NO885568L - Nye polynukleotidanaloger, fremgangsmaater for inhibering av nukleinsyrepolymeraser og fremgangsmaater til aa induseresyntese av interferon. - Google Patents

Description

Denne oppfinnelsen vedrører generelt nye syntetiske polynukleotider som er blitt kjemisk modifisert ved innføring av reaktive merkaptogrupper og også fluoratomer i 5-stillingen av noen av cytosin- og uracil-basene i deres polymerkjeder. De delvis substituerte polynukleotidene kan anvendes til å

blokkere funksjonen av nukleinsyrepolymerasene som er essensielle for replikasjonen av neoplastiske pattedyrceller. I tillegg til at de er kraftige inhibitorer for nukleinsyrepolymeraser vil komplekser som inneholder delvis substituerte polynukleotider også aktivt indusere syntese av interferon.

Man har vist at nukleinsyrepolymeraser vil være målenzymer for flere medikamenter mot kreft. Bardos et al., vol. 13, side 359, Proceedings of American Association of Cancer Research, foreslo f.eks. først å anvende modifiserte polynukleotider som inneholdt merkaptogrupper i 5-stillingen av noen av pyrimidinbasene av de polymere molekylene som inhibitorer for nukleinsyrepolymeraser. De tidlige studier viste generelt at delvis tiolerte DNA- og RNA-isolater, 5-merkaptopolycytidylsyre (MPC)

og 5-merkaptouridylsyre (MPU) kunne anvendes som inhibitorer for DNA-avhengige RNA-polymeraser, RNA-rettede DNA-polymeraser (reverse transkriptaser) og DNA polymerase alfa fra regenerende (normal) rottelever.

I tillegg til den inhibiterende antitemplat-aktiviteten av delvis tiolerte polynukleotider i et DNA-polymerase-system,

dvs. selektiv og sterk binding til et spesielt målenzym på en måte som hindrer binding av den naturlige templaten eller primeren som er nødvendig for genereplikasjon eller transkripsjon og cellevekst, har dobbelt-trådet polynukleotidkompleks, poly-(inosinsyre)-5-merkaptopolycytidylsyre (Polyl.MPC) vist seg å være i stand til å indusere humane alfa, beta og gamma inter-feroner. Både de inhibiterende (antitemplat) og interferon-induserende egenskapene hos et slikt polynukleotid kan bidra til dets generelt gunstige antitumoraktivitet.

I motsetning til antitemplat-virkemåten for delvis

tiolerte polynukleotider ble det funnet at halogenerte polynukleotider, så som fluorert polycytidylsyre (FPC) mangler DNA-polymerase inhibiterende aktivitet. I steden synes de å utvise

sin cytotoksiske effekt via en annen mekanisme. Selvom FPC således mangler den ønskete selektiviteten som er forbunnet med antitemplat-inhibiterende polynukleotider, har den allikevel i virkeligheten vist seg å være mere cytotoksisk enn MPC i noen in vitro cellekultursystemer, antagelig pga. den cytotoksiske virkningen av det monomere 5-fluorocytidinet som frigjøres som resultat av hydrolysen av FPC.

I betraktning av den observasjonen at basesammensetningen for modifiserte heteropolynukleotider synes å ha alvorlige effekter på virkemåten for antitumor-forbindelser, ville det være svært ønskelig å ha forbindelser som gir et bredere spektrum for antitumor-aktiviteter, så som at de virker som kraftige cytotoksiske midler, mens de også inhibiterer replikasjonen av tumorceller gjennom antitemplat-virkemåten, innbefattet de som virker på det immunologiske systemet. For nye delvis substituerte polynukleotider vil den foreliggende oppfinnelsen derfor tilveiebringe fremgangsmåter for aktivt å inhibitere replikasjonen av neoplastiske celler i det in vivo biologiske systemet, omfattende fremgangsmåter for å indusere syntesen av interferon.

Det er et hovedformål med den foreliggende oppfinnelsen å sørge for en gruppe av nye syntetiske heteropolynukleotider som er blitt modifisert ved alternerende innføring av merkapto-grupper og fluoratomer i 5-stillingen i noen av deres cytosin-og/eller uracil-baser. Mere spesifikt vedrører et aspekt av oppfinnelsen syntetiske, delvis substituerte polyribonukleotider og hvilke som helst av deres salter, f.eks. natrium, kalium, ammonium, cetyltrimetylammonium, avledet fra enten cytidin-5'-fosfat (CMP) eller uridin-5'-fosfat (UMP) hvor nukleotidene er bundet til hverandre ved 5' ► 3' fosfodiesterbindinger, under dannelse av en polymerkjede. De delvis substituerte polynukleotidene ifølge den foreliggende oppfinnelsen omfatter spesielt 5-merkapto-5-fluor-poly(cytidylsyre), MFPC og 5-merkapto-5-fluor-poly(uridylsyre), MFPU.

Ytterligere et formål med den foreliggende oppfinnelsen er

å sørge for en gruppe av nye syntetiske, delvis substituerte poly(2'-deoksyribonukleotider) og mulige salter av disse,

f.eks. natrium, kalium, ammonium, cetyltrimetylammonium,

avledet fra det pyrimidin base-inneholdende mononukleotidet, 2'-deoksycytidin-5'-fosfat (dCMP) eller 2'-deoksyuridin-5'-fosfat (dUMP) hvori også noen av hydrogenatomene i 5-stillingen i cytosin- og uracil-basene i deres polymerkjeder er blitt substituert med merkaptogrupper, og noen andre med fluoratomer. Spesielt omfatter de 5-merkapto-5-fluor-poly(2'-deoksycytidyl-syre) og 5-merkapto-5-fluor-poly(2'-deoksyuridylsyre).

Ytterligere et hovedformål med den foreliggende oppfinnelsen er å tilveiebringe dobbelt-trådete polymerer som omfatter de foregående delvis substituerte polynukleotidene kompleksert med poly(inosinsyre) betegnet Poly(I), eller poly(adenylsyre) betegnet Poly(A).

Ytterligere et aspekt ved oppfinnelsen vedrører fremgangsmåter for å inhibitere replikasjonen av neoplastiske celler og indusere syntesen av interferon i et in vivo biologisk system,

og spesielt pattedyrceller, ved å eksponere mistenkelige celler for en effektiv konsentrasjon av de delvis substituerte polynukleotidene eller polynukleotid-kompleksene.

Polynukleotidene i den foreliggende oppfinnelsen er heteropolymerer hvori hydrogenet i 5-stillingen i noen av deres pyrimidinbaser, cytosin eller uracil er substituert med merkapto-grupper, og noen er substituert med fluor. Cytosin- og uracil-gruppene i mononukleotidrestene i polycytidylsyre (PC)

og polyuridylsyre (PU) har derfor i 5-stillingen i hver nukleotid-enhet enten hydrogen, merkapto eller fluor. Det vil si at fra om lag 5 til om lag 90 % av hydrogenatomene i 5-stilling i (C) eller (U) enhetene i polynukleotidkjeden er substituert med fluor, og i tillegg fra om lag 1 til om lag 30

% av hydrogenatomene i 5-stilling i (C) eller (U) kjedene er substituert med merkaptogrupper som kan være tilstede i sin oksyderte disulfidform. Heteropolymerene inneholder således hydrogen, merkaptogrupper og fluor i 5-stilling i sine pyrimidinbaser. Foretrukne polyribonukleotider er betegnet MFPC og MFPU.

Ytterligere en foretrukket utførelse av de syntetiske, delvis substituerte heteropolynukleotidene er avledet fra de pyrimidinbaseholdige mononukleotidene, 2'-deoksycytidin-5'- fosfat (dCMP) og2'-deoksyuridin-5'-fosfat (dUMP). Fosfat-gruppene i slike 2'-deoksyribonukleotider binder 5'-hydroksylen i sukkergruppen til 3'-hydroksylen i den nærliggende nukleotid-enheten i polymerkjeden ved å danne en fosfodiester binding,

ved eliminering av et molekylvann. Den foreliggende oppfinnelsen vedrører derfor også delvis substituerte 3' ► 5' poly(2'-deoksyribonukleotider), poly(2'-deoksycytidylsyre (PdC) og poly(2'-deoksyuridylsyre (PdU), avledet fra det pyrimidinbaseholdige mononukleotidet, (dCMP) eller (dUMP) hvori fra om lag 5 til om lag 90 % av hydrogenatomene i 5-stilling i pyrimidinene i (PdC) eller (PdU) kjedene er substituert med fluor, og i tillegg fra om lag 1 til om lag 30 % av hydrogenatomene i 5-stilling i pyrimidinene i (PdC) eller (PdU) kjedene også er substituert med merkaptogrupper som kan være tilstede i sin oksyderte disulfidform. Foretrukne utførelser kan betegnes 5-merkapto-5-fluor-polydeoksycytidylsyre og 5-merkapto-5-fluor-polydeoksyuridylsyre, dvs. hhv. MFP(dC) og MFP(dU).

I tillegg til de enkelt-trådete delvis substituerte polyribonukleotidene MFPC og MFPU, overveier den foreliggende oppfinnelsen nye dobbelt-trådete polynukleotider. MFPC kan komplekseres med poly(inosinsyre) i et baseforhold på 1:1. I tillegg kan MFPU komplekseres med poly(adenylsyre) i et baseforhold på 1:1 eller 2:1. De dobbelt-trådete kompleksene vil aktivt indusere interferon, og også ha antitemplat-inhibi-torende aktiviteter i pattedyrceller.

Vanligvis blir polynukleotidene ifølge oppfinnelsen fremstilt ved først å syntetisere et mellomprodukt i form av delvis fluorert polynukleotid som deretter blir delvis tiolert. De delvis fluorerte polynukleotidene med forutbestemt base-sammensetning kan fremstilles enzymatisk ved å bruke polynukleotidfosforylase eller terminal deoksynukleotidyl-transferase (TdT) som katalyserer syntesen av hhv. polyribonukleotider og poly(2'-deoksyribonukleotider), som har basesammensetninger som er bestemt av forholdet mellom de substansene som er anvendt i reaksjonsblandingen.

Til fremstilling av mellomproduktene bestående av delvis fluorerte polynukleotider, er substratene 5-fluor substituerte og usubstituerte uridindifosfater eller 5-fluor substituerte og usubstituerte 2'-deoksyuridintrifosfater. Alternativt er substratene 5-fluor substituerte og usubstituerte cytidindi-fosfater eller 5-fluor substituerte og usubstituerte 2'-deoksy-cytidintrifosfater. Det spesielle forholdet mellom 5-fluor substituert og usubstituert substrat i hvert av parene ovenfor, vil bestemme sammensetningen av det resulterende delvis fluorerte polynukleotidet.

I samsvar med følgende reaksjonsskjema blir noen av de usubstituerte basene i de delvis fluorerte polynukleotidene deretter tiolert i 5-stillingene, eller med andre ord, blir det delvis fluorerte polynukleotidet deretter også delvis tiolert, mens de 5-fluorsubstituerte basene i den polymere kjeden forblir uforandret.

Det endelige delvis substituerte heteropolynukleotidet ifølge foregående reaksjonsskjema skal betraktes bare som illustrerende for en mulig sekvens av mononukleotider. Det vil si at polymeren som omfatter usubstituerte, 5-fluor substituerte og 5-merkapto substituerte baser i en kjede, kan arrangeres ifølge hvilket som helst antall mulige sekvenser.

Som tidligere vist, er de delvis substituerte polynukleotidene ifølge oppfinnelsen aktive cytotoksiske midler, og har bl.a. antitemplat-inhibiterende aktivitet, og noen synes også å utøve sine antitumor angrep gjennom eventuelle andre mekanismer. For eksempel har man funnet at MFPC er en aktiv inhibitor for DNA polymerase alfa fra MOLT-4 humane lymfomceller, i tillegg til at de er cytotoksiske for cellelinjer i faste tumorer, A-549 humant lungekarcinom og HT-29 humant kolonkarcinom.

Dessuten har man vist at MFPC er aktivt mot NIH 3T3 celler som var blitt omdannet ved det humane blære cHa ras oncogenet EJ, betegnet 3JI. De dobbelt-trådete polynukleotidene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å indusere interferon, men i tillegg har man vist at poly(I).MFPC er aktivt ved inhibitering av bryst-tumorer hos mus.

Som inhibitorer for neoplastiske pattedyrceller etc., blir mistenkelige celler eksponert for en effektiv konsentrasjon av det delvis substituerte polynukleotidet. Vanligvis vil en effektiv konsentrasjon være i området fra 1 til 60 mg/kg legemsvekt. Indusering av interferon in vitro vil forekomme ved 2-50 jjg/ml konsentrasjon. Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen kan også anvendes som antisopp-midler når de administreres til mistenkelige celler i en mengde som inhibiterer sopp.

Den virkelige mengden av forbindelsen som administreres

for behandling av tumorer, varierer avhengig av størrelsen på det varmblodige dyret som er involvert, av typen av fast tumor og av de dyreartene som er involvert. Ved de fleste anvendelsene vil den effektive tumor-inhibiterende konsentrasjonen vanligvis være innenfor det området som er vist ovenfor. Vanligvis krever store dyr mindre av en farmasøytisk forbindelse pr. kg legemsvekt enn mindre dyr. Uttrykket "faste tumorer" som dat anvendes heri er de epiteliale neoplasmene så som hud- og mage-kreft; bindevevsneoplasmer så som ben- og slettmuskel-kreft; neoplasmer i nervesystemet; neoplasmer i variert vev, så som brystkreft og nyrekreft; og forskjellige neoplasmer så som placentakreft og ovariecarcinom. Av spesiell interesse heri er de faste krefttumorene i kolon, lunge og bryst.

Behandlingen kan foregå ved en hvilken som helst egnet fremgangsmåte som er effektiv for den spesielle tumoren, dvs. oralt, rektalt, lokalt, parenteralt, eller ved andre administra-sjonsmåter etter behov. Polynukleotidene ifølge oppfinnelsen kan anvendes med farmasøytisk akseptable fortynner, ekstendere, bærere o.l. Det antas at parenteral behandling ved intravenøs, subkutan eller intramuskulær anvendelse, formulert med en egnet bærer eller fortynner for å lette anvendelsen, vil være den foretrukne fremgangsmåten for å administrere polynukleotidene ifølge oppfinnelsen, til varmblodige dyr.

De følgende spesielle eksemplene demonstrerer produktene

og fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Det skal imidlertid forstås at disse eksemplene bare er for illustrerende formål, og ikke forespeiler å være helt endelige med hensyn til betingelser og ramme.

EKSEMPEL I

Del A: Enzymatisk syntese av delvis fluorert

polyfcvtidylsyre) ( FPC)

Et reaksjonsmedium på 5 ml inneholdt kaliumcytidindifosfat (Sigma) (10 mM, 0,02303 gram), natrium 5-fluorcytidindifosfat (10 mM, 0,02403 g) , magnesiumklorid (Sigma) (10 mM) , EDTA

(Sigma) (0,5 mM, pH 6,6); polynukleotidfosforylase type 15 fra micrococcus luteus (Pharmacia) 5 enheter pr. ml reaksjonsblan-ding, tris-hydrogenkloridbuffer pH 9,0 (0,15 M og 1 ml deionisert og destillert vann; alle i spesielt behandlete 15 ml rør som var blitt neddykket i tris-HCl buffer og inngående spylt med destillert vann og gjort RNase-fri. Denne løsningen ble forsiktig omrystet og inkubert i 11 timer ved 37°C. Polymerisa-sjonsreaksjonsblandingen ble deproteinert ved gjentatte ekstraksjoner med kloroform-isoamylalkohol (24:1 v/v).

Den resulterende kopolymeren ble isolert ved gel-filtrering. En G-100 Sephadex kolonne ble anvendt til rensing; den hadde følgende dimensjoner og spesifikasjoner: høyde 87 cm, radium 0,8 cm, ekvilibrert og eluert med tris-HCl (20 mM, pH 7,2), med en strømningshastighet på omlag 48 ml/t. Vannfasen ble plassert i kolonnen, og fraksjonene oppsamlet og en LKB fraksjonator med UV recorder; 3,5 ml fraksjoner i 60 RNase-frie rør (vasket, oppvarmet ved 350°C i 45 minutter) (3,5 ml/rør)

ble oppsamlet. Polynukleotidtoppen ble konsentrert via dialyse. Cellofandialyserør (Fisher) med forskjellige diametere og forskjellige lengder ble fremstilt ved neddykking i 0,5 % natriumlaurylsulfat i 5 minutter, kokt i vann i 15 minutter og lagret i 95 % etanol ved 4°C. FPC ble overført til dialyseposen,

forseglet og plasert i en petriskpl, så dekket med polyvinyl-pyrrolidon ved 4°C. Løsningen ble kontrollert inntil et passende volum på omlag 3 ml var oppnådd, og derpå ble det overført via Pasteur-pipette til en RNase-fri flaske og lagret ved 4°C. De ureagerte monomerene ble oppsamlet via rotasjons-fordampning og lagret ved 4°C. Polynukleotidet blekarakterisertved UV analyse (Beckman Model 25, Cary 118) og NMR analyse

(JEOL 270 Mhz). NMR arbeidet ble utført med en fluor 19-probe

i 5 mm RNase-frie rør ved bruk av prøven (FPC) og standard 5-fluorcytidin-referanser (Calbiochem) ved 19 mM og 11 mM. For å oppnå en målbar mengde fluor ble FPC prøven oppkonsentrert via dialyse som tidligere beskrevet til 1,5 ml ved 61 mM. 400 scan ble kjørt på standardene og 1200 scan ble samlet på polymeren. Ekstinksjonskoeffisienten ble også bestemt ved å måle UV absorbansen ved 260 nm og mengden polynukleotid bestemt ved fosfatanalyse.

Del B: Omdanning av FPC til cetyltrimetvlammoniumsaltet

Til 14 ml av natriumsaltet av delvis fluorert poly(cytidyl-syre) 2 0,7 mg, 64,12 pmol, 4,58 mM) i en vånding løsning av tris-HCl (20 mM, pH 7,2) ved 4°C, 1,52 ml av en 2 %ig vandig løsning av cetyltrimetylammoniumbromid (Eastman Kodak) 83,2

jjmol, et overskudd på 1,3 ganger, ble tilsatt tråpevis. Det utfellte cetyltrimetylammonium FPC ble oppsamlet ved sentrifugering (7000 rpm, 10 min) i et Nalgenrør på 50 ml. Det ble vasket med destillert vann tre ganger (5 ml). Pelleten ble overført til en 100 ml rundbundet flaske (RNase-fri) og løst i metanol (20 ml) ved forsiktig omrøring ved 4°C. Etter 12

timers omrøring var ikke hele bunnfallet gått i løsning. Løsningen ble igjen sentrifugert, og supernatanten oppsamlet. UV-målinger (Cary 118) av løsningen viste en økning i absorbansen ved 270 nm (72,4 >jmol) . Pelleten ville ikke gå fullstendig i løsning i verken metanol eller vandig tris-HCl buffer. Supernatanten ble inndampet til tørrhet via roterende inndamping i vakuum. Residuet ble tørket in vacuo i dessikator over fosforpentoksyd i 12 timer ved 25°C.

Del C: Dannelse av metoks<y>bromid- addukter

Først ble fremstilt metylhypobromit. Til en blanding av vannfritt metanol (20 ml) og sølvkarbonat (1,7 g) omrørt ved

-15°C, ble tilsatt brom (tørket over H2S04) (0,14 ml).

Løsningen ble kraftig omrørt i 1,5 timer ved -15°C. Løsningen ble deretter avkjølt til -30°C og filtrert gjennom celitt over i en avkjølt (-15°C) rundbundet flaske. Den grønnaktige løsnignen (0,128 M, CH30Br) må anvendes øyeblikkelig. Det tørre cetyltrimetylammoniumsaltet av FPC ble løst i vannfri metanol (20 ml)• For kvanititativ brominering av de umodifiserte cytosinrestene ble tilsatt et overskudd på 2,2 ganger av metoksybromid (141 pmol) (1,1 ml, 0,128 M) og blandingen ble omrørt i 30 minutter ved 0°C. Fullstendig omsetning ble bestemt ved forsvinningen av U.V. toppen ved 270 nm og den samtidige tilsynekomsten av en topp ved 234 nm.

Del D: Tiolerinq av FPC

Den halogenerte kopolymeren ble inndampet ved rotasjon til 10 ml, og tørr N,N-dimetylacetamid (10 ml) ble tilsatt, og nitrogen ble ledet gjennom løsningen i 15 min. Finmalt NaSH.2H20 i to gangers overskudd (14,7 mg, 160 pmol) ble raskt tilsatt ved 0°C, og løsningen ble omrørt under nitrogen i 1,5 timer. Etter 1,5 timer ble løsningen plassert i omgivelser med filtrert luft, inntil løsningen ble fargeløs eller i 15

minutter ved 0°C. Det tiolerte polyribonukleotidet (MFPC) ble omdannet til natriumsaltet via dråpevis tilsetning av NaCl (3M,

4 ml) ved 4°C. Bunnfallet ble oppsamlet i et Nalgen-sentrifu-gerør ved sentrifugering ved 7000 rpm i 10 minutter. Supernatanten ble kastet, og pelleten vasket 3 ganger med etanol og NaCl-løsning (0,15 M) 3:1 (v/v), 15 ml hver. Den resulterende delvis tiolerte og fluorerte poly(cytidylsyre)pelleten ble løst i vandig tris-HCl (20 ml, 20 mM, pH 7,2) ved forsiktig omrøring over natten ved 4°C. Ikke hele MFPC mengden løste seg, selv etter oppvarming til 4 0°C i en time. Kopolymeren ble sentrifugert (8000 rpm, 10 minutter) og supernatanten renset på en kolonne av Sephadex G-100. Pelleten inneholdt en insignifikant mengde polymer, og ble kastet. Spektralanalyse av supernatanten ble utført på Beckman Model 25 og Gilford 2400-S før gelfiltrering. Dimensjonene på kolonnen, elueringsmiddel og oppsamlings-fremgangsmåter var de samme som beskrevet for syntesen av FPC.

Supernatanten som inneholdt MFPC ble delt i tre like fraksjoner for gelfiltrering, for å forhindre overlasting av kolonnen. De fraksjonene som inneholdt MFPC polyribonukleotider ble slått sammen og analysert spektrofotometrisk. MFPC ble deretter konsentrert via cellofan-dialysesekker ved bruk av polyvinyl-pyrrolidon ved 4°C til omlag 8 ml, og overført til en RNase-fri flaske.

EKSEMPEL II

Fremstilling av poly( I). MFPC

Ekvimolare mengder av poly(I) og av MFPC ble anilert ved bruk av standard fremgangsmåte. Således ble 10 ml av en 4 mM løsning av poly(I) og 10 ml av en 4 mM løsning av MFPC blandet sammen i en natriumfosfatbuffer, 20 mM, pH 7,2, som inneholdt 0,1 M natriumklorid og 2 mM magnesiumklorid. Løsningen ble inkubert ved 25°C i tre timer og ved 4°C i 16 timer for å sikre fullstendig anilering.

Poly(I).MFPC løsningen oppnådd på denne måten ble ytterligere analysert med ultrofiolett absorpsjons-spektrum, og dens termiske stabilitet bestemt ved den ultrafiolette absorpsjons-temperatur-profil.

EKSEMPEL III

Det delvis 5-tiolerte, delvis 5-fluorerte poly(cytidylsyre)

(MFPC) i eksempel I ble testet in vitro på sin evne til å inhibitere veksten av dyrkete celler. De tre cellene som ble testet var human lungetumorcellelinje A549, kvasi-normal mus cellelinje, NIH 3T3, og NIH 3T3 celler som var blitt omdannet med humant blære c-Ha ras oncogen, EJ. Denne klonelinjen betegnes 3JI. 8 x 10<3>celler av A549, 3T3 og 3JI ble sådd i 16 mm diamter kultur-kar i 0,5 ml alikvoter av Eagle Medium som inneholdt 10 % kalveserum (EM10C). Den følgende dag ble mediet erstattet med det som inneholdt de viste konsentrasjonene av MFPC oppført nedenfor i tabell I. Cellene ble trypsinisert og tellet 7 døgn etter såingen.

MFPC ble funnet å inhibitere hver av de foregående tre cellelinjene med konsentrasjoner som var tilstrekkelige til å inhibitere veksten med 50 % (IC50) som var i området fra mindre enn 0,003 til omlag 0,1 >jg pr. ml over flere eksperimenter. A549 og NIH 3T3 celler hadde lignende sensitiviteter, men var mere resistente mot MFPC enn 3JI cellene var.

EKSEMPEL IV

Poly(I).MFPC komplekset som var fremstilt ifølge fremgangsmåten i eksempel II, ble testet for sin evne til å inhibitere tumordannelse ved 3JI celler hos Balb/C mus. Forsøksdyrene ble injisert subkutant mellom scapula med lxlO<6>3JI celler. På dagen etter tumorimplanteringen, begynte man å injisere musene subkutant på tumorstedet med den indikerte mengden av poly(I).MFPC. Injeksjoner ble gitt hver andre dag med totalt 8 injeksjoner. Kontrolldyrene ble behandlet med Puck's G saltløsning. Dyrene ble avlivet 3 døgn etter den siste injeksjonen (18 døgn etter tumorimplanteringen) og veiet. Tumorene ble skåret ut og veiet. Resultatene av in vivo forsøkene er gitt i tabell II nedenfor.

De gitte data i tabell II viser at poly(I).MFPC ved 20 mg pr. kg legemsvekt, i betydelig grad inhibiterer veksten av tumoren. Det antas at den inhibiterende aktiviteten ved lavere doser av polynukleotid-komplekset, vil være tilsvarende, men med lavere potensial for toksisitet.

EKSEMPEL V

En serie in vivo tester ble utført for å vise ved sammen-ligning antitumor-aktiviteten for poly(I).MFPC og poly(I).MPC hos mus. Det ble vist at den MFPC som ble anvendt i denne studien, inneholdt 8 % 5-merkaptocytidylat, 33 % 5-fluorcytidylat og 49 % cytidylat. Det ble dannet en stabil dobbelhelix med poly(I). Den MPC som ble anvendt i denne studien, inneholdt 12

% 5-merkaptocytidylat-rester.

Den anvendte tumor modellen var SMT-F tumoren, en under-linjet hurtigvoksende spontan brysttumor hos mus, transplantert subkutant til DBA/2 Jackson hunmus. Små biter av tumor (1,5 mm<2>) fra en donormus ble transplantert med en 18 gauge trocar til mottakermusene som var 8 uker gamle og veide omlag 20 g hver. Den poly(I).MFPC dobbelttrådete forbindelsen ble administrert til musene ved subkutan injeksjon på samme stedet som tumortransplantasjonen i en dose på 20 mg/kg kroppsvekt på dag 1, 7 og 13 etter transplanteringen av tumoren. Kontroll-musene ble gitt det samme volumet av saltløsning. Tumorene kunne oppdages på dag 5 og var målbare på dag 7. Tumorstørrelsen ble målt over den største diameteren (lengde) og dens perpendikulære diamter (bredde) med en målepasser hver andre dag, og uttrykt som 1 x w (mm<2>). Ved slutten av eksperimentet ble musene avlivet, tumoren skåret ut og veiet. Midlere tumorstørrelse og vekt pr. gruppe, standard avvik, og standard feil ble beregnet, analysert og sammenlignet ved bruk av Student's t test.

Tre av fem mus behandlet med poly(I).MFPC var fri for tumor, og de var sunne og normale av utseende. På dag 25 viste en av disse 3 musene en observerbar tumor som vokste så stor at en uke senere måtte musen avlives. De andre to musene var fremdeles fri for tumor på dag 32. En av de 5 musene i gruppen som var behandlet med poly(I).MPC, var fri for tumor på dag 32.

Selvom både poly(I).MFPC og poly(I).MPC var inhibiterende for veksten av tumor i mus, var poly(I).MFPC mere kraftig,

(T/C = 98) enn poly(I).MPC (T/C =74).

Selvom oppfinnelsen er beskrevet i forbindelse med spesielle eksempler på denne, er dette bare illustrerende. Mange alternativer, modifikasjoner og variasjoner vil.derfor være åpenbare for fagfolk på området, i lys av den foregående beskrivelsen, og det er derfor hensikten å la alle slike alternativer, modifikasjoner og variasjoner falle innenfor ideen og den brede rammen i de vedlagte kravene.

Claims (12)

1. Fremgangsmåte til å syntetisere et delvis substituert 3' >5' polyribonukleotid og et farmasøytisk akseptabelt salt derav, karakterisert ved trinnene å erstatte noen av hydrogenatomene med fluoratomer i 5-stilling i pyrimidinbasene i en polynukleotid-kjede for å tilveiebringe et delvis fluorert polynukleotid, og erstatte noen av de gjenværende hydrogenatomene i 5-stilling i pyrimidinbasene av nevnte delvis fluorerte polynukleotid med merkaptogrupper for å tilveiebringe en delvis substituert polyribonukleotidkjede, hvori fra ca. 5 til ca. 90 % av hydrogenatomene i 5-stillingen i pyrimidinene i polymer-kjedene er substituert med fluor, og fra ca. 1 til ca. 3 0 % av hydrogenatomene i 5-stilling er substituert med merkaptogrupper som kan foreligge i sin oksyderte disulfidform.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved syntese av et polyribonukleotid hvori pyrimidinbasen er cytosin eller uracil.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det i syntesen av det delvis fluorerte polynukleotidet anvendes cytidin-5'-fosfat eller uridin-5'-fosfat.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved innføring av merkaptogrupper i den delvis fluorerte polynukleotid-kjeden for å frembringe heteropolymerer som har hydrogen, merkaptogrupper og fluoratomer i 5-stillingen i sine cytidin eller uridin baser.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av polyribonukleo-tidet 5-merkapto-5-fluor-poly(cytidylsyre), karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av polyribonukleo-tidet 5-merkapto-5-fluor-poly(uridylsyre), karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

7. Fremgangsmåten ifølge krav 5, karakterisert ved at den omfatter trinn for å kompleksere 5-merkapto-5-fluor-poly(cytidylsyre) med poly-(inosinsyre) i et baseforhold på 1:1.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at den omfatter trinn for å kompleksere 5-merkapto-5-fluor-poly(uridylsyren) med poly-(adenylsyre) i et baseforhold på 1:1.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at den omfatter trinn for å kompleksere 5-merkapto-5-fluor-poly(uridylsyre) med poly-(adenylsyre) i et baseforhold på 2:1.

10. Fremgangsmåte for å syntetisere et 3' >5' poly(2'-deoksyribonukleotid) og et farmasøytisk akseptabelt salt derav, karakterisert ved trinnene å erstatte noen av hydrogenatomene med fluoratomer i 5-stillingen i cytidin-gruppen i en poly(2'-deoksycytidylsyre) eller uridingruppen i en poly(2'-deoksyuridylsyre) for å tilveiebringe et delvis fluorert 2'-deoksyribonukleotid, og erstatte noen av de gjenværende hydrogenatomene i 5-stillingen i cytidin- og uridin-gruppene i de delvis fluorerte 2'-deoksyribo-nukleotid-kjedene med merkaptogrupper, hvori fra ca. 5 til ca. 9 0 % av hydrogenatomene i fremstillingen i cytidin- eller uridin-gruppene i de fluorerte 2'-deoksyribonukleotidkjedene blir substituert med fluor, og fra ca. 1 til ca. 3 0 % av hydrogenatomene blir substituert med merkaptogrupper som kan foreligge i sin oksyderte disulfidform.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10 ved fremstilling av poly(2'-deoksyribonukleotidet), 5-merkapto-5-fluor-poly(2'-deoksy-cytidylsyre), karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 10 ved fremstilling av poly(2'-deoksyribonukleotidet), 5-merkapto-5-fluor-poly(2'-deoksy-uridylsyren), karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.