NO882791L - Fremgangsmaate for fremstilling av enkeltkjede urokinase. - Google Patents

Abstract

Foreliggende oppfinnelse vedrører en freagangate for frematllllng av enkelt-kjede pro-oroklnase (nedenfor også referert til son pro-oPA eller scu-PA). Pen vedrører epeelelt en freagangsnate for freastllllng av pro-uPA soa Innbefatter ntrlnnlng ev uPA-genet fra et traaant genomlak bibliotek. Innsetting ar nPA-genet 1 en ekspresjonsvektor. Introduser Ing st det tllelebragte plasaldvektor IfflAet Inn 1 en dyrecelle for & tilveiebringe en transfomant morn nar evnen til & produsere det kodete proteinet og utvinning av glykosylert pro-uPA fra dyrecellen.

Description

Denne oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av enkeltkjede pro-urokinase (nedenfor også referert til som pro-uPA eller scu-PA). Den vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av pro-uPA som innbefatter utvinning av uPA-genet fra et humant genomisk bibliotek, innsetting av genet i en ekspresjonsvektor, introdusering av det tilveiebragte plasmidvektor-DNA inn i en dyrecelle for å tilveiebringe en transformant som har evnen til å produsere det kodete protein og utvinning av det glykosylerte pro-uPA fra nevnte dyrecelle .

En annen hensikt med foreliggende oppfinnelse er representert ved et humant uPA-promoterderivat som kan kontrollere transkripsjonen av et gen, som urokinasegenet, med høy effektivitet. Også innbefattet i foreliggende oppfinnelse er de nye eukaryote ekspresjonsvektorer hvori et cDNA eller et gen blir plassert under transkripsjonen kontroll av den humane uPA-promoter eller et derivat derav og uttrykkings-cellene som er transformert dermed.

En annen foretrukket fremstilling av denne oppfinnelsen er representert ved en "ekspresjonskassett" som inneholder den humane uPA-promoter eller et derivat derav, humane uPA-transkripsjonsinitiator (dvs. den såkalte TATA-boks), og, hensiktsmessig, en polylinker.

Urokinase (uPA) er en plasminogenaktivator, som kan tilveiebringes fra menneskeurin, som blir anvendt i behandling av forskjellige former av trombose eller blodproppsykdommer.

TJrokinaseproduksJ on har vært basert på rensing av enzymet hovedsakelig fra menneskeurin. Med utvikling av cellekultur-teknologi og tilgjengelighet av spesifikke anti-urokinase-antistoffer (monoklonale og polyklonale antistoffer), er det blitt vist at uPA er et aktiveringsprodukt av celle-produsert pro-uPA (Wun et al, 1982, J. Biol. Chem. 257,7262-7268; Nielsen et al., 1982, Biochemistry 21, 6410-6415). Pro-uPA er et enkelt-kjede protein (sc-uPA), mens uPA er et to-kjede protein (tc-uPA). Omdanning av scu-PA til tcu-PA avhenger av spalting av en enkelt peptidbinding i scu-uPA (Verde et al, 1984; Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81; 4727-4731; (1984); Gtlnzler et al, Hoppe S. Zschrf. Physiol. Chem. 363, 1155-1165, 1982).

Denne spesifikke spalting av enkelt-kjede pro-uPA resulterer i en økning på over 50 ganger i spesifikk aktivitet og blir tilveiebragt med proteolytiske enzymer såsom trypsin eller plasmin. Spesielt plasmin ser ut til å være ansvarlig for denne transformasjonen også in vivo.

En ikke-aktiv form av plasminogenaktivator ble identifisert i humane embryoniske nyrecellekulturer av C. Nolan allerede i 1977 et al., (Biochim Biophys Acta 1977; 496,384-400). Dette stoffet, som forfatterene anså å være en pro-aktivator form av urokinase, ble aktivert av trypsin uten forandring i molekylvekt og, når den først var aktivert, ble inhibert av kanin-antistoff til human urokinase. Den ikke-aktive "pro-aktivator" ble separert fra den aktive formen ved anvendelse av affinitetskromatografi på benzamidin-Sepharose.

En enkelt-kjede plasminogenaktivator med molekylvekt på omtrent 56.000, en spesifikk aktivitet på 40.000-50.000 CTA enheter/mg på en fibrinplate og med en høy affinitet for fibrin er beskrevet i Europa patent 40238.

Europa patentsøknad publ. nr. 92182 vedrører fremstilling av urokinasederivater via rekombinant DNA-teknologi. Den beskriver spesielt rensing og karakterisering av urokinase med lav molekylvekt (omtrent 30.000 dalton) tilveiebragt ved rekombinante DNA-teknikker i en prokariot vert (E. Coll).

En annen Europa patentsøknad, EP-A-37687, beskriver et deoksyribonukleinsyresegment som koder for en plasminogenaktivator som har egenskapene til human urokinase og en metode for uttrykking av denne DNA-sekvensen i visse bakterier. En metode for produsering av glykosylerte enkelt-kjede urokinase i dyreceller ved rekombinant cDNA-teknologi ved anvendelse av et cDNA tilveiebragt fra mRNA til en etablert human nyre-avledet cellelinje er beskrevet i Europa patent-søknad publ. nr. 154272. Riccio et al, i Nucleic Acid Research, 13, 2759 (1985) beskriver sekvensen til et fragment fra den humane uPA "promoter"-regionen på omtrent 800 bp inneholdende den 5'-flankerende regionen.

Som betraktet ovenfor, innbefatter foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av pro-uPA ved rekombinant DNA-teknologi i dyreceller, som innbefatter insetting av en DNA-vektor som inneholder et DNA-fragment med human genomisk opprinnelse som har den kodende regionen, men ikke den regulatoriske regionen til det humane urokinasegenet inn i en egnet dyrecelle for å produsere, ved dyrking, en human-type pro-uPA med den samme aminosyresekvensen som naturlig forekommende pro-uPA.

DNA-fragmentet med human genomisk opprinnelse inneholdende den uPA-kodende regionen blir tilveiebragt ved et humant genomisk bibliotek i en egnet vert, såsom et bibliotek laget i bakteriofag lambda eller i kosmider i henhold til kjente teknikker, etter screening av biblioteket med riktig DNA-probe representert ved en del av selve genet eller et syntetisk DNA-fragment med en egnet lengde som er fremstilt på basis av den kjente kodende sekvensen eller en cDNA-avledet probe.

Dette uPA-kodende fragmentet er 7,3 kb fragmentet tilveiebragt ved Smal-spalting av klonet DNA.

Et DNA-segment som dette vil gi beskrivelsen og kravene blir referert til som "åpen leseramme" (ORF), og innbefatter en genomisk DNA-sekvens innbefattende transkripsjons-transla-sjonsenheten til uPA mRNA, eventuelt avbrutt av introns og innbefattende fortrinnsvis 5' og 3' utranslaterte regioner eller en del derav som medfører translasjonseffektivitet eller mnRNA-stabilitet. Et foretrukket eksempel på ORF er en sekvens definert som ovenfor og som er avbrutt av 10 introns.

Ekspresjonsvektorer som kan bli anvendt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen innbefatter en hvilken som helst kjent vektor som blir anvendt til å transfektere dyreceller og spesielt pattedyrceller. De innbefatter essensielt en sekvens som regulerer mRNA-translasjon, såsom en promoter, og et polyadenyleringssete. I noen tilfeller innbefatter de også et eukaryot replikasjonsorigo. Promoterregionen kan innbefatte en hvilken som helst av de kjente som kan bli anvendt i dyreceller. Heterologe promotere kan bli tilveiebragt fra pattedyrvirus såsom retroviruser (f.eks. RSV), SV 40 (tidlig eller sen) og adenovirus (tidlig eller sen). Alternativt kan regulerbare promotere med dyre- eller human opprinnelse bli anvendt. Eksempler på disse regulerbare promotere er de fra muse- eller humane-metallotioneiner I og II, varmesjokk-proteiner, osv. som finnes i referansepublikasjonene såsom Hamer et al, Eykaryotic Viral Vectors, Y. Gluzman ed, 1983, 7-12, Mayo et al, Cell, 29, 99-108 (1982) og Korin et al, Nature, 308, 513-519 (1984).

I tillegg til de regulerbare promoterene, er det også blitt oppdaget at den humane uPA-promoterregionen eller et derivat derav kan bli anvendt som en effektiv promoter for uttrykking av et gen satt under dets kontroll i pattedyrceller. Den humane uPA-promoterregionen blir tilveiebragt fra et humant genomisk bibliotek (se ovenfor) ved Smal-spalting og inneholder omtrent 2,38 kb, fra omtrent -2353 bp til omtrent + 29 bp på det humane uPA-genet.

Denne promoteren og dets derivater kan bli indusert av forskjellige midler såsom forbolestere for å uttrykke høye nivåer av uPA-genet.

Det er ikke bare denne "native" humane uPA-promoter som kan bli anvendt for å uttrykke et gen i et egnet pattedyrcelle-system, men en hvilken som helst av dets derivater tilveiebragt ved delesjon, innsetting eller mutasjon som opprettholder den opprinnelige regulatoriske evnen eller som til og med innehar en forbedret regulatorisk evne, kan bli anvendt i fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse. Spesielt delesjonsderivater av uPA-promoterregionen er foretrukket. Representative eksempler på delesjonsderivater er de som blir tilveiebragt ved behandling av uPA-promoter med OxaNI eller EcoRV og påfølgende ligering av de tilveiebragte fragmentene. Ved spalting med OxaNI blir et delesjonsderivat tilveiebragt som mangler et 0,6 kb fragment mellom omtrent —1827 bp og -1202 bp, mens ved spalting med OxaNI og EcoRV blir et delesjonsderivat tilveiebragt som mangler et 1,29 kb fragment mellom omtrent —1827 bp og —537 bp.

Det er også blitt oppdaget at disse delesjonsderivater kan drive ekspresjonen av det regulerte genet med sammenlignbare og til og med høyere utbytte enn vanlige virale promotere, slik som RSV, som vanligvis blir ansett å være et veldig effektivt promotersystem. Selv om det foretrukne genet som skal bli uttrykt under uPA-promoteren eller et derivat derav er uPA-genet, kan denne promoteren bli anvendt for å uttrykke et hvilket som helst kjent gen eller kodende sekvens i pattedyrceller.

Når det gjelder polyadenyleringssetet, kan det innbefatte et hvilket som helst av de kjente, såsom et som er assosiert med promoterregionen, nativt for uPA-genet eller fra et annet pattedyrgen. Når først en ekspresjonskassett er blitt fremstilt inneholdende en promoterregion, en transkripsjons-initiator, og av hensiktsmessige grunner, en polylinker, kan den bli festet til det valgte genet for transformasjon inn i en dyrecelle. Generelt er den spesifikke rekkefølgen hvori delene blir festet sammen ikke kritisk, slik at de flankerende regionene kan først bli bundet til et replikasjonssystem innbefattende en markør eller andre regioner, såsom forster-kere (enhancers), transkripsjonene regulatoriske regioner, eller lignende, før innsetting av genet.

Måten hvorpå de forskjellige fragmentene blir festet sammen avhenger av et antall faktorer vedrørende konstruksjonslett-het, valg av restriksjonsseter, tilgjengeligheten av spesielle fragmenter, og lignende, som fagmannen lett kan bestemme .

Valg av replikasjonssystem avhenger, i en viss grad, av om det er ønskelig med en kortvarig eller stabil ekspresjon. Når det gjelder kortvarig ekspresjon, blir episomale elementer basert på viral sekvens, (såsom SV40) inneholdende et replikasjonsorigo anvendt. Stabil ekspresjon kan bli oppnådd ved anvendelse av andre episomale elementer (f.eks. bovin papilloma-virusbaserte vektorer) eller sekvenser integrert inn i genomet. En antall av disse virale sekvenser er blitt bundet til markører, såsom genene gpt. neo og dhfr. Disse markørene tillater seleksjon av celler Inneholdende vektoren og amplifikasjon av de integrerte fremmede sekvensene. For å til slutt forsterke produksjon av det ønskede stoffet, dvs. humant pro-uPA, kan det være hensiktsmessig å ko-transformere cellene med en første konstruksjon inneholdende uPA-ekspre-sjonskassetten og en annen uavhengig konstruksjon inneholdende den selekterbare markøren.

Alternativt, kan genet bli amplifisert ved preparering av tandemkonstruksjon, hvor uPA-kassetten er i tandem med en ekspresjonskassett til et gen såsom dhfr.

Vertscellene kan være en hvilken som helst dyrecelle, fortrinnsvis en pattedyr eller hulecelle, som kan produsere pro-uPA i en utvinnbar mengde ved transformering med en uPA-ekspresjonsvektor. Eksempler på disse cellene, som uttrykke-lig innbefatter celler med human opprinnelse, innbefatter de kjente og etablerte cellelinjene som enten kan eller som ikke kan produsere pro-uPA i utvinnbare mengder før tranformering, såsom LB6, en muse-fibroblastoidcellelinje avledet fra parentale L-celler (Corsaro CM. og Pearson L.M. Enhancing the efficiency of DNA-mediated gene transfer in mammalian cells, Somatic cell genetics 7, 603-616, 1981); CHO, kinesisk hamster-ovarie (Kao F.T., Puck F., Proe. Nati. Acad. Sei., 60, 1275-1281, 1968) og A 431 human epidermoid svulstcelle-linje (Fabricant R.N., De Larco J.E., og Todaro G.F., Nerve growth factor receptors on human melanoma cells in culture, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74, 565-569, 1977). De to første cellelinjer nevnt ovenfor (LB6 og CHO) produserer ikke pro-uPA mens den siste (A 431) produserer pro-uPA. Generelt kan etablerte cellelinjer såsom CHO, COS, LTK, Hela og CN-1 bli anvendt i fremgangsmåtene I oppfinnelsen.

Ved gjentatt omkloning av en uPA-produserende mono-lag CH0-cellelinje, kan oppnådde cellelinjer som opprettholder uPA-produksjonsevnen bli tilveiebragt som også har evnen til selv-replikasjon i suspensjon. Fordelen med slike cellelinjer når det gjelder letthet ved dyrking og høyere produksjonsut-bytte pr. fermentasjonsmasseenhet er innlysende for fagmannen. Disse genomiske uPA DNA-transformerte, CHO-cellelinjene som har evnen til å vokse i suspensjon i et dyrk-ningsmedium representerer en foretrukket fremstilling av foreliggende oppfinnelse.

Ekspresjonsvektoren kan bli ført inn i verten på en hvilken som helst hensiktsmessig måte såsom mikroinjeksjon, DEAE-dekstran mediert transfeksjon, kalsiumfosfatpresipitert DNA-transfeksjon og elektroporasjon (se Banerji, J. et al., Cell 33, 729-740 (1983); Graham F.L. og Van der Eb A.J., Virology, 52, 456-467 (1983) og Potter H. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81, 7161-7165 (1984)).

Etter transfeksjon, lar man cellene vokse i et hensiktsmessig medium, såsom Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) inneholdende 10# til 20$ ikke-aktivert føtalt kalveserum, hvori disse cellene blir stabilt opprettholdt og deretter blir det hensiktsmessige seleksjonsmiddelet f.eks. et antibiotika, innført.

De selekterte cellene blir gjentatte ganger klonet og produksjonen av pro-uPA/uPÅ blir beregnet ved de vanlige analysene, såsom fibrinolytisk analyse eller immunoamidolytisk analyse (IAA). De produserende klonene blir deretter masse-dyrket for å produsere vesentlige mengder av pro-uPA.

I massedyrking er en foretrukket fremstilling representert ved tilsetting av aprotinin. Resultatet av tilsetting av dette stoffet i det opprinnelige mediumet eller i løpet av dyrkingen, er at pro-uPA blir utvunnet i større mengder. Vanligvis blir aprotinin tilsatt i en konsentrasjon på 10-50 IU/ml og mest foretrukket er 20-26 IU/ml.

Avhengig av om ledersekvensen er blitt opprettholdt og produktet har evnen til å bli utskilt, kan mediumet bli kontinuerlig eller gjentatte ganger bli byttet ut og pro-uPA isolert fra mediumet. I de tilfeller hvor lederen ikke blir opprettholdt og produktet blir opprettholdt Intracellulært, kan cellene bli høstet, drept og lysert, og produktet dermed bli isolert. For isolasjon og rensing, kan vanlige teknikker såsom affinitetskromatografi, HPLC, revers-fase HPLC, FPLC, elektroforese, ekstraksjon, utfelling osv. bli anvendt.

Det er overraskende blitt oppdaget at scu-PA-stoffene i oppfinnelsen har en annen glykosylering på B-kjeden, mens den samme proteinstrukturen og komposisjon av scu-PA fra menneskeurin og likeledes den samme type biologiske aktivitet blir opprettholdt. Mens A-kjeden i disse stoffene utviser den samme elektroforetiske mobiliteten til urintilveiebragt scu-PA, viser deres B-kjeder en hensiktsmessig forskjell i elektroforetisk mobilitet korresponderende omtrent til en øket tilsynelatende molekylvekt på 1000-2000. Disse forskjellene kan bli beregnet ved analysering med spesifikke glyko- sidaser såsom glykopeptidase F som fjerner alle N-bundne sukker fra et glykoproteln eller neurominidase som fjerner det terminale sialinsyreresidiet fra glykoproteinene.

Det er merkbart at scu-PA eller tcu-PA-proteinet tilveiebragt fra scuPA/tcu-PA'er i oppfinnelsen ved fjerning av alle N-terminale sukkere med glykopeptidase F, har den samme elektroforetiske mobiliteten som scu-PA eller tcu-PA tilveiebragt fra menneskeurin, behandlet på samme måte, mens ved fjerning av de terminale sialinsyreresidiene fra scu-PA/tcu-PA'er i oppfinnelsen tilveiebringes et glykoproteln som enda har en annen elektroforetisk mobilitet (dvs. en redusert mobilitet) når man sammenligner, side-ved-side, med scu-PA/ tcu-PA avledet fra menneskeurin behandlet på samme måte.

Den biologiske aktiviteten til scu-PA'er tilveiebragt i henhold til foreliggende oppfinnelse kan bli beregnet ved de konvensjonelle in vitro eller in vivo analysene. Et eksempel på in vitro tester er representert ved den såkalte fibrinplatemetoden, hvori den fibrinolytiske aktiviteten til scu-PA tilveiebragt i henhold til foreliggende oppfinnelse blir beregnet på en fibringel tilveiebragt ved polymerisasjon av fibrinogen med trombin.

En in vitro test som kan bli anvendt for å korrelere in vitro-trekkene ved scu-PA'er i oppfinnelsen med urin-tilveiebragt eller celle-tilveiebragt scu-PA'er er en kinetisk analyse på aktivering av scu-PA'er til tcu-PA'er ved plasmin.

Et annet eksempel på en in vitro-test er representert ved en kinetisk analyse på hydrolyse av et syntetisk substrat eller av aktivering av humant plasminogen ved plasmin-aktivert scu-PA.

Et annet in vitro-eksperiment er representert ved et studie på inhibering av den f ibrinolytiske aktiviteten ved plasmin-aktivert scu-PA (dvs. en tcu-PA forbindelse ifølge oppfinnel sen) på et spesifikt syntetisk substrat ved hjelp av en kjent human plasminogenaktivator-inhibitor såsom den endotele (PAI-1).

Alle disse eksperimentene er veldig betydelige for å vise den trombolytiske aktiviteten til de testede substansene og forutser den terapeutiske anvendbarheten.

Scu-PA/tcu-PA-forbindelsene i opppfinnelsen viser den samme type amidolytisk og fibrinolytisk aktivitet som scu-PA/tcu-PA med opprinnelse fra menneskeurin i disse analysene.

En in vivo modell på eksperimentell trombe i kanin som blir anvendt for å beregne den trombolytiske aktiviteten til forbindelsene i oppfinnelsen er beskrevet ved D. Coilen et al, i J. Clin. Inv. 1983, 73, 368-376.

Kort forklart blir et segment av den indre jugularvenen til anestesibehandlede kaniner isolert med vaskulære klemmer og dets volum blir målt. En trombinoppløsning etterfulgt av friskt blod inneholdende merket humant fibrinogen blir deretter ført inn i dette tømte venesegmentet. Blodproppen som dannes blir latt stå i en forutbestemt tidsperiode (hensiktsmessig 30 min) før klemmene blir fjernet og mengden av merket stoff blir bestemt. Via en marginal ørevene, blir plasminogenaktivatoren som skal bli testet ført inn ved infusjon. Etter en gitt tidsperiode blir karsegmentet som inneholder tromben sydd sammen ved dets ende og innholdet av merket stoff blir bestemt. Grad av trombolyse blir beregnet som prosentforholdet mellom mengdene av gjenværende og opprinnelig merket stoff.

Scu-PA-forbindelsene tilveiebragt i henhold til fremgangsmåten i oppfinnelsen har de samme biologiske egenskapene som urinisolert scu-PA og kan derfor bli anvendt ved de samme terapeutiske Indikasjonene, dvs. hovedsakelig som trombolytiske medikamenter eller ved behandling av blodproppsykdom mer. De kan bli anvendt som de er eller fortrinnsvis formulert i henhold til kjente teknikker som er beskrevet i referansebøkene som Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, 1985, Mack Publishing Co. De kan spesielt bli formulert analogt med nåværende formulering av uPA eller scu-PA.

En foretrukket terapeutisk indikasjon er derfor trombolyser (thrombolytics), muligens i de tidlige fasene ved infarkt eller blodpropp, såsom hjerteinfarkt, lungeblodpropp eller perifere arterieblodpropper. Administrasjonsveien er fortrinnsvis e.v., og administrasjonsmåten kan være i pille eller ved perfusjon. En e.v. pille-administrasj on av en trombolytisk effektiv mengde av en forbindelse I oppfinnelsen blir fortrinnsvis etterfulgt, hvis nødvendig, med e.v. perfusjon i en lavere dosering I en relativt kort tidsperiode. Den daglige doseringen varierer mye med pasientens alder, størrelse, tilstand og når det gjelder infarkt og relatert terapi kan den være i området på 10-40 mg/die, fortrinnsvis 15-30 mg/die og mest foretrukket er 20 mg/die for en normal (70 kg) human pasient. Som kjent for fagmannen, blir det i dette spesielle terapeutiske området som oftest legen som bestemmer den hensiktsmessige dosering og admini-strasjonsskjema fra tilfelle til tilfelle. Pasienter, i henhold til foreliggende oppfinnelse, er varmblodige dyr, fortrinnsvis pattedyr og mest foretrukket er mennesket. Doseringsenheten, som inneholder de vanlige stabiliserings-midlene er beskrevet for kommersielt tilgjengelig urokinase, kan inneholde omtrent 50.000-200.000 IU uPA per enhet.

Et eksempel på en frysetørret farmasøytisk formulering for rekonstitusjon i 2 ml sterilt saltvann for e.v. injeksjon er følgende:

3F11 scu-PA 5 mg

mannitol 20 mg

natriumedetat 2 mg

fosfatbuffer q.s.

En mere detaljert forklaring av en fremstilling av foreliggende oppfinnelse vedrørende fremstilling av transfeksjons-vektorer og måter er gitt i de følgende paragrafene (fra A.l til A.7).

A. l - Kloning av det humane uPA- genet

En human genomisk DNA-bank blir tilveiebragt ved kloning av delvis spaltet lever-DNA i Charon 28 lambda-vektor. uPA-gen inneholdende fag blir reddet ved screening av den genome banken med en egnet probe, såsom en probe tilveiebragt fra et delvis uspleiset humant uPA cDNA. De positive fag-klonene blir isolert, analysert ved restriksjonsanalyser for å isolere de som inneholder uPA åpen leseramme (ORF) eller 5'-regionen som inneholder uPA-promoteren.

A. 2 - Fremstilling av uPA- kodende DNA

Nære ved 5'-enden til det humane uPA mRNA eksisterer fire Smal restriksjonsseter og den nærmeste til høyre ligger utenfor den kodende regionen, etter uPA-polyadenyleringssetet. 5'-setene henger sammen i et kort DNA-segment innenfor det første ekson og første intron i en region forutgående for det translasjonsbare initieringskodonet beliggende ved begynnelsen av det andre eksonet (fig. 1).

Restriksjonsanalyse av lambda-uPAl fag-klonen vist at, i hvertfall ved våre spaltingsbetingelser, at bare det første og femte Smal-setet vanligvis blir spaltet. Det er dermed mulig, ved Smal-spalting av lambda-uPAl og DNA-fragmentseparering på agarosegel, å kutte ut den uPA-kodende regionen og deretter sette det inn i en annen vektor. Ved å gjøre dette, blir et annet Smal-fragment også tilveiebragt, dvs. 2,38kb Smal-fragmentet som ligger 5' til uPA ORF og som inneholder uPA mRNA begynnelsessete, promoter og regioner som regulerer det gjennom trans-regulerende faktorer. Dette fragmentet kan regulere mRNA-transkripsjon av et 3<*->ved siden av liggende gen. ;A. 3 - Ekspresjon av uPA- genet i dyreceller;For å uttrykke det humane uPA-genet i pattedyrceller, må DNA-regionen som koder for uPA mRNA bli plassert under transkripsjonen kontroll av en eukaryot promoter. Et antall forskjellige signaler (f.eks. forsterker og polyadenyleringsseter) kan innvirke på hastigheten av mRNA-transkripsjon og mRNA-stabilitet (Y. Gluzman, Viral vectors, Cold Spring Harbor Press, New York). ;A. 4 - Konstruksjon av RSV- avledete vektorer;Et eksempel på en eukaryot promoter som kan bli anvendt i fremgangsmåten i foreliggende oppfinnelse, er den lange terminale gjentagelsessekvensen (the long terminal repeat) ;(LTR) til Rous Sarcoma Virus (RSV) (se D.E. Schwartz et al, Nucleotide sequence of Rous Sarcoma Virus, Cell 32, 853 ;(1983)). Et foretrukket RSV-avledet plasmid er "plasmid RSV-Neo" hvori genet for resistens for antibiotika neomycin, klonet fra det bakterielle transposon Tn5, blir satt inn i RSV LTR nedstrøms for RSV-forsterkeren og promoteren og 5' til SV 40 polyadenyleringssete. Siden den også inneholder pBR322-avledet ampicillinresistens og replikasjonsorigofunk-sjoner, kan RSV-Neo-plasmidet bli propagert i E. coli. Etter transfeksjon inn i pattedyrceller, påfører RSV-Neo resistans mot neomycin og dets analoger til disse cellene (se F. Colbere-Garapin et al., A new dominant selective marker for higher eukaryotic cells; J. Mol. Biol. 150, 1 (1981) og P.J. Southern og P. Berg, Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under the control of SV40 early region promoter; J. Molec. and Appl. Genetics, 1, 327 (1982)). En vektor for uttrykking av humant uPA kan bli tilveiebragt fra RSV-Neo ved erstatting av neomycinresis-tens-genet, som er mellom RSV-promoteren og SV40 polyadeny leringssetet, med den uPA-kodende regionen. Dermed, ved anvendelse av RSV-Neo som utgangsmateriale, blir det humane uPA-genet satt inn i RSV LTR i den samme transkripsjonsorien-teringen; plasmiden som blir tilveiebragt på denne måten blir kalt RSV-sc-uPA. Transformering av pattedyrceller med dette plasmidet gir dem evnen til å utskille uPA i kulturmediumet. ;I korte trekk kan en uPA-uttrykkende vektor (RSV-uPA) bli konstruert som følger: a) et 7,3 kb fragment inneholdende uPA-kodende regionen blir tilveiebragt fra innsetting av fag lambda-uPAl; b) et DNA-fragment inneholdende LTR fra RSV, SV 40 polyadenyleringssete og pBR322-avledet ampicillinresistens og prokaryot replikasjonsorigo bli tilveiebragt fra plasmid RSV-Neo ; c) den uPA-kodende regionen blir satt inn under kontroll av RSV-promoteren som dermed danner det bakterielle plasmid RSV-uPA; d) RSV-uPA blir ko-transfektert I pattedyrceller sammen med RSV-Neo og e) antibiotikaresistente, uPA-produserende kloner blir selektert og propagert videre. ;A. 4. 1 - Fremstilling av vektor DNA;RSV-Neo er et kjent og tilgjengelig plasmid som inneholder neomycinresistentgenet fra det bakterielle transposon Tn5 under transkripsjonen kontroll av RSV-promoteren. Når plasmidet blir transfektert i pattedyrcellene, gjør plasmidene dem resistente for neomycinanalogen G418. ;RSV-Neo blir spaltet med Hindlll, 5 *-overhengende endene blir fylt med Klenowfragment til DNA polymerasel, spaltet med Hpal og behandlet med kalvetarm-fosfatase (CIP). Disse behandling-ene danner to defosforylerte fragmenter med butte ender, hvor den minste inneholder replikasjonsorigo og ampicillinresistensgenet som kommer fra plasmid pBR322 og som har, ytterst, RSV-promoteren og SV 40 polyadenyleringssete (PAS). Etter separasjon på agarose, blir dette 3,5 Kb fragmentet renset og anvendt som en eukaryot ekspresjonsramme hvori uPA-genet kan bli satt inn.

A. 4. 2 - Kloning av uPA- genet under RSV- promoteren

Innskuddet og vektor-DNAene blir ligert sammen og anvendt for å transformere kompetente E. coli- celler. Blant ampicillin-resistente kolonier, blir RSV-uPA valgt og som har den humane uPA-kodende regionen satt inn i den hensiktsmessige orienteringen I RSV LTR.

A. 5 - Konstruksjon av BPV- avledet eplsomiske vektorer

En mulighet for å øke proteinproduksjonen i pattedyrceller transformert med fremmede gener, er å øke genkopi-antallet, f.eks. ved anvendelse av dehydrofolat reduktase (DHFR)-baserte vektorer eller Bovin papilloma virus (BPV)-avledete vektorer.

BVP er et 7945bp langt, dobbelttrådet, sirkulært DNA-virus som naturlig forekommer i kveg-papiHornas (se C.Y. Chen et al., The primary structure and the genetic organization of the Bovine Papilloma Virus type 1 genome, Nature 299, 529

(1982)). Infekterte celler opprettholder virus-DNAet ekstra-kromosomalt som en stabil episom med et høy kopiantall, (se M.F. Law et al, Mouse cells transformed by Bovine Papilloma Virus contains only extrachromosomal viral DNA sequences, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78, 2727 (1981), og W.D. Lan-caster, Apparent lack of integration of bovine papilloma virus DNA in virus-induced equine and bovine tumor cells and virus-transformed mouse cells, Virology 108, 251 (1981)). BPV-genomet kan i store trekk bli delt inn i tre funksjonelle regioner: en ikke-kodende, regulatorisk region omtrent lkb langt, mellom Hindlll og Epal-setene, en transformerende region som utgjør omtrent 60$ av genomet mellom Hpal og BamHI og en region som koder for de strukturelle virusproteinene fra BamHI til Hindlll (se M. Lusky og M. Botchan, Charateri-zation of the Bovine Papilloma Virus plasmid maintenance sequences, Cell 36, 391 (1984), og B.A. Spalholz et al, Transactivation of a Bovine Pailloma Virus transerIptional regulatory element by the E2 gene product, Cell 42, 183

(1985)). BPV DNA kan bli anvendt til å transformere gnagerceller, men BPV-partiklene blir ikke produsert i in vitro transformerte celler på grunn av at disse ikke tillater ekspresjon av BamHI-Hindlll-regionen (E. Antmann, BPV transcription, polyadenilated RNA species and assesment of the direction of trascription, J. Virol. 43, 59 (1982), og L.W. Engel, Trascription organization of the BVP type, J. Virol. 47, 516 (1983)). Denne regionen ser derimot ikke ut til å være nødvendig for celletransformering. Hybride plasmider er blitt konstruert ved anvendelse av BPV og pMLd, som er et pBR322-avledet plasmid, hvori noen "gift"-sekvenser som inhiberer virusreplikasjon i pattedyrceller er blitt deletert (M. Lusky og M. Botchan, Characterization of the Bovine Papilloma Virus plasmid maintenance sequences, Cell 36, 391 (1984 ); B.A. Spalholz et al, Transactivation of a Bovine Papilloma Virus transcriptional regulatory element by the E2 gene product, Cell 42, 183 (1985)). Disse rekombinante virusene kan bli propagert i E. Coli og likeledes i dyreceller og kan bli lett anvendt i rekombinante DNA-prosedyrer (D. DiMaio et al., BPV vector that propagates as a plasmid in both mouse and bacterial cells, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79, 4030 (1982); P.J. Kushner et al, A plasmid that repli-cates in both mouse cells and E. coli, J. Mol. Appl. Gen. 1, 527 (1982), N. Sarver et al, BPV deoxyribonucleic acid: a novel eukaryotic cloning vector, Molec. and Cell. Biol. 1, 486 (1981)). Evnen som BPV-genomet har til å transformere in vitro gnagerceller, blir opprettholdt i de hybride plasmidene (CA. Heilman; Virus specific trascription in BPV transformed mouse cells; Virology 119, 22 (1982)) som derfor kan bli anvendt som pattedyr ekspresjonsvektorer (F. Colbere-Garapin et al, A new dominant selective marker for higher eukaryotic cells, J. Mol. Biol. 150, 1 (1981)); P.J. Southern og P. Berg, Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under the control of the SV40 early region promoter, J. Molec. and Appl. Genetics, 1, 327 (1982); N. Sarver et al., Transformation and replication in mouse cells of a BPV-pML2 plasmid vector that can be rescued in bacteria, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79, 7147

(1982); N. Sarver et al, BPV shuttle vectors, Gene expression, J. Setlpw og A. Hollander ed, 173, Plenum Press, New York; G. Meneguzzi et al, Plasmidial maintenance in rodent fibroblasts of a BPVl-pBR322 shuttle vector without immediat-ely apparent oncogenic transformation of the recipient cells, EMBO J. 3, 365 (1984)). Fremmed DNA kan blokkere BPV-funksjo-nene (f.eks. plasmidial opprettholdelse, kopiantallreguler-ing, BPV DNA-replikasjon og celletransformering) når de blir satt inn i posisjoner som er forskjellig fra grensene til de tre regionene. Ekspresjon av fremmede gener og cDNAer har vist seg å være i hvert fall delvis avhengig av innsettings-setet og mening med transkripsjonen (N. Sarver et al, Enhancer-dependent expression of the rat preproinsulin gene in BPV type 1 vectors Mol. Cell. Biol. 5, 3507 (1985 )). Et antall fremmede gener er blitt satt inn i rekombinante plasmider og anvendt til å uttrykke gener som er plassert under transkripsjonen kontroll av konstitutive og induserbare promotere: Y. Gluzman, Viral vectors, Cold Spring Harbor Press, New York, P.J. Kushner et al, A plasmid that replica-tes in both mouse and E. coli cells J. Mol. Appl. Gen. 1, 527

(1982); N. Sarver et al, BPV shuttle vectors, Gene expression, J. Setlow og A. Hollander ed, 173, Plenum Press, New York; N. Sarver et al, Enhancer-dependent expression of the rat preproinsulin gene in BPV type 1 vectors, Mol. Cell. Biol. 5, 3507 (1985); E. T. Scherborn et al, Expression of a human Ul RNA gene introduced into mouse cells via BPV vectors, Mol. Cell. Biol. 5, 1318 (1985); M. Eiden et al, Type 1 Human T-cell Type Leukemia Virus small envelope proteins expressed in mouse cells by using a BPV-derived shuttle vector, Mol. Cell. Biol, 5, 3320 (1985); P.M. Howley et al, Eukaryotic cloning vectors derived from BPV DNA; Methods in enzymology 101, 387 (1983), D. DiMaio et al, High level expression of a cloned HLA heavy chain gene introduced into mouse cells on a BPV vector; Mol. Cell. Biol. 4, 340

(1984); N. Husiung et al, Efficient production of Hepatitis B surface antigen using a BPV-Metallothionein vector, J. Molec. Appl. Genet.; Y. Want et al, Enhanced production of Hepatitis B surface antigen in NIH3T3 mouse fibroblasts by using an extrachromosomally replicating BPV vector, Mol. Cell. Biol., 3, 1032 (1983); M. Karin et al, Expression and regulation of a human metallothionein gene carried on an autonomously replicating shuttle vector, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80, 404 (1983); L. Maroteaux et al., Cyclohexamide induces expression of the human interferon beta 1 gene in mouse cells transformed by BPV-interferon beta-1 recombinants, J. Virol. 47, 89 (1983); S. Mi trani-Rosenbaum et al., Inducible expression of the human interferon beta-1 gene linked to a BPV DNA vector and maintained extrachromosomally In mouse cells, Mol. Cell. Biol. 3, 233 (1983): G.N. Pavlakis and D.H. Hammer, Expression of cloned growth hormone and metallothionein genes in heterologous cells, Recent Progress in Hormone Research 39, 363 (1983). BPV 230,8 plasmidet inneholder BPV DNA åpnet ved BamHI-setet og klonet i samme sete til pBR322-avledet pML2d plasmid (se B. Binetruy et al, Recombinant DNA molecules comprising BPV type 1 DNA linked to a plasmid DNA are maintained in a plasmidial state both in rodent fibroblasts and in bacterial cells, EMBO J. 1, 621 (1982)).

Episome ekspresjonsvektorer har hovedsakelig to fordeler:

a) i forhold til transformeringer hvori det transfekterte DNA blir satt inn i det cellekromosomale DNAet, opprettholder de episome vektorene genet som skal bli uttrykt i et definert milje; b) genkopiantallet er vanligvis høyere og mere stabilt enn det som kan bli tilveiebragt med innsatte gener.

En serie BPV-avledete vektorer, inneholdende RSV promoter-uPA ORF-transkripsjonsenheten, blir konstruert som følger: I) et unikt Xhol-sete blir satt inn i pBPV230,8 ved tre definerte forskjellige posisjoner som tilveiebringer

tre forskjellige vektorer;

II) RSV-uPA blir modifisert med innføring av to Xhol-seter i enden av RSV-uPA transkripsjonsenheten;

III) RSV-uPA transkripsjonsenheten blir kuttet ut med Xhol og satt inn i de tre BPV-avledete vektorene i begge

orienteringer;

IV) de seks plasmidene blir testet for deres evne til å

produsere uPA ko-transfektering av disse sammen med RSV-Neo i pattedyrceller og deretter selektering av antibiotika-resistente, uPA-produserende kloner.

A. 5. 1 - Restriks. lonssetemodif lkasjon i BPV230. 8

For å unngå muligheten av uønsket sete for innsetting eller genorientering (f.eks. promoter "dampening"), er det tilråde-lig å innsette RSV-uPA-konstruksjonen ved tre forskjellige seter i BPV230.8 plasmidene i begge orienteringer. For å gjøre dette, blir plasmidene restriksjonsseter BamHI, Hindlll og Sali modifiserte i separate eksperimenter ved innsetting av en fosforilert Xhol-linker. Plasmid DNA blir først spaltet med det hensiktsmessige enzymet, deretter blir de overhengende endene fylt med Klenow-fragmentet til DNA Polymerase I, en Xhol-linker blir ligert i stort overskudd, og det tilveie bragte DNA-fragmentet blir spaltet med Xhol, selv-ligert og anvendt for å transformere E. coli kompetente celler.

Tre plasmider blir tilveiebragt:

- pBB, hvori det nye unike Xhol-setet blir satt inn ved BamHI-posisjonen og blir flankert av to BamHI-seter som er dannet ved linker/vektorfusjon; - pBS, hvori det nye unike Xhol-setet blir satt inn ved Sall-posisjonen og blir flankert av to Sall-seter som er dannet ved linker/vektorfusjonen; - pBH, hvori det nye unike Xhol-setet blir satt inn ved HindiII-posisjon.

A. 5. 2 - Restrlksjonssetemodifikasjon 1 RSV uPA

I RSV-uPA-plasmidet kutter restriksjonsendonukleasen Ndel og Apal bare en gang hver, det første kuttet er i den pBR322-avledete regionen nære ved RSV-promoteren og det andre kuttet er i SV 40 regionen 3' for uPA-polyadenyleringssete. Disse to setene kan bli modifisert med Xhol-linker som følger: plasmid DNA blir dobbeltspaltet med Ndel og Apal, de overhengende endene blir gjort butte og modifisert med en Xhol-linker. Fragmentet inneholdende replikasjonsorigo og ampicillinresistens blir defosforylert og deretter ligert til fragmentet inneholdende RSV/uPA ekspresjonsfunksjonene. Et plasmid blir tilveiebragt, hvori RSV/uPA konstruksjonen er flankert av Xhol-seter, som blir kalt plasmid p71. Etter Xhol-spalting, gir denne et DNA-fragment inneholdende RSV promoter/uPA kodende regionen egnet for å bli klonet i en hvilken som helst vektor som har et Xhol eller Sali sete eller som kan bli modifisert på en slik måte at disse innsettingssetene finnes.

A. 5. 3 - Innsetting av RSV/ uPA 1 BPV- avledete vektorer

I separate eksperimenter blir pBB og pBH spaltet med Xhol mens pBS blir spaltet med Sali og de lineariserte vektorene blir defosforylert med CIP. Fragmentet inneholdende RSV/uPA-konstruksjonen blir tilveiebragt ved spalting av plasmid p71 med Xhol og separering av de to resulterende fragmentene på agarosegel. Vektor og DNAer som skal bli satt inn, blir ligert sammen, spaltet med Xbal som bare spalter BPV en gang, deretter selv-sammensmeltet og anvendt til å transformere kompetente E. coli celler. Et visst antall plasmider som bærer RSV/uPA transkripsjonskonstruksjonen i begge orienter-ingene ved 3 forskjellige posisjoner resulterer.

A. 6 - Fremstilling av den humane uPA- promoteren

Eukaryote gener som blir transkribert av RNA polymerase II har vist seg å være under transkripsjonen kontroll av veldig omfattende promotere. Aktivering og/eller undertrykking av disse promotere fører til cellecyklusfasen, vev og dlfferen-sieringsfasespesifikk ekspresjon av hvert gen. Ekstracellu-lære faktorer (f.eks. hormoner, ioner, temperatur) kan aktivere, modulere eller undertrykke stabil-fasenivået til aktiviteten ved veldige forskjellige mekanismer. DNA-bindende faktorer, nukleær matrise og kovalente modifikasjoner av DNA, såsom metylering, gjør det mulig for promoteren å transkribere det nærliggende genet.

Et DNA-fragment beliggende rett oppstrøms for den åpne leserammen (ORF) som koder for proUK og som inneholder proUK mRNA begynnelsessete og promoter blir klonet inn i Smal-setet til det promoterløse plasmidet pEMBL8-CAT oppstrøms for det bakterielle kloramfenikolacetyltransferase (CAT) reporter-genet. Det resulterende plasmidet (kalt puPA2) er modifisert i Smal-setet 5' for promoteren ved innsetting av en Xhol-linker for å lette videre modifikasjoner. puPA2-plasmidet og dets derivat blir deretter transfektert i dyrkede pattedyrceller og deres evne til transkripsjon blir testet og som dermed vurderer CAT-aktiviteten.

Resultatene av denne testen indikerer at uPA-promoteren kan drive CAT-gentranskripsjonen i så store nivåer som er sammenlignbare til de som blir gitt av RSV-promoteren. puPA2-plasmidet og dets derivat er derfor sterke ekspresjonsvektorer når et fremmed gen eller cDNA blir satt inn i polylinkerregionen nedstrøms for uPA-promoteren. Ellers så kan et plasmidfragment inneholdende uPA-promoterregionen bli anvendt som en "ekspresjonskassett" foran gener og cDNAer ved å sette dem inn i plasmid polylinkeren (som er avledet fra pEMBL8).

A. 6. 1 - uPA ekspresjonsvektorer

Spalting av lambda-uPAl DNA med Smal danner, blant andre, et fragment inneholdende den humane uPA-promoter (se A ovenfor). Dette fragmentet kan bli klonet oppstrøms fra et gen for å drive dets transkripsjon i egnede pattedyrceller. Slik konstruksjon medfører hovedsakelig tre fordeler: ekspresjonsvektoren inneholder ingen sekvenser med viral

opprinnelse;

promoteren kan inneholde sekvenser som gjør at den kan bli indusert ved signaler såsom ioner, kjemikalier og hormoner ;

promoteravledete sekvenser oppretthold i 5'-enden av mRNA

kan gjøre den mere stabil.

I korte trekk, vektorer hvori den humane uPA-promoteren kan drive transkripsjonen av 3' tilstøtende gen blir fremstilt som følger: a) et 2.38 kb fragment blir tilveiebragt fra lambda-uPAl ved Smal-spalting; b) dette fragmentet blir satt inn i riktig orientering i et plasmid såsom pEMBL8 CAT ved Smal-setet som dermed medfører plasmidpuPA2; c) Smal-setet 5' for promoteren blir omdannet til et Xhol-sete ved hjelp av en linker, som dermed tilveiebringer et plasmid kalt puPA2/41 (dette plasmidet, som puPA2, kan uttrykke det ved siden av liggende CAT-genet når den blir satt inn i en egnet pattedyrcelle); d) CAT-genet blir tatt ut ved delvis spalting av puPA2/41 med Xbal, fylling av de overhengende endene, ligering av en Sall-linker og spalting med Sali som tilveiebringer plasmid pPP41; e) et 7.3kb Smal-fragment tilveiebragt fra lambda-uPAl fag som inneholder uPA ORF (se A.2) og satt inn i riktig orientering i det unike Smal-setet til pPP41 for å tilveiebringe uPA-ekspresjonsvektoren kalt pPP41XS;

f) pPP41XS blir ko-transfektert med RSV-Neo og

g) antibiotikaresistente, uPA-produserende kloner bir

selektert og propagert.

A. 6. 2 - Konstruksjon av puPA2 plasmid

For å tilveiebringe plasmid puPA2, blir DNA fra lambda-uPAl fag spaltet med Smal. Et bånd på 2.38 kb blir renset i gel og satt inn i pEMBL8-vektoren som er blitt linearisert med det samme enzymet og defosforylert med CIP. Bakterielle kolonier som bærer det rekombinante plasmidet med promoteren i riktig orientering blir selektert. Et av disse, kalt puPA2, inneholder 2.38kb fragmentet til prouPA-promoteren 5' for CAT-genet og driver transkripsjonen av det bakterielle genet når den blir transfektert i prouPA-produserende celler.

A. 6. 3 - Konstruksjon av plasmid puPA2/ 41

For å sette inn et unikt sete ved 5'-enden av pro-uPA-promoteren som kan bli anvendt for å modifisere puPA2- plasmidet videre, kan den bil delvis spaltet med Smal og restriksjonssetet modifisert ved innsetting av en Xhol-linker. Det resulterende plasmidet, kalt puPA2/41, har Smal-setet i enden oppstrøms for uPA-promoteren erstattet med et unikt Xhol-sete.

Evnen som puPA2-plasmidet og dets derivater har til å drive transkripsjon av det tilstøtende CAT-genet blir sammenlignet med evnen som RSV-CAT har, et plasmid hvori CAT-genet er under transkripsjonen kontroll av RSV LTR. Plasmidene blir ført inn i A 1251-celler (en human cellelinje avledet fra en nyresvulst) ved kalsiumfosfatutfelling og CAT-aktiviteten blir målt i en transient ekspresjonsanalyse.

puPA2/41 DNA blir deretter delvis spaltet med Xbal, de overhengende endene blir fylt med Klenow-fragmentet til DNA Poll, ligert til et overskudd av Sall-linker og spaltet med Sali. Et fragment på 4.8 kb blir renset på agarosegel, selv-ligert og anvendt for å transformere kompetente E. coli-celler. Et plasmid (kalt pPP41) blir valgt ved miniprep-analyse; et fremmed gen kan bli den pElVIBL8-avledete polylinkeren nedstrøms for uPA-promoteren og uPA mRNA transkripsjons-begynnelsespunktet. Promotergenkonstruksjonen kan bli tatt ut fra pPP41 ved anvendelse av Xhol og Sali og satt inn i et Xhol eller Sali sete til et gitt plasmid.

A. 6. 4 - Innsetting av uPA- genet i pPP41

uPA ORF inneholdende 7.3kb fragmentet tilveiebragt ved Smal-spalting av lambda-uPAl DNA blir ligert inn i Smal-spaltet, CIP-behandlet pPP41 DNA og anvendt til å transformere kompentente E. coli-celler. Blant de ampicillin-resistente koloniene, blir et plasmid (kalt plasmid pPP41XS) valgt som inneholder uPA ORF under kontroll av dets egen promoter og en region som ligger ved siden av. Denne konstruksjonen etab-lerer på nytt det opprinnelige Smal-setet nedstrøms for mRNA-

begynnelsespunktet og den opprinnelige mRNA-transkripsjons-sekvensen.

A. 7 - Konstruksjon av uPA- promoter delesjonsderivater

Eukaryote promotermodifikasjoner, såsom delesjoner, innsett-inger eller mutasjoner kan påføre en promoter nye karaktertrekk såsom en videre spesifisitet og et høyere transkrip-sjonsnivå. Det faktum at induserbare regioner kan enda være konserverte i slike promotere og som dermed kan bli modulert av ytre faktorer gjør at disse er spesielt anvendbare i de tilfeller hvor det produserte proteinet er slik at den interfererer på en negativ måte med biologien til cellen. Delesjoner innenfor et 2.38kb DNA-fragment avledet fra den humane uPA-promoter kan bli tilveiebragt ved genetisk konstruering av det bakterielle plasmidet puPA2/41 beskrevet ovenfor. Delesjoner blir fortrinnsvis laget ved å utnytte restriksjonssetene som allerede er tilstede i uPA-promoteren. To plasmider blir tilveiebragt med denne fremgangsmåten: - et plasmid, kalt puPA2/17, som har en 625bp delesjon som spenner over de to OxaNI-setene; - et annet plasmid, kalt puPA2/254, som har en 1.28kb delesjon som spenner fra OxaNI-setet i posisjon 5080 til EcoRV-setet i posisjon 6369 (se fig. 8 med puPA2-plasmid-kartet).

Disse to plasmidene bærer det bakterielle CAT-genet nedstrøms for den modifiserte uPA-promoter og derfor kan promoterak-tiviteten lett bli detektert ved måling av CAT-aktiviteten etter transfeksjon av plasmidet i eukaryote celler.

Et annet gen kan lett bli satt inn under kontroll av disse delesjonspromoterene ved å utnytte polylinkeren fra pEMBL8-rammen eller så kan disse delesjonspromoterene bli anvendt som "ekspresjonskassetter" inneholdende, 5' til 3', promot eren, mRNA-begynnelsessete og en polylinker og bli satt Inn oppstrøms for et gen som er inne i en annen vektor.

Ved anvendelse av denne konstruksjonen ble også uPA-genet uttrykt. I korte trekk, blir konstruksjonene utført som følger: a) puPA2/41 blir fullstendig spaltet med OxaNI som tilveiebringer puPA2/17; b) puPA2/41 ble fullstendig med EcoRv, OxaNI og fylt med Klenowfragment til DNA Poll som tilveiebringer puPA2/254; c) de to uPA-avledete delesjonspromoterene blir testet for deres evne til å drive transkripsjonen i en CAT-analyse; d) CAT-genet blir tatt ut fra både puPA2/17 og puPA2/254 som beskrevet ovenfor (A6.3); e) uPA ORF blir satt inn under kontroll av de to delesjonspromoterene ; f) de to uPA-ekspresjonsvektorene blir transfektert inn i pattedyrceller.

De vedlagte tegningene er ment å Illustrere oppfinnelsen og referanse til tegningene i beskrivelsen og kravene er for å illustrere oppfinnelsen og er ikke ment å være begrensende for rammen i foreliggende oppfinnelse. Følgende korte beskrivelse av tegningene er ment å gjøre forståelsen av tegningene og oppfinnelsen lettere.

Fig. 1 Strukturen til uPA- genet. mRNA og protein

Øverst til nederst:

restriksjonskart av det innsatte uPA-genet i fag lambda- uPA2; restriksjonskart av det innsatte uPA-genet i fag lambda- uPAl; restriksjonskart av uPA "åpen leseramme" (Ba: BamHI; Ei: EcoRI; Smal; HUI; Hindlll);

ekson/intron-struktur av det humane uPA-genet: svarte bokser: ikke-translaterte 5' og 3' regioner; skraverte

bokser: translaterte eksons; linjer: introns; ekson/intron-strukturen til den delvis uspleisede cDNA-klonen pHUKl;

sammenhengen mellom eksoner og aminosyrer i pro-uPA mRNA; sammenhengen mellom proteindomenene og aminosyrene i pro-uPA.

Fig. 2 Konstruksjon av RSV- uPA

Et Smal DNA-fragment inneholdende hele ORF til uPA mRNA tilveiebragt fra lambda-uPAl (se den øverste delen av denne figuren) blir satt inn på en slik måte at det medfører riktig transkripsjon i Hindlll og Hpal spaltet RSV-Neo-plasmid som inneholder de bakterielle plasmidfunksjonene og LTR til RSV (se venstre delen av denne figuren). RSV-uPA har uPA ORF under kontrollen av promoteren som er inne i RSV LTR og kan uttrykke proteinet når den blir satt inn i en egnet eukaryot vert (se nederste del av denne figuren).

Fig. 3 Restriksjonssetemodifikasjon av RSV- uPA

RSV-uPA-setene Ndel og Apal blir erstattet av to Xhol-seter ved innsetting av linkere som danner plasmid p71 (fig. 3 i midten). Spalting av p71 plasmidet med Xhol tilveiebringer et fragment inneholdende uPA ORF under kontroll av RSV-promoteren som kan bli satt inn i enten Xhol eller Sali inneholdende vektorer (fig. 3 nedenfor).

Flg. 4 Restriksjonskart av pBPF- 230. 8

pBR322 avledet pML2d blir satt Inn i det unike BamHI-setet til BPV-1 genomet (Saver et al. Mol. Cell. Biol.5, 3507; 1985) og BamHI-setet ved siden av 3'-enden til den transformerende regionen blir modifisert til Sali.

Fig. 5 Innsetting av RSV- uPA konstruksjon 1 episomale vektorer

Plasmid pBPV230.8 blir modifisert ved erstatting av et av de tre virale setene BamHI, Hindlll og Sali som respektivt tilveiebringer pBB, pBH og pBS. Det nye Xhol-setet er "satt i boks" i hver fremkommet vektor. De nye BamHI og Sali setene som resulterer fra innsetting av Xhol-linkeren og som flankerer Xhol-setet i pBB og pBS er vist. I de tre plasmidene er RSV/uPA-konstruksjon (se fig. 3) satt inn i Xhol-setet i begge orienteringer som tilveiebringer følgende plasmider: - pBBuPAa, pBHuPAa og pBSuPAa hvori uPA og BPV mRNAene blir transkribert i samme retning (same sense) som BPV; - pBBuPAb, pBHuPAb og pBSuPAb, hvori uPA mRNA og BPV mRNAene blir transkribert i motsatt retning.

Fig. 6 Konstruksjon av puPA2

Plasmid pEMBL8-CAT er avledet fra pEMBL8 ved erstatting av fragmentet mellom Clal og Hindlll med et fragment som inneholder det bakterielle CAT-genet (Dente et al., Nucl. Acid Res., 1645-1655; 1983): Et Smal-fragment som inneholder uPA-promoteren blir satt inn oppstrøms for CAT-genet og som danner plasmid puPA2 (denne figuren, til høyre) med den riktige promotersekvensorienteringen for å transkribere CAT-genet .

Fig. 7 - Sekvensen til den humane uPA- promoteren

Sekvensen til et 2.38kb Smal-framgent fra lambda-uPAl fag DNA, Inneholdende mRNA begynnelsespunktet, TATA-boks og de regulatoriske regionene oppstrøms for uPA-promoteren, er vist. Nukleotid +1 på kartet korresponderer med det første nukleotidet i uPA mRNA beskrevet av Riccio et al. ved anvendelse av primerekstensjonsanalyse.

Flg. 8 Restriksjonskart av uPA- promoteren og dets derivater

Restriksjonskartet til de puPA2-modifiserte plasmidene som indikerer hvor uPA-promoteren er blitt modifisert er representert; spesielt: - puPA2/41, hvori Smal-setet ved 5'-enden av promoteren er omdannet til Xhol; - puPA2/17, hvori regionen mellom de to OxaNI-setene er blitt deletert; - puPA2/254, hvori regionen mellom 5' OxaNI-setet og EcoRV-setet er blitt deletert.

Fig. 9 uPA promoter- avledete vektorer

Fig. 9A beskriver restriksjonskartet til plasmidene puPA2/41,

puPA2/17 og puPA2/254

Fig. 9B beskriver restriksjonskartet til plasmidene pPP41,

pPP17 og pPP254 som er tilveiebragt fra puPA2/41, puPA2/17 og puPA/254, respektivt, ved uttaging av CAT-genet ved Sall/Xbal spalting og Sali linker.

Disse vektorene inneholder uPA-promoter (eller et derivat derav), TATA-boks, og mRNA begynnelsespunktet og kan bli anvendt for å uttrykke genene elelr cDNAene ved å sette dem inn i, for eksempel, det butt-endete Smal-setet eller i BamHI-setet med fragmenter som har Mbol, Bglll, Bell og BamHI endene. Disse konstruksjonene kan bli tatt ut ved dobbelspal-ting med Xhol og Sali. De samme dobbeltspaltingene kan bli anvendt for å ta ut promoterkonstruksjonen for å sette den inn i, som en "ekspresjonskassett", en annen plasmid 5' for genet eller cDNA som skal bli uttrykt. Den fylte sirkelen indikerer replikasjonsorigo for plasmidet.

Fig. 9C beskriver plasmidene pPP41XS, pPP17XS, og pPP254XS,

som er avledet fra pPP41, pPP17 og pPP254, respektivt, ved innsetting av et 7.3 kb Smal-f ragment inneholdende uPA ORF i plasmid Smal-setet.

Fig.10 N-terminal aminosyresekvens (18 residier)

av 3F11 scu-PA sammenlignet med human nyre scu-PA (Kohno T., Hopper P., Lillquist J.S., Suddith R.L. Greenlee R., Moir D.T., Biotechnol. 1984, 2, 628-634) Human A431 scu-PA, human urin scu-PA og muse-scu-PA.

Fig. 11

SDS-PAGE (natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese) av:

a) scu-PA med urinopprinnelse

b) scu-PA fra A431-celler

c) RSV-A431-scu-PA

d) RSV-LB6-scu-PA

e) RSV-LB6-scu-PA

f) RSV-CHO-scu-PA

ved ikke-reduserende betingelser.

Pilen til høyre viser molekylvektstandarder.

Flg. 12

SDS-PAGE av scu-PA'er rapportert i fig. 11 (i samme rekke-følge) etter aktivering med plasmin for å omdanne disse til de korresponderende tcu-PA'er, under reduserende betingelser (se 1.6.2.) Filen til høyre viser molekylvektstandardene.

Fig. 13

SDS-PAGE sammenligning av tcu-PAer tilveiebragt ved aktivering med plasmin av scu-PAer rapportert i fig. 11 (i samme rekkefølge) ubehandlet og etter behandling med glykopeptidase F, under reduserende betingelser (se 1.6.5). En 1:1 blanding av ubehandlet tcu-PA og glykopeptidase F behandlet tcu-PA ble applisert i hver fil. Filen til høyre viser molekylvektstandarder.

Fig. 14

SDS-PAGE-sammenlignlng av tcu-PAer tilveiebragt ved aktivering med plasmin av scu-PAene rapportert i fig. 11 (i samme rekkefølge) ubehandlet og etter behandling med neuraminidase under reduserende betingelser (se 1.6.5). En 1:1 blanding av ubehandlet tcu-PA og neuraminidasebehandlet tcu-PA ble applisert i hver fil.

Filen helt til venstre viser molekylvektsstandarder.

EKSEMPLER

Følgende eksempler er ment å illustrere oppfinnelsen og måten den kan bli utnyttet, men skal ikke bli konstruert for å begrense rammen av oppfinnelsen. For å gjøre forståelsen lettere, beskriver vi i paragrafene som går forut for disse (fra 1.1 til 1.6.7) teknikkene og fremgangsmåtene (såsom enzymmodifikasjon, DNA-utfelling, proteinrensing, osv.) som blir anvendt, essensielt på samme måte, i forskjellige eksempler. I eksemplene, blir paragrafen hvor den blir beskrevet noen ganger referert til i steden for å gjenta hele fremgangsmåten.

1.1. Cellen som blir anvendt er kommersielt tilgjengelig eller på annen måte tilgjengelig gjennom det vitenskapelige samfunnet.

1.2. Cellene blir dyrket i et hensiktsmessig medium såsom Dulbecco's modifiserte Eagle-medium (DMEM) inneholdende 10$ varme-inaktivert føtalt kalveserum.

1.3 - Medier, buffere og oppløsninger for molekylær biologi.

Når tilgjengelig, er reagensene "DNA/RNA kvalitet" og "analytisk kvalitet" i alle andre tilfeller. Hvis ikke noe annet blir beskrevet, blir de flytende og faste mediene for bakterier og fagvekst, buffere og oppløsninger, fremstilt, lagret og anvendt som indikert i Maniatis T. , Fritsch E.F. , Sambrook J., Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1982), heri "Maniatis et al". Hvis ikke noe annet er beskrevet, blir glassvarene, plastikkvarene og laboratorieutstyret preparert, lagret og anvendt som indikert i samme referanse. Deionisert/destillert vann blir anvendt, og autoklavert hvis de skal bli anvendt i enzym-buffere.

1. 4 - Enzymer for molekylær biologi

Restriksjonsendonuklease, DNA-modifiserende enzymer og RNase er kommersielt tilgjengelige. VI anvendte de som ble kjøpt fra Boehringer, Bethesda Research Laboratories (BRL), Collaborative Research, New England Biolabs and Pharmacia; lysozym og bovinserumalbumin (BSA) er også kommersielt tilgjengelig. Vi kjøpte lysozym fra Sigmaog BSA fra Boehringer. Bufferoppløsninger som vanligvis blir anvendt blir også anvendt her i hver enzymreaksjon. Sammensetningen og fremstillingen av disse er generelt kjent og de blir frem stilt i henhold til informasjon som følger med hvert enzym, preparatene blir filtersterilisert og lagret i aliquoter ved -20°C. Mange buffere som for tiden blir anvendt er også kommersielt tilgjengelige som konsentrater. Syntetiske DNA-linkere er tilgjengelige og likeledes er t-RNA tilgjengelig og laksesperm-DNA. VI kjøpte syntetiske DNA-linkere fra P-L Pharmacia eller New England Biolabs, mens tRNA og laksesperm DNA ble kjøpt fra Boehringer.

1. 5 - rDNA- teknikker

Hvis ikke noe annet er beskrevet i de følgende eksemplene, blir rDNA-teknikker utført som beskrevet i Maniatis et al, og i de opprinnelige referansene som er innbefattet deri.

1. 5. 1 - Restrlksjonsspalting og DNA- enzymatlsk modifikasjon

Enkelte og multiple restriksjonsspaltinger og DNA-enzymatiske modifikasjoner blir utført som kjent innenfor fagområdet, og som også er beskrevet i tilgjengelige bøker fra produsenten og i Maniatis et al, ch. 4. "Varme-inaktivering" innbefatter inaktivering av enzymet ved 70°C i 10-15 min, deretter la blandingen stå i romtemperatur fra 10 til 15 min. og nedspin-ning i 2 min i en Eppendorf sentrifuge. Restriksjonsspalt-ingene og resultatene av enzymatisk DNA-modifikasjon blir kontrollert på 0,5 mikrog/ml etidiumbromid-inneholdende 1% agarosegeler som blir kjørt ved 100 v i 1-2 t (se også Maniatis et al., kap. 5).

1. 5. 2 - Fenol/ kloroformekstraherlnger

Fenol/kloroformekstraheringer av proteinene fra nukleinsyre-vannholdige oppløsninger blir fortrinnsvis utført som beskreveti Maniatis et al., s. 458-459; og DNAet blir "tilbake-ekstrahert" når reaksjonsvolumet er mindre enn 200 mikrol.

1. 5. 3 - DNA- utfelling

DNA-utfellingene blir fortrinnsvis utført ved tilsetting av 0,1 vol 3M natriumacetat pH 5,2 og 2,5 volumer etanol (ved-20°C). 20 til 40 mikrog tRNA blir bare tilsatt når dette er beskrevet i de følgende eksemplene. Blandingen blir latt stå i et tørr-is/etanolbad i 15 til 30 min. eller ved -20°C over natt og deretter spunnet ned ved 4°C i 15 min. ved 10000 x G i en Eppendorf mikrosentrifuge eller i en Sorvall-sentrifuge. DNA-pelleten blir vasket en gang med 70$ etanol og deretter en gang med 100$ etanol og deretter tørket i en Savant-vakuum-sentrifuge.

1. 5. 4 - 5' defosforllering

5' DNA-endene blir fortrinnsvis defosforilert med kommersielt tilgjengelige kalvetarmfosfatase (CIP, kjøpt fra Boehringer), ved 37°C ilt ved pH 8. CIP blir fjernet ved fenol:kloroform ekstrahering eller ved tilsetting av EGTA (etylen bis (oksyetylennitrilo) - tetraeddiksyre) til en final konsentrasjon på omtrent 50mM og oppvarming ved 68°C i 45 min.

1. 5. 5 - DNA ligering

DNA-ligeringene blir utført som kjent innenfor fagområdet. Forhandlerens instruksjoner for T4 DNA ligase blir fulgt. Ligasereaksjonene blir utført ved 8°C når syntetiske linkere blir anvendt, og ved 14 til 16°C i alle de andre tilfellene. Når butt-endet DNA skal bli ligert, blir PEG 1500 eller PEG 4000 tilsatt til en final konsentrasjon på 10$. 10 x ligeringsbuffer med følgende sammensetning blir anvendt: 0,66 M Tris-HCl pH 7,6, 50mM MgCl2, 50 mM ditiotreitol, og 5mM ATP.

1. 5. 6 - DNA- linkere

Linker-DNAene blir anvendt, fosforylert og kontrollert som beskrevet i Maniatis et al, sidene 125-126, og fortrinnsvis anvendt som beskrevet på side 392 og påfølgende Kinasereak-sjon, ligering og restriksjon av bare linkere og de ligerte DNA-fragmentene blir undersøkt ved elektroforese: linker på en 2$ agarosegel i 10 til 20 min. (1 til 2 timer når det gjelder linkerdannede DNA-fragmenter) og deretter visualiser-ing av DNA ved autoradiografi som beskrevet i Maniatis et al, s. 172.

1. 5. 7 - Preparativ gelelektroforese

Preparativ gelelektroforese blir fortrinnsvis utført på 0,7$ til 0,8$ agarosegel inneholdende 0,5 mikrog/ml etidiumbromid i IX TBE buffer (0,089 M Tris, 0,089 M Borsyre og 0,002 M EDTA, Maniatis et al, s. 156). DNAet blir kjørt ved 25V de første 2 t og ved 50V I 16 til 20 t. DNA-f ragmentene blir visualisert på en 305nm UV transilluminator og DNA-båndene blir skåret ut og elektroeluert i et elektroelueringssystem (ISCO) i 0,1X TBE ved 400V i 10 til 15 min. DNA blir renset på Elutip-D kolonne (Schleicher & Schuell) preparert og renset med lav salt buffer og eluert med høy salt buffer. Kolonnen blir vanligvis preparert i en buffer inneholdende 0,2 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,3-7,5 (Tris er 2-amino-2-hydroksy-metyl-1,3-propandiol) og 1,0 mM EDTA. Denne bufferen blir også anvendt for skylling, mens elueringsbufferen inneholder 1,0 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7,3-7,5, og 1,0 mM EDTA. Til slutt blir DNA utfelt som indikert i 1.5.3.

1. 5. 8 - E. coli transformering

E. Coli transformering blir fortrinnsvis (jfr. Hanahan D. , Studies on transformation of E. Coli with plasmides, J. Mol. Biol. (1983) 155 557-580) utført ved anvendelse av kommersielt tilgjengelig eller på annen måte tilgjengelige kompetente celler, såsom stammer DH1, DH5 eller HB101 fra BRL (Bethesda Research Laboratories) i henhold til i seg selv kjente teknikker som også er oppsummert i forhandlerens bøker. 100 mikrol (BRL) protokollen blir anvendt når et DNA- fragment skal bli satt Inn 1 et annet plasmid, mens 20 mikrol (BRL) protokollen i liten skala blir anvendt ved omdanning av restriksjonssetene med DNA-linkere. Etter inkubering uten antibiotika, blir cellene sådd ut på agar LB skåler (Maniatis et al. s 440-444) og inkubert over natt ved 37 "C i nærvær av det hensiktsmessige antibiotika.

1. 5. 9 - Screening av de transformerte cellene ( miniprep-analyse

Resistente kolonier fra DNA-transformerte kompetente E. Coli celler blir fortrinnsvis screenet ved å la isolerte kolonier vokse over natt ved 37° C i 5 ml LB og det hensiktsmessige antibiotika (Maniatis et al., s. 440) og analysering av prøvene (1,5 ml) fra væskekulturen med kokemetoden som beskrevet i Maniatis et al., s. 366-367. Følgende variasjoner kan bli introdusert: - reaksjonsvolumene blir forhøyet 1,5 ganger; - E. Coli stamme DH1 blir kokt i 60 sek.; - DNA-utfelling blir utført uten tilsetting av salt, men med tilsetting av 1 vol isopropanol og la rørene står ved -20°C i 20 til 25 minutter; - utfelt DNA blir vasket en gang med 1 ml 70$ etanol og en gang med lml 100$ etanol; - DNase-fri RNase blir tilsatt i 10 mikrog/ml og DNAet blir Inkubert 20 min. ved 70°C.

1. 5. 10 - Preparering av plasmid i stor skala

Prepareringer av plasmid i stor skala blir fortrinnsvis utført som beskrevet i Maniatis et al, kap. 3, alkalisk lyse-metoden blir fortrinnsvis anvendt for utvinne plasmid DNA (jfr. Maniatis et al, s. 90-91), plasmid DNAet blir renset to ganger på etidiumbromid inneholdende CsCl gradienter, deretter blir blandingen ekstrahert med isoamylalkohol, og den vannholdige DNA-inneholdende fasen blir separert og dialysert mot TE pH8 (Maniatis et al.) og lagret ved 4"C. 1. 6 - Rensing og karakterisering av tilveiebragt pro- uro-klnase

1. 6. 1 - Kjemikalier:

Alle kjemikaliene som blir anvendt er enten kommersielt tilgjengelige eller så kan de lett bli fremstilt fra kommersielt tilgjengelige produkter. Følgende liste innbefatter for eksempel noen kjemikalier som blir anvendt i de følgende eksemplene og deres kilder: Affi-Gel 10 (aktivert agarose), akrylamid, bisakrylamid, natriumdodecylsulfat, Comassi Brilliant Blu er fra Bio Rad, Richmond, USA; CNBr-aktivert Sepharose, elektroforesekalibreringskit for proteiner med lav molekylvekt er fra Pharmacia, Uppsala, Sverige. Amfolin er laget fra LKB AB, Bromma Sverige; bovint serumalbumin (BSA), Cohnfraksjon V, grise-trypsin, grise-plasmin, fibrinogenfrak-sjon I type IV, benzamidin, er fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178, USA; aprotinin er fra Bayer, Leverkusen, GFR, glykopeptidsase F er fra Boehringer Mannheim GmbH, FRG; S-2444 fra Kabl AB, Stockholm, Sverige. Urokinase med høy molekylvekt (HMW-uPA) er produsert av Lepetit Research Laboratories SpA Milano, Italia. Scu-PA (pro-uPA) kan bli fremstilt som fremgangsmåten beskrevet av Stump D.C., Thienpoint M. , Coilen D. , J. Biol. Chem. 261, 1267-1273, 1986. A431 scu-uPA blir tilveiebragt i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Corti A., Nolli M.L. , Soffientini A., Cassani G., i Thromb Haemostas 1986; 56, 219-224. Human endotelisk plasminogenaktivator-inhibitor (PAI-1) kan bli fremstilt ifølge prosedyren beskrevet av van Mourik, J.A., Lawrence, D.A. og Loskutoff, D.J., Purification of an inhibitor of plasminogen activator (antiactivator) synthe-tized by endothelial cells, J. Biol. Chem. 259, 14914-14921, 1984 .

Alle andre reagensene var produkter med analytisk kvalitet som er kommersielt tilgjengelige fra Merck Darmstad, GFR eller Carlo Erba, Italia.

1. 6. 2 - Immunologiske analyser og aktivitetsanalyser

Den fibrinolytiske analysen blir utført ved fibrinplatemetoden (Astrup T. , Mullertz S. , The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity, Arch Biochem Biophys 1952, 40:346-351). Urokinase-referansestandard blir anvendt for å kalibrere hver analyse. Aktiviteten blir målt i internasjo-nale enheter (I.U.) relativt til Internasjonal referanse-preparering som primær standard. sc-uPA (celleprodusert enkelt-kjede urokinase) fibrinolytisk latent aktivitet blir bestemt etter aktivering som følger: plasmin (10 mg) blir koblet til CNBr-aktivert Sepharose (kryss-bundet agarose)

(2,5 ml) ved anvendelse av 0,5 M natriumkarbonatbuffer som koblingsbuffer. En 1:10 suspensjon av plasmin-agarose (0,9 ml) i 0,15 M natriumklorid, 0,05 M natriumfosfatbuffer pH 7,4 blir blandet med sc-uPA prøver (0,1 ml) og forsiktig rotert i 1 t ved 20"C. Plasmin-agarose blir fjernet ved sentrifugering i 2 min ved 10000 x g og supernatanten ble testet ved fIbrinplateanalysen.

Proteinkonsentrasjonene ble målt i henhold til Lowrymetoden (Lowry 0., Rosebrough H., Parr A., Randall R., Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem. 1951, 193, 265-275).

De amidolytiske analysene ble utført ved måling av hydrolyse-graden til det syntetiske substratet pyro-Glu-Gly-Arg-pNA, S-2444 (Claeson G., Friberger P., Knos M., Eriksson E., Methods for determination of pre-kallikrein in plasma, glandular kallikrein and urokinase, Haemostasis 1978; 7:76-78).

Immunoadsorbent-amidolytisk analyse (IAA) blir utført som beskrevet av Corti A., Nolli ML. , Cassani G. , Differential detection of single-chain and two-chain urokinase type plasminogen activator by a new immunoadsorbent amidolytic assay (IAA), Throm Haemostas 1986, 56:407-10. Analysen kombinerer selektiviteten til immunoanalysene med spesifisi-teten til enzymsaktivitetsanalysene og utviser både de antigene og enzymatiske egenskapene til de to proteinene. tcu-PA og scu-PA blir selektivt immunoadsorbert til brønnene i en mikrotiterplate belagt med monoklonalt antistoff 5B4 og testet for enzymatisk aktivitet før og etter aktivering ved plasminbehandling.

1. 6. 3 - Revers fase FPLC

Revers fase kromatografi blir utført I et FPLC (Rask protein væskekromatografi) system (Pharmacia Fine Chemicals) ved anvendelse av en pro-RPC HR5/10 revers fase kromatografisk kolonne (makroporøs, mikropartikulat silisiumoksyd med bundne Ci/Cg-grupper). Elueringsbuffere: buffer A, 0,1$ trifluoreddiksyre i vann, og buffer B, 0,1$ trifluoreddiksyre i acetonitril; elueringsmåte: 100$ A i 20 min, lineær gradient fra 0 til 60$ B i A i 65 min, 100$ B i 25 min; elueringshastighet 0,3 ml/t.

1. 6. 4 - Elektroforetiske prosedyrer

SDS-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) blir utført i henhold til Laemmli UK, (Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 1970, 227:680-685), i en gel-slab 1,5 x 120 x 150 mm eller i et raskt, elektroforesesystem med høy resolusjon (såsom Phast System fra Pharmacia, se også Olsson I. et al, Electrophore-sis, 1988, 9, 16-22). De konsentrerende gelene og separerende gelene inneholdt 3$ og 12,5$ akrylamid respektivt. Markør-proteiner (Ampholiner) til det kommersielt tilgjengelige elektroforesekalibreringskit for molekylvektbestemming (Pharmacia) blir kjørt i hver gel. 2-Merkaptoetanol blir anvendt som reduseringsmiddel og Comassie Brilliant Blå R250 ble anvendt for gelfarging. Immunoblotting blir utført essensielt som kjent (jfr. Salerno G. , Verde P., Nolli ML., Corti A., Szots H. , Meo T. , Johnson J., Bullok S., Cassani G., Blåsi F., Monoclonal antibodies to human urokinase identify the single-chain pro-urokinase precursor, Proe. Nati. Acad. Sei USA, 1984, 81:110-114), ved anvendelse av rensede anti-uPA monoklonale antistoffer såsom Mab5B4 (Nolll ML. , Corti A., Soffientini A. , Cassani G., A monoclonal antibody that recognizes the receptor binding region of human urokinase plasminogen activator, Throm Haemostas 1986, 56:214-8), Mabl05IF10 og Mab52C7 (se Salerno, G. et al., ovenfor) og kanin anti-uPA anti serum.

1. 6. 5 - Behandling av pro- uPA med glykopeptidase F og neuraminidase

Aliquoter (2 mikrol) av rekombinant scu-PA (pro-uPA) og urin scu-PA, fremstilt vesentlig som beskrevet av Stump et al. se punkt 1.6.1, 1,5 mg/ml i 0,1 M natriumfosfatbufret pH 7,4 blir blandet med 2 mikrol 5 mikrog/ml plasminoppløsning i samme buffer og latt stå i 4 t ved 37°C. Deretter blir enten 3 mikrol 6,6 IU/ml glykopeptidase F (Boehringer Mannheim) i 100 mM natriumfosfat, 20 mM EDTA (etylendiamintetraeddiksyre) 0, 1% 2-merkaptoetanol, 1% Triton X-100 (polyetylenglykol p-isoctylfenyleter) og 10 mM benzamidin, eller 4 mikrol 1 mg/ml neuramidinase (Clostridium perfringens, fra Boehringer) i 50 mM natriumacetatbuffer, pH 5, 50 mM natriumklorid og 10 mM benzamidin tilsatt til hver prøve. Alle prøvene blir latt stå for å reagere over natt ved 370 C og deretter analysert ved SDS-PAGE (se 1.6.4, ovenfor).

1. 6. 6 - Isoelektrofokusering ( IEF)

IEF blir utført på 1 mm tykke gel-slaber inneholdende 5% akrylamid (forholdet mellom akrylamid og bisakrylamid er fortrinnsvis 25:1), 2% amfolin pH 3,5-10, 4M urea, og 3, 5% glyserol. Gelen blir avkjølt ved 12°C. 50 mikrol prøve (0,3 mg/ml) blir applisert på filterpapir-strimler ved anoden, etter pre-fokusering. Total kjøretid er 150 min ved 20 W, 1500 V ved ekvilibrering. pH-målinger blir utført ved kutting av 5 mm gel-biter, eluering med 1 ml 10 mM kaliumklorid og måling av pH ved 12°C. Ingen pl-korreksjoner blir utført for nærvær av urea. Gel-farging blir utført som beskrevet av Blakesley RW, Boezi JA, A new staining technique for proteins in polyacrylamide gels using Comassie Brilliant Blue G-250, Anal Biochem 1977; 82,580-582.

1. 6. 7 - N- terminal sekvensanalyse

N-terminal aminosyresekvensanalyse blir utført ved anvendelse av en applied Biosystem model 470A gass-fase proteinsekven-ser.

1. 6. 8 - C- terminal sekvensanalyse

C-terminal analyse blir utført ved inkubering av 3Fllsc-uPA (RSV-LB6-scu-PA) (200 mikrogram) med karboksypeptidase Y Sigman, St. Louis, MO, USA) ved romtemperatur i 100 mikroliter 0,1M natriumacetat pH 5,5 og 4M urea. Forholdet mellom karboksypeptidase Y og 3Fllsc-uPA er omtrent 1:50 ved vekt. Ved intervaler ble 10 mikroliter aliquoter fjernet, varmet ved 100°C i 10 min og tørket under vakuum. Hver prøve er løst opp I 40 mikroliter 0,2 M natriumborat, pH 9,5, og porsjoner på 5 mikroliter blir behandlet med et overskudd av o-ftalal-dehyd i 1 min ved romtemperatur, og deretter applisert på en Beckman Ultrasphere ODS (250 x 4,6 mm) kolonne i et HP1090 HPLC system, ekvilibrert i 0,1M natriumfosfat, pH 6,8. Separasjon blir oppnådd på en 23 min lineær gradient fra 40$ til 80$ vannholdig metanol, med en elueringshastighet på 0,7 ml/min. Aminosyrederivater blir identifisert med et HP1046 spektrofluorimeter og kvantitert med en HP3390 integrator i henhold til vanlige statistiske analyser og beregnings-metoder .

1. 6. 9 - Inhibering av tcu- PA aktivitet ved PAI- 1

Human endotel plasminogenaktivator inhibitor

Human endotel plasminogenaktivator inhibitor (PAI-1, 20 pg/ml) blir aktivert med SDS (final konsentrasjon 0,5$) i 30 min. ved 37°C. Til en serie fortynninger av aktivert PAI-1 (55 mikrol), blir 55 mikrol 1$ (v/v) Triton X-100 i 0,2 M Tris-HCl buffer, pH 7,6 og 0,1$ (v/v) Tween 20 tilsatt. Deretter blir 30 mikrol 8 ng/ml tcu-PA (testprøve) tilsatt, blandet og inkubert i 30 min ved romtemperatur. For å måle den gjenværende aktiviteten, blir 110 mikrol human plasminogen (6 CU./ml) i 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6 og 0,1$ Tween 20, tilsatt og prøvene blir inkubert ved 37°C i 45 min. Deretter blir 0,5 ml 0,9 mM S-2251 tilsatt og prøven blir inkubert i 20 min. ved romtemperatur. Etter stopping av reaksjonen med 0,1 ml 50$ eddiksyre, blir den optiske tettheten ved 405 nm målt. Den gjenværende aktiviteten i nærvær av forskjellige mengder PAI-1 blir uttrykt som en prosentdel av aktiviteten til kontrollene uten PAI-1 og dose-responskurver blir plottet. Fra disse plottene blir mengden av PAI-1 hvorpå 50$ av kontrollplasminogenaktivator-aktivitet er opprettholdt blir beregnet.

1. 7 - Kinetisk analyse

1. 7. 1 - Aktivering av scu- PAer med plasmin

Kinetikken ved aktivering av scu-PA fra urin og rekombinant scu-PA ved plasmin blir målt ved 37° C i 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7,6, inneholdende 38 mM natriumklorid, 0,01 $ Tween 20, 0,01 $ bovint serumalbumin og 0,5 mM pyro-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilid (S-2444). Reaksjonssystemet blir kalibrert for 0,5 nM plasmin og 50-750 nM scu-PAer. S-2444 er et spesifikt substrat for tcu-PA og blir ikke hydrolysert av plasmin, fordi under disse betingelsene er tcu-PA som blir dannet av hver scu-PA ved plasminaktivering proporsjonal til mengden av frigjort p-nitroanilin, detektert fotometrisk ved 405 nm. De opprinnelige aktiveringshastighetene, når de er plottet i et Lineweaver-Burk type diagram, tillater beregning av Km- og Vmax-verdiene.

1. 7. 2 - Amidolvtisk aktivitet på S- 2444

For å bestemme de kinetiske parametrene til den amidolytiske aktiviteten, blir plasmin-aktiverte u-PAer (4,5 nM) inkubert ved forskjellige konsentrasjoner (0,03 - 0,3 mM) av pyro-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilid (S-2444 ) i 0,1 M Tris Cl (pH 8,8), 50 mM NaCl og 0,1$ bovint serumalbumin ved 37°C. Den opprinnelige hastigheten av p-nitroanilin-frigjøring blir bestemt fotometriskt ved 405 nm. Den lineære økningen av absorbans med tiden for de forskjellige konsentrasjonene av S-2444 er ført opp i et Lineweaver-Burk plot og fra disse blir Km- og Vmax-verdiene beregnet ved ekstrapolering av kurvene tilveiebragt ved anvendelse av et lineært regresjonsprogram.

1. 7. 3 - Aktivering av humant plasmlnogen

Kinetikken til aktivering av plasmlnogen til plasmin ved urin tc-uPAer og rekombinant tc-uPAer (20 pM) blir målt ved 37°C i 0,05 M Tris-HCl buffer, pH 7,4, inneholdende 0,04 M NaCl, 0,01$ Tween 80, 0,01$ bovint serumalbumin, 0,5 mM D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilid (2-2251) og plasmlnogen (5,2 - 23 mM). Siden S-2251 er et spesifikt substrat for plasmin og ikke blir hydrolysert av tc-uPA, er den genererte plasminaktivi-teten proporsjonal til mengden p-nitroanilin frigjort ved disse betingelsene, og blir detektert fotometrisk ved 405 nm. De opprinnelige aktiveringshastighetene for de forskjellige konstrasjonene av plasmlnogen er ført opp i et Lineweaver-Burk plot og ut fra disse blir Km og Vmaxberegnet ved ekstrapolering av kurvene tilveiebragt ved anvendelse av et lineært regresjonsprogram.

Eksempel EO

Humant genomisk bibliotek

Et bibliotek av humant genomisk DNA i bakteriofag lambda Charon 28 blir fremstilt ved teknikkene som er kjent innenfor fagområdet (jfr. P.H. Hieter et al., Cell, Vol. 22, 197-207

(1980) og Maniatis et al). Det rekombinante lambdalysatet blir titrert på E. Coli K12 stamme LE 392 (Maniatis et al s. 504). Teknikker for fagtitrering, og likeledes for screening av et fagbibliotek med en nick-translatert probe, er også velkjent innenfor fagområdet (se blant annet, Maniatis et al) og blir i vesentlig grad anvendt som dette i de følgende eksperimentene. For screening, blir 10 mikroliter av en en-tusen-gangers fortynning av lysatet adsorbert på 0,3 ml på en 2,5 ganger konsentrert kultur E. Coli K12 LE 392 i 10 mM MgS04og inkubert i 20 minutter ved 37°C. 7 ml 0,7$ agarose blir tilsatt og hele blandingen blir sådd ut på 150 mm plastplater inneholdende NZYMC-agar (type-A hydrolisat av kasein 10 g/l; NaCl 5 g/l; gjaerekstrakt 5 g/l; kasaminosyrer 1 g/l; og MgS04.7H20 2 g; justert til pH 7,5; se Maniatis et al). 0,41 ml av en 10-<3>fortynning av lysatet blir anvendt, på totalt 41 plater. Etter inkubasjon i en dag, ble et gjennomsnitt på 1,5 x IO<4>plaques/plate observert. 6 x IO<5>plaques observert i 41 plater innbefatter en god representa-sjon. Alle plaquene fra hver plate blir overført til to nitrocellulosefiltere (Schleicher og Schuell Co.). Filtrene blir tørket, vasket, bakt i vakuum og pre-hybridisert som vanlig (se Maniatis et al). Hybridiseringen blir utført med nick-translatert probe bestående av et DNA-fragment isolert fra et humant urokinase cDNA (Verde A. et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 81, 4727-4731, 1984).

E0. 1 - Nick- translasjon

Plasmid pHUK-I (Verde et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 81, 4727-4731 1984) inneholder et rekombinant innskudd som er komplementær til mRNA for human urokinase. Et 1,5 kb Pstl- fragment, isolert ved agarose-gelelektroforese og utskjæring av den korresponderende gelregionen og utvinning av DNA-fragmentet ved elektroeluering (jfr. 1.5.7), inneholder omtrent 75$ av den kodende regionen til human urokinase mRNA (Verde et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 81, 4727-4731, 1984). Ensartet merking av dette Pstl-fragment (5,0 mikrog) blir utført med et nick-translasjonskit fra Bethesda Research Laboratories i nærvær av 200 mikroCi av hver av alfa<32>P-dCTP og alfa<32>P-dGTP (jfr. Maniatis et al). Utbyttet av merket DNA er 1,8-2,9 x 10<8>cpm/mikrog.

EO. 2 - Isolering av uPA- gen positive fag

41 filtere (tilveiebragt som i EO) blir hybridisert med det nick-translaterte Pst-I-fragmentet. Grupper på 8 filtere blir hybridisert i 40 ml hybridiseringsoppløsning i en enkelt plast-lomme med omtrent 10<8>cpm merket DNA. Hybridisering blir utført ved 42°C i 17 timer i 2 x SSC (17,5 g NaCl og 88 g natriumsitrat blir løst opp i 800 ml vann, pH blir justert til 7,4 med vannholdig NaOH og volumet blir justert til 1 1), 0,1$ natriumdodecylsulfat (SDS) (Maniatis et al, s. 447). Filtrene blir vasket fire ganger i 2 x SSC 0,1$ SDS i 15 minutter ved romtemperatur, og en gang i 1 x SSC, 0,1$ SDS i 2 timer ved 68°C. Etter tørking, blir filtrene utsatt for røntgen-flimer (Kodak) i 12-24 t og fremkalt. Fra denne screeningen blir plaques som har vist seg å gi en positiv hybrldiseringsflekk i identiske posisjoner på begge duplikate filtere (tre) plukket opp med et lite volum NZYMC medium (Maniatis et al) og anvendt for å infisere E. Coli K12 L 392 ved forskjellige fortynninger og sådd ut på 10 cm plater med NZYMC-agar. Platene som gir mellom 500 og 5000 plaques blir deretter valgt ut og på nytt screenet. Disse plaquene blir overført til duplikate nitrocellulosefiltere (Schleicher og Schuell Co.) og filtrene blir behandlet og hybridisert med nick-translatert 1,5 Kb Pst-I fragmentet av humant uPA cDNA beskrevet ovenfor. Nesten alle plaquene gir et positivt hybridiseringssignal, med en anriket faktor på omtrent IO<5>.

Enkelte plaqueisolater av de tre positive plaquene ble kalt lambda-uPA-1 lambda-uPA-2 og lambda-uPA-3.

EO. 3 - Preparering av fag i stor skala

Plaquene blir amplifisert på E. Coli K12 LE 392 ved anvendelse av store kulturlysater, og fagene blir isolert ved gjentatt bånd-dannelse i cesium-klorid, og renset ved ekstrahering av den vannholdige fasen med fenol og deretter med kloroform/isoamyl alkohol (24:1) og DNA etanol-presipi-tering fra den vannholdige fasen i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Maniatis et al, kap. 3.

Eksempel El

Ekspresjon av det uPA- kodende genet i pattedyrceller

El. l - Isolering av uPA ORF

200 mikrog lambda-uPAl tilveiebragt essensielt som i EO. 3 blir spaltet i 80 mikrol med 30 U Smal ved 25°C Ilt; reaksjonen blir stoppet med EDTA (final konsentrasjon 50 mM) og det blir kjørt en elektroforese av DNAet på en etidiumbromid inneholdende 0,8$ agarosegel ved anvendelse av en 10 cm kam ved 100V. Deretter blir gelen analysert under UV-lys og det nest sakteste båndet (på omtrent 7,3 kb), et Smal-fragment inneholdende den åpne leserammen (ORF) til det humane uPA-genet, blir skåret ut av gelen. DNAet blir elektroeluert og renset som beskrevet i 1.5.7.

El. 2 - Preparering av vektor- DNA

Et RSV-neo avledet fragment inneholdende RSV-promoteren og pBR 322 avledet ampicillin-resistens og replikasjonsorigo blir fremstilt ved Hindlll spalting, inn-fylling, Hpal-spalting, CIP-behandling og fragmentseparering på agarosegel.

RSV-neo-vektoren blir modifisert som følger (se fig. 2):

El. 2. 1 - Hindlll spalting

20 mikrog RSV-neo plasmid DNA blir fullstendig spaltet med 80 U Hindlll i en 1 t ved 37°C i 200 mikrol. Restriksjonsenzymet blir varmeinaktivert og deretter blir blandingen ekstrahert med et likt volum fenol:kloroform, DNAet blir utfelt ved tilsetting av 50 mikrog tRNA (1.5.3), og løst opp på nytt i 20 mikrol TE (Tris 10 mM pH 8 og EDTA 1 mM; Maniatis et al).

El. 2. 2 - Innfylling og Hpal- spalting

De overhengende endene til den åpne vektoren fremstilt ovenfor blir gjort butte ved inkubering av DNA med 1U Klenow fragment fra DNA-polymerase I i 25 mikrol (Maniatis et al, s. 113) ilt ved 37° C og rensing som beskrevet i 1.5.2 og 1.5.3. Deretter blir den lineariserte, butt-endete vektor DNAet spaltet med 80 U Hpal i 40 mikrol ilt ved 37° C og renset på samme måte. Disse handlingene spalter neomycin resistensgenet og medfører et lineært butt-endet 3,5 kb langt DNA-fragment hvor RSV-Neo er åpnet mellom LTR-promoterregionen og SV 40 polyadenyleringssetet og inneholdende replikasjonsorigo og ampicillinresistensgenet avledet fra plasmid pBR322 (Fig. 2).

El. 2. 3 - CIP- behandling

DNAet blir behandlet med 1,5 U kalve-tarmfosfatase (CIP) i 50 mikrol reaksjonsmedium (finalt volum) for å fjerne 5'-fosfatresidlet fra DNA-endene; enzymet blir deretter inaktivert ved tilsetting av etylen bis(oksyetylenitrilo) tetraeddiksyre (EGTA) (final konsentrasjon 10 mM) og behandling ved 68°C (se 1.5.4).

El. 2. 4 - Fragment- rensing

DNA-fragmentene blir separert ved anvendelse av en 0,6$ agarose preparativ gel som beskrevet i 1.5.7. Den delen av gelen som inneholder 3,5 kb båndet blir skåret ut og DNA-fragmentet blir elektroeluert (1.5.7), og den tilveiebragte blandingen blir justert til den hensiktsmessige saltkonsentrasjonen og renset på en Elutip-D kolonne (Schleicher og Schuell Co.). Etter eluering, etanol, Na-acetat, og bærer tRNA blir satt til DNA-oppløsningen og DNAet blir utfelt og på nytt løst opp i 20 mikrol TE som beskrevet i 1.5.3.

E. 1. 3 - Kloning av uPA- genet under RSV- LTR- promoter

3 TJ T4 DNA ligase og 2.5 mikrol 10X buffer (Maniatis et al., s. 246 ) blir satt til 3 mikrog def osf orilert DNA-vektor (fremstilt som beskrevet ovenfor i El.2) og 7,5 mikrog 7,3 kb uPA-fragment (fremstilt som beskrevet i El.l). 25 mikrol reaksjonsblanding blir inkubert 16 t ved 14°C (se 1.5.5) og anvendt for å transformere 100 mikrol HB101 E. coli kompetente celler (se 1.5.8). Bakteriene blir selektert over natt på LB agarskåler (trypton 10 g/l, gjærekstrakt 5 g/l, NaCl 10 g/l, justert til pH 7,5 med vannholdig natriumhydroksyd) inneholdende 50 mikrog/ml ampicillin ved 37°C. Isolerte kolonier blir plukket opp, og dyrket i 5 ml ampicillin inneholdende LB og preparert ved standard miniprep-analyse (1.5.9). Restriksjonsmønsteret til renset plasmid DNAene blir studert for å bestemme den riktige orienteringen av uPA-genet i vektorrammen. En av disse plasmidene som har riktig orientering blir betegnet RSV-uPA, isolert og anvendt i flere eksperimenter (fig. 2).

E. 1. 4. 1 - Transfeksjon

Dagen før transfeksjon blir cellene (murin LB6, beskrevet av Corsaro CM. og Pearson L.M. i Somatic Cell Genetics,7, 603, 1981), sådd ut i en konsentrasjon på omtrent IO<4>mikrol/cm<2>i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM, Flow Laboratories Inc.) supplementert med penicillin (50 U/ml), streptomycin (50 mikrog/ml), 2 mM glutamin, Og 10$ varmeinaktivert føtalt kalveserum (FCS). På transfeksjonsdagen er cellene i den logaritmiske vekstfasen og blir på ny matet 3 t før DNA-tilsetting. Kalsiumfosfat-DNA ko-utfellingsmetoden blir fulgt for transfeksjonen (Graham og Van der Eb, Virology 52, 456, 1983). Kalsiumfosfat DNA-utfelling blir fremstilt ved tilsetting av en DNA-oppløsning (i dette tilfellet en blanding av RSV-uPA, se El.3, og RSV-neo, se El.2, omtrent 1 til 1) i 2 mM CaCl2(0,25 ml, finalt volum) til en 2 X HBS (137 mM NaCl, 0,7 mM Na2HP04, 21 mM HEPES, 4-(2-hydroksy-etyl )-l-piperazinetansulfonsyre, pH 7,1) (0,25 ml). Denne DNA ko-utfellingsblandingen blir deretter satt til cellene. Etter 3 t ved 37°C, blir utfellingen fjernet fra cellene som blir vasket to ganger med DMEM (uten føtalt kalveserum), 1,5 15$ oppløsning av glyserol i HBS blir tilsatt, og cellene blir inkubert 1-2 min ved 37° C og glyserol blir fjernet ved vasking med DMEM (uten føtalt kalveserum). Deretter blir cellene matet med fullstendig DMEM beskrevet ovenfor (når det gjelder celledyrking) og latt stå i omtrent 48 t ved omtrent 37°C, deretter ble de veldig forsiktig trypsinert og sådd ut i en konsentrasjon på omtrent IO<5>celle/skål i DMEM + 10$ varmeinaktivert FCS + 50 U/ml penicillin, 50 mikrog/ml streptomycin, 2mM glutamin +0,8 mikrog/ml G 418 (Geneticin, Gibco). Deretter inkuberes cellene i omtrent 2-3 uker, og mediet blir skiftet ut hver 3. dag. Etter dette, blir koloniene telt, overført til mikrotiterplater med 24-brønner, og latt vokse opp til metting før supernatantene ble analysert. Klonene som demonstrerte nyttige nivåer av pro-uPA produksjon (mere enn 0,5 mikrog/ml) blir lagret som frosne stokk-løsninger i flytende nitrogen etter supplementering av varmeinaktivert føtalt kalveserum med 10$ DMSO. Disse cellen blir også klonet på nytt for å velge ut celler som produserer mye og som også blir lagret i frossen tilstand som beskrevet ovenfor. Klonen som gir den høyeste produksjonen av pro-uPA i disse eksperimentene (kalt 3F 11 eller RSV-LB6) blir klonet på nytt og massedyrket.

El. 4. 2 - Massedyrking

En 4 liter cellereaktor med automatisk kontroll av oppløst oksygenspenning, pH og temperatur blir anvendt for å dyrke et inokulum av klonen som produserer mest tilveiebragt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksemplene ovenfor, som blir kalt 3 F 11. Mediet for kulturen er DMEM med 5$ varme-inaktivert FCS, 1 mM glutamin, 25 U/ml penicillin, 25 mikrog/ml streptomycin, 400 mikrog/ml G 418 og 27 IU/ml aprotinin eller en serum-fri formulering inneholdende DMEM og F10 (Flow Labs. Inc.), forhold 1:1, som base supplementert med 27 IU/ml aprotinin, albumin, insulin, transferin, etanolamin, cholin, vitaminer og spormetaller. Celle ino-culumet blir dyrket i en 150 cm<2>flaske i DMEM pluss 10$ varme-inaktivert FCS, 2 mM glutamin, 50 U/ml penicillin, 50 mikrog/ml streptomycin, 400 mikrog/ml G 418, og cellene blir dyrket på Cytodex mikrobærere (Pharmacia).

Cellene oppnådde en maksimal populasjonstetthet på 2.5.10^/ml og pro-uPA blir syntetisert i løpet av varigheten av kulturen og analysert ved velkjente metoder såsom fibrinolytisk analyse eller IAA-analyse (se 1.6.2). En maksimum konsentrasjon på 20 mikrog/ml ble oppnådd slik det ble testet ved IAA.

El. 4. 3

Kloningeksperimentene beskrevet ovenfor (jfr. El.4.1 og El.4.2) blir gjentatt ved anvendelse av CHO (Kao F.T. , Puck F., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 60, 1275-1281, 1968) eller A 431 (Fabricant R.N. et al, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 74, 565-569; 1977) celler. Transfeksjons/dyrkingsbetingelsene er i vesentlig grad uforandret med unntagelse av substituering av Ham F10 (Flow Labs) som kulturmedium istedenfor DMEM for CHO-cellene.

Enkeltkjede uPA produsert av CHO-cellene transfektert med en RSV-vektor som beskrevet ovenfor blir kalt RSV-CHO-scu-PA mens den som blir produsert av A431 er kalt RSV-A431-scu-PA.

En ny kloning av prouPA produserende mono-lag CHO-kloner og seleksjon av ikke-adhesiv produserende kloner tilveiebragte en klon som hadde evnen til å danne pro-uPA i suspensjon (1,5 mg/l, ved IAA).

El. 5 - Kvantitering av pro- uPA

Mengden pro-uPA som ble produsert av cellelinjene tilveiebragt som beskrevet ovenfor (E 1.4) blir enten analysert via fibrinolyse (se 1.6.2.) eller ved immunoamidolytisk analyse (se 1.6.2). Resultatene fra transfeksjonseksperimentene med ko-transfektering av plasmidet som inneholder genet for neomycin (RSV-neo) under kontroll av lang terminal gjentagelse (Long Terminal Repeat) til Rous Sarcoma-virus (RSV-LTR) og plasmidet inneholdende uPA-genet under kontroll av den samme RSV-LTR (plasmid RSV-uPA) er ført opp i følgende tabell:

Eksempel E2

Produksjon av uPA ved RSV- uPA- BPV- vektorer

I RSVuPA plasmid DNAet restriksjonsendonukleasen Ndel og Apal kutter bare en gang hver (flg. 3), den første spalter i pBR322 avledete regionen nær RSV-promoteren og den andre spalter 1 3'-regionen til uPA-polyadenyleringssetet. Disse to setene kan bli modifisert ved Xhol-linker-behandling for å tilveiebringe, etter Xhol-spalting, et fragment som inneholder RSV-promoteren/uPA-kodende regionen som er egnet for kloning i en vektor som har et Xhol-sete eller Sall-sete.

E2.1.1 - 70 mikrog RSV-uPA DNA blir fullstendig spaltet med 420 TJ Ndel i 300 mikrol i 24 t ved 37° C (analysebetingelser: 150 mM NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 7,8, 7 mM MgCl2, 6 mM w-merkaptoetanol, 100 mikrog/ml BSA). Etter varme-inaktivering, blir NaCl-konsentrasjonen justert til Apal-betingelser (6 mM NaCl, 6 mM Tris.HCl pH 7,4, 6 mM MgCl2, 6 mM 2-merkaptoetanol, 100 mikrog/ml BSA) og DNAet blir fullstendig spaltet med 160 U Apal i 400 mikrol (finalt volum) i 4 t ved 30°C. DNAet blir deretter renset og utfelt som i 1.5.3, på nytt løst opp i 200 mikrol TE og de Ndel-overhengende endene blir fylt med 5 U E.Coli DNA polymerase I ved inkubering av DNA (finalt reaksjonsvolum 25 mikrol) ilt ved 37°C etterfulgt av varme-inaktivering av enzymet (Maniatis et al, s. 113).

E2.1.2 - Ndel/Apal spaltet, butt-endet RSV-uPA plasmid som tilveiebragt ovenfor ble blandet med fosforilert Xhol-linker DNA (molart forhold omtrent 1:50) og inkubert i 18 t ved 8°C, (finalt volum 50 mikrol), som beskrevet i 1.5., etterfulgt av ligase varme-inaktivering. Deretter ble DNAet spaltet med 120 TJ Xhol i 200 mikrol i 4 t ved 37° C og Xhol blir varme-inaktivert .

E.2.1.3 - DNA-fragmentene tilveiebragt ovenfor blri separert ved elektroforese på en etidiumbromid-inneholdende, 0,75$ agarosegel og kjørt 20 t ved 35 V (se 1.5.7 for flere detaljer), de tilvelebragte båndene blir detektert på en UV transillumlnator, hvor det største båndet korresponderer til 8,35 kb RSV-promoter/uPA-kodende regionfragmentet og det minste båndet til 2,45 kb ampicillin-resistens og det replikasjonsorigoinneholdende fragmentet. De to båndene blir skåret ut og renset som i 1.5.7. Det minste båndet blir behandlet med 3 U CIP i 30 min ved 37°C og 30 min ved 56°C og renset og utfelt som beskrevet 1 1.5.2 og 1.5.3. De store og små fragmentene blir blandet i forskjellige molare forhold varierende fra omtrent 1:1 til omtrent 4:1, ligert 3 t ved 14°C og en fraksjon av hver reaksjonsblanding blir anvendt til å transformere E. Coli DH1 kompetente celler som beskrevet i 1.5.8. Bakterier blir latt vokse over natt på ampicillin inneholdende agarskåler, og plasmider fra isolerte kolonier blir analysert for hensiktsmessig restriksjonsfrag-mentmønster og en av dem blir valgt (plasmid p71) hvori det humane uPA-genet satt under RSV-promoter translasjonskontroll kan bli tatt ut fra resten av plasmidet ved spalting med Xhol (fig. 3 nederst).

E2. 1. 4 - BPV- restriksjonssete- modifikasjon

pBPV 230,8 (fig. 4) blir modifisert ved tre forskjellige seter (BamHI, Hind III eller Sali, respektivt) ved innsetting av et unikt Xhol-sete som gjør innsetting av RSV-promoter/uPA-kodende regionen (RSVuPA) lettere. I hvert eksperiment, blir et overskudd av det hensiktsmessige restriksjonsenzymet (BamHI eller Hindlll eller Sali) anvendt for å fullstendig spalte 10 mikrog BPV230.8 DNA i 3 t ved 37° C i 100 mikrol (finalt volum). Enzymet blir varme-inaktivert og DNAet blir renset som beskrevet i 1.5.3, løst opp på nytt I 10 mikrol buffer (50 mM Tris pH 7,2 10 mM MgS04, 0,1 mM ditiotreitol, 50 mikrog/ml BSA; Maniatis et al, s. 113) og gjort butt-endet ved behandling med 5 U Klenow-fragment til E. coli DNA polymerase I i 2 t ved 37°C. Etter polymerase-varme-inaktivering, blir DNAet defosforilert i 50 mikrol

(finalt volum) med 5 TJ CIP i 30 min. ved 37° C og i 30 min til ved 56°C. Deretter blir dette enzymet til slutt inaktivert ved oppvarming I nærvær av EGTA og DNAet blir renset som beskrevet i 1.5.2. og 1.5.3. Til det gjenoppløste, butt-endete, lineære BPV230.8 DNAet, blir merket Xhol linker DNA tilsatt (molart forhold 200:1) og ligert i 50 mikrol (finalt volum) i 15 t ved 8°C i nærvær av 2,5 TJ T4 DNA-ligase (1.5.4). Etter ligase varme-inaktivering, en prøve inneholdende omtrent 1$ av det ligerte DNAet blir spaltet med 8 TJ Xhol, kjørt på elektroforese med en lik mengde DNA fra før og etter ligeringen og analysert som i 1.5.6. Deretter blir saltkonsentrasjonen justert til lOOmJM NaCl og pHen blir justert til omtrent 7,5 (Maniatis et al, s. 104 og Biocheml-cals for Molecular Biology; Boehringer Mannheim, Munich 1985 ), DNAet blir spaltet med Xhol, 1 t ved 37° C i 200 mikrol, applisert på en 0,6$ agarosegel, og elektroforese blir kjørt og båndet som korresponderer til det lineære plasmidet blir skåret ut, elektroeluert og renset som i 1.5.7. Det lineære DNAet blir selv-sammensmeltet ved ligering og anvendt for å transformere kompetente E. coli DH5-celler (BRL) (se 1.5.8). Plasmider fra kolonier isolert etter over natt inkubering på ampicillin-inneholdende agarskåler blir screenet ved miniprep-analyse (1.5.9) for nærvær av det nye Xhol-setet. Det følgende pBPV230.8 avledete plasmidet ble tilveiebragt (fig. 5, i midten): - pBB, hvori et Xhol-sete blir dannet ved BamHI-posisjonen og er flankert av to BamHI-seter; - pBS, hvori et Xhol-sete blir dannet ved Sall-posisjonen og er flankert av to Sall-seter; - pBH, hvori et Xhol-sete blir dannet ved Hindlll-posisjonen.

E2.1.5 - I forskjellige eksperimenter blir 50 mikrog av hver av pBB, pBH og pBS DNAer fullstendig spaltet med et overskudd av Xhol (Sali når det gjelder pBS) i 50 mikrol, ved 37°C i 2 t, enzymet blir varme-inaktivert, og det lineariserte plasmid DNAet blir defosforilert med 1TJ CIP som beskrevet i 1.5.4. Etter enzym-varme-inaktivering blir DNAet applisert på en etidiumbromid-inneholdende, 0,6$ agarosegel og elektroforesen blir kjørt 1 16 t ved 30V. Et hoved DNA-bånd som korresponderer til det monomere lineære plasmidet blir elektroeluert, renset og på nytt løst opp som beskrevet i 1.5.7. På lignende måte blir 50 mikrog p71 plasmid DNA fullstendig spaltet med 80U Xhol, enzymet blir varme-inaktivert, og blandingen blir applisert på en etidiumbromid-inneholdende 0,6$ agarosegel og elektroforesen blir kjørt i 16 t ved 30 V. Geldelen med båndet på 8.35 kb, som inneholder RSV-promoter/uPA kodende regionkonstruksjonen, blir elektroeluert, renset og på nytt løst opp som beskrevet i 1.5.7. BPV vektor-DNA (fig. 5, i midten) og Innskudd-DNA (fig. 3, nederst) blir blandet i forhold varierende fra 2:1 til 1:4 og ligert med 2U/prøve T4 DNA ligase i 24 t ved 15"C og ved en DNA-konsentrasjon på omtrent 0,2 mikrog/mikrol. Reaksjonsmediumet blir justert med buffer og det ligerte DNAet blir spaltet ilt ved 37" C med 20 U Xbal i 15 mikrol (finalt volum). (Analysebetingelser: 50 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl pH 7,9, 6 mM MgCl2, 100 mikrog/ml BSA). Dette enzymet spalter ikke RSV/uPA konstruksjonen og spalter bare BPV230.8 avledete vektorer. Etter Xbal varme-inaktivering blir den tilveiebragte DNA-blandingen fortynnet 1 til 5 med vann, 10x ligeringsbuffer blir tilsatt og inkubert 2 t ved 14°C med 2.5 U T4 DNA-ligase. En 5 mikrol prøve fra hvert reaksjonseksperiment blir anvendt for å transformere E. Coli DH5 kompentente celler (1.5.8.) Disse bakteriene blir latt vokse over natt på ampicillin-inneholdende agarskåler ved 37°C og prøver fra de resulterende koloniene blir analysert ved mlniprep analyse (se 1.5.9). Plasmider fra isolerte kolonier med riktig restriksjons-mønster blir valgt (1.5.9, fig. 5 nederst).

E. 2. 1. 6. - Transfeksjon/ massekultlvering

Transfeksjonseksperimenter i murine LB6-celler blir utført som beskrevet under E.1.4.1 og de høyest produserende cellene blir massekultivert som beskrevet i E.l.4.2.

E. 2. 1. 7. - Kvantitering av uPA

Mengden uPA produsert av cellene transfektert i henhold til E.2.1.6 blir beregnet som beskrevet under E.1.5. Transfek-sjonene som ble gjort ko-transfektering av RSV-Neo plasmid-inneholdende genet for neomycin (neo) under kontroll av lang terminal gjentagelse til Rous Sarcoma Virus (RSV-LTR) og de BPV-avledete vektorene inneholdende RSV-uPA-kassetten (fig. 3, nederst) (se E 2.1.5) ga neo-resistente, pro-uPA-produserende kloner med pro-uPA-nivået varierende mellom 1.3 mikrog/ml og 26 mikrog/ml. Enkeltkjede uPA som ble produsert av disse cellene blir kalt BPV-LB6-scu-PA. Dataene som vedrører disse eksperimentene er rapportert nedenfor:

Eksempel E3

Rensing og karakterisering av pro- uPA

Supernatanter til dyrkede transformerte celler (se El.4.2) blir hver for seg renset og deretter analysert for å bekrefte deres hoved-strukturelle trekk. Den elektroforetiske adferden til RSV-LB6-SCU-PA, RSV-A431-SCU-PA, RSV-CHO-scu-PA, og BPV-LB6-scu-PA blir sammenlignet parallelt med scu-PA med humant urinopprinnelse og scu-PA fra A431 ikke-transformerte celler (A431-scu-PA).

E3. 1 - Rensing av pro- uPA

3Fll-scu-PA (RSV-LB6-SCU-PA), RSV-A431-sc-uPA, RSV-CHO-sc-uPA og BPV-LB6-sc-uPA (Se El. 4.2) blir hver for seg renset fra cellekultursupernatanter ved immunoaffinitetskromatografi på JMab5B4-agarose og ionebytte FPLC ved hovedsakelig å følge fremgangsmåten som er blitt beskrevet for rensing av A431-uPA fra A431 svulstcellesupernatanter (Corti A., Nolli M.L. , Soffientini A., Cassani G, Purification and characterization of single-chain urokinase-type plasmlnogen activator from human A431 cells, Throm Haemostas 1986; 56:219-224).

En agarosemodifisert matrise som bærer et monoklonalt antistoff som binder urokinase med høy molekylvekt uten binding av den lavmolekylære formen (MAB 5B4-agarose, 2,6 cm x 8,6 cm, fremstilt i henhold til konvensjonelle metoder som beskrevet av Corti A. , Nolli ML. , Soffientini A. og Cassani G. i Throm Haemostas 1986; 56:219-24), blir ekvilibrert med 0,15 M natriumklorid, og 0,05 M natriumfosfatbuffer pH 7,4 inneholdende 1% polyetylenglykol (PEG) 6000. Kolonnen blir påført 24 liter scu-PA-inneholdende cellesupernatant (se ovenfor og El.4.2) med en elueringshastighet på 220 ml/t, ved 4°C, og deretter vasket med ekvilibrerende buffer.

Desorpsjon blir utført med 1 M natriumklorid og 0,1 M eddiksyre inneholdende 1$ PEG 6000. Alle fraksjonene blir testet ved IAA og de fraksjonene som inneholder scu-PA blir samlet, slått sammen og videre renset og konsentrert ved ionebyttekromatografi i et FPLC (rask protein væske kromatografi) system (Pharmacia Fine Chemicals, Sverige) ved anvendelse av en Mono S HR5/5 kolonne (sterk kationbytter basert på kuleformige hydrofile harpiks med snever partikkel-størrelsesdistribusjon; ladet gruppe er -CH2SO3) pre-ekvilibrert med 0,05 M natriumacetatbuf f er, pH 4. Prøven blir vanligvis fortynnet to ganger med destillert vann for å redusere ionestyrken og deretter applisert på kolonnen. Etter vasking med ekvilibrerende buffer, blir de bundne proteinene eluert med en salt/pH lineær gradientblanding av buffer A (0,05 M natriumacetatbuffer, pH 4) og buffer B (1 M natriumklorid, 0,05 natriumacetat, pH5) fra 30 til 70$ B i A i 50 min., deretter 100$ B i 20 min.; elueringshastighet, 60 ml/t. 3F11 (RSV-LB6) cellesupernatanter tilveiebragte 0,034 mg/l enzymatisk aktivt uPA antigen, og 0,870 mg/l enzymatisk uaktivt, plasminaktiverbart uPA-antigen målt ved immunoadsorbent-amidolytisk analyse (IAA) (se 1.6.2.) Mengdene enzymatisk aktivt og inaktivt uPA (pro-uPA) utvunnet hvert trinn er rapportert i tabell 2. Omtrent 0,95 mg aktivt uPA og 15,5 mg plasma aktiverbart uPA ble utvunnet fra 24,1 3F11 supernatanten som korresponderer med utbytter på 116$ og 73,8$ respektivt, beregnet ved IAA. Det enzymatisk aktive uPA i det endelige produktet utgjorde 5,8$ av det totale. Revers-fase FPLC analyse av 3Fll-scu-PA resulterte i en enkel absorbans-topp ved 280 nm med den samme retensjonstiden som A431scu-PA og urin-scu-PA (jfr. 1.6.1).

Lignende resultater blir tilveiebragt når cellesupernatanter (jfr. El.4.2) fra PSV-A431-scu-PA, RSV-CHO-scu-PA og BPV-LB6-scu-PA produserende celler blir utsatt for denne rensnings-prosedyren.

E3. 2 - Strukturell karakterisering av scu- PA

E3. 2. 1 - Molekylvekt og immunoreaktivitet

Stoffet renset fra 3F11 celle-supernatantene (3F11 scu-PA)

(se El.6) blir analysert ved SDS-PAGE og immunoblotting for å bestemme renheten, molekylform og immunologiske egenskaper. SDS-PAGE (se 1.6.4) av 3F11-UPA under ikke-reduserende betingelser tilveiebragte et 52.000 Mv-bånd som etter blotting på nitrocellulosemembran immunoreagerte med kanin anti-uPA antiserum og forskjellige monoklonale antistoffer mot forskjellige epitoper av urin uPA, såsom Mab5B4, Mab 105IF10 og Mab 52C7 (se 1.6.4). Et lignende immunoreaktivi-tetsmønster ble også tilveiebragt med naturlig urin-scu-PA

(1.6.1) som indikerer at 3F11 scu-PA er immunologisk nært knyttet til human-urin scu-PA. SDS-PAGE av 3Fll-uPA under reduserende betingelser tilveiebragte et hovedbånd ved 50.000 Mv som korresponderer til mere enn 90$ av totalt protein, og to mindre bånd ved 33.000 Mv og 20.000 Mv. Alle båndende immunoreagerte med anti-uPA antiserum på Western blot, som indikerer at stoffet renset fra 3F11 celle-supernatantene besto hovedsakelig av en enkelt-kjede uPA (3F11 scu-PA) 50.000 Mv-bånd med mindre enn 10$ to-kjede uPA (3Flltcu-PA), 33.000 Mv og 20.000 Mv bånd.

E3. 2. 2 - Kjedestruktur og glykosylering

Den molekylære formen til 3Fll-scu-PA (RSV-LB6-uPA), RSV-A431-scu-PA, RSV-CHO-scu-PA og BPV-LB6-scu-PA blir undersøkt etter aktivering med plasmin (jfr. 1.6.2). Alle stoffene nevnt ovenfor (scu-PAer) blir totalt omdannet av plasmin til 52.000 Mv to-kjede proteiner (tcu-PAer) som er laget av en 20.000 Mv A-kjede og en 33.000 Mv B-kjede som beregnet ved SDS-PAGE under reduserende betingelser. Molekylvekt og kjedestruktur til rekombinante scu-PAer ble sammenlignet med naturlig urin scu-PA (1.6.1) før og etter behandling med plasmin og glykopeptidase F eller med plasmin og neuraminidase (se 1.6.5).

Den elektroforetiske mobiliteten til hver av de ovenfor rapporterte rekombinante scu-PAer under ikke-reduserende betingelser er noe lavere enn urin-scu-PA som tilsvarer en forskjell på 1000-2000 i molekylvekt (se figur 11). Et lignende resultat ble tilveiebragt under reduserende betingelser. Molekylvekten til B-kjede tcu-PAer, beregnet på basis av dets mobilitet, resulterte i 32.000-33.000 Mv mens molekylvekten til B-kjede urin-tcu-PA resulterte i 31.000 Mv (se figur 12). Ingen forskjeller ble observert på A-kjedene (20.000 Mv). Når alle scu-PAene ble behandlet med glykopeptidase F for å hydrolysere de N-glykosidholdige båndene (Steffens G.J., Gtlnzler W.A. , Otting F., Frankus E. , Flohe L. The complete aminoacid sequence of low molecular mass urokinase human urine, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1982, 363, 1043-1058) ble like bånd på 30.000 Mv observert for B-kjedene for alle proteinene (se figur 13). Disse dataene foreslår at forskjellene i elektroforetisk mobilitet til rekombinante scu-PAer og urin-scu-PA er relatert til forskjellig sukkerinnhold. Denne forskjellen i sukkerinnhold ble bekreftet ved behandling av de ovenfor nevnte scu-PAene med neuraminidase (se 1.6.5), et enzym som selektivt spalter de terminale sialinsyreresidiene til glykoproteinene. Etter inkubering med plasmin og deretter med neuraminidase, viste urin scu-PA ikke noen detekterbare forskjeller i både A og B-kjedene sammenlignet med urin scu-PA behandlet med bare plasmin. B-kjede til rekombinant scu-PAer viste derimot, ved samme betingelser, en elektroforetisk mobilitet som er en mellomting mellom ubehandlet protein og fult deglykosylert protein (se figur 14). Disse proteinene har derfor forskjellig sialinsyreinnhold.

E3. 2. 3 - Isoelektrisk fokusering

3Fllscu-PA og RSV-A431-scu-PA ble utsatt for IEF (se 1.6.6.) sammenlignet med A431scu-PA og urin scu-PA. Flere isoelektriske former ble observert for alle proteinene; minst seks isoelektriske former med pl 8,75, 8,85, 9,0, 9,1, 9,15, og 9,25 ble observert for 3Fllscu-PA og RSV-A431-scu-PA mens bare fire isoelektriske former på pl 9,1, 9,15, 9,25 og 9,3 ble observert for A431scu-PA. Urin scu-PA presenterte alle båndende observert med 3Fllscu-PA og A431scu-PA, men med forskjellige mengder.

E3. 2. 4 - Aminosyresekvensanalyse

A) Den N-terminale aminosyresekvensen (18 residier) av 3Fllscu-PA ble analysert ved automatisert Edman degradering (se 1.6.7). Den tilveiebragte sekvensen er rapportert i fig. 10. Som vist, er sekvensen til 3Fllscu-PA identisk med naturlig human urin scu-PA og A431scu-PA (Kasai S. , Arimura H. , Nishida TM. , Suyama T. Primary structure of single-chain pro-urokinase, J. Biol. Chem. 1985; 260/12382-12389), og klart forskjellig fra muse scu-PA (Belin D., Vassalli J.D., Combepine C, Godeau F., Nagamine Y. , Reich E. , Kocher H.P., Duvoisin R., Cloning, nucleotide sequencing and expression of cDNAs encoding mouse urokinase-type plasmlnogen activator, Eur J. Biochem. 1985, 148, 225-232). B) En kinetisk analyse av spalting av 3Fllscu-PA med karb-oksypeptidsase Y (se 1.6.8) viste den C-terminale sekvensen Ala-Leu(C00H), som svarer til human urin sc-uPA (Kasai S. , Arimura H, Nishida M, og Suyama T Primary structure of single-chain pro-urokinase, J. Biol. Chem. 1985, 260, 12382-12389 ).

E3. 2. 5 - Interaksjon mellom u- PA og PAI- 1

Human endotel plasmlnogen aktivator inhbitor (PAI-1) reagerer med tcu-PA og danner et 1:1 molart kompleks som I et annet trinn blir kovalent, som dermed forhindrer den proteolytiske aktiviteten til tcu-PA (Bachmann, F, Fibrinolysis, In: Thrombosis and Haemostasis 1987, publisert av M. Verstraete, J. Vermylen, H.R. Lljnen og J. Arnout, International Society on Thrombosis and Haemostasis and Leuven University Press, Leuven 1987, s. 227-265). Vi har undersøkt grad av inhibering av de ovenfor rapporterte uPAene (RSV-LB6-scuPA, RSV-A431-scuPA, RSV-CHO-scuPA og BPV-LB6-scuPA etter plasminaktivering) ved PAI-1 (se 1.6.9). Økende mengde PAI-1 ble dermed preinkubert med en fastsatt mengde plasmin-aktivert tcu-PA (se 1.6.2) og den gjenværende plasminogenaktivator-aktiviteten blir målt med en indirekte analyse, ved anvendelse av det plasmin-spesifikke substratet S-2251. Dose-responskurver av inhibering (prosentandel aktivitet uten PAI-1 som en funksjon av PAI-1 konsentrasjon) er plottet. Med 1,7 ng/ml, uPA 50$ inhibering av aktiviteten ble oppnådd i alle tilfellene med 6-8 ng/ml PAI-1, alle tcu-PAene viste lignende kurver.

E3. 3 - Enzymatisk aktivitet

E3. 3. 1 - Flbrlnolytisk aktivitet

Den enzymatiske aktiviteten til 3Fllscu-PA ble beregnet etter omdanning til enz<y>matisk aktivt 3Flltcu-PA ved behandling med plasminagarose (se 1.6.2). Immobilisert plasmin kan lett bli separert fra det aktiverte enzymet ved sentrifugering, som dermed unngår mulige innblandinger i påfølgende analyser. Den spesifikke fibrinolytiske aktiviteten til 3Flltcu-PA, beregnet ved fibrinplatemetoden, resulterte i 117225 IU/mg (se tabell 2). Dette resultatet stemmer bra med de rapporterte verdiene for A431tcu-PA (Corti A, Nolli ML, Cassani G, Differential detection of single-chain and two-chain urokinase type plasmlnogen activator by a new immunoadsorbent amidolytic assay (IAA), Throm Haemostas 1986; 56, 407-410).

E3. 3. 2 - Kinetisk analyse

3F11-scu-PA (RSV-LB6-scuPA), RSV-A431-scuPA, RSV-CHO-scu-PA og BPV-LB6-scu-PA ble sammenlignet med urin scu-PA og A431-scu-PA for deres kinetiske adfersel i rensede systemer (se 1.7.1, 1.7.2 og 1.7.3). Aktivering av scu-PAer til tcu-PAer ved plasmin (tabell 3), og evnen som plasmin-aktiverte uPAer har til å hydrolysere det kromogene substratet S-2444 (tabell 4) og til å aktivere plasmlnogen (tabell 5) ble undersøkt med en Lineweaver-Burk type analyse. I alle tilfellene viste de forskjellige scu-PAene en lignende kinetisk adferd! med sammenlignbare verdier av Michaelis-Menten konstant (Km) og den katalytiske konstanten (kca-t;).

Eksempel E4

Konstruksjon av modifiserte derivater av den humane uPA promoterreglonen

E4. 1 - Konstruksjon av plasmid puPA2

50 mikrog lambda-uPAl DNA fremstilt som beskrevet i EO.3 blir spaltet i 100 mikrol (finalt volum) med 30 U Smal i den hensiktsmessige bufferen i 60 min. ved 30°C. 500 ng av det tilveiebragte DNAet blir analysert på en etidiumbromid-inneholdende 1$ agarosegel mens det gjenværende blir lagret ved -20°C. Enzymet blir deretter varme-inaktivert ved 68°C (10 min) og det resulterende DNA-preparatet blir deretter applisert på en etidiumbrom-inneholdende 0,8$ preparativ agarosegel. Den elektroforetiske separasjon blir kjørt i 20 t ved 50 v i TBE-buffer (Maniatis et al, kap. 5) og DNA-båndene blir visualisert på en UV transillumantor med medium-lengde. Et bånd på omtrent 2,38 kb som inneholder pro-uPA promoteren blir skåret ut og DNAet elektroeluert og renset som beskrevet i 1.5.7. 50 mikrog pEMBL8CAT DNA (fig. 6) blir på lignende måte spaltet i 1 time ved 30° C med 30 U Smal i 25 mikrol (finalt volum). 64 mikrol vann, 10 mikrol CIP 10X buffer og 1 U CIP i 1 mikrol (finalt volum) blir tilsatt og reaksjons-blandingen blir videre inkubert i 60 min. ved 37°C. CIP blir inaktivert ved tilsetting av EGTA og oppvarmet som beskrevet i 1.5.4 og DNAet blir renset på en etidiumbromid-inneholdende, 0,8$ agarosegel under de samme betingelsene som beskrevet I 1.5.7. 1,5 mikrog 2,38 kb lambda-uPAl avledet fragment og 500 ng linearisert, defosforylert pEMBL8CAT DNA som fremstilt ovenfor blir blandet sammen og ligert i 20 mikrol hensiktsmessig buffer inneholdende 10$ PEG og 2 U T4 DNA-ligase i 20 t ved 14"C. 5 mikrol av denne reaksjonsblan-dlngen blir deretter anvendt for å transformere kompetente HB101 E. Coli celler som beskrevet i 1.5.8. Ampicillin-resistente kolonier blir analysert, og blandt de som inneholder innskuddet ved riktig orientering, blir en valgt og betegnet puPA2. (Fig. 6 til høyre).

E4. 2 - Konstruksjon av puPA2/ 41 plasmid

Optimale betingelser for å oppnå en Smal delvis spaltet, linearisert form av puPA2 DNA fremstilt ovenfor blir under-søkt ved spalting av 250 ng av dette plasmidet respektivt med 1,0, 2,0, 3,0 og 4,0 U Smal i 10 mikrol (finalt volum) av hensiktsmessig buffer. 50$ (v/v) av hver reaksjonsblanding blir overført til et annet rør og fryst i et tørr is/etanol-bad etter 6 min ved 30°C, mens de gjenværende porsjonene blir frosset etter inkubering i 9 min lenger. Deretter blir hver fryste prøve bragt til 10 mM med EDTA, enzymet blir varme-inaktivert og DNAet blir analysert på en etidiumbromid-inneholdende, 1$ agarose minigel. Gode resultater blir opprettholdt ved inkubering med 2 U i 15 min og med 3 U i 6 min. Deretter blir en preparativ spalting satt opp som følger: 5 mikrog puPA2 DNA blir spaltet med 40 U Smal i 50 mikrol hensiktsmessig buffer, reaksjonen blir stoppet ved tilsetting av 1 mikrol 500 mM EDTA og frosset. Etter varme-inaktivering av det tilsattet enzymet, blir dette puPA2 DNA-preparatet blandet med 2,25 mikrog Xhol-linker, fosforylert som beskrevet i 1.5.6 og ligert i 86 mikrol reaksjonsblanding inneholdende 10$ PEG 1500 og 2,5 U T4 DNA-ligase, og ble først inkubert 6 t ved 7°C og deretter ble temperaturen sakte øket til 17° C og inkuberingen ble fortsatt i 10 timer. Ligeringsenzymet blir varme-inaktivert, og 10$ av det ligerte DNAet blir spaltet med 55U Xhol i 2 t ved 37° C PRTin 20 mikrol (finalt volum), dette enzymet blir deretter varme-inaktivert og DNAet utfelt som indikert i 1.5.3. Det utfelte DNAet blir på nytt løst opp i 4 mikrol TE (Maniatis et al), 1 mikrol 1U T4 DNA-ligase inneholdende 5X ligeringsbuffer (Maniatis et al), blir tilsatt, blandingen blir latt stå for å selv-ligere ved 15°C i 2 t 30 min og deretter anvendt for å transformere HB101 kompetente E. Coli-celler (1.5.8). Ampicillin-resistente kolonier blir screenet ved miniprep-analyse. En av disse, med Smal-setet (som flankerer 5'-enden til uPA-promoteren inneholdende 2.38kb innskuddet) omdannet til et Xhol-sete (fig. 8) blir kalt puPA2/41.

E4. 3 - CAT analyse

puPA2, dets derivat puPA2/41 og RSV-CAT ble analysert for deres evne til å drive transkripsjon av CAT-genet. Plasmid DNAene blir transfektert inn i den humane A1251-celle-linjen (1.1) som var avledet fra en nyresvulst (Stoppelli M.P., Verde P., Grimaldi G. , Locatelli E.K. , Blåsi F., J. Cell Biol. 1986, 102, 1231-1241) ved kalsiumfosfat-utfellings-prosedyren og nivåene av CAT-proteinet som muligens blir produsert i de transfekterte cellene blir målt etter 64 ± 4 timer.

E4. 3. 1 - Rensing av plasmid DNA

Plasmid DNAene blir renset ved anvendelse av alkalisk lyse-medoten som beskrevet ved Birnboim H.C. og Doly J., 1979, Nucleic Acids Res. 7, 1513 (også rapportert i Maniatis et al, s. 90) fra en 400ml LB medium over natt kultur av hver bakterielle klon. Plasmid DNAet som ble tilveiebragt på denne måten blir deretter renset to ganger på etidiumbromid CsCl-gradienter, hvor båndet som inneholdt plasmid DNAet blir samlet ved punktering, og omfattende ekstrahert med isoamylalkohol (Maniatis et al, s. 93-94). DNAet som inneholder den vannholdige CsCl-oppløsningen ble deretter fortynnet 1:4 med vann og DNAet blir utfelt ved tilsetting av 0,1 vol 3M natriumacetat pH 5,2 og 3 vol etanol. Etter henstand av blandingen i 30 min ved -20"C, blir DNA-fraksjonene spunnet ned ved lOOOOXg i 15 min ved 4°C, vasket en gang med 70$ etanol og en gang med 100$ etanol, tørket, løst opp i 2ml TE, utfelt på nytt og vasket på samme måte og til slutt løst opp på nytt i 1 ml TE (Maniatis et al). 0.D.260blir målt og konsentrasjonen blir justert til omtrent 500ng/mikrol, undersøkt på minigel og på nytt målt ved spektrofotometri. Til slutt blir plasmid DNAene fortynnet 1:1 med absolutt etanol og lagret ved -20°C.

E. 4. 3. 2 - Utfelling ved kalsiumfosfatprosedyre

For hver 60mm Petri-skål som skulle bli transfektert, 40 mikrol DNA-etanol/TE-oppløsning, ekvivalent med 10 mikrog DNA, blir tørket i en Savant-vakuum sentrifuge og på nytt løst opp i 220 mikrol vann. 30 mikrol 2M CaCl2(fra Mallin-krodt eller Merck) blir tilsatt og raskt blandet. 250 mikrol 2X HBS (lOg/1 HEPES, 4-(2-hydroksyetyl)-l-piperazin etansul-fonsyre, 16 g/l NaCl, pH 7,1 ± 0,05, steril) og 5 mikrol 100X P04(70 mM Na2HP04og 70mM NaH2P04, steril) ble blandet og DNA/CaCl2oppløsningen blir sakte tilsatt dråpevis med omfattende bobling med en Pasteur pipette. Denne blandingen ble deretter latt stå ved romtemperatur i 30 min (Graham og Van der Eb, VIrology, 52, 456; 1984).

E4. 3. 3 - Transfeksjon av A1251- celler

A1251-celler blir dyrket nesten til konfluens i fullstendig medium [DME-medium (Gibco) supplementert med 10$ føtalt kalveserum (Hyclone) og 1$ antibiotika-oppløsning (Gibco)] i 5$ CO2fukt-inkubator ved 37°C. 24 timer før transfeksjon, blir cellene adskilt i 60mm Petri-skåler med IO<5>celle/skål og på ny matet med friskt medium 4 til 6 timer før transfeksjon. Ved tg blir utfelt DNA tilsatt og blandingen latt stå i 16 til 18 timer i inkubator. Etter inkubering over natt, blir cellene vasket en gang med DME (7,2) deretter på nytt supplementert med fullstendig medium, latt stå i inkubatoren for å fullføre inkubasjonen og høstet. I eksperimenter som blir kjørt i triplikat, blir alle trinnene etter oppløsning av tørket DNA utført separat for hver prøve. De høstede cellene blir anvendt i påfølgende trinn.

E. 4. 3. 4 - Preparering av celle- lysater

64 ± 4 timer etter tilsetting av utfelt DNA, blir cellene (fremstilt i E 4.3.3) vasket 3 ganger med et fosfatbufret saltvann (PBS) fri fra Ca<++>(80 g NaCl, 2 g KC1 , 11,5 g Na2HP04.2H20, 2 g KH2P04per 1 liter destillert vann, bragt til pH 7,2) deretter blir 1 ml STE (lOOmM NaCl, lOmM TRIS, ImM EDTA) tilsatt og blandingen blir latt stå ved romtemperatur 1 5 min. Etterpå blir cellene skrapet av med en gummi-spatel og overført til et Eppendorf-rør, spunnet ned i en mikrosentrifuge i 3 min ved 4°C og resuspendert i 100 mikrol Tris 250mM pH 7,8. Cellesuspensjonen blir latt stå i 15 min i et tørris/etanol-bad og deretter overført til et 37°C-bad; denne fryse/tine-syklusen blir gjentatt to ganger, celle-kjernene blir spunnet ned i mikrosentrifuge ved 4<0>C i 5 min og supernatanten blir overført til et nytt rør. For å unngå mindre forskjeller i proteininnhold i hver prøve forårsaket av en mulig liten forskjell i celleantall fra plate til plate, blir proteinkonsentrasjonen bestemt ved å beregne 10 ml fra hver prøve i henhold til Lowry-metoden (se E.1.6). De gjenværende delene av lysatene blir lagret ved -20°C helt til de blir anvendt i CAT-analysen.

E4. 3. 5 - CAT- analyse

Et volum inneholdende 100 mikrog protein fra hvert lysat ble bragt til 133,5 mikrol vann og 44 mikrol av en oppblandet oppløsning inneholdende 22,5 mikrol 2M Tris pH 7,8, 20 mikrol av en nylaget oppløsning av 3 mg/ml acetylCoA (Sigma) og 1,5 mikrol radioaktiv<14>C-kloramfenikol (50-60 mCi/mmol, fra Amersham) blir tilsatt. Blandingen blir inkubert ved 37°C i 1 t, deretter blir reaksjonen stoppet ved tilsetting av lml etylacetat og vorteksbehandling. De to fasene som dannes blir separert i en Eppendorf mikrosentrifuge (5 min) og den organiske fasen blir overført til et nytt Eppendorf-rør, fordampet i en Savant-vakuumsentrifuge, gjenoppløst i 20 mikrol etylacetat og analysert ved TLC på 0,25-1 mm silisiumoksyd-gelplater (Kodak). TLC blir kjørt i 2-3 t ved kloro-formrmetanol (HPLC-kvalitet), 95:5 som mobil fase, og de radioaktive flekkene som korresponderer til merket antibiotika blir visualisert ved autoradiografi. Områdene av kromatogrammet som korresponderer til de radioaktive flekkene blir skåret ut, plassert i en beholder med 5ml egnet scintil-lasjonsoppløsning såsom Econofluor, (New England Nuclear) og radioaktiviteten blir målt i en beta-teller. Resultatene er vist i tab. 3 nedenfor.

E4. 4. 1 - Konstruksjon av plasmid puPA2/ 17

300 ng puPA2/41 DNA (se E3.2) blir fullstendig spaltet med 4.2 U OksaNI i 4 t ved 37" C i hensiktsmessig buffer (100 mM NaCl, lOmM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM 2-merkaptoetanol, 100 mikrog/ml BSA). DNA-restriksjon blir undersøkt på en etidiumbromid-inneholdende minigel (1.5.1) og enzymet blir inaktivert ved oppvarming i 10 min ved 68° C. 2 mikrol vann, 1,5 mikrol 10X buffer (se 1.5.5) og 1,5 mikrol T4 DNA-ligase blir tilsatt og blandingen inkubert ved 15°C i 18 t. 2,5

mikrol av denne blandingen blir anvendt for å transformere E. Coli EB101 kompetente celler (1.5.8). Ampicillin-resistente kolonier blir analysert ved miniprep-analyse (1.5.9). De som har riktig restriksjonsmønster blir valgt og en av dem kalt puPA2/17. (Fig. 8).

E4. 4. 2 - Konstruksjon av plasmid puPA2/ 254

4 mikrog puPA2/41 DNA (se fig. 8) blir fullstendig spaltet med 5U EcoRV i 10 mikrol hensiktsmessig buffer (50 mMNaCl, 10 mM Tris HC1, 10 mM MgCl2og 1 mM ditiotreitol), (Maniatis et al) ved 37° C i 2 t, deretter blir en blanding av 7 mikrol vann, 2 mikrol 0,5 M Tris pH8 og 1U CIP og 1 mikrol buffer (Maniatis et al) tilsatt. Blandingen blir inkubert 1 t ved 37°C, EGTA blir tilsatt til en final konsentrasjon på lOmM og blandingen blir inkubert med 68° C i 45 min. DNAet blir utfelt, vasket og tørket som beskrevet i 1.5.3 og til slutt løst opp på ny i 7,5 mikrol TE (Maniatis et al). DNAet blir fullstendig spaltet med 4,2 U OksaNI i 4 t ved 37° C i 10 mikrol (finalt volum) og 5'-endene blir fylt inn med 1U Klenow fragment til DNA Poll (20 mikrol, finalt volum) ved 37°C ilt. DNAet blir deretter utfelt (1.5.3) og resuspendert i 7,5 mikrol TE (Maniatis et al). 0,5 mikrol 100 mM ATP, 1 mikrol 10X buffer (se 1.5.5) (Maniatis et al) og 2,5U T4 DNA-ligase (1 mikrol, finalt volum) blir tilsatt og blandingen blir inkubert i 18 t ved 15°C. Deretter blir 2,5 mikrol av denne blandingen anvendt for å transformere E. Coli HB101 celler (1.5.8), bakteriene blir sådd ut på ampicillin-inneholdende LB-skåler (Maniatis et al). Koloniene som har riktig restriksjonsmønster blir valgt og en av dem blir kalt puPA2/254 (fig. 8).

E4. 4. 3 - CAT- analvse

puPA2/41, dets delesjonsderivater puPA2/17 og puPA2/254 og RSV-CAT blir testet for deres evne til å drive transkripsjon av CAT-genet. Plasmid DNAene blir transfektert i A1251-

cellelinjene (1.1) ved anvendelse av kalsiumfosfat-presipita-sjonsteknikken og CAT-intracellulære nivået blir målt etter 64 ± 4 timer. Rensing av plasmid DNA, utfelling ved kalsiumfosfat, celletransfeksjon, preparering av cellelysater og CAT-analyse blir utført i vesentlig grad som beskrevet i E4.3. Resultatene er vist nedenfor:

TABELL

A1251

RSV-CAT 100

puPA2/41 128

puPA2/17 303.8

puPA2/254 378.5

E4. 5 - Konstruksjon av uPA- avledet ekspresjonsvektor

Det bakterielle CAT-genet kan bli tatt ut fra plasmidene puPA2/41, puPA2/17 og puPA2/254 for å anvende dem som ekspresjonsvektorer. Modifikasjonene vil fortrinnsvis konservere den uPA-promoter-avledete sekvensen, uPA TATA-boks, mRNA begynnelsespunkt, og pEMBL8-avledet polylinker. DNA-fragmentene innbefattende disse regionene kan bli tatt ut fra vektoren og satt inn oppstrøms for forskjellige gener som "ekspresjonskassetter". Fra de ovenfor beskrevne plasmidene, ble tre uPA-avledete ekspresjonsvektorer tilveiebragt ved uttaging av det bakterielle CAT-genet: pPP41 fra puPA/41, pPP17 fra puPA2/17; pPP254 fra puPA2/254.

E4. 5. 1 - Konstruksjon av pPP41

25 mikrog puPA2/41 DNA blir delvis spaltet med 4 U Xbal ved 37° C i 45 min og reaksjonen blir stoppet ved tilsetting av EDTA (til lOmM) og varme-inaktivering. Etter utfelling (1.5.3), blir DNAet fylt inn med 2.5U Klenow-fragment fra DNA Poll (endelig volum 20 mikrol) ved 37°C i 1 t, ligert til et 50 molart overskudd Sali linker (1.5.5 og 1.5.6) i 16 t ved 8°C med 2U-ligase og, etter varme-inaktivering av enzymet, fullstendig spaltet ved 37° C i 2 t med et overskudd Sali. DNA-fragmentene blir kjørt på en 0,75 agarosegel (1.5.7) og geldelen som inneholder et DNA-fragment i området 5-6 kb blir skåret ut. Dette DNAet blir ekstrahert og renset som beskrevet i 1.5.7, resuspendert i 10 mikrol TE og 2 mikrol av denne oppløsningen blir selv-ligert ved 16° C i 4 t med 2U ligase (endelig volum 10 mikrol). 2,5 mikrol av dette DNA-preparatet blir deretter anvendt for å transformere DH5 E.Coli kompentente celler (1.5.8 - 1.5.9). Blant de ampicillin-resistente koloniene blir plasmid pPP41, dvs. et plasmid som mangler regionen som er innbefattet mellom Sall-setet og Xbal-setet nedstrøms for CAT-genet, valgt ved miniprep-analyse (fig. 9B).

E4. 5. 2 - Konstruksjon av pPP/ 17 og pPP/ 254

Ved å vesentlig følge den ovenfor beskrevne fremgangsmåten, blir to ekspresjonsvektorer tilveiebragt ved fullstendig spalting av 10 mikrog puPA2/17 DNA eller 10 mikrog puPA2/254 DNA, respektivt, med 24U Xbal ved 37°C i 2 t. De 5'-overhengende endene av det lineariserte plasmidet blir fylt med Klenow-fragmentet til DNA Poll (2,5U) ved 37°C i 1 t og deretter ligert til et 50 molart overskudd av Sall-linker (1.5.5 og 1.5.6) i 16 t ved 8°C med 2U ligase, og etter varme-inaktivering av enzymet, blir DNAet fullstendig spaltet ved 37° C i 2 t med et overskudd Sali. Deretter blir dette enzymet varme-inaktivert og DNAet utfelt (1.5.3) og resuspendert 1 10 mikrol TE. 2 mikrol av denne oppløsningen blir ligert ved 15°C i 16 t med 2U DNA ligase (finalt volum 10 mikrol) og 2,5 mikrol blir anvendt til å transformere DH5 E. Coli kompetente celler. Blant ampicillin-resistente kolonier, blir plasmid pPP17 og pPP254 valgt, som inneholder uPA-avledete delesjonspromotere og som har de generelle karaktertrekkene beskrevet for pPP41 i E4.5.1 (fig. 9B ).

Eksempel E5

Fremstilling av uPA- avledete minlgener

E5. 1 - Fremstilling av vektorer

Plasmid DNAer fra pPP41, pPP17, pPP254 (20 mikrog hver, fremstilt som beskrevet ovenfor) blir linearisert ved separat spalting med 50 U Smal ved 25° C i 3 t (finalt volum 50 mikrol). Deretter bli de lineariserte plasmidene defosforilert med 1U CIP ved 37°C i lt, renset på 0,8$ agarosegel (se 1.5.3), resuspendert i 20 mikrol TE og lagret ved 4°C.

E5. 2 - Fremstilling av minlgener

Hvert lineariserte defosforilerte plasmid DNA tilveiebragt ovenfor (E5.1) (3 mikrog) blir blandet med 1 mikrog uPA-ORF (dvs. Smal-fragment (7,3 kb) inneholdende den uPA-kodende regionen tilveiebragt som beskrevet i El.l) i 10$ PEG 1500 med 2U ligase (finalt volum 10 mikrol) i 16 t ved 15°C.

2,5 mikrol fra hver reaksjonsblanding blir anvendt for å transformere kompetente E. Coli DH5 celler (jfr. 1.5.8). Blant de ampicillin-resistente koloniene blir plasmid pPP41XS, pPP17XS, og pPP254XS, som er avledet fra pPP41, pPP17 og pPP254, respektivt, valgt ved miniprep-analyse (jfr. 1.5.9) for å ha følgende karaktertrekk (fig. 9C): den uPA-kodende regionen blir satt inn i Smal-setet til uPA-promoteren som inneholder vektoren

uPA mRNA begynnelsessete er det samme som i det humane uPA-genet

de inneholder en pEMBL8-avledet sekvens

de uPA-avledete minigenene kan bli tatt ut fra de vektorene og satt inn i forskjellige vektorer fortrinnsvis ved spalting med Xhol og Sali

de minigenene som er blitt tatt ut kan bli satt inn i

vektorer som enten har et Sali eller et Xhol-sete

minigenene som er blitt satt ut kan bli satt inn i vektorer som har evnen til å opprettholde dem 1 en episomal form når de blir satt inn i en egnet vert

pPP41XS har den uPA-kodende regionen under kontroll av et

2,35 fragment fra uPA-promoteren;

pPP17XS har den uPA-kodende regionen under kontroll av det samme promoterfragmentet tilveiebragt i pPP41XS, men hvori en delesjon er blitt dannet mellom de to OxaNI-setene;

pPP254XS har den uPA-kodende regionen under kontroll av det samme promoterfragmentet som er inne i pPP41XS, men hvori en delesjon er blitt dannet mellom 5'OxaNI-setet og EcoRV-setet.

E. 5. 4. - Transfeksjon/ massekultivering

Transfeksjonseksperimentene i murine LB6-celler blir utført som beskrevet under E.1.4.1. De høyest produserende cellene blir massedyrket som beskrevet i E.l.4.2.

E. 5. 5. - Kvantitering av uPA

Mengde uPA som blir produsert av cellene transfektert i henhold til E.5.4. blir beregnet som beskrevet under E.1.5. Resultatene fra transfeksjoner gjort ko-transfekterende av plasmidet inneholdende genet for resistens mot neomycin (neo) under kontroll av de lang terminale gjentagelsene til Rous Sarcoma Virus (RSV-LTR) og plasmidet inneholdende uPA-genet under kontroll av en uPA-avledet promoter (pPP41XS, pPP17XS ellerpPP254XS) blir rapportert nedenfor (utskilt pro-uPA blir beregnet ved IAA, jfr. 1.6.2; pro-uPA-nivåene fra den RSV-uPA transformerte klonen blir betraktet som 100$):

De fysiske-kjemiske og biologiske karaktertrekkene til utvunnet scu-PA kan ikke skjelnes fra de til RSV-LB6-scu-PA (3F11 scuPA) rapportert ovenfor.

Ved gjentagelse av transfeksjonen og massekultiveringen i CHO eller A431-celler, blir en scu-PA tilveiebragt med de samme kjemiske-fysiske og biologiske trekkene som RSV-CHO-scu-PA eller RSV-A431-scuPA, respektivt.

Claims (33)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av human-type enkelt-kjede glykosylert urokinase (pro-uPA), karakterisert ved at man transformerer en dyrecelle med en ekspresjonsvektor som inneholder den uPA-kodende genomiske sekvensen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den uPA-genomiske sekvensen er et DNA-fragment på omtrent 7.3 kb som man oppnår ved delvis Smal-spalting av et genomisk DNA klonet inn i en egnet kloningsvektor.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at kloningsvektoren er bakteriofag lambda.

4 . Fremgangsmåte ifølge kravene 1, 2 eller 3, karakterisert ved at dyrecellene er pattedyrceller.

5. Fremgangsmåte ifølge kravene 1, 2, 3 eller 4, karakterisert ved at man velger dyrecellene fra etablerte humane, murine, hamster, og apekatt cellelinjer.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at man velger cellelinjen fra murine LB6, kinesisk hamster ovarie (CHO) og humane epidermoide svulst-celle-1inj er.

7. Fremgangsmåte ifølge kravene 1, 2, 3, 4, 5 eller 6, karakterisert ved at den uPA-kodende sekvensen er under kontroll av den humane uPA-promoter eller et derivat derav med human opprinnelse.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved den humane uPA-promoteren har sekvensen representert i fig. 7 eller en allel form derav.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at den humane uPA-promoteren er et 2.38 Kb fragment tilveiebragt ved Smal-spalting av et genomisk DNA klonet inn i en egnet kloningsvektor.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at kloningsvektoren er bakteriofag lambda.

11. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 10, karakterisert ved promoteren er et delesjonsderivat av den humane uPA-promoteren.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at det humane uPA-promoterderivatet er et delesjonsderivat som mangler fragmentet på 0,6 Kb spaltet av OxaNI mellom omtrent - 1827 bp og -1202 bp eller et delesjonsderivat som mangler fragmentet på 1.29 Kb mellom OxaNI-setet ved omtrent - 1827 bp og EcoRV-setet ved omtrent - 537 bp.

13. Promotersekvens for anvendelse til uttrykking av en kodende sekvens i pattedyrceller, karakterisert ved at den er et innskuddsderivat, delesjonsderivat eller mutasjonsderivat av den humane uPA-promoteren.

14 . Promotersekvens ifølge krav 13, karakterisert ved at den er et delesjonsderivat av den humane uPA-promoteren.

15. Promotersekvens i henhold til krav 13, karakterisert ved at det humane uPA-promoterderivatet er et delesjonsderivat som mangler fragmenter på 0.6 Kb spaltet ved OxaNI eller et delesjonsderivat som mangler fragmenter på 1.29 Kb mellom OxaNI-setet ved omtrent - 1827 bp og EcoRV-setet ved omtrent - 597 bp.

16. Ekspresjonskassett, karakterisert ved at den innbefatter en promoter ifølge kravene 13, 14 eller 15.

17. Ekspresjonsvektor som har evnen til transkribering av et flankerende gen eller cDNA 1 eukaryote celler, karakterisert ved at den innbefatter en human uPA-promotersekvens eller en promoter ifølge kravene 13, 14 eller 15.

18. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den har en DNA-sekvens som innbefatter den uPA-kodende humane genome sekvensen og en promotersekvens som er en human uPA-promotersekvens eller en promoter ifølge kravene 13, 14 eller 15.

19. Plasmid, karakterisert ved at det blir valgt fra pPP41, pPP17 og pPP254.

20. Plasmid som har evnen til å uttrykke den humane uPA-kodende sekvensen i pattedyrceller, karakterisert ved at den blir valgt blant pPP41XS, pPP17XS, og pPP254XS.

21. Transformert dyrecelle, karakterisert ved at den innbefatter en promoter ifølge kravene 13, 14 eller 15 eller et plasmid ifølge kravene 19 eller 20.

22. Transformert celle ifølge krav 21, karakterisert ved at den har evnen til å uttrykke uPA eller scu-PA.

23. Transformert celle ifølge kravene 21 eller 22, karakterisert ved at den blir valgt fra etablerte humane cellelinjer, murine cellelinjer, hamstercellelinjer og apekattcellelinjer.

24 . Transformert celle ifølge kravene 21 eller 22, karakterisert ved at de blir valgt fra murine LB6 cellelinje, kinesisk hamster ovarie cellelinjer og humane epidermoide carcinoma cellelinjer.

25. Transformert celle ifølge kravene 21 eller 22, karakterisert ved at den er en kinesisk hamster ovarie cellelinje som har evnen til å vokse og uttrykke proteinet i suspensjon i vekstmediumet.

26. Transformert celle ifølge et hvilket som helst av kravene 21, 22, 23, 24 eller 25, karakterisert ved at den inneholder et resistensgen til et seleksjonsmiddel.

27. Glykosylert enkelt-kjede human-type urinplasminogenaktivator, karakterisert ved at den har en tilsynelatende molekylvekt i gelelektroforeseanalyse på 500-3000 enheter høyere enn scu-PA tilveiebragt fra human urin, og hvor nevnte forskjell er forårsaket av en forskjell i molekylvekt som avhenger av den forskjellige glykosyleringen av B-kjeden.

28. Glykosylert enkelt-kjede human urokinase-type plasminogenaktivator, karakterisert ved at den har: a) amino- og karboksyterminalsekvenser til humane pro-uPA b) en tilsynelatende molekylvekt på omtrent 52.000 i SDS-PAGE, korresponderende til en molekylvekt på omtrent 1000-2000 enheter høyere enn human urin tilveiebragt pro-uPA, bestemt ved de samme analysebetingelsene; hvor nevnte forskjell i molekylvekt er essensielt forårsaket av en korresponderende forskjell i molekylvekt til B-kjeden c) en tilsynelatende molekylvekt av A-kjeden som er lik den humane A-kjeden d) en tilsynelatende molekylvekt av B-kjeden som er lik den til B-kjeden av human opprinnelse etter fjerning av N-glykosidsubstituenter ved glykopeptidase F.

29. Glykosylert enkelt-kjede human urokinase-type plasminogenaktivator ifølge kravene 27 eller 28, karakterisert ved at den blir produsert av transformerte murine LB6, kinesisk hamster ovarie cellelinjer eller humane epidermoide svulstcellelinjer.

30. Glykosylert enkelt-kjede human urokinase-type plasminogenaktivator ifølge krav 29, karakterisert ved at de produserte cellelinjene blir transformert i henhold til fremgangsmåten i krav 7.

31. Glykosylert enkelt-kjede human urokinase-type plasminogenaktivator, karakterisert ved at den har karaktertrekkene til 3Fll-sc-uPA, RSV-A431-scu-PA, RSV-CHO-scu-PA eller BPV-LB6-scu-PA.

32. Human-type to-kjede urokinase, karakterisert ved at den blir tilveiebragt ved proteolytisk spalting av glykosylert, enkeltkjede, human-type pro-uPA ifølge kravene 27, 28, 29, 30 eller 31 eller fremstilt i henhold til fremgangsmåten til et hvilket som helst av kravene 1 til 12.

33. Farmasøytisk komposisjon, karakterisert ved at den inneholder en forbindelse ifølge kravene 27, 28, 29, 30 eller 31 som det aktive ingrediens.