NO885389L - Fremgangsmaate for fremstilling av immobilisert interleukin 2, og interleukin 2 inneholdende en carboxylterminal forlengelse. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår proteiner erholdt

ved hjelp av molekylær kloning og mikrobiell ekspresjon. Nærmere bestemt angår oppfinnelsen fremstillingen i E. coli

av endrede, biologisk aktive former av humant interleukin 2 (IL2) som adskiller seg i sekvens fra naturlig IL2 ved tilsetningen av aminosyrerester ved carboxylterminalen av proteinet. Oppfinnelsen angår også biologisk funksjonelt IL2 immobilisert på et fast støttemateriale.

Interleukin 2 (IL2) er et protein utskilt av lymfocytter og tilhører klassen av immunmodulerende stoffer betegnet lymfokiner. IL2 ble først beskrevet som T-celle-vekstfaktor (TCGF), et lymfokin som kan fremme den vegetative formering av T-lymfocytter (Morgan et al. (1976)

Science 193, 1007-1008; Ruscetti et al. (1977) 3. Immunol. 119 , 131-138). IL2 er vist å modulere mange andre immuno-logiske virkninger på lymfoide celler innbefattet cyto-toksiske T-celler, naturlige dreperceller, aktiverte B-celler og lymfokin-aktiverte dreper (LAK)-celler (Robb

(1984) Immunol. Today 5_, 203 og referanser deri) . IL2 anvendes for å frembringe LAK-celler som dreper friske tumor-celler, men ikke normale celler (Grimm et al. (1982) J. Exp. Med. 155, 1823-1841; Mazumder et al. (1984) J. Exp. Med. 159, 495-507). Nylig har behandling av kreftpasienter ved administrasjon av IL2 og autologe LAK-celler vist den poten-sielle anvendelse av IL2 som et immunterapeutisk middel (Rosenberg et al. (1985) N. Eng. J. Med. 313, 1485-1492).

Cellulære IL2-reseptorer (IL2-R) med både høy og

lav affinitet overfor IL2 (Robb et al. (1984) J. Exp. Med. 160, 1126-1146), såvel som oppløselige reseptorer oppbygget av aktiverte lymfocytter (Rubin et al. (1985) J. Immunol.

135, 3172-3177), er beskrevet. Den fremherskende lav-affinitetsform av reseptoren består av et tilnærmet 55 kDa protein betegnet Tac, mens høy-affinitetsformen består av Tac og ytterligere én eller flere bestanddeler (Neeper et al.

(1987) J. Immunol. 138, 3532-3538 og referanser deri). Høy-af f initetsformen av IL2-R omfatter en IL2-bindende under-enhet med molekylvekt på 75 kDa (Sharo et al. (1986) Science 234, 859-863). Både TCGF- og LAK-celleaktiverings-signalene gitt av IL2, er antatt å være formidlet av IL2-R. Oppløselig IL2 gjøres internt av reagerende celler, og dette utføres tydeligvis ved hjelp av høyaffinitet IL2-R (Weissman et al. (1986) Proe. Nati. Acad. Sei. 83, 1463-1466; Fujii et al. (1986) J. Exp. Med. 163, 550-562). Imidlertid går det ikke klart frem fra kjent teknikk hvorvidt interngjøringen av IL2 er nødvendig for å gi den cellulære stimulus for enten vekst eller aktivering.

Det er av interesse å undersøke de biologiske egenskaper til immobilisert IL2 for mulig anvendelse i, f.eks., affinitetsisoleringen av lymfocytter som bærer IL2-R, og i fremstillingen av LAK-celler. Konjugasjonen av IL2 og andre lymfokiner til oppløselige polymerer og uoppløselige overflater er beskrevet i Beecham patentsøknad EP 183503, Asahi patentsøknad JP 61280432 og JP 61277628 og Kanegafuchi Chem patentsøknad JP 62164470. Asahi-søknadene som ble publisert etter at foreliggende oppfinnelse ble gjort, fremlegger frembringelsen av LAK-celler ved anvendelse av immobilisert leetin eller protein A som primært stimuleringsmiddel, og immobilisert IL2 som sekundært stimuleringsmiddel. Immobilisering av IL2 med det formål selektivt og spesifikt å affinitetsutfelle IL2-R, er også tidligere publisert (Robb og Greene (1983) J. Exp. Med. 158, 1332-1337; Takeda patent JP 61053300). Tidligere forsøk på kjemisk å modifisere IL2 ved jodering (Robb (1982) Immunobiol. 161, 21-50) og anvendelse av andre konvensjonelle reagenser, førte vanligvis til tap av biologisk aktivitet, selv om det i den senere tid er publisert noen vellykkede derivatiseringer (Robb et al. (1985) J. Immunol. Meth. 81, 15-30; Hatakeyama et al. (1985) Nature 318, 467-470; Katre et al. (1987) Proe. Nat. Acad. Sei. 8_4 , 1487-1491) . Ikke desto mindre er det tydelig at IL2 er mottakelig for inaktivering ved kjemisk modifikasjon.

Neeper et al. (1987) J. Immunol. 138, 3532-3538, som ble publisert etter at foreliggende oppfinnelse ble gjort, fremlegger kobling av IL2 til Sepharose<®>4B-perler og anvendelse av det immobiliserte IL2 til å affinitetsutfelle IL2-R. Neeper et al. beskriver IL2 som en spesifikt konstruert form inneholdende en C-terminal utvidelse med 14 aminosyrer, innbefattet flere lysinrester, og med normal in vitro biologisk aktivitet og reseptoraffinitet. Den C-terminale utvidede IL2 anvendt av Neeper et al., var L-IL2 ifølge foreliggende oppfinnelse som er beskrevet i det følgende. Neeper et al. erholdt L-IL2 og beskrivelsen av denne fra foreliggende oppfinnere. Neeper et al. gir ingen undervisning i fremstilling av L-IL2 eller noen anvendelighet av L-IL2 annet enn affinitetsutfelling av IL2-R.

Forut for foreliggende oppfinnelse var det ikke kjent hvorvidt IL2 kunne immobiliseres på et fast støtte-materiale og fremdeles beholde sin biologiske aktivitet. Det var forventet at immobilisert IL2 kunne være inaktivt fordi, i motsetning til oppløselig IL2, det ikke kunne gjøres internt av målceller. Det var også kjent at kjemisk derivatisering påkrevet for immobilisering, kunne endre proteinkonformasjon og føre til tap av aktivitet.

Molekylær kloning av det humane IL2-cDNA (Taniguchi et al. (1983) Nature 302, 305-310; Deves et al. (1983) Nucleic Acids Res. _11, 4307-4323) har tillatt bestemmelse av den primære sekvensstruktur av IL2 og fremstillingen av store mengder biologisk funksjonell IL2 ved anvendelse av heterologe ekspresjonssystemer, innbefattet E. coli-systemer (Ju et al. (1987) J. Biol. Chem. 262, 5723-5731 og referanser deri). Fremgangsmåter for molekylær kloning har vært anvendt for å fremstille strukturelt endrede former av IL2 med substitusjoner og utslettelser av aminosyrerester (Ju et al. op. eit. og referanser deri). Ved å undersøke virkningene av disse strukturelle endringer på funksjonen av IL2, er områder av IL2-proteinet som er viktige for dens funksjon, identifisert. Biologisk funksjonelle IL2-avledede proteiner inneholdende ytterligere aminosyrerester ved N-terminalen av IL2, har også "blitt publisert (Takeda patent EP 1058198; Murphy patent W0 88/0090; Sandoz patent EP 0163603). Fremstillingen og den funksjonelle karak-terisering av IL2-avledede proteiner som inneholder ytterligere aminosyrerester ved C-terminalen, er ikke tidligere publisert. Patentsøknader tilhørende Hoechst (DE 3.419.995) og Amgen (WO 85/00817), gjør krav på endrede former av IL2-proteiner inneholdende ytterligere uspesifiserte aminosyrerester ved C-terminalen av IL2. Imidlertid er eksempler på slike endrede former av IL2 ikke fremlagt. Tidligere referanser viser da også at små utslettelser eller substitusjoner ved C-terminalen av IL2 fører til tap av funksjonell aktivitet (Ju et al. op. eit.; Liang et al. (1986)

J. Biol. Chem. 261, 334-337).

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer strukturelt endrede biologisk funksjonelle former av IL2 inneholdende ytterligere aminosyrerester ved C-terminalen. I en utfør-elsesform av oppfinnelsen er IL2 spesifikt oppbygget for å inneholde en forlengelse på 14 aminosyrer ved C-terminalen. Denne utvidelse på 14 aminosyrer letter oppløseliggjøringen, derivatiseringen og immobiliseringen av proteinet i en aktiv konformasjon.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer biologisk funksjonelle IL2-avledede proteiner som adskiller seg fra naturlig IL2 ved tilføyelsen av aminosyrerester ved C-terminalen. Disse funksjonelt endrede former av IL2 erholdes ved molekylær kloning og ekspresjon i E. coli. I en utfør-elsesform av foreliggende oppfinnelse ble IL2 oppbygget til å inneholde en lysinrik forlengelse på 14 aminosyrer ved C-terminalen. Denne modifiserte form av IL2 er betegnet L-IL2. L-IL2 adskiller seg fra naturlig, human IL2 ved at de to C-terminalrester (Leu-Thr) er erstattet med:

Gly-Thr-(Gly)3~(Lys-Lys-Asp)^-Leu-Glu.

Sekvensen av den C-terminale forlengelse av IL2 i L-IL2 ble utvalgt for å øke dets polaritet og derved lette oppløseliggjøringen av proteinet, og for å lette derivatiseringen og immobiliseringen av proteinet i en biologisk aktiv form. Oppdagelsen av at L-IL2 beholder full biologisk aktivitet viser at IL2 kan kobles i en biologisk aktiv kon formasjon til andre funksjonelle grupper, polypeptid-sekvenser, eller faste støttematerialer ved dets C-terminal.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også fremgangsmåter for immobilisering av IL2 eller derivater av IL2, slik som L-IL2, til et fast støttemateriale til en konformasjon som binder til IL2-R og som er aktivt til å stimulere T-celle vegetativ formering, som forhøyer naturlig dreper (NK)-celleaktivitet og som frembringer LAK-celler. Funksjonell, immobilisert IL2 er anvendelig ved utvelgelse og rensing av delmengder av lymfoide celler som bærer IL2-R, og som primært, sekundært eller eneste stimuleringsmiddel ved frembringelse av LAK-celler. Funksjonelt, immobilisert IL2 kan anvendes i alle innretninger og terapier som omfatter IL2-formidlede, biologiske virkninger.

Adskillige derivater av IL2 er fremstilt i E. coli ved anvendelse av fremgangsmåter med molekylær kloning. I humane celler uttrykkes humant IL2 som et forløperprotein som er proteolytisk spaltet for å danne den modne, biologisk funksjonelle form av IL2 (Taniguchi et al., op. eit.; Robb et al. (1983) Proe. Nati. Acad. Sei. 80, 5990-5994). Denne form av humant celleuttrykt IL2, betegnet modent IL2, har en N-terminal Ala-rest og har en mengde på 133 aminosyrerester. Aminosyrerestene og de tilsvarende kodoner for modent IL2 er betegnet gjennom hele patentsøknaden som aminosyre'1 til aminosyre 133. F.eks. er aminosyre 1 i naturlig modent, humant IL2 en Ala-rest. E. coli ekspresjonsvektoren, og betegnelsen og strukturen av det IL2-avledede protein kodet for av E. coli ekspresjonsvektoren, er vist i tabell 1. IL2-derivatene uttrykt i E. coli, inneholder en N-terminal Met i begynnelsen etter translasjon; imidlertid kan denne Met-rest senere fjernes proteolytisk i E. coli ved hjelp av methionin-aminopeptidaser. N-terminal-sekvensanalyse av renset r-IL2 har vist at den N-terminale Met fjernes i tilnærmet 50% av molekylene renset fra E. coli. Det er sannsynlig at N-Met fjernes fra tilnærmet den samme prosentdel av andre E. coli-uttrykte IL2-avledede molekyler, innbefattet t-IL2, fl-IL2 og L-IL2 (tabell 1 og eksempel 1). Den fjernede prosentdel kan økes, hvis ønskelig, ved behandling med methionin-aminopeptidaser etterfulgt av isolering og rensing.

Fremgangsmåten for den molekylære kloning og E. coli-ekspresjon er beskrevet i detalj i eksempel 1 og eksempel 2. Den C-terminale forlengelse på 14 aminosyrer av IL2 i L-IL2, (Gly)2-(Lys-Lys-Asp)2-Leu-Glu, ble spesielt utformet for å lette oppløseliggjøringen og derivatiseringen av proteinet. Proteinderivatiseringer anvender ofte epsilon aminogruppen av lysiner. Fordi kovalent tilknytning av interne lysiner til funksjonelle grupper, eller faste støttematerialer, sterisk kan blokkere etterfølgende interaksjon mellom IL2 og dens cellulære reseptor og derved forstyrre IL2-funksjon, ble et modifisert IL2-molekyl utformet for å inneholde et lysinrikt, hydrofilt segment for å tilveiebringe et kjemisk tilgjengelig derivatiseringssete. Modifiseringen ble an-brakt ved C-terminalen. Asp-restene ble innblandet for å tilveiebringe økt hydrofilisitet og derved forhøye oppløse- heten av proteinet i vandig oppløsning. Gly-restene tjener som et mellomstykke mellom IL2 og det Lys-rike segment av forlengelsen. Leu-Glu-gruppen kommer fra nucleotidsekvensen utvalgt for å tilveiebringe et restriksjonsendonuclease (Xhol)-spaltningssete.

L-IL2 beholder de fullstendige biologiske aktivi-teter som naturlig IL2; L-IL2 understøtter den vegetative formering av T-celler, forhøyet NK-celleaktivitet og frem-kaller LAK-celleaktivitet. Denne oppdagelse er den første demonstrasjon av at aminosyrerester kan tilføyes til C-terminalen av IL2 uten tap av IL2-bioaktivitet. Det E. coli-uttrykte L-IL2-protein besitter forskjellige forutsagte bio-kjemiske egenskaper. Den fremkomne molekylvekt er ubetydelig større enn molekylvekten til IL2. Dets isoelektriske punkt er vesentlig mer basisk enn IL2, og dets hydrofilitet er forhøyet.

Det er uten vanskelighet mulig å derivatisere L-IL2 med det amin-reaktive biotinyleringsreagens biotin-SP-NHS (Jackson Immuno Research). Biotinderivatiseringen gir et middel for å binde IL2 fast til avidin eller streptavidin (Green (1975) Adv. Prot. Chem. 29, 85-133). Biotinylert IL2 er bifunksjonelt ved at det er i stand til å binde det cellulære IL2-R og i tillegg streptavidin, enten den sist-nevnte foreligger i oppløsning eller knyttet til en fast overflate. Immobilisert L-IL2 kan immunutfelle Tac IL2-R

fra cellelysater (Neeper et al., op. eit.). Videre ble det påvist at streptavidin-formidlet immobilisert, biotinylert L-IL2 beholder evnen til å binde IL2-R-bærende celler for

å fremkalle vegetativ formering og vekst av T-celler, og for å fremkalle LAK-celleaktivitet. Dette er den første påvisning av at IL2 kan immobiliseres og beholde sin biologiske aktivitet innbefattet evnen til å frembringe LAK-celler .

Ved anvendelse av standardfremgangsmåter for molekylær kloning og ekspresjon som beskrevet i det følgende,

kan IL2 med en C-terminal peptidforlengelse med enhver ønsket lengde, fra 1.til 100 eller flere aminosyrerester, og med

ethvert ønsket aminosyreinnhold og sekvens, fremstilles.

Med grunnlag i påvisningen av at L-IL2 er biologisk funksjonell, forventes det at mange andre slike C-terminale, for-lengede IL2-avledede molekyler også vil være biologisk funksjonelle. Det er foretrukket at forlengelsen har en lengde på minst 5 aminosyrerester og at aminosyrene utvelges slik at forlengelsen vil bibringe noen ønskelige karakteristika til molekylet, som reaktivitet, hydrofilitet eller antigeni-sitet. For derivatisering av molekylet, dvs. tilknytning av funksjonell gruppe eller fast støttemateriale, er en C-terminal forlengelse inneholdende minst 10 mol% av én eller flere lett derivatiserte aminosyrerester som Lys, Asp, Glu, Met, Ser, Tyr, Thr og Trp, ønskelig; Cys kan være til stede, men er mindre ønskelig på grunn av potensiell dann-else av disulfidbinding. For derivatisering inneholder forlengelsen fortrinnsvis minst 2 Lys-rester. Det foretrekkes at 2 Lys-rester i forlengelsen er beliggende i umiddelbar nærhet av hverandre og kan adskilles fra carboxyl-terminalen av IL2-segmentet ved hjelp av 3 eller flere mellomliggende rester som Gly. Det foretrekkes helst at forlengelsen inneholder minst 4 Lys-rester og at Lys utgjør minst 20 mol% av forlengelsen. For å forbedre hydrofiliteten og oppløseligheten av molekylet er en forlengelse som inneholder én eller flere Asp- eller Glu-rester, ønskelig. Forlengelse kan inneholde andre aminosyrerester, innbefattet Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Gly, Tyr, Asp, Arg, His og Gin.

IL2-delen inneholder i det vesentlige aminosyresekvensen til human, naturlig IL2. Den kan være identisk i aminosyreinnhold og sekvens med naturlig, humant IL2, eller den kan være et IL2-mutein som fl-IL2 eksemplifisert heri, og muteinene beskrevet i Ju et al. (1987) J. Biol. Chem.

262, 5723-5731 og referanser beskrevet deri, og i Mark et al., US patent 4.518.584 hvis fremleggelser er innbefattet heri ved referanse.

Ved anvendelse av fremgangsmåter ifølge foreliggende oppfinnelse kan IL2 sammensmeltes via dets C-terminal med polypeptidområder som forhøyer serumretensjon, reduserer toksisitet eller reduserer immunogenisitet. IL2 kan også sammensmeltes via dets C-terminal med polypeptidområder slik som de avledet fra albumin, transferrin, beta 2-mikroglobu-lin, eller immunoglobulin som gjenkjenner en spesifikk cellemarkør, for å lette målinnretting av det IL2-avledede, hybride molekyl mot spesifikke celler eller organer. Økningen i molekylstørrelse av IL2 ved hjelp av sammensmelt-ning av polypeptidområder ved dets C-terminal kan redusere utskillelse via nyrene og forhøye serumretensjonstid, og derved redusere den effektive terapeutiske dose og den led-sagende toksisitet. Den C-terminale forlengelse av IL2 kan lette den kjemiske derivatisering av molekylet i en biologisk aktiv tilstand. Derivatisering kan innbefatte konjugasjon av IL2 til metall-chelaterende midler for binding av metall-radioisotoper, eller konjugasjon av IL2 til foto-reaktive kryss-bindende reagenser for anvendelse ved immobilisering av IL2 og tilknytning av IL2 til bærerproteiner, eller celler, eller partikler. IL2 kan sammensmeltes ved dets C-terminal med en peptidepitop for å lette rensing og immobilisering av det IL2-avledede sammensmeltningsprotein ved anvendelse av et antistoff som gjenkjenner epitopen. Alternativt kan et hapten eller enhver annen del kjemisk derivat.iseres eller kobles ved C-terminal av IL2. IL2 kan sammensmeltes ved C-terminalen med en cytotoksisk del, slik som Pseudomonas toksin, og anvendes for selektivt å drepe IL2-R-bærende celler.

Den foreliggende påvisning at IL2 kan immobiliseres på et fast støttemateriale mens dets evne til å frembringe LAK-celler beholdes, har viktige anvendelser. Immobilisert IL2 er anvendelig for eks-vivo-innfangelsen av aktiverte IL2-R-bærende lymfocytter for isolasjon, videre aktivering, numerisk utvidelse og terapeutisk reinfusjon i pasienter med kreft, immunmangelsykdommer og andre sykdommer. Immobilisert IL2 kan anvendes for på stedet-adsorpsjonen av IL2-reseptorer funnet i oppløsning slik som i blodet eller i det lymfatiske system hos pasienter. Denne fremgangsmåte kan være en hjelp i reduksjonen i toksiske doser av IL2 anvendt i terapien av pasienter med kreft eller immun-mangeltilstander. Immobilisert IL2 er anvendelig ved på stedet-aktiveringen av blod eller lymfeceller for forbedret terapi av kreft, immunmangelsykdommer og andre sykdommer. Immobilisert IL2 kan også anvendes i immunanalyser for påvisning og kvantitativ bestemmelse av IL2-reseptorer, anti-IL2-antistoffer og IL2-bærende celler eller proteiner.

Atskillige fremgangsmåter er kjent for festing av polypeptider inneholdende reaktive aminosyrerester til faste støttematerialer. Se Affinity Chromatography and Related Techniques, redigert av T.C.J. Gribnau, J. Vissar, R.J.F. Nirard (1982) Elsevier Scientific Publishing, NY, kapittel II, "Polymeric Matrices and Ligand Immobilization", s. 113-245. Enhver av disse konvensjonelle fremgangsmåter kan anvendes for å immobilisere polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse som har en C-terminal forlengelse inneholdende reaktive aminosyrerester, for å tilveiebringe immobiliserte polypeptider som har evnen til å binde IL2-R, stimulere T-cellevekst og vegetativ formering, og frembringe LAK-celler. Bindingen mellom det faste støttemateriale og IL2 kan være kovalent og kan være direkte eller indirekte, dvs. gjennom et homobifunksjonelt eller heterobifunksjonelt kryssbindingsmiddel. Den kovalente binding kan være til det IL2-avledede polypeptid, eller til et antistoff spesifikt

for en epitop på den C-terminale forlengelse. Et medlem av et immun- eller ikke-immun-spesifikt bindingspar kan anvendes for immobilisering, f.eks. kan et antistoff, anti-gen, hapten eller ikke-immunt bindingsstoff være kovalent tilknyttet det faste støttemateriale, en spesifikk bindings-deltager for det immobiliserte ledd kan være kovalent bundet til det C-terminale, utvidede IL2, og affiniteten av bindings-paret kan anvendes for å immobilisere IL2-molekylet. Den foretrukne fremgangsmåte for immobilisering er anvendelsen av biotin og avidin (eller streptavidin) som beskrevet ovenfor for immobilisering av L-IL2. Det foretrukne reagens for biotinylering er biotin-SP-NHS (Jackson Immuno Research)

som har formelen:

Andre biotinyleringsreagenser, som biotin-NHS (Pierce Chemical Company), som har formelen:

kan også anvendes. Reaksjonens molforhold mellom biotin-yleringsmiddel og IL2-polypeptid med C-terminal forlengelse bør være i området 5 til 60.

Som illustrert i eksemplene i det følgende, er det også funnet at dersom r-TL2 (ingen C-terminal forlengelse) biotinyleres ved anvendelse av biotin-SP-NHS ved et molforhold mellom biotin og IL2 i området 5 til 20, og immobiliseres på et avidin-overtrukket støttemateriale, beholder polypeptidet evnen til å binde IL2-R, stimulere den vegetative formering av T-celler og frembringe LAK-celler. Dette er en overraskende påvisning fordi tidligere forsøk på å

biotinylere IL2 ved anvendelse av biotin-NHS ved et høyere molforhold førte til tap av biologisk aktivitet. Denne påvisning viser at ethvert polypeptid med i det vesentlige den samme aminosyresekvens og biologiske aktivitet som human IL2, uten hensyn til hvorvidt det inneholder en reaktiv C-terminal forlengelse, kan biotinyleres ved anvendelse av biotin-SP-NHS og immobiliseres på et avidin- eller streptavidin-overtrukket støttemateriale, og det immobiliserte polypeptid vil beholde evnen til å binde IL2-R og frembringe LAK-celler, forutsatt at reaksjonens molforhold

mellom biotin og IL2 opprettholdes i området 5 til 20 for et polypeptid som ikke har noen C-terminal forlengelse,

eller i området 5 til 60 for et polypeptid med en C-terminal forlengelse.

Som faste støttematerialer kan det anvendes ethvert av de alminnelige vannuoppløselige materialer anvendt i affinitetskromatografi og ved analyttinnfangelse i immunanalyser. Foretrukne materialer er organiske polymere perler, filmer, fibre, plater og rør. Egnede polymerer innbefatter polystyren, nylon, aminoalkyl-polyacrylamider, dextran kryssbundet med epiklorhydrin, allyldextran kryssbundet med N,N-methylenbisacrylamid, agarose kryssbundet med 2,3-di-brompropanol, cellulose m.fl. Metalliske partikler, spesielt magnetiske partikler, kan også anvendes, slik som par-tiklene beskrevet i Hersch, U.S. patent 3.933.997, Forrest et al. U.S. patent 4.141.687 og Lau U.S. patent 4.661.408.

E. coli-stamme HB101 transformert med plasmid pTrpGk som koder for protein L-IL2 og som er beskrevet i eksempel 1, er deponert under Budapest-avtalen hos American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, og bærer deponerings-aksesjonsnummer 67540. Ved utstedelse av et patent ifølge foreliggende søknad vil alle restriksjoner på tilgjengelig-heten av det deponerte materiale for offentligheten ugjen-kallelig fjernes.

Eksempler

Foreliggende oppfinnelse beskrives videre ved hjelp av de etterfølgende eksempler hvori alle deler og prosent-deler er angitt som vektdeler, og grader angis som grader Celsius.

Eksempel 1

PlasmidfremstiIlinger

Plasmidfremstillinger ble utført ved anvendelse av standardfremgangsmåter ifølge Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982), som herved er innbefattet ved referanse. Enzymer og andre reagenser anvendt for plasmidfremstillinger, ble erholdt fra Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg,

MD eller New England Biolabs, Beverly, MA. Fremgangsmåter for fordøyelse, identifisering, gjenvinning og rensing av de forskjellige nucleotidsekvenser anvendt i foreliggende oppfinnelse, er kjent for de dyktige teknikere, likeledes som fremgangsmåter for legering av -sekvenser i vektorer, transformering av vert-mikroorganismestammer, kloning, og gjenvinning av syntetiserte produkter. I overensstemmelse med dette vil fremgangsmåtene bare beskrives med referanse til spesifikke utførelsesformer ifølge foreliggende oppfinnelse fremlagt i.det følgende.- Oligonucleotider ble syntetisert på en Applied Biosystems DNA-synthesizer ved anvendelse av fremgangsmåter anbefalt av leverandøren.

Fremstilling av plasmid pTrpGt

Plasmid pTrpGt som i E. coli uttrykker en C-terminal-avkuttet IL2, betegnet t-IL2, ble fremstilt som beskrevet i det følgende. IL2-kodingssekvensen ble erholdt fra et cDNA-bibliotek oppbygget fra gibbon T-cellelinje MLA-144 som beskrevet av Chen et al. (1985) Proe. Nati. Acad. Sei. 82, 7284-7288). En klon fra dette cDNA-bibliotek betegnet A36, ble vist ved standard DNA-hybridisering, restriksjons-endonucleasekartlegging, og DNA-sekvensanalysefremgangs-måter, å inneholde en DNA-innføyelse tilsvarende en IL2-cDNA. Fig. IA viser A36 i en M13 kloningsvektor. Det N-terminale Ala hos modent IL2 (Robb et al. (1983) Proe. Nati. Acad. Sei. 80, 5990-5994) er her betegnet som aminosyre (aa) 1. Den modne form av IL2 har en lengde på 133 aminosyrer. Som vist i figur IA, finnes det i klon A36 et EcoRl-sete ved kodonene som tilsvarer aminosyre 116 og aminosyre 117. IL2-cDNA-segmentet som koder for aminosyre 1 til aminosyre 117, ble innføyet i en E. coli plasmid ekspresjonsvektor ved anvendelse av fremgangsmåten angitt skjematisk i figur 1. Klon A36-DNA ble spaltet med HgiAl, de 3'-enkelttrådede ender ble fjernet for å danne butte ender ved anvendelse av T4-DNA-polymerase, DNA ble spaltet med EcoRl, og det butt-endede HgiAl til EcoRl-DNA-fragment inneholdende IL2-kodingssekvensen, ble isolert (fig. 1A-1C). Den butt-endede HgiAl-ende ble omdannet til en Hindlll-ende ved ligering til et oligonucleotid betegnet oligo-adapter I (fig. 1C), og EcoRl-enden ble omdannet til en BamHl-ende ved ligering til et oligonucleotid betegnet oligo-adapter II (fig. 1C). Oligo-adapter I tilveiebringer et ATG-trans-lasjonsstartkodon 5' til IL2-kodon 1, og oligo-adapter II tilveiebringer et TGA-translasjonsstoppkodon 3' til IL2 kodon 117. Det resulterende Hindlll til BamHl IL2-holdige DNA-fragment (fig. ID, 1E) ble deretter ligert til det BamHl til Hindlll-tryptofan (trp)-promoter-holdige fragment (fig. 1G) av plasmid, pKPG36-trp (fig. 1F) (Ivanoff et al.

(1986) Proe. Nati. Acad. Sei. 83, 5392-5396). Plasmid-ekspresjonsvektor pKGP36-trp tilveiebringer transkripsjons-kontrollsignaler erholdt fra E. coli tryptofan-operonet, såvel som translasjons-startsignaler. Det resulterende plasmid, betegnet pTrpGt, uttrykker under trp-promoter-kontroll et C-terminal-utslettet IL2-avledet protein, betegnet t-IL2, som tilsvarer aminosyre 1 til aminosyre 117 av IL2. Det bør bemerkes at t-IL2 som er tilfelle med hvert av de E. coli-uttrykte IL2-avledede proteiner beskrevet heri, adskiller seg fra autentisk IL2 ved tilsetningen av en N-terminal Met-rest i en del av molekylene.

Fremstilling av plasmid pTrpGfl

For å lette etterfølgende molekylære kloningstrinn ble det Hindlll til EcoRl IL2-holdige fragment av pTrpGt innføyd mellom Hindlll og EcoRl-setene av det høykopi pBR322 derivat, pHC624 (Boros et al. (1984) Gene 30, 257-26), for å danne plasmid pHCGt. En IL2-kodingssekvens nøyaktig tilsvarende den fullt utviklede, modne IL2-kodingssekvens, ble rekonstruert ved ligering av det store IL2-holdige BamHl til EcoRl-fragment av pHCGt, til det følgende EcoRl til BamHl syntetiske oligonucleotid:

Stjernene angir et translasjons-stoppkodon. Det angitte oligonucleotid utvider IL2-kodingssekvensen fra kodon 117 til kodon 133. Det resulterende plasmid betegnes pHCGfl. Proteinproduktet som tilsvarer IL2-kodingssekvensen i pHCGfl (fl-IL2), adskiller seg fra naturlig humant eller gibbon ape-IL2 bare ved substitusjonen av Leu ved aminosyre 132 med en Gly-rest. Gly ble substituert for Leu ved amino-syreposisjon 132 som en konsekvens av introduksjonen av et Kpnl-sete ved denne posisjon i kodingssekvensen. Som beskrevet i det følgende, anvendes dette Kpnl-sete for å frembringe en forlengelse ved C-terminalen av IL2-proteinet. Det Hindlll til BamHl IL2-holdige fragment ble deretter ligert til det BamHl til Hindlll trp promoterholdige fragment av pKGP36-trp, for å danne pTrpGfl. Det IL2-erholdte produkt kodet for og uttrykt av pTrpGfl, er betegnet fl-IL2.

Fremstilling av plasmid pTrpGk

De følgende trinn ble anvendt for å fremstille plasmid pTrpGk som koder for et IL2-avledet protein som adskiller seg fra naturlig IL2 ved erstatningen av de C-terminale Leu-Thr-rester med sekvensen:

Gly-Thr-Gly^-(Lys-Lys-Asp)^-Leu-Glu.

Dette IL2-derivat med en Lys-rik 14 aminosyrer C-terminal forlengelse er betegnet L-IL2.

Kpnl-enden av det Hindlll til Kpnl IL2-holdige fragment av pTrpGfl ble ligert til Kpnl til BamHl-oligonucleo-tidet vist nedenfor.

Det resulterende Hindlll til BamHl DNA-fragment ble ligert mellom Hindlll-og BamHl-setene av plasmid pHC624 for å danne pHCGL. Etterfølgende bekreftelse av struktur ved hjelp av DNA-sekvensanalyse ble det Hindlll til BamHl IL2-holdige fragment fra pHCGL ligert til det BamHl til Hindlll trp-promoterholdige fragment av pKGP36-trp, for å danne pTrpGk.

Fremstilling av pTrp- IL2

Et humant IL2 cDNA ble erholdt fra et cDNA-bibliotek fremstilt ved anvendelse av standardfremgangsmåter (Gubler og Hoffman (1983) Gene 25_, 263-287) fra den humane Jurkat T-cellelinje. De dobbelttrådede cDNA-er ble avsluttet med dCTP og terminal nucleotidyl transferase og deretter herdet med det G-avsluttede pBR322. Dette danner et Pstl-sete ved hver ende av cDNA. Det Jurkat-avledede cDNA-bibliotek ble sorteringsanalysert ved hjelp av standard hybridiser-ingsfremgangsmåter ved å anvende et oligonucleotid som probe som svarer til et segment av den publiserte, humane IL2- sekvens (Taniguchi et al., op. eit.). Et slikt pBR322-avledet plasmid inneholdende en human IL2 cDNA-innføyelse, ble isolert og betegnet plH40.

For å uttrykke aktivt, modent IL2 ved høye nivåer i E. coli ble IL2-CDNA klippet for å fjerne 5<1->DNA-kodings-området for signalsekvensen, og det klippede IL2-CDNA ble innføyet i en ekspresjonsvektor. Plasmid plH40 ble for-døyet med Pstl, og cDNA-innføyelsen ble renset. Et HgiAl-restriksjonssete er beliggende ved forbindelsen mellom den siste aminosyre i signalsekvensen og den første aminosyre (Ala) i modent, humant IL2. Pstl-fragmentet inneholdende IL2-cDNA, ble spaltet med HgiAl. Fordi HgiAl etterlater et 3'-overheng med fire basepar, ble Klenow-fragmentet av DNA-polymerase anvendt for å fjerne de fire baser og etterlate en butt ende. Denne manipulasjon fjernet Ala-kodonet og etterlot en butt ende som startet med CCT som er kodonet for den andre aminosyre (Pro) av modent IL2.

For å frembringe et translasjons-startkodon (ATG) såvel som kodonet for Ala, ble det følgende adapter-oligonucleotid syntetisert:

Dette oligonucleotid tilveiebringer et ATG-startkodon, det første kodon av modent IL2 (GCT), såvel som et Hindlll-sete som ligger foran ATG. Adaptermolekyler ble ligert til det butt-endede-HgiAl-cDNA-fragment beskrevet ovenfor, og det ligerte DNA ble fordøyet med Hindlll og Stul. Hindlll- til Stul-fragmentet med 450 basepar ble ligert til Hindlll- til PvuII-fragmentet med 2325 basepar av pBR322 for å danne pBREIL-2.

Det store IL2-holdige Hindlll- til Pstl-f ragment fra pBREIL-2 ble ligert til det lille trp-promoter-holdige fragment av pKGP36-trp for å danne plasmid pTrpE-IL2.

Plasmid pTrpE-IL2 uttrykker den modne form av humant IL2 i

E. coli under transkripsjonskontrollen av trp-operon-promoteren. Produktet av pTrpE-IL2 er-betegnet r-IL2.

E. coli-uttrykt modent IL2 (r-IL2) adskiller seg fra human celle-uttrykt modent IL2 ved tilsetningen av en N-terminal Met-rest. Tilnærmet 50% av modent, humant IL2 uttrykt i

E. coli, har den N-terminale Met-rest spesifikt fjernet ved virkningen av aminopeptidaser i E. coli. Sekvensen av modent, humant IL2 uttrykt i E. coli fra pTrpE-IL2 er vist i tabell 1.

Eksempel 2

Ekspresjon i E. coli og rensing av IL2- avledede proteiner

Som beskrevet ovenfor, ble E. coli plasmid-ekspresjonsvektor inneholdende tryptofanpromoteren, avledet fra pKGP36-trp (Ivanoff et al., op. eit.). E. coli vertstammer MM294 og HB101 ble anvendt (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982)). Ekspresjon fra tryptofanpromoteren ble utført som beskrevet (Ivanoff et al., op. eit.).

Hver av de IL2-avledede proteiner, t-IL2, fl-IL2 og L-IL2, akkumulerte til høyt nivå i E. coli, noe som repres-enterte tilnærmet 5 til 10% totalt E. coli-protein. Høyere enn 95% av det IL2-avledede protein ble uttrykt som et aggregat som forble uoppløselig under betingelser som opp-løser de fleste E. coli-proteiner. Som et resultat kan det uoppløselige, aggregerte IL2-avledede protein renses i høy grad ved hurtige og enkle ekstraksjonstrinn og sentrifuger-ingstrinn. Mange produkter er kjent for å aggregere i en forholdsvis uoppløselig form etter en høy nivå-ekspresjon i E. coli (se Marston (1986) Biochem. J. 240, 1-12).

Etter induksjon av IL2-avledet proteinekspresjon i

E. coli ble cellene innsamlet ved sentrifugering, suspendert i buffer TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 0,1 mM EDTA), og på nytt bunnfelt ved sentrifugering og suspendert i buffer TE. E. coli-cellene ble lyset ved sonikering (tre 10-sekunders pulser), og cellelysatet ble sentrifugert (27.000 x g, 30 minutter). Etter sentrifugering ble pelleten av sonikerte bakterier ekstrahert med 50% eddiksyre eller 80% eddiksyre pluss 10% methanol. Etter omrøring i 30 minutter ved omgivelsestemperatur ble suspensjonen sentrifugert ved 10.000 RPM (SS34 rotor, Sorvall) i 10 minutter. Super-natanten ble fortynnet 3 ganger med 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) i vann og filtrert gjennom et 0,8 mikron filter (Corning). Filtratet ble plassert direkte på 1 x 25 cm "Ultrapore" RPSC motsatt fasekolonne (Beckman). Kolonnen ble utviklet med en linær gradient med økende acetonitrilkonsen-trasjon i 0,1% TFA. L-IL2 eluerte ved 40-45% acetonitril,

i motsetning til den normale eluering av E. coli-uttrykt humant IL2 som eluerer ved 52-56% acetonitril. Materialet i HPLC-toppen ble konsentrert to ganger under en strøm av nitrogen. På SDS-polyacrylamidgelelektroforese fremsto L-IL2 som rent. Glucose ble tilsatt til en konsentrasjon av 0,3 M, og oppløsningen ble dialysert i 10 timer mot 0,3 M glucose. L-IL2 ble aktivert ved oppvarming til 65°C i 2 timer etterfulgt av hurtig avkjøling i et isbad. Oppløsningen ble filtrert gjennom et 0,22 mikron filter.

Eksempel 3

TCGF- aktivitet av E. coli- uttrykte IL2- avledede proteiner TCGF-bioaktiviteten av IL2 ble målt ved anvendelse av den murine cytolytiske T-cellelinje CTLL-2 (Gillis og Smith (1977) Nature 268, 154-156). Disse celler vokser bare i nærvær av IL2, og deres vekst er direkte proporsjonal med IL2-aktiviteten i kulturene. Veksten av CTLL-celler over natten i nærvær av forskjellige mengder IL2 kan måles enten ved opptak av [methyl- Hjthymidin (Gillis et al. (1978)

J. Immunol. 120, 2027-2032) eller ved cellenes evne til å metabolisere fargestoffet MTT (Mosman (1983) J. Immunol. Meth. 65_, 55). 20.000 CTLL-2-celler utstrykes i 96-brønners mikrotiterplater i et medium som enten mangler IL2, eller som inneholder fortløpende fortynnede konsentrasjoner av et standardisert IL2-preparat. En enhet av TCGF-aktivitet ble definert som den resiproke verdi av fortynningen som ga halvparten av maksimal inkorporering av [methyl- Hjthymidin eller en forandring av optisk tetthet av MTT. Ukjente IL2-preparater måles mot en standardkurve av standard IL2 på en logit-plotting (Robb (1982) Immunobiol. 161, 21-50). Tabell 2 viser IL2 TCGF-bioaktiviteten av urent og HPLC-renset E. coli-uttrykt r-IL2, t-IL2, fl-IL2 og L-IL2.

Indusert E. coli inneholdende plasmidet angitt i paren-teser, ble lyset ved sonikering i buffer TE, og cellelysatet ble sentrifugert. Den urene E. coli-lysat-supernatant ble fortynnet i TE inneholdende 0,01% SDS forut for TCGF-analyse. IL2-avledede proteiner ble også analysert etter HPLC-rensing. TCGF-aktivitet ble bestemt i CTLL-analysen ved logit-analyse under anvendelse av renset Jurkat (pattedyr) IL2 som standard.

Som vist i tabell 2, er TCFG-aktiviteten av fl-IL2

og L-IL2 vesentlig den samme som aktiviteten av r-IL2. Disse resultater viser at substitusjon av Leu 132 med Gly, som i fl-IL2, eller den C-terminale forlengelse med 14 aminosyrer i L-IL2, ikke endrer TCFG-aktiviteten av molekylet. I motsetning til dette fører utslettelsen av 15 C-terminale aminosyrerester fra IL2, som i t-IL2, til fullstendig tap av TCGF-aktivitet. Således, selv om de C-terminale rester er kritiske for TCGF-aktivitet, er det vist at tilsetningen av aminosyrerester til C-terminalen av IL2 ikke svekker TCGF-aktivitet.

Eksempel 4

IL2- avhengig forhøyelse av naturlig drepercelleaktivitet i humane, perifere blodlymfocytter

Normale, sirkulerende lymfocytter utviser evnen til

å drepe visse dyrkede tumorcellelinjer (Herberman og Oraldo

(1981) Science 214, 24). Denne evne forhøyes markert etter inkubasjon over natten med IL2 (Trinchieri et al. (1984)

J. Exp. Med. 160, 1147-1169).

Ikke-klebrige, humane, perifere blodlymfocytter ble erholdt etter Ficoll-Hypaque-sentrifugering og plastisk klebing, ved anvendelse av beskrevne fremgangsmåter (Boyum, A. (1968) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 (Suppl. 97): 77-89). Disse lymfocytter ble anvendt som effektorceller i en korttids (4 timer)<51>[Cr] frigivelsesanalyse mot K562 erythroleukemiceller (ATCC nr. CC1-243) som var merket med natrium<51>[Cr], ved anvendelse av beskrevne fremgangsmmåter (Muul et al. (1986) J. Immuno. Methods _88, 265).

Effektorcellene ble inkubert i tilnærmet 18 timer i nærvær av forskjellige IL2-preparater. Tabell 3 viser resultatene av disse eksperimenter som viser at L-IL2 har evnen til å forhøye NK-aktivitet. E. coli inneholdende det egnede plasmid, ble indusert for ekspresjon av det angitte protein. Etter induksjon ble E. coli-celler lyset ved sonikering, og cellelysatet ble sentrifugert (27.000 x g,

30 minutter). Den resulterende supernatant ble fortynnet som angitt i tabell 3 i buffer TE inneholdende 0,01% SDS.

(1) IL2 TCGF-bioaktiviteter av prøver forut for fortynning (målt i CTLL-bioanalysen) var 9.100 enheter/ml (fl-IL2), 17.000 enheter/ml (L-IL2) og 14.500 enheter/ml (r-IL2). Sonikerte bakterielysater ble fortynnet i buffer TE

inneholdende 0,01% SDS.

(2)<51>[Cr]-merket K562-celler ble anvendt som målceller;

data er vist som prosent frigitt<51>[Cr].

Eksempel 5

Frembringelse av lymfokin- aktivert dreper ( LAK) celleaktivitet i humane, perifere blodlymfocytter

Humane, perifere blodlymfocytter ble erholdt ved Ficoll-Hypaque sentrifugering (Boyum, op. eit.) og inkubert

i nærvær av 10 TCGF enheter/ml r-IL2, L-IL2 eller B-L-IL2

(se eksempel 6) i 3 til 4 dager. LAK-celle-cytotoksisitet av de dyrkede celler ble målt ved anvendelse av ^[Cr]-merkede Daudi-celler (ATCC nr. CCL-213) som målceller i løpet av en 4-dagers analyse. Som naturlig IL2 er L-IL2 og B-L-IL2 i stand til å indusere LAK-aktivitet i humane, perifere blodlymfocytter etter utsettelse av disse celler for IL2 i 3 dager (tabell 4). Lignende resultater ble erholdt ved anvendelse av Raji-celler (ATCC nr. CCL-86) som målceller (ikke vist).

Eksempel 6

Biotinylering av L- IL2 og r- IL2

Renset L-IL2 og r-IL2 ble derivatisert med bio-tinyleringsreagenset biotin-SP-NHS (Jackson Immuno Research) Reaksjoner ble utført i 0,1 M NaHC03. Biotinreagenset ble oppløst i dimethylformamid (DMF) og tilsatt til den vandige L-IL2-oppløsning for å gi en sluttkonsentrasjon av DMF som ikke overstiger 10%. Blandingen ble omrystet i 1 time ved omgivelsestemperatur (tilnærmet 25°C). Gjenværende biotin-SP-NHS-reaktivitet ble stoppet ved tilsetning av 1/5 volum 0,1 M glycin eller ethanolamin, og blandingen ble omrystet i ytterligere 30 minutter. Reaksjonsblandingen ble dialysert mot saltvann inneholdende 0,3 M glucose ved anvendelse av membraner med en 6000 dalton utelukkelse ved 4°C. L-IL2 biotinylert på denne måte, betegnes B-L-IL2; r-IL2 biotinylert på denne måte, betegnes B-IL2.

B-L-IL2 og B-IL2 beholder biologisk aktivitet i

TCGF CTLL-2-bioanalysen (tabell 5). Biotinylering ble ut-ført ved forskjellige molare forhold mellom biotin og L-IL2 eller r-IL2. Som vist i tabell 5, er biologisk aktivitet redusert ved overdreven biotinylering, og optimal bioaktivi-tet er funnet ved molare forhold mellom biotin og IL2 på

5 til 20. Som vist i tabell 5, beholder L-IL2 høyere TCGF-aktivitet enn r-IL2 etter reaksjon med biotin-SP-NHS. Dette resultat er i overensstemmelse med den foretrukne reaksjon av biotin-SP-NHS med Lys-rester i den C-terminale utvidelse av L-IL2.

B-L-IL2 ble vist å beholde i det vesentlige den maksimale evne til å frembringe LAK-celleaktivitet. Den spesifikke aktivitet av B-L-IL2 i denne analyse var lik aktiviteten av L-IL2 og r-IL2. Se tabell 4, eksempel 5.

B-L-IL2 og B-IL2 ble vist å bindes til IL2-R på HUT-102-celler. Etter inkubasjon med B-L-IL2 eller B-IL2 ved 4°C i 30 minutter og vasking, ble HUT-102-cellene inkubert videre i 30 minutter i nærvær av streptavidin (StAv) inneholdende fluorescein (StAv-FITC) (Sigma) og analysert i et Spectrum III gjennomstrømningscytometer. Celler ble sterkt fluorescerende bare i nærvær av B-L-IL2 eller B-IL2 (data ikke vist) som viser bifunksjonaliteten av det biotinylerte IL2 (tabell 6). I tillegg var denne binding spesifikk for det cellulære IL2-R, da den kunne inhiberes ved preinkubasjon av cellene i 30 minutter med overskudd av IL2 (100 enheter/ml), eller anti-Tac-antistoff (ascites fortynnet 1:2000). B-L-IL2 frembrakt under lave molare forhold mellom biotin og L-IL2, utviste bedre spesifisitet, dvs. bindingens evne til å konkurrere med IL2 eller anti-Tac-antistoff.

Disse resultater viser bifunksjonaliteten av B-L-IL2. B-L-IL2 kan samtidig binde cellulært IL2-R på HUT-102-celler og streptavidin (StAv) inneholdende fluorescein (StAv-FITC). Lignende spesifikk bifunksjonell binding til andre IL2-R-bærende celler (f.eks. PHA-blaster, CTLL-2) er også observert (data ikke vist).

Som vist i tabell 7, synes B-L-IL2 å bindes mer effektivt til IL2-R-bærende HUT-102-celler enn B-IL2 synes å gjøre. Dette resultat viser at den Lys-rike C-terminale hale som er til stede i L-IL2, letter derivatiseringen av IL2 i en aktiv konformasjon. B-IL2 og B-L-IL2 ble frembrakt ved reaksjonen av hhv. enten IL2 eller L-IL2 med biotin-SP-NHS, ved et biotin:IL2 molforhold på 5, og deretter ble de sammenlignet med henblikk på evnen til samtidig å binde streptavidin-FITC og IL2-R på HUT-102-celler. B-IL2 og B-L-IL2 ble inkubert ved forskjellige konsentrasjoner med 200.000 HUT-celler og 20 ug/ml streptavidin-FITC i 96-brønners skåler. Prosentdelen fluorescerende celler ble bestemt ved gjennomstrømningscytometri, som beskrevet ovenfor. Resultater er vist i tabell 7.

Eksempel 7

Biologisk aktivitet av immobiliserte E. coli- uttrykte IL2-avledede proteiner

Tidligere forsøk fra foreliggende oppfinnere for å immobilisere bioaktivt IL2 var mislykkede. Forsøk på å utføre dette ved passiv adsorpsjon til polystyren eller for-ankring med anti-IL2-antistoff førte til reversibel tilknytning. Kjemisk derivatisering av IL2 forårsaket vanligvis tap av biologisk aktivitet.

Overflater av polystyren-dyrkningsskåler ble covalent overtrukket med StAv ved anvendelse av carbodiimid-koblingsreagenset l-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)-carbo-

diimid-HCl (CDI). Bunnoverflaten av skålene (petriskåler,

24- eller 96-brønners dyrkningsplater (Costar)) ble aktivert ved behandling med 1 mg/ml CDI i 0,1 M natriumacetatbuffer,

pH 4,8 eller 0,2 M MES-buffer (Sigma), pH 5,5 i 30 minutter ved 37°C. Etter rensing med acetatbuffer ble StAv (Sigma) tilsatt ved forskjellige konsentrasjoner (se tabell 8) i 16 timer. Ubundet StAv ble vasket gjentatte ganger, og gjenværende reaktivitet av plasten ble fjernet ved tilsetning av glycin eller ethanolamin (0,1 M, 30 minutter, 3 7°C), etterfulgt av 1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) (2 til 16 timer, ved romtemperatur). Beholderen ble vasket

3 ganger med Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) inneholdende 2% føtalt kalveserum (FCS). B-L-IL2 eller B-IL2 (se eksempel 6) ble tilsatt ved 0,1 ijg/mm 2 og tillatt a bindes ved 4°C i 30 minutter. Brønnene ble vasket med 0,2 M natrium-citratbuffer, pH 2,5, inneholdende 1 M NaCl. Dette trinn ble hurtig gjentatt 3 ganger og etterfulgt av 10 vaskinger med

HBSS/FCS.

CTLL-2-celler ble utspredt i 96-brønners mikrotiter-skåler covalent overtrukket med StAv og ladet med B-L-IL2 eller B-IL2. IL2-bioaktiviteten i løpet av natten ble målt i CTLL-2-prøven og sammenlignet med en standard titrerings-serie under anvendelse av oppløselig IL2. Resultatene er vist i tabell 8.

Som vist i tabell 8, frembrakte immobilisert IL2

ifølge foreliggende oppfinnelse lav, men målbar TCGF-aktivitet. Ikke noe ubundet IL2 ble påvist i brønnene etter over-trekkingen (data ikke vist). Denne påvisning står i motsetning til den foreslåtte mekanisme av IL2-formidlet signal-transduksjon som krever reseptor-ligand interndannelse etter binding. B-L-IL2 var ubetydelig mer effektiv som en immobilisert stimulator av CTLL-2-vekst enn B-IL2, noe som igjen tyder på mindre destruktiv biotinylering og/eller bedre utforming på den overtrukne overflate.

Immobilisert IL2 ifølge foreliggende oppfinnelse virker også ved frembringelsen av LAK-celler, som vist i tabell.9. Humane, perifere blodlymfocytter isolert ved Ficoll-Hypaque-fraksjonering, ble dyrket i 3 dager ved 37°C i 24 brønners skåler overtrukket som beskrevet ovenfor med immobilisert B-IL2 eller B-L-IL2 fremstilt som beskrevet i tabell 7, eller i brønner inneholdende oppløselig r-IL2 ved 10 TCGF enheter/ml. Cytolytisk aktivitet ble målt mot [Cr]-merkede Daudi målceller ved forskjellige forhold mellom effektorceller og målceller. Lymfokin-aktivert- dreper (LAK)-aktivitet var påvisbar i dette system ved anvendelse av det immobiliserte IL2 som vist i tabell 9.

Det virker som om IL2 ikke behøver å interndannes etter binding til IL2-R på celleoverflaten for å stimulere T-celle-vegetativ formering, eller å formidle dannelsen av LAK-celler.

Claims (31)

1. Polypeptid, karakterisert ved aminosyresekvensen ifølge humant IL2, immobilisert på et fast støttemateriale, og med evnen til å binde en IL2-reseptor, å stimulere vegetativ formering eller vekst av T-celler og frembringe LAK-celler.

2. Blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at polypeptidet i det vesentlige består av et segment med aminosyresekvens ifølge humant IL2 og en carboxyl-terminal sammensmeltet peptidforlengelse.

3. Blanding ifølge krav 2, karakterisert ved at den sammensmeltede peptidforlengelse inneholder lysin.

4. Blanding ifølge krav 1, karakterisert ved at en lysinrest i polypeptidet er festet til biotin, støttematerialet er festet til avidin eller streptavidin, og polypeptidet er immobilisert på støttematerialet gjennom binding av biotin til avidin eller streptavidin.

5. Blanding ifølge krav 3, karakterisert ved at en lysinrest i polypeptidet er festet til biotin, støttematerialet er festet til avidin eller streptavidin, og polypeptidet er immobilisert på støttematerialet gjennom binding av biotin til avidin eller streptavidin.

6. Blanding ifølge krav 3, karakterisert ved at den carboxyl-terminale sammensmeltede peptidforlengelse inneholder minst 2 lysinrester og at peptidet minst inneholder 10 mol% lysin.

7. Blanding ifølge krav 5, karakterisert ved at den carboxyl-terminale sammensmeltede peptidforlengelse inneholder minst 2 lysinrester og at peptidet inneholder minst 10 mol% lysin.

8. Blanding ifølge krav 6, karakterisert ved at minst 2 lysinrester i forlengelsen ligger i umiddelbar nærhet av hverandre.

9. Blanding ifølge krav 7, karakterisert ved at minst 2 lysinrester i forlengelsen ligger i umiddelbar nærhet av hverandre.

10. Blanding ifølge krav 8, karakterisert ved at forlengelsen inneholder minst 4 lysinrester og at peptidet inneholder minst 20 mol% lysin.

11. Blanding ifølge krav 9, karakterisert ved at forlengelsen inneholder minst 4 lysinrester og at peptidet inneholder minst 20 mol% lysin.

12. Blanding ifølge krav 10, karakterisert ved at IL2-segmentet av polypeptidet tilsvarer humant IL2 med unntak av at leucin ved posisjon 132 er erstattet med glycin, og at den carboxyl-terminale sammensmeltede peptidforlengelse er GGGKKDKKDKKDLE.

13. Blanding ifølge krav 11, karakterisert ved at IL2-segmentet av polypeptidet tilsvarer humant IL2 med unntak av at leucin ved posisjon 132 er erstattet med glycin, og at den carboxyl-terminale sammensmeltede peptidforlengelse er GGGKKDKKDKKDLE.

14. Blanding ifølge krav 2, karakterisert ved at den sammensmeltede peptidforlengelse inneholder en epitop, at støttematerialet er festet til et antistoff mot epitopen, og at polypeptidet er immobilisert på støttematerialet gjennom binding av antistoffet mot epitopen.

15. Fremgangsmåte for innfangning av humane celler med IL2-reseptorer, karakterisert ved at cellene bringes i kontakt med en blanding ifølge krav 1.

16. Fremgangsmåte for forhøyelse av NK-aktivitet eller frembringelse av LAK-celler, karakterisert ved at humane lymfocytter bringes i kontakt med en blanding ifølge krav 1.

17. Fremgangsmåte for stimulering av vegetativ formering eller vekst av T-celler, karakterisert ved at humane T-lymfocytter bringes i kontakt med en blanding ifølge krav 1.

18. Fremgangsmåte for behandling av en pasient med kreft eller immunmangeltilstand, karakterisert ved at ex vivo blod, blod-fraksjon eller lymfe fra pasienten bringes i kontakt med en blanding ifølge krav 1 for å innfange aktive IL2-R-bærende lymfocytter, videre aktivering og numerisk utvidelse av cellene ved kontakt med en aktiverende mengde av et lymfokin, og reinfusjon av cellene i pasienten.

19. Fremgangsmåte for behandling av en pasient med kreft eller immunmangeltilstand ved administrering av IL2, karakterisert ved en forbedring som omfatter at ex vivo blod eller lymfe fra pasienten bringes i kontakt med en blanding ifølge krav 1 for å fjerne oppløselig IL2-R derfra og tilbakeføring av blodet eller lymfen til pasienten. -20.-.

Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at lymfocyttene bringes i kontakt med det immobiliserte polypeptid på stedet og tilbakeføres til pasienten.

21. Polypeptid, karakterisert ved et segment med i det vesentlige den samme aminosyresekvens som humant IL2 og en carboxyl-terminal sammensmeltet peptidforlengelse, og med evnen til å binde en IL2-reseptor, stimulere vegetativ formering eller vekst av T-celler og frembringe LAK-celler.

22. Polypeptid ifølge krav 21, karakterisert ved at den sammensmeltede peptidforlengelse inneholder asparaginsyre og/eller glutamin syre.

23. Polypeptid ifølge krav. 21, karakterisert ved at peptidforlengelsen inneholder lysin.

24. Polypeptid ifølge krav 23, karakterisert ved at den sammensmeltede péptidhale inneholder asparaginsyre og/eller glutaminsyre.

25.. Polypeptid ifølge krav 24, karakterisert ved at peptidforlengelsen inneholder minst 2 lysinrester og at peptidforlengelsen inneholder minst 10 mol% lysin.

26. Polypeptid ifølge krav 25, karakterisert ved at minst 2 lysinrester i forlengelsen er beliggende i umiddelbar nærhet av hverandre.

27. Polypeptid ifølge krav 26, karakterisert ved at forlengelsen inne holder minst 4 lysinrester og at forlengelsen inneholder minst 20 mol% lysin.

28. Polypeptid ifølge krav 27, karakterisert ved at det tilsvarer humant IL2, med unntak av at leucin ved posisjon 132 er erstattet med glycin, og at utvidelsen er GGGKKDKKDKKDLE.

29. Polypeptid ifølge krav 21, karakterisert ved at det er konjugert med et molekyl utvalgt fra bærerproteiner, antistoffer, toksiner, haptener, hormoner, enzymer, legemidler, bestanddel av et ikke-immunt bindingspar, metall-chelaterende middel, foto-aktive/fotoreaktive forbindelser.

30. Polypeptid ifølge krav 23, karakterisert ved at det er konjugert gjennom lysin til biotin, reaksjonsmolforholdet mellom biotin og polypeptidet er beliggende i området 5 til 60.

31. Biotinylert, humant IL2, karakterisert ved i det vesentlige den samme biologiske aktivitet som naturlig humant IL2, molfor-holdet mellom biotin og polypeptid er beliggende i området 5 til 20.