg mus og 15.625 enheter IL-2/kg mus, fremstilt in vitro og injisert i Meth-A mus ip daglig i samme antall dager og i løpet av 16 dager etter implantering, ingen av tumorene tilbake. Den samme IL-2 og TNF ble benyttet som i Eksempel 1. Resultatene viser at blandingen av TNF og IL-2 ga en komplett helbredelse mens hver komponent alene kun ga 20% helbredelse i Meth-A regresjonsmodellen som generelt er mere sensitiv overfor terapeutika enn modellen ifølge Eksempel 1.

EKSEMPEL 3

Forsøkene I eksemplene 1 og 2 ble gjentatt flere ganger (bortsett fra at man ikke brukte P388) for å generere data for mellom 10 til 50 dyr/dosegruppe. Den maksimalt tolererte dose, MTD, ble definert I disse studier som den maksimale mengde av ett eller flere lymfokiner som kan injiseres slik at det ikke opptrer død og at kroppsvekttapet under og 5 dager etter terapien var mindre enn 5%. For TNF ble denne MTD funnet å være 250 pg/kg (5 pg/20 g mus). for IL-2 ble en maksimal oppløselig dose, 8 mg/ml, benyttet i et volum som holdt 0,1 ml for alle terapeutiske injeksjoner. Således var i IL-2 dosene 500 til 800 jjg/kg (10-16 pg/20 g mus) administrert ip på en daglig basis i 14 dager.

For foreliggende studiums formål betyr "signifikant" forlengelse av levetiden for ip tumormodeller tid-til-død på over 150% i forhold til kontrollgruppene som var PBS behandlet. En total blokkering av tumorfjerning ("helbredelse") er definert i subcutanmodeliene som Ikke målbare tumorer tilstede 60 dager etter initialtumorutfordring.

Resultatene viser at alle dyr utviklet subcutantumor 1 L1210, PB815, B16W10 og EL-4-modellene mens 95% av dyrene hovedsakelig utviklet subcutante Meth-A tumorer. Når de to lymfokiner ble bedømt med henblikk på terapeutisk effektivitet som enkeltmidler ble enkelte inltialvekst inhiberinger observert, (spesielt med L1210 og P815) med TNF behandlinger når terapien ble startet en dag etter tumorutfordring hvis TNF ble administrert ved MTD. En tilsvarende marginalvirknlng ble sett for enkelte ikke Meth-A tumormodeller, spesielt P815, når IL-2 ble administrert som et enkelt middel daglig i 14 dager, igjen kun når terapien ble initiert i løpet av tumorimplantatdagen.

I Meth-A modellen var lymfokinene mere dramatisk effektive fordi sogar en enkelt dose TNF resulterte 1 regresjon av tumorer som var tillatt opptil 10 dagers vekst før terapien ble initiert. Tilsvarende resultater kunne man se for 7-10 dager gamle Meth-A tumorer med høye doser av IL-2 terapi. Når enten TNF eller IL-2 ble gitt som et enkelt middel ved gjentatt dosering i løpet av de første 14 dager, til dyr som hadde kun 1 dag gamle tumorer, kunne Meth-A tumorveksten forsinkes i ca. 30 dager etter opphør av terapien i et signifikant antall dyr, men hovedandelen av dyrene utviklet tumorer på dag 45.

Resultatene i ikke Meth-A modeller viste at dyr som mottar et MTD av TNF samtidig med en optimal (oppløselig) dose av IL-2 innen 1 dag etter tumorutfordringen ikke utvikler tumorer. Interessant er det at mens IL-2 dosen i kombinasjonen i enkelte tilfeller kunne reduseres til 1% av det optimale kunne mengden TNF i blandingen ikke reduseres mer enn 50% for å blokkere tumor"fjerning".

For en definisjon av reelle tumor opptaksperioder for de forskjellige modeller ved bruk av IL-2 + TNF kombinasjonen ble en fiksert kombinasjonsdose (20 pg/kg TNF + 500 >jg IL-2) behandlingen ble initiert på dag 1, benyttet, og deretter ble den tid som gikk med for at tumortypen skulle kunne vokse, undersøkt før initiering av effektiv kombinasjonsterapi. Den maksimalt tillatelige tid for tumorfjerning som fremdeles er godkjent for effektiv TNF + IL-2 terapi er satt som et middel 3-5 dager, selv om B16W10 terapi er initiert til dag 1. Omvendt var for Meth-A 10 dagers tumorer "helbredbare" og viste regresjon. I hver av disse modeller resulterte kombinasjonsbehandlinger som begynte etter den optimale tumorfjerningsperlode i en tumorvekstinhibering men ingen helbredelse. Interessant er å merke seg at vekstinhiberende effekter ble sett kun tidlig i den første uke av den to ukers behandlingsperiode (bortsett fra selvfølgelig for Meth-A der regresjon og vekstinhibering varte meget lenger) og tumorer i dyr som fikk mindre enn totalt effektive TNF- + IL-2 doser vokste hurtig til kontrollnivåer i løpet av uke 2 og 3.

Resultatene av enkeltmiddel- og kombinerings prototerapi for intraperitoneale modeller av de fem murintumorer ble studert. I alle tilfeller ble behandlingene initiert en dag etter tumorcelle inokuleringer. Mens kombinasjonen av TNF og IL-2 blokkerte tumorfjerning i subcutane modeller var det ingen tilsvarende blokkering i de intraperitoneale modeller når disse lymfoklner ble administrert i kombinasjon eller alene. Imidlertid observerte man en signifikant forlengelse av levetiden for peritonealt B16 melanom-, EL-4 lymfom- og Meth-A tumorer når kombinasjonen av IL-2 og TNF ble administrert ved bruk av den samme protokoll som den med totalt blokkerte tumorfjerning i subcutane modeller.

Til slutt ble kombinasjonen av IL-2- og TNF terapi sammenlignet med enkeltmiddeladministrering i dyr som intravenøst var inokulert med B16Q10 melanocyter. Studier tilsvarende de som prøver tumorcellebelastninger-fjernlngsperioden for de subcutane tumorer ble også gjennomført slik at den maksimale mengde av den tid som kunne tillates for tumorvekst før man startet helbredelsesteraplen kunne defineres nærmere. Behandlinger med IL-2 og TNF, administrert concomitant som en optimal dose, var synergistisk hvis behandlingen ble Initiert 1 dag etter tumorimplantering. Når behandlingen ble initiert 3 dager etter implantering var antallet pulmonære metastaser signifikant mindre enn kontrollene men alle dyrene hadde tumorer.

Som en konklusjon krever kombinasjonene TNF + IL-2 terapeutisk synergi tydeligvis (a) TNF I en maksimal tolerert daglig dose; mens mengden IL-2 i det daglige program kunne skjæres tilbake helt ned til 99%, (b) bindes til tumorbelastningen eller mengdene tid de implanterte celler ble tillatt før Initiering av terapien, og denne tid varierte avhengig av tumortype, og (c) være effektiv for subcutane og pulmonære tumorer men resulterte ikke i blokkering av fjerning av intraperitoneale tumorer.

De synergistiske virkninger av TNF og IL-2 i disse modeller skyldes mest sannsynlig et komplekst sett av interaksjoner. I tillegg til en åpenbar avhengighet av vertens tumorbelastning med henblikk på vellykket lmmunoterapi kan synergisme mellom TNF og IL-2 forklares uten å begrenses til noen teori ved (a) direkte TNF virkning på tumorcellene, (b) en økning i cytolytisk celle IL-2 reseptoreksprimerlng, kanskje som et indirekte resultat av TNF virkning på heterogene cellepopula-sjoner, f. eks. makrofager, som forårsaket frigivning av andre lymfokiner, f. eks. IL-2 som så påvirker IL-2 respetor-eksprimeringen, eller (c) ved direkte aktivering av cytolyt-iske celler både ved IL-2 og TNF. Det er således mulig at kombinasjonen hyperaktiverer T-celler eller Initierer LAK-lignende aktiviteter. Virkningene som angis her skyldes mest sannsynlig slike effektor cellefenomener, noe som bekreftes av det faktum at en identisk kombinasjon av TNF og IL-2 ikke blokkerer tumorfjerning for de samme tumorer når de dyrkes i nakne NIH-3 (beige-nakne-XID) mus som er CFTL henholdsvis LAK og CTL deficiente.

EKSEMPEL 4

I dette eksempel ble sekvensen av administrering av IL-2 og TNF bedømt for å bedømme optimalprotokoll. De følgende forsøk ble gjennomført.

A. Meth- A tumorer

1. TNF fulgt av IL-2

Ved bruk av Meth-A tumormodellen der tumoren var subcutan ble grupper på 5 Balv/c mus med tumoren i syv dager (eller 11 dager i et tilfelle av PBS + IL-2) tilfeldig utvalgt, øremerket og så behandlet på dag 0 med TNF, IL-2, TNF fulgt av IL-2, PBS eller PBS fulgt av IL-2. Den vanlige bestem-melse av tumorvolum, av kroppsvekt og tumorvekt var dag 14. Som angitt ble visse grupper i disse forsøk holdt i 43 dager for å sikre frekvensen av langtidshelbredelse (dvs. der tumorene fullstendig ble utslettet). Protokollen for forsøkene er gitt nedenfor idet alle midler ble administrert intravenøst i 0,2 ml volumer og der betegnelse ku betyr kiloenheter.

Resultatene er vist i Tabell X derABW er forholdet mellom midlere kroppsvekt på dag 14 og den midlere kroppsvekt på dag 0 innen en enkelt gruppe mus, og der ATV er forholdet midlere tumorvolum på dag 14 og midlere tumorvolum på dag 0 i en enkelt gruppe mus.

Som en konklusjon forbedrer administrering av TNF fulgt av IL-2 ganske signifikant antitumoreffektiviteten sammelignet med hvert middel alene, noe som resulterer i langtidshelbredelse i gruppen behandlet med 20 ku/dose IL-2. Ved dosene 5 og 20 ku/dose IL-2 med enten en 7-dagers eller 11-dagers tumor hadde IL-2 eller TNF alene liten eller Ingen virkning.

2. IL-2 fulgt av TNF.

Ved bruk av Meth-A tumor modellen der tumoren var subcutan ble grupper på 5 Balb/c mus med tumoren båret i 7 dager (eller 11 dager når det gjelder PBS + IL-2) vilkårlig utvalgt, øremerket og deretter behandlet på dag 0 med TNF, IL-2 fulgt av PBS, PBS fulgt av TNS, PBS/SDS, eller IL-2 fulgt av TNF. Bestemmelsen av tumorvolumet, -vekten og kroppsvekten var på dag 14. Protokollen for disse forsøk er gitt nedenfor idet alle midler ble inngitt intravenøst i 0,2 ml volumer idet ku er kiloenheter.

Resultatene er vist i Tabell XI derABQ ogATW er som angitt i Tabell X ovenfor.

Resultatene antyder at ingen forbedring i effektiviteten ble observert når IL-2 ble administrert før TNF. Utenbegrensning til noen spesiell teori var det en antydning av en reduksjon av TNF avlivningen når IL-2 ble administrert først, det var som om IL-2 modulerte sensitiviteten i tumoren, eller 1 verten, til TNF og således gjorde denne tumor mere resistent overfor TNF avlivning.

B. L1210 Modell

1. TNF fulgt av IL-2

Ved å benytte L1210 tumormodellen som beskrevet 1 Eksempel 1 ble grupper på fem BD2F1 mus Implantert subcutant med 3 x IO<6>L1210 celler på dag 0 og behandlet Intraperitonealt på dag 3 med TNF og IL-2 sammen, TNF fulgt av IL-2, PBS eller IL-2 fulgt av TNF. Resultatene er vist i Tabell XII. På dag 27 og etter 60 dager hadde gruppe 2 fremdeles Ingen tegn på tumordannelse 1 denne rigorøse tumormodell. Forskje-llen 1 resultater mellom gruppe 1, gruppe 2, gruppe 4 og 5 Indikerer at planen og doseringen såvel som sekvensen i administreringen er viktig for å oppnå god respons i L1210 modellen.

EKSEMPEL 5

I dette eksempel ble Meth-A tumormodellen som beskrevet ovenfor benyttet for å prøve kombinasjonen av Poly I/C, en kommersielt tilgjengelig indusør av Klasse I interferoner, med det TNF mutein som er beskrevet ovenfor.

Når kombinasjonen ble administrert samtidig ble det observert en synergistisk antitumoreffektivitet og i enkelte tilfeller helbredelse, sammenlignet med hvert middel alene. I forsøk på å bestemme virkningene av administreringssekvensen var det ingen indikasjon om at sekvensen av Poly I/C og TNF påvirket den obseverte synergisme. Begge sekvenser virket like bra. Dette forsøk antyder at synergisme skulle kunne forventes ved bruk av klonet muse IFN-p og TNF sammen.

EKSEMPEL 6

Kombinasjonen av TNF og IL-2 administerer ip daglig 1 14 dager og i forskjellige 14 dagers sekvenser har vist effektivitet mot B16 subcutan tumor. Dette forsøk ble konstruert for å prøve hvorvidt administreringen av TNF og IL-2 i en "klinisk" plan (dvs. week-ender fri) viste en ekvivalent virkning. I tillegg ble kombinasjonen av IL-2 gitt intramus-kulært og TNF gitt intraperitonealt daglig i 14 dager prøvet på effektivitet.

I dette forsøk ble BDFI hunnmus, 5/gruppe, Injisert subcutant med 5 x IO<6>B15 celler/mus på dag 0. Behandlingen begynte på dag 1. Alle injeksjoner ble gitt intraperitonealt unntatt der det er angitt. Tumormållngene skjedde på dagene 10, 14, 21 , 28, 35 og 42.

Hver gruppe av mus ble behandlet 1 henhold til følgende oppsett med 25 mg/kg TNF og et mg/kg IL-2, administrert hver time der dette er angitt.

Sluttpunktet ble satt til når tumorvolumene var større enn 2.000 mm<3>eller der det ikke var tumorer etter mer enn 16 dager. Resultatene er vist i Tabell XIII.

Resultatene viste at ingen av TNF/IL-2 doserlngsoppsettene med en week-end "fri" som benyttet her viste noen effektivitet. Det synes som om, i denne B16 subcutane tumormodell, administreringen av både TNF, IL-2 eller kombinasjonen, må skje i løpet av en 24 timers periode og med en varighet av

med enn 7 dager for at den skal være effektiv.

Alle de mus som fikk TNF intraperitonealt og IL-2 intramusku-lært døde ved den 8 dose. I tillegg døde kontrolldyr som var gitt et tilsvarende volum saltoppløsning lntramuskulært, etter 9 injeksjoner. Det synes så at prøvegruppen ikke kunne tolerere den virkelige injeksjon og at døden ikke var relatert til prøvematerialet.

EKSEMPEL 7

Dette forsøk prøvet tidligere effektive kombinasjoner mot 10 dager tumorbelastning for å bestemme effektiviteten i en mere rigorøs modell.

I dette eksempel ble BDFI hunnmus i et antall av 5/gruppe injiset subcutant med 5 x IO<6>B16 celler/mus på dag 0. Behandlingen begynte på dag 11. Alle injeksjoner ble gitt intraperitonealt og tumormålingene ble gjennomført på dag 10, 14, 21 og 28. Hver gruppe mus ble behandlet i henhold til følgende dosering og plan.

Sluttpunktet ble fastsatt til det tidspunkt når tumorvolumene var over 2.000 mm<3>eller der det ikke var tumorer tilstede etter mer enn 42 dager. Resultatene er vist i Tabell XIV. Resultatene viser at den samme dose og sekvensplan for TNF (0,25 kg/dag 1-3) og IL-2 (1 mg/kg dag 4-14) som var effektiv mot en 1-dag tumor også var effektiv i den mere rigorøse 10 dagers B16 subcutane modell (Gruppe 2). Den alternerende TNF- og IL-2 utførelse, gruppe 3, var ikke effektiv.

Den samme mengde IL-2 og TNF gitt intrapeitonealt samtidig daglig i de første 3 dager og fortsatt de neste 11 dager virket kun i mus som hadde tumorer som var 1 eller 3 dager gamle, ikke i mus med tumorer som var 10 dager gamle (blandingen av IL-2 og TNF etter 3 dager var ikke så god som sekvensiell administrering). Dette antyder at sekvensen kan være bedre enn en blanding.

EKSEMPEL 8

A. Eksprimentelt oppsett:

1. Art: Rotte, CD stammen

2. Behandlingsvarighet: daglig i 14 dager

3. Administreringsvei: intravenøst

4. Dosenivå excipient kontroll, TNF alene ved 50 pg/kg IL-2 alene ved 0,5 eller 1,0 mg/kg, TNF/IL-2 kombinert med 50 pg/kg TNF/0,5 mg/kg IL-2 eller 50 >jg/kg TNF/ 1,0 mg/kg IL-2.

5. Antall dyr/dosenivå: 5 hanndyr og 5 hunndyr

6. Bedømte parametre:

Dødelighet

Kroppsvekter og -vektendringer

Observasjoner på kliniske tegn

Generelle ncropsyfunn

Hematologi

Eventuelle histopatologiske bedømmelser.

B. Resultater:

Kroppsvektøkningen ble redusert ved begge TNF/IL-2 kombinerte grupper sammenlignet med TNF- eller IL-2 alene gruppen. Bortsett fra for 3 hunnrotter som døde etter en Injeksjon av en TNF/IL-2 kombinert dose i et nivå av 50 pg/kg TNF/1,0 mg/kg IL-2, overlevet alle andre studerte dyr de 14 daglige infeksjoner. "Blodig avføring/diare" ble funnet for to av de tre dyr før de ble funnet døde og alle dyrene hadde "fluidfylt G.I. kanal" ved necropsy. Alle tre dyr døde av tilsyne-latende TNF toksisitet fordi "blodig avføring/diare" eller "fluidfylt G.I. kanal" er de typiske funn ved TNF toksisitet hos rotter. Alle dyr som overlevet inntil 14 dager i forsøket hadde isolerte episoder av "blodig avføring/diare" kun på dag 1 og 2 i forsøket og de hadde ingen tegn hverken på IL-2- eller TNF-tokslsitet ved necropsy. Forhøyede leukocyt- neutrofil-, lymfocyt- og eoslnofUtellinger ble bemerket hos både hann- og hunnrotter ved TNF-IL-2 kombinerte dosenivåer på 50 jjg/kg TNF/0,5 mg/kg IL-2 eller 50 pg/kg TNF/1,0 mg/kg IL-2. Signifikant reduserte erythrocyt telling, hemoglobinkonsentrasjon og prosentoal hematocrit ble også bemerket hos både hann- og hunnrotter i en doserelatert måte for begge TNF/IL-2 kombinerte dosenivåer.

C. Konklusjon:

Basert på resultatene av dette studium ble den maksimale tolererbare dose, MTD, fastsatt til 50 pg/kg TNF/0,5 mg/kg IL-2 når TNF og IL-2 administreres kombinert intravenøst til rotten i 14 på hverandre følgende dager. Denne MTD er sammenlignbar med MTD verdiene når TNF ble behandlet alene og noe lavere enn når IL-2 ble behandlet alene (MTD verdien for IL-2 alene var ved 1,0 mg/kg).

Ingen forskjellige toksisitetsresultater ble observert når kombinert TNF og IL-2 ble administrert under denne prøvebe-tlngelse sammenlignet med når TNF eller IL-2 ble gitt alene. Det riktige "no observable effect level", NOEL, ble ikke fastslått ut fra resultatene 1 dette studium på grunn av den reduserte kroppsvektsøkning, forhøyde leukocyt og differen-sielle leukocyttellinger og reduksjonen 1 leukosyttellinger og relaterte parametre.

Som en konklusjon ser man at foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en kombinasjon av TNF og IL-2 og/eller IFN-p med en antitumoraktivitet, og som i tillegg Ikke forårsaker signifikante øket toksisitet hos pattedyrverter. Det er uventet at TNF som dreper noen celler 1 humantumormodeller in vitro men ikke i naken mus xenograftmodeller av disse celler prøvet inntil i dag in vivo, eller 1 de klassiske murintumor-modeller in vivo, skulle være et effektivt anti-cancermiddel kombinert med små mengder IL-2 og/eller IFN-p. Det var heller ikke å vente at TNF- og IL-2 cytokinblandingen Ikke skulle forårsake signifikant økning av toksisiteten (fordi det er kjent at kombinasjonen av IL-2 og IFN--y er signifikant mere toksisk enn forbindelsene sett alene).

Claims (10)

1. Preparat egnet for parenteral eller subcutan administrering til pattedyrverter for terapeutisk behandling av cancer, karakterisert ved at den omfatter en blanding av TNF og IL-2 eller TNF og IFN-p, eller TNF, IL-2 og IFN-p, i synergistisk effektive mengder, hvori TNF, IL-2 og IFN-p stammer fra en pattedyrart.

2. Preparat ifølge krav 1, karakterisert ved at det videre omfatter et farmasøytisk aksepterbart bærermedium for TNF og IL-2 og/eller IFN-p.

3. Preparat ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at TNF og IL-2 er benyttet og at TNF er human- eller kanin TNF og at IL-2 er human IL-2.

4 . Preparat ifølge krav 3, karakterisert ved at TNF er et mutein med de første åtte aminosyrer utelatt og IL-2 er des-ala^ -IL-ser^25 •

5 . Preparat ifølge krav 4, karakterisert ved at mengden TNF er ca. 230 til 260 jjg til TNF/kg vertsvekt og mengden IL-2 er ca. 15.000 til 800.000 enheter IL-2/kg vertsvekt.

6. Preparat ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det benyttes TNF og IFN-P og at IFN-P er muse IFN-P og TNF er human TNF.

7. Preparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, karakterisert ved at canceren er leukemi, melanom, mastocytom eller lymfom.

8. Fremgangsmåte for terapeutisk behandling av cancer i pattedyrverter . karakterisert ved at den omfatter administrering av en synergistisk effektiv mengde av TNF og IL-2 eller TNF og IFN-P, eller TNF, IL-2 og IFN-P til verten, idet TNF, IL-2 og IFN-p stammer fra en pattedyrart, og, hvis TNF og IL-2 administreres sekvensielt, administreringen av TNF skje før administreringen av IL-2.

9. Fremgangsmåte Ifølge krav 8 der TNF og IL-2 benyttes og administreres separat til verten.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 8 eller 9, karakterisert ved ved at det benyttes TNF og IL-2 og at disse blandes ln vitro før administrering til verten.